CN102727931A - 一种三维仿生电极化梯度孔神经导管的构建及其制备 - Google Patents

Abstract

一种三维仿生电极化梯度孔神经导管的构建及其制备。该神经导管是电极化β-磷酸三钙/聚乳酸/透明质酸/壳聚糖/神经生长因子神经导管，是以聚乳酸为基质材料，添加电极化β-磷酸三钙，制备均匀分散的电极化β-磷酸三钙与聚乳酸芯材；再以静电自组装和偶合交联将透明质酸和壳聚糖及神经生长因子附于芯材表面制备的成分和孔结构双重梯度的三维仿生电极化梯度孔神经导管，长度10～100mm，内径1～6mm，壁厚0.5～2mm，外层管壁为三维网络状结构。本发明的神经导管应用于周围神经系统的修复、诱导周围神经再生以及组织工程中神经细胞的体外培养。本发明的制备方法简单，成本低，对环境友好，经济效益高，适于工业化生产。

Description

一种三维仿生电极化梯度孔神经导管的构建及其制备

技术领域

   本发明属于神经导管的构建及其制备领域，特别是涉及一种三维仿生电极化梯度孔神经导管的构建及其制备。

背景技术

周围神经缺损是临床常见疾病，大约2.8%的创伤患者导致周围神经损伤，并且严重者将终身残疾。我国每年有几十万病例需要神经修复，但修复效果不尽如人意，故周围神经损伤后的再生和功能恢复一直是神经科学领域的热门课题。目前，自体神经移植作为周围神经损伤的金标准，是最为经典的桥接修复神经缺损的方法，但其并非最理想的方法。除供体来源有限，会造成供体部位部分功能丧失及永久性神经损伤，还受可修复长度、瘢痕形成等问题的限制。当前研究着重于发展能够用物理性神经再生通过损伤区的神经导管。所以设计具有良好的生物相容性、生物可降解性和力学性能的神经导管是临床医学的重大需求。

理想的神经导管材料除应具有良好的生物相容性，良好的生物可降解吸收性，良好的可塑性和适宜的力学性能等外，还应具有良好的表面活性和组织诱导性。β-磷酸三钙（β-tricalci -umphosphate(β-TCP)）是一种生物降解和生物吸收型磷酸钙生物活性材料，具有良好的可生物降解性、生物相容性和生物无毒性。且其降解产物显弱碱性，能部分中和材料降解产生的酸性，并且有研究表明Ca²⁺在介导轴突生长和迁移方向中起关键作用。聚乳酸（PDLLA）是一种重要的生物可降解聚合物，以其优良的生物相容性和生物可吸收性以及良好的力学性能而被广泛研究和应用于周围神经的损伤与修复中。透明质酸（HA）带有大量负电荷，对成纤维细胞有排斥作用，可形成化学屏障。同时高浓度、高分子量HA具有抑制淋巴细胞、单核细胞和成纤维细胞的迁移，减轻炎症反应，形成免疫屏障的作用。更为重要的是，HA能够选择性地刺激成纤维细胞合成胶原，促进胶原纤维以网状排列方式沉积，从而减少瘢痕的形成。壳聚糖（CHS）是唯一的碱性天然多糖高分子，具有良好的生物可降解性和生物相容性，与生物体的亲和性能体现在细胞水平上，产生抗原的可能性很小，对受损伤的生物体能诱生特殊细胞，加快创伤愈合，特别是促进愈合张力的增长，还具有消炎、止血、镇痛和抑菌等性能，能有效防止神经再生过程中瘢痕的产生，但其力学性能较差。神经生长因子（NGF）不仅能够保护神经元、诱导神经轴突伸展、促进周围神经再生，而且可以参与机体免疫、造血、炎症反应、生殖等系统功能的调节，作为从生物体中提取的一种生物制剂，极具发展潜力。

自组装是指构建基元在没有人为介入的情况下自发地形成有序结构。目前，将聚合物的自组装应用于制备精细表面及界面己成为十分活跃的研究方向。逐渐成为研究生物功能、理解生命现象、探索生命起源的一个极其重要的研究领域。其中，“静电自组装”已成为一种日益引起广大生物材料工作者兴趣的新方法。

目前，国内外研究较多的是用生物可降解材料所构建的神经导管修复神经损伤。然而，任何单一的可降解材料都无法满足上述要求，只有充分利用天然高分子的生物活性基元及合成高分子良好的力学加工性能、便于大批量生产以及成本低等特点，进行天然高分子和合成高分子结构杂化和优势互补，才能使制备出的周围神经再生导管赋予更多的性能。高渗透、梯度孔三维神经导管因可以负载生长因子和活体细胞并能引导神经纤维定向生长，故在周围神经再生修复方面具有独特的优势。探索寻找更为适宜制备此类神经导管材料的研究始终在进行中。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种三维仿生电极化梯度孔神经导管及其制备方法，该导管具有“人工神经”以及神经组织工程支架的双重作用，有利于负载生长因子和活体细胞，并能引导神经纤维定向生长，且该神经导管具有良好的生物相容性和生物降解性能；其制备方法简单，无污染。

本发明的一种三维仿生电极化梯度孔神经导管是基于细胞外基质材料的仿生分子来设计的，它是电极化β-磷酸三钙/聚乳酸/透明质酸/壳聚糖/神经生长因子神经导管，是以聚乳酸（PDLLA）为基质材料，添加电极化β-磷酸三钙（β-TCP在外加电场的作用下，使其电极化），制备均匀分散的电极化β-磷酸三钙与聚乳酸（电极化β-TCP/PDLLA）芯材；再以静电自组装和偶合交联技术将透明质酸和壳聚糖以及神经生长因子附于芯材表面制备的成分和孔结构双重梯度的三维仿生电极化梯度孔神经导管（记作：电极化β-TCP /PDLLA/HA/CHS/NGF神经导管）。

所述的神经导管长度为10～100mm，内径为1～6mm，壁厚为0.5～2mm。

本发明的一种三维仿生电极化梯度孔神经导管的制备方法，包括如下步骤：

(1) 将β-磷酸三钙（β-TCP）粉末（10-100nm）放置在一个直径2～8cm，高0.5～3cm氧化铝环中，在2～10kvcm-1直流电场作用下，于100～500℃空气中电极化1～2小时，得电极化β-磷酸三钙，取出备用；

(2) 在室温下，以乙酸乙酯、氯仿、丙酮或三氯甲烷为溶剂，加入聚乳酸（PDLLA），再加入电极化β-磷酸三钙（电极化β-TCP），制成混合溶液，混合溶液中聚乳酸质量浓度为5wt%～20wt%,电极化β-磷酸三钙质量浓度为5wt%～10wt%；

(3) 用磁力搅拌使上述混合液完全分散，再将混合溶液徐徐倾倒入玻璃模具内，室温下，采用溶剂挥发法挥发12～48小时，真空干燥12～48小时，再从模具上剥离芯材，制成电极化β-磷酸三钙与聚乳酸（极化β-TCP /PDLLA）芯材；

(4) 胺化：将步骤（3）制得的电极化β-磷酸三钙与聚乳酸芯材，浸入浓度为1～10mg/ml的己二胺-异丙醇、己二胺-正丙醇、乙二胺-异丙醇或者乙二胺-正丙醇溶液中，反应1～2小时，用水充分漂洗去掉未反应的己二胺或乙二胺，真空干燥至恒重；

(5) 将上述胺化后的电极化β-磷酸三钙与聚乳酸芯材依次在浓度为1～10mg/ml的透明质酸、1～10mg/ml的壳聚糖溶液中自组装，使其在室温下搅拌，组装完毕，置于1～10mg/ml的神经生长因子水溶液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)反应，其加入量为电极化β-磷酸三钙与聚乳酸芯材总当量的l～1.5倍，反应完毕后真空冷冻干燥，消毒，即得三维仿生电极化梯度孔神经导管。

本发明所用的聚乳酸的分子量为1.0×10⁵～3.0×10⁵ ，β-磷酸三钙粉末的粒径为10-100nm；选的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、丙酮或三氯甲烷。

本发明的制备方法步骤（3）中，制得的电极化β-磷酸三钙与聚乳酸芯材直径为1.5～8mm。

本发明的制备方法步骤(5)中，得到的神经导管外层管壁孔隙率为65%-75%的三维网络状结构。

本发明的三维仿生电极化梯度孔神经导管应用于周围神经系统的修复、诱导周围神经再生以及组织工程中神经细胞的体外培养。

电极化β-TCP的引入可发挥电刺激诱导神经生长作用，PDLLA被广泛用于神经导管的制备，HA属酸性多糖，是细胞外基质的重要组成部分，CHS是自然界存在的唯一天然碱性多糖，是类细胞外基质成分，NGF是典型的靶源性神经营养因子，β-TCP、PDLLA、HA和CHS的综合利用可获得良好力学性能，故本发明用这几种材料制备的神经导管具有仿细胞的微环境，可达到成分仿生的目的；利用热致相分离技术和糖模板法可获得定向高通透性、梯度孔结构，达到结构仿生的目的。

本发明的有益效果在于：

   1、本发明可以诱导再生神经定向生长。通过β-TCP组成梯度解决引导再生神经轴突定向生长和迁移方向的钙离子、磷酸根离子适时、适量供给问题，同时解决电极化β-TCP的电荷储存量和保证诱导神经再生的有效电流问题；通过偶联技术解决NGF控制释放问题。

2、本发明构建的静电自组装多层膜与芯材的装配以及多层膜内部具有良好的稳定性。

   3、本发明可以通过神经导管的定向、梯度孔、高通透性的结构的设计与构建技术，实现神经定向再生诱导因子的适时、适量释放，解决细胞和生长因子定向趋附以及结缔组织入侵等难题，为粗大、长段的神经缺损提供解决方案。

4、本发明的制备方法简单，成本低，对环境友好，经济效益高，适于工业化生产。

附图说明

图1：神经导管示意图

图2：神经导管芯材及其扫描电镜示意图

图中：1为β-TCP/PDLLA芯材，2为自组装层，3为梯度孔层。

由图可见，梯度孔层由两层不同孔径的多孔层组成，内层为β-TCP/PDLLA多孔结构，外层为CHS/HA多孔结构。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种等价改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

三维仿生电极化梯度孔神经导管的制备，制备步骤为：

(1) 将β-磷酸三钙（β-TCP）粉末（10-100nm）放置在一个直径2厘米，高0.5厘米氧化铝环中，在2kvcm-1直流电场作用下，于100℃空气中电极化1小时，即得电极化β-TCP，取出备用；

(2) 在室温下，以乙酸乙酯为溶剂，分别加入聚乳酸（PDLLA）和电极化β-TCP，制成质量浓度5%的聚乳酸和质量浓度5%的电极化β-TCP混合溶液；

(3) 用磁力搅拌使上述混合液完全分散，再将混合溶液徐徐倾倒入玻璃模具内，室温下，采用溶剂挥发法挥发12小时，真空干燥12小时，再从模具上剥离芯材，制成电极化β-TCP /PDLLA芯材；

(4) 胺化，将电极化β-TCP /PDLLA芯材浸入1mg/ml的己二胺-异丙醇溶液中，反应1小时，用水充分漂洗去掉未反应的己二胺，真空干燥至恒重；

(5) 将上述胺化后的电极化β-TCP /PDLLA芯材依次在浓度为1mg/ml的HA、1mg/ml的CHS溶液中自组装，使其在室温下缓慢搅拌，组装完毕，置于浓度为1mg/ml的NGF水溶液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)反应，其加入量为电极化β-磷酸三钙与聚乳酸芯材总当量的l倍，反应完毕后真空冷冻干燥，消毒，得三维仿生电极化梯度孔神经导管。

实施例2

三维仿生电极化梯度孔神经导管的制备，制备步骤为：

(1) 将β-磷酸三钙（β-TCP）粉末（10-100nm）放置在一个直径4厘米，高1.5厘米氧化铝环中，在5kvcm-1直流电场作用下，于200℃空气中电极化2小时，即得电极化β-TCP，取出备用；

(2) 在室温下，以氯仿为溶剂，分别加入聚乳酸（PDLLA）和电极化β-TCP，制成质量浓度10%的聚乳酸和质量浓度6%的电极化β-TCP混合溶液；

(3) 用磁力搅拌使上述混合液完全分散，再将混合溶液徐徐倾倒入玻璃模具内，室温下，采用溶剂挥发法挥发24小时，真空干燥24小时，再从模具上剥离芯材，制成电极化β-TCP /PDLLA芯材；

(4) 胺化，将电极化β-TCP /PDLLA芯材浸入4mg/ml的己二胺-正丙醇溶液中，反应2小时，用水充分漂洗去掉未反应的乙二胺，真空干燥至恒重；

(5) 将上述胺化后的β-TCP /PDLLA芯材依次在浓度为4mg/ml的HA、4mg/ml的CHS溶液中自组装，使其在室温下缓慢搅拌，组装完毕，置于4mg/ml的NGF水溶液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)反应，其加入量为电极化β-磷酸三钙与聚乳酸芯材总当量的1.5倍，反应完毕后真空冷冻干燥，消毒，得三维仿生电极化梯度孔神经导管。

实施例3

三维仿生电极化梯度孔神经导管的制备，制备步骤为：

(1) 将β-磷酸三钙（β-TCP）粉末（10-100nm）放置在一个直径6厘米，高2厘米氧化铝环中，在8kvcm-1直流电场作用下，于300℃空气中电极化1小时，即得电极化β-TCP，取出备用；

(2) 在室温下，以丙酮为溶剂，分别加入聚乳酸（PDLLA）和电极化β-TCP，制成质量浓度15%的聚乳酸和质量浓度8%的电极化β-TCP混合溶液；

(3) 用磁力搅拌使上述混合液完全分散，再将混合溶液徐徐倾倒入玻璃模具内，室温下，采用溶剂挥发法挥发36小时，真空干燥36小时，再从模具上剥离芯材，制成电极化β-TCP /PDLLA芯材；

(4) 胺化，将电极化β-TCP /PDLLA芯材浸入7mg/ml的乙二胺-异丙醇溶液中，反应1小时，用水充分漂洗去掉未反应的乙二胺，真空干燥至恒重；

(5) 将上述胺化后的电极化β-TCP /PDLLA芯材依次在浓度为7mg/ml的HA、7mg/ml的CHS溶液中自组装，使其在室温下缓慢搅拌，组装完毕，置于7mg/ml的NGF水溶液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)反应，其加入量为电极化β-磷酸三钙与聚乳酸芯材总当量的1.15倍，反应完毕后真空冷冻干燥，消毒，得三维仿生电极化梯度孔神经导管。

实施例4

三维仿生电极化梯度孔神经导管的制备，制备步骤为：

(1) 将β-磷酸三钙（β-TCP）粉末（10-100nm）放置在一个直径8厘米，高3厘米氧化铝环中，在10kvcm-1直流电场作用下，于500℃空气中电极化2小时，即得电极化β-TCP，取出备用；

(2) 在室温下，以三氯甲烷为溶剂，分别加入聚乳酸（PDLLA）和电极化β-TCP，制成质量浓度20%的聚乳酸和质量浓度10%的电极化β-TCP混合溶液；

(3) 用磁力搅拌使上述混合液完全分散，再将混合溶液徐徐倾倒入玻璃模具内。室温下，采用溶剂挥发法挥发48小时，真空干燥48小时，再从模具上剥离芯材，制成电极化β-TCP /PDLLA芯材；

(4) 胺化，将电极化β-TCP /PDLLA芯材浸入10mg/ml的乙二胺-正丙醇溶液中，反应2小时，用水充分漂洗去掉未反应的乙二胺，真空干燥至恒重；

(5) 将上述胺化后的β-TCP /PDLLA芯材依次在浓度为10mg/ml的HA、10mg/ml的CHS溶液中自组装，使其在室温下缓慢搅拌，组装完毕，置于10mg/ml的NGF水溶液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)反应，其加入量为电极化β-磷酸三钙与聚乳酸芯材总当量的1.3倍，反应完毕后真空冷冻干燥，消毒，得三维仿生电极化梯度孔神经导管。

Claims (7)

1.一种三维仿生电极化梯度孔神经导管，其特征在于：它是电极化β-磷酸三钙/聚乳酸/透明质酸/壳聚糖/神经生长因子神经导管，是以聚乳酸为基质材料，添加电极化β-磷酸三钙，制备均匀分散的电极化β-磷酸三钙与聚乳酸芯材；再以静电自组装和偶合交联技术将透明质酸和壳聚糖以及神经生长因子附于芯材表面制备的成分和孔结构双重梯度的三维仿生电极化梯度孔神经导管。

2.根据权利要求1所述的一种三维仿生电极化梯度孔神经导管，其特征在于：所述的神经导管长度为10～100mm，内径为1～6mm，壁厚为0.5～2mm。

3.一种三维仿生电极化梯度孔神经导管的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1) 将β-磷酸三钙纳米粒子放置在一个直径2～8cm，高0.5～3cm氧化铝环中，在2～10kvcm-1直流电场作用下，于100～500℃空气中电极化1～2小时，得电极化β-磷酸三钙，取出备用；

(2) 在室温下，以乙酸乙酯、氯仿、丙酮或三氯甲烷为溶剂，加入聚乳酸，再加入电极化β-磷酸三钙，制成混合溶液，混合溶液中聚乳酸质量浓度为5wt%～20wt%,电极化β-磷酸三钙质量浓度为5wt%～10wt%；

(3) 用磁力搅拌使上述混合液完全分散，再将混合溶液徐徐倾倒入玻璃模具内，室温下，采用溶剂挥发法挥发12～48小时，真空干燥12～48小时，再从模具上剥离芯材，制成电极化β-磷酸三钙与聚乳酸芯材；

(4) 胺化：将步骤（3）制得的电极化β-磷酸三钙与聚乳酸芯材，浸入浓度为1～10mg/ml的己二胺-异丙醇、己二胺-正丙醇、乙二胺-异丙醇或者乙二胺-正丙醇溶液中，反应1～2小时，用水充分漂洗去掉未反应的己二胺或乙二胺，真空干燥至恒重；

(5) 将上述胺化后的电极化β-磷酸三钙与聚乳酸芯材依次在浓度为1～10mg/ml的透明质酸、1～10mg/ml的壳聚糖溶液中自组装，使其在室温下搅拌，组装完毕，置于1～10mg/ml的神经生长因子水溶液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐反应，其加入量为电极化β-磷酸三钙与聚乳酸芯材总当量的l～1.5倍，反应完毕后真空冷冻干燥，消毒，即得三维仿生电极化梯度孔神经导管。

4.根据权利要求3所述的三维仿生电极化梯度孔神经导管的制备方法，其特征在于：所用的聚乳酸的分子量为1.0×10⁵～3.0×10⁵ ，β-磷酸三钙粉末的粒径为10-100nm；选的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、丙酮或三氯甲烷。

5.根据权利要求3所述的三维仿生电极化梯度孔神经导管的制备方法，其特征在于：步骤（3）制得的电极化β-磷酸三钙与聚乳酸芯材直径为1.5～8mm。

6.根据权利要求5所述的三维仿生电极化梯度孔神经导管的制备方法，其特征在于：得到的神经导管外层管壁孔隙率为65%-75%的三维网络状结构。

7.如权利要求1所述的一种三维仿生电极化梯度孔神经导管的应用，其特征在于：应用于周围神经系统的修复、诱导周围神经再生以及组织工程中神经细胞的体外培养。

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