CN113941028B - 可降解自驱动神经修复导管及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种可降解自驱动神经修复导管及其制备方法和应用。所述可降解自驱动神经修复导管包括：外层，所述外层具有多个微孔；中间层，所述中间层的一面与所述外层相接触，且所述中间层的背离所述外层的另一面设有第一电极和第二电极，所述第一电极和第二电极分别位于所述神经修复导管的轴向两端部；以及内层，所述内层与所述中间层的所述另一面的未设有所述第一电极和所述第二电极的部分相接触，且所述内层由纤维丝交织而成。本发明的可降解自驱动神经修复导管具有与神经组织相近的弹性模量以及极佳的抗拉伸性能且具有电池的放电性能，为神经组织与导管内壁之间提供了理想的机械匹配界面。

Description

可降解自驱动神经修复导管及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种可降解自驱动神经修复导管及其制备方法和应用，属于 医用材料领域。
背景技术
神经修复导管是利用组织工程学的原理和方法，用天然和/或合成可降解 高分子材料制备的可以在周围神经损伤断端建立神经桥接的中空管状结构， 能够为损伤的神经提供适宜的神经再生微环境。常用的天然材料包括胶原、 明胶、壳聚糖、丝素蛋白等，均具有良好的生物相容性、低免疫原性；合成 可降解高分子材料包括聚乳酸、聚羟基丁酸戊酸共聚酯、聚(D,L-乳酸-co-乙 醇酸)等，具有良好的力学强度、可降解性特点。
神经修复过程是一个复杂的生物学问题，神经修复导管除了具有良好的 生物相容性、无毒、低免疫原性性外，适宜的导管构型及力学强度对神经修 复同样起到重要作用。目前是通过研究不同管壁结构，无论单层、双层还是 多层结构仍存在一些问题，不能完全仿制出具有天然神经结构的支架。
在现有技术中，已经上市的天然高分子材料的神经修复导管，虽然具有 良好的生物相容性、低免疫原性，但缺陷在于力学强度不足，降解过快，在 实际临床应用过程中耐撕裂能力差，容易出现中空导管崩塌现象而阻碍神经 修复过程。合成可降解高分子材料的神经修复导管虽然具有相对更好的力学 强度、较慢的降解性能，但其仍然具有聚酯自身的疏水性及相对较差的生物 相容性的缺点，不利于细胞的附着和迁移并容易引起排异反应。
引用文献1公开了一种神经修复导管，该神经修复导管包括圆柱形的内 芯和可包裹所述内芯的外膜，所述内芯具有沿轴向延伸的第一通孔和沿垂直 于所述内芯轴向的方向延伸的第二通孔。引用文献2公开了一种神经修复导 管及其制备方法，神经修复导管包括：内层和设于所述内层外壁的外层；所 述内层由胶原、壳聚糖及其衍生物中的一种或者多种复合材料制得，所述外 层由胶原、壳聚糖、丝素蛋白及其的生物中的一种或者多种复合材料制得。
但是，上述两种神经修复导管因不具导电性或导电性较差，无法在神经 修复过程中实施电信号传递以剌激和引导神经生长及轴突再生。神经修复后 虽然有大量再生神经纤维，但由于运动终板等靶器官因失去电剌激而萎缩， 功能恢复欠佳。
目前，大量的细胞和分子水平研究表明：通过具有电活性神经修复导管 的电剌激可改变细胞外基质分子的局域电场，增加细胞对细胞外基质中蛋白 的吸附和DNA的合成，从而促进神经细胞贴附、迁移和轴突生长。因而寻 找具有电活性的神经修复导管已成为神经组织工程研究的重要内容。但是， 现有技术中存在的神经修复导管在促进神经再生和神经修复导管在体内降 解不可兼得。
引用文献3公开了一种可生物吸收，可植入的无线刺激器，它结合了射 频功率采集器和与目标周围神经的电接口。无线刺激器包括一个环形天线， 该天线具有双层双线圈配置(Mg，～50μm厚)，带有一个聚乳酸-乙醇酸 (PLGA)介电中间层，一个基于掺杂硅的射频二极管纳米膜(～320nm厚)， 具有Mg(～300nm厚)的电极，以及在二氧化硅电介质(SiO2，～600nm 厚)上方和下方使用Mg导电平面(～50μm厚)的平行板电容器。但是该 无线刺激器虽然可以降解，但是它需要外加设备来为该无线刺激器提供能量， 造成很大不便。
引用文献4公开了一种多节传导神经支架，其通过消耗葡萄糖和氧气， 制备了具有自我供电的ES的多节传导神经支架。通过在细菌纤维素(BC) 的纳米纤维上原位聚合聚吡咯(PPy)来制备导电基底。将铂纳米颗粒电沉 积在正极侧进行葡萄糖氧化，而氮掺杂的碳纳米管(N-CNT)则负载在负极 侧以减少氧气。但是该多节传导神经支架中的葡萄糖电池与导电基底是结合 在一起的，而其导电基底不可完全降解，且需要二次手述取出，为患者带来 很大的不便。
引用文献
引用文献1：CN110584829A
引用文献2：CN105983136A
引用文献3：Wireless bioresorbable electronic system
enables sustained nonpharmacological neuroregenerative therapy,NatMed. 2018.
引用文献4：Enhanced Neurite Outgrowth on a Multiblock Conductive NerveScaffold with Self-Powered Electrical Stimulation,Adv.Healthcare Mater. 2019,8,1900127.
发明内容
发明要解决的问题
鉴于现有技术中存在的技术问题，例如：目前的神经修复导管大都不可 降解，不能起到一个稳定的电刺激作用，且结构复杂或机械性能较差等问题， 本发明首先提供了一种可降解自驱动神经修复导管。
本发明的神经修复导管的降解性能优异，且具有与神经组织相近的弹性 模量以及极佳的抗拉伸性能，并且其在神经修复、促进神经再生、促进神经 髓鞘化、促进细胞增殖以及神经功能恢复等方面均表现优异。
进一步地，本发明还提供了一种可降解自驱动神经修复导管的制备方法， 该制备方法的原料易于获取，制备方法简单易行。
用于解决问题的方案
[1]、一种可降解自驱动神经修复导管，其包括：
外层，所述外层具有多个微孔；
中间层，所述中间层的一面与所述外层相接触，且所述中间层的背离所 述外层的另一面设有第一电极和第二电极，所述第一电极和第二电极分别位 于所述神经修复导管的轴向两端部；以及
内层，所述内层与所述中间层的所述另一面的未设有所述第一电极和所 述第二电极的部分相接触，且所述内层由纤维丝交织而成。
[2]、根据上述[1]所述的可降解自驱动神经修复导管，其中，所述外层 的厚度为250μm～450μm，和/或，
所述微孔的平均孔径为20μm～40μm。
[3]、根据上述[1]或[2]所述的可降解自驱动神经修复导管，其中，所述 外层的材料为可降解的高分子材料，优选地，所述外层的材料为聚己内酯。
[4]、根据上述[1]-[3]任一项所述的可降解自驱动神经修复导管，其中， 所述中间层的厚度为200μm～400μm，和/或
所述中间层的材料为可降解的聚乳酸类共聚物，优选地，所述中间层的 材料为聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯共聚物。
[5]、根据上述[1]-[4]任一项所述的可降解自驱动神经修复导管，其中， 所述中间层的极限应变>150％，和/或，所述中间层的弹性模量为1MPa～2MPa。
[6]、根据上述[1]-[5]任一项所述的可降解自驱动神经修复导管，其中， 所述第一电极的厚度小于所述第二电极的厚度；和/或
所述第一电极和/或所述第二电极为金属电极；优选地，所述第一电极为 铁锰合金薄膜电极，所述第二电极为镁电极。
[7]、根据上述[1]-[6]任一项所述的可降解自驱动神经修复导管，其中， 所述内层的厚度为10μm～100μm；和/或
所述内层的材料为可降解的高分子材料，优选地，所述内层的材料为聚 己内酯。
[8]、一种根据上述[1]-[7]任一项所述的可降解自驱动神经修复导管的制 备方法，其包括将所述内层、中间层以及外层复合成型的步骤。
[9]、根据上述[8]所述的制备方法，其中，包括以下步骤：
将所述外层与所述中间层的一面进行粘附；
通过磁控溅射技术，在所述中间层的背离所述外层的另一面设置第一电 极和第二电极，并使所述第一电极和第二电极分别位于所述神经修复导管的 轴向两端部；
利用静电纺丝技术制备所述内层，并使所述内层与所述中间层的所述另 一面的未设有所述第一电极和所述第二电极的部分相接触。
[10]、根据上述[9]所述的制备方法，其中，通过将外层溶液和/或中间层 溶液滴涂在基材上以形成所述外层和/或所述中间层。
[11]、一种根据上述[1]-[7]任一项所述的可降解自驱动神经修复导管或者 上述[8]-[10]任一项所述的制备方法制备得到的可降解自驱动神经修复导管 在制备神经修复制品中的用途。
发明的效果
本发明的技术效果至少具备以下多项技术效果之一：
本发明的可降解自驱动神经修复导管具有与神经组织相近的弹性模量 以及极佳的抗拉伸性能且具有电池的放电性能，为神经组织与导管内壁之间 提供了理想的机械匹配界面。
本发明的可降解自驱动神经修复导管具有良好的定向引导作用，可以引 导神经细胞定向生长，从而促进神经修复。
本发明的可降解自驱动神经修复导管的降解性能优异。
本发明的可降解自驱动神经修复导管可以极大地促进神经再生以及雪 旺细胞的增殖。
本发明的可降解自驱动神经修复导管对髓鞘化的促进作用几乎可以比 肩于自体神经的髓鞘化。
本发明的可降解自驱动神经修复导管的神经功能的恢复情况优异，例如 促进神经控制的肌肉功能、运动功能的恢复等方面均表现优异，并且基本上 可以达到与自体神经移植后同样的水准。
附图说明
图1示出了本发明的可降解自驱动神经修复导管的示意图以及在大鼠中 的使用部位及使用部位的局部放大图。
图2示出了本发明的可降解自驱动神经修复导管的外层的经扫描电子显 微镜(SEM)照片。
图3示出了本发明的可降解自驱动神经修复导管的内层的扫描电子镜 (SEM)观察到的表面形貌；其中，图3中的a是内层的经扫描电子显微镜 (SEM)照片；图3中的b是大鼠背根神经节细胞(DRG)沿定向内层定向 生长的共聚焦照片。
图4示出了本发明可降解自驱动神经修复导管的制备过程示意图。
图5示出了本发明实施例1的外层、中间层以及外层和中间层的复合结 构的拉伸测试示意图。
图6示出了Mg-FeMn电池的放电情况示意图。其中，图6中的a和b 是电池在磷酸盐缓冲液中不同外载条件下的放电情况示意图；图6中的c是 可降解自驱动神经修复导管在动物体内的放电情况示意图。
图7示出了可降解自驱动神经修复导管在加速水解实验中不同阶段的照 片。
图8示出了有电刺激环境中和无电刺激环境(对照组)中大鼠背根神经 节细胞(DRG)的共聚焦照片。
图9示出了大鼠背根神经节细胞(DRG)在电刺激环境中随时间变化的 钙离子成像照片。
图10示出了有电刺激和无电刺激(对照组)条件下大鼠背根神经节细 胞(DRG)钙离子活动的量化统计示意图。
图11示出了电刺激组和对照组培养的雪旺细胞共聚焦照片。
图12示出了对照组、FeMn组、Mg组以及电刺激组的雪旺细胞数目的 量化统计示意图。
图13示出了通过酶联免疫吸附测定(ELISA)得到的电刺激组和对照 组的雪旺细胞NGF(大鼠神经生长因子)，BDNF(大鼠脑源性神经营养因 子)，CNTF(大鼠睫状神经营养因子)以及VEGF(大鼠血管内皮生长因子) 分泌总量的量化统计示意图。
图14示出了手术植入神经修复导管的照片。
图15示出了术后7天坐骨神经以及神经修复导管的磁共震(MRI)成 像。
图16示出了术后3周时电刺激组、空管对照组以及自体移植组的再生 神经组织横截面的免疫荧光染色图。
图17示出了使用微计算机断层扫描技术跟踪植入的神经修复导管的第 一电极和第二电极的降解情况示意图。
图18示出了电刺激组、空管对照组以及自体移植组的再生神经组织横 截面(1/2处)的免疫荧光染色以及扫描电子显微镜(SEM)照片。
图19示出了电刺激组、空管对照组以及自体移植组的轴突髓鞘化程度 (g-ratio)(以面积为基础)和轴突直径的统计图；其中，图19中的a为轴 突髓鞘化程度(g-ratio)量化统计图，图19中的b为轴突直径量化统计示意 图。
图20示出了电刺激组、空管对照组以及自体移植组的手术侧肌肉的动 作电位变化示意图。
图21示出了电刺激组、空管对照组以及自体移植组的手术侧肌肉动作 电位量化统计示意图；其中，图21中的a为动作电位波幅的量化统计示意 图；图21中的b为动作电位潜伏期的量化统计示意图)。
图22示出了电刺激组、空管对照组以及自体移植组的腓肠肌的超声弹 性的量化统计示意图。
图23示出了电刺激组、空管对照组以及自体移植组的手术侧与正常侧 肌肉照片以及手术侧肌肉横截面的马松(MASSON)三色法染色图；其中， 图22中的a，b，c分别为各实验组手术侧与正常侧肌肉照片，其中每个图 中左为正常侧，右为手术侧(植入侧)；图22中的d，e，f分别为各实验组 手术侧肌肉横截面的马松(MASSON)三色法染色图。
图24示出了电刺激组、空管对照组以及自体移植组的肌肉湿重比的量 化统计示意图。
图25示出了电刺激组、空管对照组以及自体移植组的肌肉纤维横截面 积的量化统计示意图。
图26示出了电刺激组、空管对照组以及自体移植组的SD鼠足底压力的 3D分布的示意图。
图27示出了电刺激组、空管对照组以及自体移植组的坐骨神经功能指 数(SFI)随时间变化的示意图。
具体实施方式
以下，针对本发明的内容进行详细说明。以下所记载的技术特征的说明 基于本发明的代表性的实施方案、具体例子而进行，但本发明不限定于这些 实施方案、具体例子。需要说明的是：
本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、 B的范围。
本说明书中，如没有特殊声明，则“多”、“多种”、“多个”等中的“多”表 示2或以上的数值。
本说明书中，所述“几乎”、“基本上”、“大体上”或“实质上”表示于相关 的完美标准或理论标准相比，误差在5％以下，或3％以下或1％以下。
本说明书中，如没有特别说明，则“％”均表示质量百分含量。
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某 种处理两方面的含义。
本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生 或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选 的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例 如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中， 并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理 解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
本说明书中，所述“水”包含去离子水、蒸馏水、离子交换水、双蒸水、 高纯水、纯净水等能够使用的任何可行的水。
本说明书中，所述“常温”的温度可以是10-40℃。
第一方面
如图1所示，本发明的第一方面提供了一种可降解自驱动神经修复导管， 其包括：
外层，所述外层具有多个微孔；
中间层，所述中间层的一面与所述外层相接触，且所述中间层的背离所 述外层的另一面设有第一电极和第二电极，所述第一电极和第二电极分别位 于所述神经修复导管的轴向两端部；以及
内层，所述内层与所述中间层的所述另一面的未设有所述第一电极和所 述第二电极的部分相接触，且所述内层由纤维丝交织而成。
本发明的可降解自驱动神经修复导管的降解性能优异，且具有与神经组 织相近的弹性模量以及极佳的抗拉伸性能，并且其在神经修复、促进神经再 生、促进神经髓鞘化、促进细胞增殖以及神经功能恢复等方面均表现优异。 具体而言：
<外层>
如图2所示，本发明的外层具有多个微孔，这些微孔有助于导管内外生 长物质的交换。具体地，所述微孔的平均孔径为20μm～40μm。为了使所述外 层的功能得到有效发挥，在本发明中，所述外层的厚度为250μm～450μm。
由于本发明的神经修复导管需要其自身具有降解性，因此，外层可以使 用可降解的高分子材料进行制备。对于外层具体所使用的材料，本发明不作 特别限定，可以是本领域常用的任何可行的可降解的高分子材料。作为优选， 所述外层的材料为聚己内酯(PCL)。
进一步，本发明的外层可以通过盐析法制备得到外层溶液，进而通过滴 涂的方式以制备所述外层。
<中间层>
本发明的中间层的一面与所述外层相接触，且所述中间层的背离所述外 层的另一面设有第一电极和第二电极，所述第一电极和第二电极分别位于所 述神经修复导管的轴向两端部。
在一些具体的实施方案中，为了使所述中间层的功能得到有效发挥，所 述中间层的厚度为200μm～400μm。
在本发明中，所述中间层的极限应变>150％，和/或，所述中间层的弹 性模量为1MPa～2MPa。因此，本发明的中间层具有与神经组织相近的弹性 模量以及极佳的抗拉伸性能，这为神经组织与神经修复导管内壁之间提供了 理想的机械匹配界面。
在一些具体的实施方案中，所述中间层的材料为聚乳酸类共聚物。考虑 到本发明的神经修复导管需要其自身具有降解性，因此，中间层应当使用可 降解的聚乳酸类共聚物进行制备。对于中间层具体所使用的材料，本发明不 作特别限定，可以是本领域常用的任何可行的可降解的聚乳酸类共聚物。
优选地，所述中间层的材料为聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯共聚物 (PLLA-PTMC)。具体地，对于聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯共聚物，其共聚 比例可以是50-70：30-50。
本发明通过设置第一电极和第二电极，使神经修复导管形成电池体系， 从而使本发明的神经修复导管可以长时间持续放电进行电刺激。
对于第一电极和第二电极的材料，为了方便制备，本发明的所述第一电 极和/或所述第二电极为金属电极。本发明对具体金属不作特别限定，可以是 本领域常用的任何可行的金属。优选地，所述第一电极为铁锰合金薄膜电极， 所述第二电极为镁电极。
在一些具体的实施方案中，当所述第一电极为铁锰合金薄膜电极，所述 第二电极为镁电极时，可以使所述第一电极的厚度小于所述第二电极的厚度， 这是因为铁锰合金降解速率慢，镁降解速率快，这样设计尽可能保证在镁电 极降解后铁锰合金也可以同一时间降解。具体地，可根据所要求的降解时间 确定厚度，举例而言，所述第一电极的厚度为0.5～2.5μm，所述第二电极的 厚度为2.5～4.5μm。
在一些具体的实施方案中，本发明通过磁控溅射技术制备所述第一电极 和/或第二电极。
磁控溅射的工作原理是指电子在电场E的作用下，在飞向基片过程中与 氩原子发生碰撞，使其电离产生出Ar正离子和新的电子；新电子飞向基片， Ar离子在电场作用下加速飞向阴极靶，并以高能量轰击靶表面，使靶材发生 溅射。在溅射粒子中，中性的靶原子或分子沉积在基片上形成薄膜。
本发明的磁控溅射过程中，工艺参数会对磁控溅射得到的内层产生影响， 通过控制工艺参数，可以制备获得不同尺寸、形态和不同结构的第一电极和 第二电极。本发明对于磁控溅射的方式没有特别的要求，可以是本领域中常 用的磁控溅射方式。
内层
本发明的所述内层与所述中间层的所述另一面的未设有所述第一电极 和所述第二电极的部分相接触，且所述内层由纤维丝交织而成。其结构如图 3所示，由图3中的a可以看出，本发明的内层具有良好的方向性，是定向排 布的。另外，定向排布的内层可以引导神经细胞定向生长，具体如图3中的b 所示，从而可以促进神经修复，其中，图3中的b是在共聚焦荧光显微镜下拍 照得到的。
在一些具体的实施方案中，使用静电纺丝方法制备得到所述内层。静电 纺丝的原理是在静电纺丝过程中，对聚合物液体施加高电压，使电荷引入液 体。当液体中的电荷聚集到一定量的时候，液体会在喷头形成泰勒锥，在外 加电场力的作用下克服表面张力形成液体射流，然后射流在静电斥力、库伦 力(Coulomb)和表面张力的共同作用下，聚合物射流沿不规则螺旋状轨迹 运动。射流在极短时间内被牵引拉伸，随着溶剂挥发或者热量散失，聚合物 射流固化形成微米/纳米纤维。静电纺丝过程中，很多参数会对最终静电纺丝 纤维产生影响，通过控制过程参数，可以制备获得不同尺寸、形态和不同结 构的微米/纳米纤维。
本发明的静电纺丝过程中，工艺参数会对静电纺丝得到的内层产生影响， 通过控制工艺参数，可以制备获得不同尺寸、形态和不同结构的内层。本发 明对于静电纺丝的方式没有特别的要求，可以是本领域中常用的静电纺丝方 式。具体而言，本发明将可降解的高分子材料溶于合适的溶剂中，制备可降 解的高分子材料的纺丝原液；然后采用静电纺丝将纺丝原液纺制成由纤维丝 交织而成的内层，所述内层也具有多孔结构，适宜神经细胞生长。
对于纤维丝的直径，在本发明中，所述纤维丝的直径可以为200nm～4μm。 进一步地，为了使本发明的内层的功能得到更有效的发挥，所述内层的厚度 为10μm～100μm。
进一步，本发明的神经修复导管需要其自身具有降解性，因此，内层可 以使用可降解的高分子材料进行制备，所述内层的材料与所述外层的材料可 以相同，也可以不同。对于内层具体所使用的材料，本发明不作特别限定， 可以是本领域常用的任何可行的可降解的高分子材料。作为优选，所述内层 的材料为聚己内酯。
第二方面
本发明的第二方面提供了一种第一方面的可降解自驱动神经修复导管 的制备方法，其包括将所述内层、中间层以及外层复合成型的步骤。
具体地，所述制备方法包括以下步骤：
将所述外层与所述中间层的一面进行粘附；
通过磁控溅射技术，在所述中间层的背离所述外层的另一面设置第一电 极和第二电极，并使所述第一电极和第二电极分别位于所述神经修复导管的 轴向两端部；
利用静电纺丝技术制备内层，并使所述内层与所述中间层的所述另一面 的未设有所述第一电极和所述第二电极的部分相接触。
在一些具体的实施方案中，将所述外层与所述中间层的一面进行粘附， 可以使用可降解的胶粘剂将所述外层与所述中间层的一面进行粘附，但是本 领域中，有一部分可降解的聚乳酸类共聚物自身是具有粘附性的，则如使用 自身具有粘附性的聚乳酸类共聚物，则外层与中间层的粘附可以是利用中间 层自身的粘附性粘附在一起的，例如：聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯共聚物等。
对于外层，通过盐析法制备所述外层溶液，进而通过滴涂的方式以制备 所述外层。
具体地，对于盐析，所述盐析法的制备外层溶液的步骤包括：将可降解 的高分子材料、金属盐与溶剂混合的步骤，以获得盐析液，即外层溶液；其 中，金属盐可以是氯化钠、氯化钾等，溶剂可以是含酰胺类化合物，例如： N-N二甲基酰胺等。在混合的过程中，可以适当进行加热，加热的温度一般 是40-50℃。另外，可以使用机械搅拌的方式以加快混合，或使混合的更加 均匀，搅拌的时间可以是1-4h。其中，所述可降解的高分子材料为第一方面所述的适用于外层的可降解的高分子材料。
进一步地，本发明制备所述外层溶液中所使用可降解的高分子材料、金 属盐以及溶剂的量不作特别限定，只要能够获得外层即可。
对于滴涂，是通过将盐析液滴涂在基材上，以形成所述外层。其中，基 材的表面光滑且几乎没有任何缺陷的，例如：玻璃片或表面皿等。待盐析液 晾干成膜后，将膜片从基材上取下，然后浸泡在水中，浸泡的时间可以是 10-30min。
对于中间层的制备，也可以是通过将中间层溶液滴涂在基材上以形成所 述中间层。所述基材是表面光滑且没有任何缺陷的，例如可以是玻璃片、表 面皿等。
具体地，所述中间层的制备方法可以包括以下步骤：将可降解的聚乳酸 类共聚物溶于溶剂中，配制可降解的聚乳酸类共聚物的质量分数为1-20％的 前体溶液，即中间层溶液，然后将前体溶液滴涂在基材上，等待干燥凝固成 膜。另外，为了更有利于得到性能优异的中间层，可以将前体溶液置于3-6℃ 的温度下保存20min以上，然后再将冷藏后的前体溶液滴涂在基材上，等待 干燥凝固成膜。
对于溶剂，可以是本领域常用的溶剂，例如三氯甲烷等。另外，为了加 速溶解，可以采用机械搅拌的方式辅助溶解，搅拌时间可以为1-2h等。另 外，为了防止被污染等，搅拌应当是在密封的环境下进行。
本发明利用磁控溅射技术制备第一电极和第二电极。对于第一电极和第 二电极，均可以使用掩模版在中间层上进行磁控溅射。其中，对于第一电极， 其磁控溅射的条件可以为：沉积速率为
Figure BDA0002586117310000141
电压为320～360V，电 流0.05～0.5A。对于第二电极，磁控溅射的条件为，溅射电压为250-310V， 工作电流为0.01-0.3A，溅射速率即沉积速率为
Figure BDA0002586117310000142
本发明采用静电纺丝技术制备所述内层。在静电纺丝步骤中，将可降解 的高分子材料溶于合适的溶剂中，制备可降解的高分子材料的纺丝原液；其 中，所述可降解的高分子材料可以为第一方面中的适用于内层的可降解的高 分子材料。对于形成溶液的溶剂种类的具体浓度没有特别的限定，只要能够 满足后续静电纺丝工艺的要求即可。举例而言，合适的溶剂可以为三氟乙醇、 六氟异丙醇、三氟乙酸、环己酮、丙酮、丁酮、四氢呋喃中的一种或两种以 上的组合。具体地，纺丝原液中，可降解的高分子材料的质量分数可以是 5-10％。
静电纺丝过程中可以通过调节纺丝参数制备所需的内层。例如电压、注 射器推进速度和接收器转速、纺丝环境等。优选地，本发明中所述静电纺丝 工艺参数可以为：电压为10～20kV，注射器推进速度为0.01～5mm/min，接 收器转速为700～1000rpm，环境温度一般为10～40℃，例如常温即可。
最后，将制备好的含内层、中间层以及外层的2D平面结构卷曲成3D 管状结构，得到本发明的可降解自驱动神经修复导管。
第三方面
本发明的第三方面提供了一种本发明的第一方面的可降解自驱动神经 修复导管以及第二方面的制备方法制备得到的可降解自驱动神经修复导管 在制备神经修复制品中的用途。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术 人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范 围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。
实施例1
本发明的制备过程具体如图4所示，具体包括以下步骤：
外层制备：将1.5g的聚己内酯(PCL)，0.375g的NaCl，10mL的N-N 二甲基酰胺混合，加热至45℃搅拌2.5h，接着将溶液利用滴涂的方法滴在玻 璃表面，待溶液晾干成膜后，将薄膜浸泡在去离子水中，浸泡20min后得 到外层薄膜，其厚度约为350μm。
中间层制备：聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯共聚物(PLLA-PTMC)，其中， 聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯共聚物溶液配制：聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯共聚 物的共聚比例为60：40，溶剂为三氯甲烷，配制质量分数为10％的溶液， 密封搅拌1.5h溶解后，放入4℃的冰箱保存20mins以上再使用。利用滴管 吸取4mL该溶液，滴涂到载玻片上等待干燥凝固成膜。得到中间层薄膜， 其厚度约为300μm。
电极制备：两层薄膜通过聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯共聚物自身具有的 粘性粘附在一起以后，使用掩模板在中间层上进行磁控溅射，在中间层的两 端分别制备FeMn合金薄膜电极(厚度约为1.5μm)以及Mg薄膜电极(厚 度约为3.5μm)作为金属电极；其中，Mg薄膜电极(第二电极)的溅射参 数为：沉积速率为
Figure BDA0002586117310000151
溅射电压为280V，工作电流为0.16A；FeMn合 金薄膜电极(第一电极)的溅射参数为：沉积速率为
Figure BDA0002586117310000152
溅射电压为 340V，工作电流为0.3A。
内层制备：在溅射金属电极的一面利用静电纺丝技术制备内层，即定向 聚己内酯薄膜(厚度约为30μm)。其中，静电纺丝的步骤为：使用质量分 数为7％的PCL溶液，其中，六氟异丙醇作为溶剂。将PCL溶液吸入注射器 中，然后在常温下进行静电纺丝。其中，静电纺丝参数：电压15kV，注射 器推进速度0.3mm/min，接收器的转速850rpm。
最后，将制备好的含内层、中间层以及外层的2D平面结构卷曲成3D 管状结构，得到本发明的可降解自驱动神经修复导管。
性能测试
I、拉伸强度测试
检测方法：使用拉伸测试机，样品尺寸：10*0.35*50mm，拉伸应变速 率：0.002s-1，测试结果如图5所示：
由图5可以看出，实施例1中的聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯共聚物 (PLLA-PTMC)具有与神经组织相近的弹性模量以及极佳的抗拉伸性能 (1.45±0.27MPa，极限应变>150％)，这为神经组织与导管内壁之间提供了 理想的机械匹配界面。
II、放电测试
通过磁控溅射在PET基底上溅射厚度为3.5μm的Mg薄膜电极，厚度为 1.5μm的FeMn电极，在电极表面封装厚度为50μm的聚乳酸-聚三亚甲基碳 酸酯共聚物(PLLA-PTMC)，两个电极表面积都是1cm2，以细胞培养液(1640 Medium)为电解质溶液进行电池测试，以体现Mg-FeMn电池的放电情况。 其中，磁控溅射的条件与实施例1完全相同。测试结果如图6中的a和b所 示：
图6中的a和图6中的b给出了Mg-FeMn电池在具有恒定外部载荷的 磷酸盐缓冲液(PBS)中的体外放电情况。结果表明，外部电阻的增加导致 电压升高，而输出电流降低，并且在10000欧姆的外部负载下观测到持续约 13.6小时的长时间放电，证明两侧的金属薄膜电极可以长时间持续放电进行 电刺激。
另外，为了进一步体现本发明的可降解自驱动神经修复导管中电池的放 电情况，将实施例1制备得到的可降解自驱动神经修复导管植入大鼠神经截 断部位后，每天定时对其进行电学性能的测试，实验结果表明(如图6中的 c所示)，在可降解自驱动神经修复导管植入的前两天，神经修复导管内的 Mg-FeMn电池会长时间保持一个稳定的电压，但是其电压会缓慢下降，最 终在第三天电压逐渐降到0，说明这一导管在植入初期会有一个比较稳定的 电刺激作用。
III、加速水解实验
为了评估可降解自驱动神经修复导管的降解特性，我们将可降解自驱动 神经修复导管置于PBS溶液中(pH＝7.4，60℃)进行了加速水解实验，并 记录下了各阶段神经修复导管的水解状况，结果如图7所示。
由图7可以看出，Mg薄膜电极在1天以后就完全消失，紧接着FeMn 电极在34天后消失，而剩余的可降解的高分子材料和聚乳酸类共聚物则在 56天以后完全水解。
IV、体外细胞实验
本发明的体外细胞实验是为了体现本发明的可降解自驱动神经修复导 管中的Mg-FeMn电池的电刺激作用。具体地，在玻璃培养皿上通过磁控溅 射制备了厚度为3.5μm的Mg薄膜电极和厚度为1.5μm的FeMn电极，以形 成Mg-FeMn电池，两个电极表面积都是1mm2，记作电刺激组。并且以空白 培养皿(记作：对照组)、同等条件下仅溅射Mg薄膜电极(记作：Mg组)、 同等条件下仅溅射FeMn电极(记作：FeMn组)作为对照；其中，磁控溅 射的条件与实施例1完全相同。
在电池两个电极之间分别培养大鼠背根神经节细胞(DRG)以及雪旺细胞， 以此来模拟体内电刺激神经生长过程。具体培养步骤为：将大鼠背根神经节 细胞在这些培养皿中恒温培养7天(5％CO2，37℃)。
大鼠背根神经节细胞经过7天培养以后，得到如图8所示结果。从DRG 生长状况可以发现电刺激作用极大地促进了大鼠背根神经节细胞的生长，电 刺激下的轴突长度远大于对照组大鼠背根神经节细胞的轴突长度，并且电刺 激使得大鼠背根神经节细胞轴突沿电场方向定向生长，说明电刺激在神经生 长过程中起到了十分重要的促进作用。电场对神经细胞的刺激可以通过钙离 子成像来展示。
图9所示的电场作用下的钙离子成像清晰地反映了大鼠背根神经节细胞 在电刺激作用下具有很强的兴奋性。
对钙离子活动进行量化后，可以获得钙离子信号数目，通过电刺激组与 对照组的比较可以得出，电刺激组的钙离子活性远高于对照组(如图10所 示)。
对于雪旺细胞来说，电刺激则能显著促进雪旺细胞快速增殖(如图11 所示)，由图11可以看出，电刺激组的雪旺细胞数目远高于对照组。这一点 在对雪旺细胞数目进行量化后可以得到更显著的结论(如图12所示)，由图 12可以看出，电刺激的雪旺细胞数目高于Mg组、FeMn组以及对照组。
并且，对雪旺细胞培养液上清液进行酶联免疫吸附测定(ELISA)，能 够统计得到上清液中神经生长因子(NGF)，脑源性神经营养因子(BDNF)， 睫状神经营养因子(CNTF)和血管内皮生长因子(VEGF)这四种神经营养 因子的总含量，具体如图13所示。由图13可以看出，由于电刺激对雪旺细 胞增殖的促进作用，电刺激作用下雪旺细胞分泌的四种神经营养因子均远高 于对照组中雪旺细胞的分泌量。
V、体内动物实验
在大鼠的坐骨神经截取10mm长的神经截段，然后将该神经修复导管 (记作电刺激组)、空管对照组(其制备方法同实施例1，仅仅是不含有第一 电极和第二电极)以及自体神经(记作自体神经组)分别缝合在多只大鼠的 神经截断处(如图14所示)，对比神经修复状况，其中，图14中未提供空 管对照组的植入照片，其从照片上看，与电刺激组和自体神经组的植入情况 大致相同。并且在神经修复过程中，我们定时利用磁共振成像(MRI)来观 测植入部位，结果如图15所示。
根据图15所示，MRI可以清晰地显示坐骨神经以及植入神经修复导管 的位置，并且观测到在刚植入时导管内有组织液的聚集，图中没有图像失真 表明神经修复导管中Mg薄膜电极和FeMn薄膜电极的磁化率很低。为了评 估神经再生状况，每3周进行一次取材，截取截断部位的横截面，比较横截 面内轴突和雪旺细胞的面积。
图16是术后3周时的再生神经组织横截面的免疫荧光染色图，如图16 所示，电刺激作用下的神经截断面的轴突和雪旺细胞面积远大于空管对照组 的面积，并且电刺激组的神经生长状况基本接近于自体神经(神经再生领域 的黄金标准)的生长状况。由此可见，电刺激可以极大地促进神经再生以及 雪旺细胞的增殖。
同时我们以微计算机断层扫描技术(Micro-CT)作为辅助检测，用来进 行神经再生状况的评估以及跟踪植入神经修复导管的第一电极和第二电极 的降解情况。如图17所示，Micro-CT可以准确地捕捉植入神经修复导管以 及FeMn薄膜电极、Mg薄膜电极的位置。
接下来，在12周生长后，通过免疫荧光染色和透射电镜技术评估神经 再生状况。图18展示了在神经再生部位(1/2处)横截面的免疫荧光染色以 及透射电镜的照片。接着，对其中观察到的髓鞘，轴突进行了量化统计，得 到轴突髓鞘化程度(g-ratio)(以面积为基础)和轴突直径的统计图，如图 19所示。
由图19可以看出，统计发现，对于轴突髓鞘化程度(g-ratio)，电刺激 组与自体神经组几乎没有统计学差异，而这两组均远优于空管对照组。自体 神经组平均轴突直径略大于电刺激组，但是电刺激组的平均直径仍远大于空 管对照组(p<0.01)。由此可见，电刺激对于神经髓鞘化也有明显的促进作 用，在以轴突髓鞘化程度(g-ratio)为检测指标时，电刺激对髓鞘化的促进 作用几乎可以比肩于自体神经的髓鞘化。
VI、大鼠神经功能恢复的评估
延续上述体内动物实验继续进行大鼠神经功能恢复的评估。神经功能的 恢复是评价神经再生状况的关键指标，所以本发明通过电生理评估，肌肉分 析以及步态分析三项研究对神经功能的恢复进行了评价。
VI-1、电生理评估
电生理评估是对神经传导性恢复的评估，测试方法是刺激手术侧坐骨神 经近端，然后在相连接的腓肠肌上记录其动作电位(CMAP)，得到如图20 所示的电位变化，其中，测试条件为脉冲电流：3.0mA,1Hz；在神经截断 部位的近端与远端分别刺激。
然后对这些电位变化做了定量统计(如图21所示)，尽管统计显示在信 号延时上电刺激组、空管对照组以及自体移植组的差距几乎没有，但是电位 的峰值仍差距很大，除自体神经组之外，电刺激组依然远优于空管对照组 (p<0.01)。
VI-2、肌肉分析
在坐骨神经被截断后，由于肌肉失去了神经的控制，会导致肌肉发生萎 缩，如果神经再生状况差，肌肉萎缩会更为严重，因此，手术侧肌肉萎缩程 度(这里的手术侧是指植入神经导管的部位，即：右后侧大腿坐骨神经处) 的评估是神经功能恢复状态的重要指标之一。具体的手术过程为：在大鼠右 后侧大腿切开皮肤，分离肌肉，使坐骨神经暴露出来，然后截取10mm，之 后将导管缝合在截断部位两侧。肌肉萎缩程度主要通过肌肉超声分析，肌肉 湿重测量，肌肉横截面马松(MASSON)三色染色来评估。
图22是肌肉超声分析得到的腓肠肌肉的超声弹性量化统计图，由图22 可以看出，电刺激组的肌肉弹性远小于空管对照组(p<0.01)，略微高于自 体神经移植组(p<0.05)。
图23示出了电刺激组、空管对照组以及自体移植组的手术侧与正常侧 肌肉照片以及手术侧肌肉横截面的马松(MASSON)三色法染色图；其中， 图22中的a，b，c分别为各实验组手术侧与正常侧肌肉照片，其中每个图 中左为正常侧，右为手术侧(植入侧)；图23中的d、e、f同时给出了自体 移植组、空管对照组以及电刺激组的肌肉横截面马松(MASSON)三色染色 后的结果，由图23可以看出，在电刺激组和自体神经移植组肌肉胶原纤维 明显更少，而横断面肌肉胶原纤维的面积更大，这说明这两组肌肉受到了更 好的神经调控与控制。
将不同实验组的腓肠肌进行湿重对比，结果显示电刺激组和自体移植组 肌肉的重量远高于空管对照组(如图24所示)。
对其中的肌肉纤维的横截面积进行量化分析以后(如图25所示)，结果 显示，尽管自体移植组肌肉纤维的横截面积略高于电刺激组，但是电刺激组 仍远高于空管对照组(p<0.01)。而这些神经功能恢复评估的结果，进一步 论证了我们的可降解自驱动神经修复导管可以极大地促进神经再生，同时促 进神经控制的肌肉功能的恢复。
VI-3、步态分析
为了评估神经再生过程中运动功能的恢复情况，还在与体内动物实验相 同的位置手术植入神经修复导管以后利用动物步态分析系统(CATWALK) 每两周进行一次步态分析。
图26展示了植入后12周获得的左后肢和右后肢(手术侧)的3D足底 压力分布。结果表明，电刺激组的脚印面积和足底压力分布均与自体移植组 相当。坐骨神经功能指数(SFI)的统计结果(一种坐骨神经功能的量度) 是通过四个不同的足迹参数计算得出的，SFI值接近0表示运动功能正常， 而SFI值接近-100表示严重功能障碍。
如图27所示，自体移植组、空管对照组以及电刺激组的坐骨神经功能 指数(SFI)在植入后最初4周均呈现下降趋势，这是由于坐骨神经截断引 起的运动功能受损，其后坐骨神经功能指数数值随时间呈上升趋势，表明4 周开始后，运动功能逐步恢复。在第2周到第4周各组SFI数值基本接近， 在4周以后，电刺激组与自体神经移植组基本接近，并且远高于空白对照组 (p<0.01)。这一结果说明我们的可降解自驱动神经修复导管可以显著促进运动功能的恢复，并且使其达到与自体神经移植后同样的水准。
产业上的可利用性
本发明的可降解自驱动神经修复导管能够在工业上被制备，且能够用于 制备神经修复制品。
需要说明的是，尽管以具体实例介绍了本发明的技术方案，但本领域技 术人员能够理解，本发明应不限于此。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性 的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和 精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显 而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际 应用或对市场中的技术改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解 本文披露的各实施例。

Claims (14)

1.一种可降解自驱动神经修复导管，其特征在于，包括：
外层，所述外层具有多个微孔；
中间层，所述中间层的一面与所述外层相接触，且所述中间层的背离所述外层的另一面设有第一电极和第二电极，所述第一电极和第二电极分别位于所述神经修复导管的轴向两端部；以及
内层，所述内层与所述中间层的所述另一面的未设有所述第一电极和所述第二电极的部分相接触，且所述内层由纤维丝交织而成；
所述第一电极为铁锰合金薄膜电极，所述第二电极为镁电极。
2.根据权利要求1所述的可降解自驱动神经修复导管，其特征在于，所述外层的厚度为250μm～450μm，和/或，
所述微孔的平均孔径为20μm～40μm。
3.根据权利要求1或2所述的可降解自驱动神经修复导管，其特征在于，所述外层的材料为可降解的高分子材料。
4.根据权利要求3所述的可降解自驱动神经修复导管，其特征在于，所述外层的材料为聚己内酯。
5.根据权利要求1或2所述的可降解自驱动神经修复导管，其特征在于，所述中间层的厚度为200μm～400μm，和/或
所述中间层的材料为可降解的聚乳酸类共聚物。
6.根据权利要求5的可降解自驱动神经修复导管，其特征在于，所述中间层的材料为聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯共聚物。
7.根据权利要求1或2所述的可降解自驱动神经修复导管，其特征在于，所述中间层的极限应变>150％，和/或，所述中间层的弹性模量为1MPa～2MPa。
8.根据权利要求1或2所述的可降解自驱动神经修复导管，其特征在于，所述第一电极的厚度小于所述第二电极的厚度。
9.根据权利要求1或2所述的可降解自驱动神经修复导管，其特征在于，所述内层的厚度为10μm～100μm；和/或
所述内层的材料为可降解的高分子材料。
10.根据权利要求9所述的可降解自驱动神经修复导管，其特征在于，所述内层的材料为聚己内酯。
11.一种根据权利要求1-10任一项所述的可降解自驱动神经修复导管的制备方法，其特征在于，包括将所述内层、中间层以及外层复合成型的步骤。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所述外层与所述中间层的一面进行粘附；
通过磁控溅射技术，在所述中间层的背离所述外层的另一面设置第一电极和第二电极，并使所述第一电极和第二电极分别位于所述神经修复导管的轴向两端部；
利用静电纺丝技术制备所述内层，并使所述内层与所述中间层的所述另一面的未设有所述第一电极和所述第二电极的部分相接触。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，通过将外层溶液和/或中间层溶液滴涂在基材上以形成所述外层和/或所述中间层。
14.一种根据权利要求1-10任一项所述的可降解自驱动神经修复导管或者权利要求11-13任一项所述的制备方法制备得到的可降解自驱动神经修复导管在制备神经修复制品中的用途。
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