CN114569790B - 具有促内皮化及抗凝双功能的人工血管及制备方法、用途 - Google Patents

具有促内皮化及抗凝双功能的人工血管及制备方法、用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种人工血管，具体涉及一种具有促内皮化及抗凝双功能的人工血管及制备方法、用途。该人工血管将RGD‑pH响应二氧化硅载药纳米粒负载于人工血管内层外壁，能够在人体血液正常pH下实现药物的缓慢稳定释放，同时RGD多肽可诱导内皮细胞有序生长，二氧化硅纳米粒也可体内降解，有益于自体血管再生；负载的抗凝血药物能够长效预防人工血管内血栓形成，提升人工血管的血液相容性。

Description

具有促内皮化及抗凝双功能的人工血管及制备方法、用途
技术领域
本发明提供一种人工血管，具体涉及一种具有促内皮化与抗凝双功能的人工血管及制备方法、用途，特别的是，该人工血管负载RGD多肽修饰的pH响应型纳米粒，内包裹抗凝药物利伐沙班，实现其双功能。
背景技术
据资料显示，心血管疾病是在世界范围内高发且高致死率的疾病之一；随着居民生活水平提高和生活节奏加快，其心血管疾病发生率亦呈上升状态。在心血管疾病的临床治疗中，组织工程移植物手术治疗，是一种普遍又有效的治疗手段；针对无法完成自体血管移植的患者，人工血管移植是一种重要的替代方案。
目前，管内内膜增生、血栓多发、移植物易感染和力学性能仿真差异大，是人工血管方面的突出问题。在人工血管移植领域，小口径(≤6mm)动脉血管的仿生制造，一直是研究的重点和热点，而小口径人工血管抗血栓，是亟待解决的问题。目前并没有阻止人工血管发生血栓的有效途径，用药物减少血栓发生的方法多是在人工血管内壁粘涂抗凝药或者直接在人工血管材料中包裹抗凝药。但在人工血管内壁粘涂的抗凝药，一次释放，预防血栓发生的周期较短；将抗凝药物包裹在人工血管材料中，需要考虑的因素比较多，往往降低了人工血管的力学性能。
现在制备人工血管所用的材料，也暴露出了明显的性能差异。比如聚乳酸、聚己内酯是人工合成的高分子生化材料，虽然其力学性能优异、可体内降解，但生物相容性明显低于天然生物材料。
因此，研究一种力学性能佳、生物相容性高且能有效延缓血栓发生周期的人工血管具有重要的意义。
发明内容
鉴于以上技术问题，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种具有促内皮化与抗凝双功能的的人工血管的制备方法，包括以下步骤：
S1、将重组蛛丝蛋白的甲酸溶液与聚己内脂混合，得到内层纺丝液；
将重组蛛丝蛋白的甲酸溶液与聚乳酸混合，得到外层纺丝液；
所述重组蛛丝蛋白与所述聚己内脂的质量比为1∶15-35；
所述重组蛛丝蛋白与所述聚乳酸的质量比为1∶18-30；
S2、以所述内层纺丝液为原料，利用静电纺丝法制得人工血管内层；
S3、在所述人工血管内层的外表面涂覆厚度为0.025mm-0.05mm聚多巴胺层，按0.5-1.5*10-3μg/cm3的量继续在聚多巴胺层的上表面粘附RGD-pH响应型二氧化硅载药纳米粒，即得负载有二氧化硅载药纳米粒的人工血管内层；其中，所述RGD-pH响应型二氧化硅载药纳米粒上负载的药物为抗凝药物；
S4、利用静电纺丝法向S3制得的负载有二氧化硅载药纳米粒的人工血管内层的外表面粘附所述外层纺丝液，即得具有促内皮化及抗凝双功能的人工血管。
优选地，所述RGD-pH响应型二氧化硅载药纳米粒是按照以下步骤制备得到：
S31、将介孔二氧化硅纳米粒子在水中分散，加入抗凝药物，得到的混合液离心，取沉淀依次清洗、干燥，得到负载药物的介孔二氧化硅纳米粒子；
S32、将所述负载药物的介孔二氧化硅纳米粒子与盐酸多巴胺置于缓冲液中，常温下暗搅拌24h，离心，取沉淀依次清洗、干燥，得中间产物A；
S33、将聚(2-乙基-2-噁唑啉)与所述中间产物A置于缓冲液中，常温搅拌5-6h后，离心，取沉淀依次清洗、干燥，得到中间产物B；
S34、将精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽与所述中间产物B置于缓冲液中，搅拌2-4h，离心，取沉淀依次清洗、干燥，即得RGD-pH响应型二氧化硅载药纳米粒。
优选地，
S31中，所述介孔二氧化硅纳米粒子与所述抗凝药物的质量比为9∶4-6，所述离心是在15000r·min-1下离心15min，
S32中，所述负载药物的介孔二氧化硅纳米粒子与盐酸多巴胺的质量比为3∶1-2，所述离心是在15000r·min-1下离心7min；
S33中，所述聚(2-乙基-2-噁唑啉)与所述中间产物A的质量比为4-6∶9，所述离心是在10000r·min-1下离心10min；
S34中，所述精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽与所述中间产物B的质量比为4-6∶9，所述离心是在10000r·min-1下离心10min。
优选地，S2及S4中，所述静电纺丝过程中电纺参数设置为：电压18-22kV、固化距离15cm、挤出速度1-2mL/h、转轴直径1.2mm、温度为22-30℃、相对湿度为50％；
所述静电纺丝法的具体操作过程为：
人工血管内层制备：将所述内层纺丝液注入装有针头的注射器中，针与高电压电源的正极连接，在距针尖15cm处垂直放置轴式收集器，再以针尖所在平面为基准，将轴式收集器绕着针尖顺时针倾斜45-55°，并以2500-3500r/min旋转；待所述内层纺丝液均匀沉积在轴式收集器的旋转芯轴上后，再以针尖所在平面为基准，将轴式收集器绕着针尖逆时针倾斜45-55°；重复上述操作，待所述内层纺丝液均匀沉淀在旋转芯轴上后，即得人工血管内层；
人工血管的制备：将所述外层纺丝液注入装有针头的注射器中，针与高电压电源的正极连接，在距针尖15cm处垂直放置轴式收集器，并使轴式收集器以2500-3500r/min旋转，待外层纺丝液均匀沉淀在所述人工血管内层的外周，即得所述人工血管。
优选地，所述抗凝血药物为利伐沙班。
本发明第二个目的是提供一种根据上述任一项方法制备得到的人工血管。
本发明第三个目的是提供一种所述人工血管在促内皮化中的用途。
本发明第三个目的是提供一种所述人工血管在延缓人工血管血栓出现时限中的用途。
对比现有技术，本发明的有益效果为：
1、本发明提供的人工血管，将经RGD肽段修饰的pH响应二氧化硅纳米粒负载于人工血管内层外壁上，RGD多肽可诱导内皮细胞有序增殖，利于人工血管形成天然的抗血栓保护层，且二氧化硅纳米粒也可体内降解，不会阻碍自体血管再生；该人工血管负载RGD肽段修饰的pH响应二氧化硅纳米粒，包裹抗凝血药物利伐沙班时，在人体血液正常pH下可以实现药物的稳定缓释，避免一次释药问题，能够更长效预防人工血管内血栓形成，延缓人工血管血栓出现时限。本发明制备的人工血管，负载RGD多肽修饰的pH响应型纳米粒子(包裹抗血栓药物利伐沙班)，实现了促内皮化和抗凝双功能。
2、蛛丝蛋白纤维自天然蛛丝蛋白中提取而来，具有优良的弹性和生物相容性。聚乳酸、聚己内酯和蛛丝蛋白按比例混合后作为人工血管主体材料，弥补了人工高分子材料的不足，在保证其生物力学性能的同时，提高了人工血管的组织相容性，其组织相容性也更趋近于人体自身血管。
3、将包裹抗凝血药物的RGD肽段修饰的pH响应二氧化硅纳米载体粘附于以聚己内酯和蛛丝蛋白复合材料制成的人工血管内层外表面、聚乳酸和蛛丝蛋白制成的人工血管外管壁内表面，不会对人工血管的力学性能造成不利影响，不仅具有优良的力学性能和组织相容性，还可以促进血管内皮细胞定向生长，长期预防管内血栓形成。
4、本发明提供的人工血管，可选择具有良好生物相容性并且能够包裹于RGD多肽修饰的pH响应二氧化硅纳米粒中的药物，发挥该药物相应的治疗效果，应用广泛。
5、本发明所用材料种类少，体内可降解，且材料和药物普遍易得。
6、采用静电纺丝技术，方便易成型，安全无污染，也易于放大生产。
附图说明
图1是本发明实施例制备得到的人工血管的结构示意图；
图2是本发明实施例制备得到的人工血管与普通人工血管的血液相容性体外实验结果图；A、APTT；B、TT；C、HR；D、PRT；
图3是本发明实施例制备得到的人工血管与普通人工血管移植动物体内后的内皮化免疫荧光图；A、修饰组；B、普通组。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
一种具有促内皮化与抗凝双功能的的人工血管，是按照以下步骤制备得到的：
S1、静电纺丝液的制备：
内层纺丝液：分别称取0.04g pNSR16(重组蛛丝蛋白)、0.96g PCL(聚己内脂)，以98％甲酸为溶剂，配制pNSR16与PCL质量比为4∶96的混合电纺溶液作为内层纺丝液；
外层纺丝液：分别称取0.05g pNSR16、0.95g PLA(聚乳酸)，以98％甲酸为溶剂，配制pNSR16与PLA质量比为5∶95的混合电纺溶液作为外层纺丝液；
S2、人工血管内层的制备
静电纺丝时，将内层纺丝液装入装有10号针头的10mL注射器中，使用注射器泵以0.03mL/min流速注入，针被连接到一个高电压电源的正极，并安装在一个平行板的中心，接地芯轴式收集器(OD＝3.8mm，L＝15厘米)垂直放置在距针尖约15厘米处，而后以针尖所在平面为基准，将轴式收集器绕着针尖顺时针倾斜50°，并以3000r·min-1旋转。在静电纺丝过程中，电纺参数设置为：电压18kV、固化距离15cm、挤出速度1mL/h、转轴直径1.2mm、温度为30℃、相对湿度为50％，待内层纺丝纤维均匀沉积在旋转芯轴上后，再以针尖所在平面为基准，将轴式收集器绕着针尖逆时针倾斜50°。重复上述操作，待内层纺丝纤维再次均匀沉淀在旋转芯轴上后，即得人工血管内层；
S3、粘附负载抗凝药利伐沙班的RGD-pH响应二氧化硅载药纳米粒(产物d)
将聚多巴胺均匀涂抹在人工血管内层外表面，再将产物d黏附于其上，使每1cm2人工血管内层的外表面上黏附0.5*10-3μg产物d，待产物d固定后，将黏附有产物d的人工血管内层置于去离子水中超声处理5min，反复2-3次，以便除去多余的产物d；
产物d是按照以下方法制备得到：
S31、称取中空介孔二氧化硅纳米粒子75mg、抗凝血药物利伐沙班(去除包衣，研磨成粉)40mg，将称取的中空介孔二氧化硅纳米粒子放入15ml去离子水中，超声25min后，加入已备好的利伐沙班粉末，边加边搅拌直至其混合均匀。然后将二者混合溶液在15000r·min-1下离心处理15min，取沉淀并用去离子水洗涤干净，37℃真空干燥后，即得负载利伐沙班的中空介孔二氧化硅纳米粒子(产物a)；
S32、称取产物a 75mg、盐酸多巴胺40mg，将二者置于40ml Tris-HCl缓冲液(10mmol，pH＝8.5)中，常温下暗搅拌24小时，15000r·min-1离心7min，取沉淀并用离子水洗净，37℃真空干燥后得中间产物b；
S33、称取40mg聚(2-乙基-2-噁唑啉)，与中间产物b一并溶于16ml Tris-HCl缓冲液中，常温下搅拌5小时，10000r·min-1离心10min，取沉淀用离子水洗净，37℃真空干燥后，制得中间产物c；
S34、称取40mg精氨酸(R)-甘氨酸(G)-天冬氨酸(D)多肽(RGD多肽)及75mg中间产物c，共溶于40ml Tris-HCl缓冲液(10mmol，pH＝8.5)中，室温下搅拌2h，10000r·min-1离心10min，取沉淀用离子水洗净，37℃真空干燥后，即得负载抗凝药利伐沙班的RGD-pH响应二氧化硅载药纳米粒(产物d)；
S4、人工血管的制备
将外层纺丝溶液装入装有16号针头的10ml注射器中，使用注射器泵以0.03mL/min等容流速注入，针被连接到一个高电压电源的正极，并安装在一个平行板的中心，接地芯轴式收集器(OD＝3.8mm，L＝15厘米)垂直放置在距针尖约15厘米处，并以3000转/分钟旋转。在静电纺丝过程中，电纺参数设置为：电压18kV、固化距离15cm、挤出速度1mL/h、转轴直径1.2mm、温度为30℃、相对湿度为50％，将外层纺丝纤维沉积在上述S3得到的负载有产物d的人工血管外层，制备得到均匀的管状支架。然后将带芯轴的静电纺丝管状支架用质量分数100％甲醇处理20min，在化学通风柜使乙醇挥发，然后小心地将其从芯轴上滑动而获得内径约为6mm的管状支架，即为负载RGD-pH响应二氧化硅载药纳米粒的抗凝血人工血管(如图1所示)。
实施例2
一种具有促内皮化与抗凝双功能的的人工血管，是按照以下步骤制备得到的：
S1、静电纺丝液的制备：
内层纺丝液：分别称取0.04g pNSR16(重组蛛丝蛋白)、0.60g PCL(聚己内脂)，以98％甲酸为溶剂，配制pNSR16与PCL质量比为1∶15的混合电纺溶液作为内层纺丝液；
外层纺丝液：分别称取0.05g pNSR16、0.95g PLA(聚乳酸)，以98％甲酸为溶剂，配制pNSR16与PLA质量比为5∶95的混合电纺溶液作为外层纺丝液；
S2、人工血管内层的制备
静电纺丝时，将内层纺丝液装入装有10号针头的10ml注射器中，使用注射器泵以0.03mL/min流速注入，针被连接到一个高电压电源的正极，并安装在一个平行板的中心，接地芯轴式收集器(OD＝3.8mm，L＝15厘米)垂直放置在距针尖约15厘米处，而后以针尖所在平面为基准，将轴式收集器绕着针尖顺时针倾斜45°，并以2500r·min-1旋转。在静电纺丝过程中，电纺参数设置为：电压18kV、固化距离15cm、挤出速度1mL/h、转轴直径1.2mm、温度为30℃、相对湿度为50％，待内层纺丝纤维均匀沉积在旋转芯轴上后，再将轴式收集器在针尖所在平面内绕着针尖逆时针倾斜45°，重复上述操作，待内层纺丝纤维再次均匀沉淀在旋转芯轴上后，即得人工血管内层；
S3、粘附负载抗凝药利伐沙班的RGD-pH响应二氧化硅载药纳米粒(产物d)
将聚多巴胺均匀涂抹在人工血管内层外表面，再将产物d黏附于其上，使每1cm2人工血管内层的外表面上黏附0.5*10-3μg产物d(产物d的制备方法与实施例1相同)，待产物d固定后，将黏附有产物d的人工血管内层置于去离子水中超声处理5min，反复2-3次，以便除去多余的产物d；
S4、人工血管的制备
将外层纺丝溶液装入装有16号针头的10ml注射器中，使用注射器泵以0.03mL/min等容流速注入，针被连接到一个高电压电源的正极，并安装在一个平行板的中心，接地芯轴式收集器(OD＝3.8mm，L＝15厘米)垂直放置在距针尖约15厘米处，并以2500转/分钟旋转。在静电纺丝过程中，电纺参数设置为：电压18kV、固化距离15cm、挤出速度1mL/h、转轴直径1.2mm、温度为30℃、相对湿度为50％，将外层纺丝纤维沉积在上述S3得到的负载有产物d的人工血管外层，制备得到均匀的管状支架。然后将带芯轴的静电纺丝管状支架用质量分数100％甲醇处理20min，在化学通风柜使乙醇挥发，然后小心地将其从芯轴上滑动而获得内径约为6mm的管状支架，即为负载RGD-pH响应二氧化硅载药纳米粒的抗凝血人工血管
实施例3
一种具有促内皮化与抗凝双功能的的人工血管，是按照以下步骤制备得到的：
S1、静电纺丝液的制备：
内层纺丝液：分别称取0.04g pNSR16(重组蛛丝蛋白)、1.40g PCL(聚己内脂)，以98％甲酸为溶剂，配制pNSR16与PCL质量比为1∶35的混合电纺溶液作为内层纺丝液；
外层纺丝液：分别称取0.05g pNSR16、0.95g PLA(聚乳酸)，以98％甲酸为溶剂，配制pNSR16与PLA质量比为5∶95的混合电纺溶液作为外层纺丝液；
S2、人工血管内层的制备
静电纺丝时，将内层纺丝液装入装有10号针头的10ml注射器中，使用注射器泵以0.03mL/min流速注入，针被连接到一个高电压电源的正极，并安装在一个平行板的中心，接地芯轴式收集器(OD＝3.8mm，L＝15厘米)垂直放置在距针尖约15厘米处，而后将轴式收集器在针尖所在平面内绕着针尖顺时针倾斜55°，并以3500r·min-1旋转。在静电纺丝过程中，电纺参数设置为：电压18kV、固化距离15cm、挤出速度1mL/h、转轴直径1.2mm、温度为30℃、相对湿度为50％，待内层纺丝纤维均匀沉积在旋转芯轴上后，再将轴式收集器在针尖所在平面内绕着针尖逆时针倾斜55°，重复上述操作，待内层纺丝纤维再次均匀沉淀在旋转芯轴上后，即得人工血管内层；
S3、粘附负载抗凝药利伐沙班的RGD-pH响应二氧化硅载药纳米粒(产物d)
将聚多巴胺均匀涂抹在人工血管内层外表面，再将产物d黏附于其上，使每1cm2人工血管内层的外表面上黏附0.5*10-3μg产物d(产物d的制备方法与实施例1相同)，待产物d固定后，将黏附有产物d的人工血管内层置于去离子水中超声处理5min，反复2-3次，以便除去多余的产物d；
S4、人工血管的制备
将外层纺丝溶液装入装有16号针头的10ml注射器中，使用注射器泵以0.03mL/min等容流速注入，针被连接到一个高电压电源的正极，并安装在一个平行板的中心，接地芯轴式收集器(OD＝3.8mm，L＝15厘米)垂直放置在距针尖约15厘米处，并以3500转/分钟旋转。在静电纺丝过程中，电纺参数设置为：电压18kV、固化距离15cm、挤出速度1mL/h、转轴直径1.2mm、温度为30℃、相对湿度为50％，将外层纺丝纤维沉积在上述S3得到的负载有产物d的人工血管外层，制备得到均匀的管状支架。然后将带芯轴的静电纺丝管状支架用质量分数100％甲醇处理20min，在化学通风柜使乙醇挥发，然后小心地将其从芯轴上滑动而获得内径约为6mm的管状支架，即为负载RGD-pH响应二氧化硅载药纳米粒的抗凝血人工血管。
实施例4
一种具有促内皮化与抗凝双功能的的人工血管，是按照以下步骤制备得到的：
S1、静电纺丝液的制备：
内层纺丝液：分别称取0.04g pNSR16(重组蛛丝蛋白)、0.96g PCL(聚己内脂)，以98％甲酸为溶剂，配制pNSR16与PCL质量比为4∶96的混合电纺溶液作为内层纺丝液；
外层纺丝液：分别称取0.05g pNSR16、0.90g PLA(聚乳酸)，以98％甲酸为溶剂，配制pNSR16与PLA质量比为1∶18的混合电纺溶液作为外层纺丝液；
S2、人工血管内层的制备
静电纺丝时，将内层纺丝液装入装有10号针头的10ml注射器中，使用注射器泵以0.03mL/min流速注入，针被连接到一个高电压电源的正极，并安装在一个平行板的中心，接地芯轴式收集器(OD＝3.8mm，L＝15厘米)垂直放置在距针尖约15厘米处，而后将轴式收集器在针尖所在平面内绕着针尖顺时针倾斜50°，并以3000r·min-1旋转。在静电纺丝过程中，电纺参数设置为：电压18kV、固化距离15cm、挤出速度1mL/h、转轴直径1.2mm、温度为30℃、相对湿度为50％，待内层纺丝纤维均匀沉积在旋转芯轴上后，再将轴式收集器在针尖所在平面内绕着针尖逆时针倾斜50°，重复上述操作，待内层纺丝纤维再次均匀沉淀在旋转芯轴上后，即得人工血管内层；
S3、粘附负载抗凝药利伐沙班的RGD-pH响应二氧化硅载药纳米粒(产物d)
将聚多巴胺均匀涂抹在人工血管内层外表面，再将产物d黏附于其上，使每1cm2人工血管内层的外表面上黏附0.5*10-3μg产物d(产物d的制备方法与实施例1相同)，待产物d固定后，将黏附有产物d的人工血管内层置于去离子水中超声处理5min，反复2-3次，以便除去多余的产物d；
S4、人工血管的制备
将外层纺丝溶液装入装有16号针头的10ml注射器中，使用注射器泵以0.03mL/min等容流速注入，针被连接到一个高电压电源的正极，并安装在一个平行板的中心，接地芯轴式收集器(OD＝3.8mm，L＝15厘米)垂直放置在距针尖约15厘米处，并以3000转/分钟旋转。在静电纺丝过程中，电纺参数设置为：电压18kV、固化距离15cm、挤出速度1mL/h、转轴直径1.2mm、温度为30℃、相对湿度为50％，将外层纺丝纤维沉积在上述S3得到的负载有产物d的人工血管外层，制备得到均匀的管状支架。然后将带芯轴的静电纺丝管状支架用质量分数100％甲醇处理20min，在化学通风柜使乙醇挥发，然后小心地将其从芯轴上滑动而获得内径约为6mm的管状支架，即为负载RGD-pH响应二氧化硅载药纳米粒的抗凝血人工血管。
实施例5
一种具有促内皮化与抗凝双功能的的人工血管，是按照以下步骤制备得到的：
S1、静电纺丝液的制备：
内层纺丝液：分别称取0.04g pNSR16(重组蛛丝蛋白)、0.96g PCL(聚己内脂)，以98％甲酸为溶剂，配制pNSR16与PCL质量比为4∶96的混合电纺溶液作为内层纺丝液；
外层纺丝液：分别称取0.05g pNSR16、1.50g PLA(聚乳酸)，以98％甲酸为溶剂，配制pNSR16与PLA质量比为1∶30的混合电纺溶液作为外层纺丝液；
S2、人工血管内层的制备
静电纺丝时，将内层纺丝液装入装有10号针头的10ml注射器中，使用注射器泵以0.03mL/min流速注入，针被连接到一个高电压电源的正极，并安装在一个平行板的中心，接地芯轴式收集器(OD＝3.8mm，L＝15厘米)垂直放置在距针尖约15厘米处，而后将轴式收集器在针尖所在平面内绕着针尖顺时针倾斜50°，并以3000r·min-1旋转。在静电纺丝过程中，电纺参数设置为：电压18kV、固化距离15cm、挤出速度1mL/h、转轴直径1.2mm、温度为30℃、相对湿度为50％，待内层纺丝纤维均匀沉积在旋转芯轴上后，再将轴式收集器在针尖所在平面内绕着针尖逆时针倾斜50°，重复上述操作，待内层纺丝纤维再次均匀沉淀在旋转芯轴上后，即得人工血管内层；
S3、粘附负载抗凝药利伐沙班的RGD-pH响应二氧化硅载药纳米粒(产物d)
将聚多巴胺均匀涂抹在人工血管内层外表面，再将产物d黏附于其上，使每1cm2人工血管内层的外表面上黏附0.5*10-3μg产物d(产物d的制备方法与实施例1相同)，待产物d固定后，将黏附有产物d的人工血管内层置于去离子水中超声处理5min，反复2-3次，以便除去多余的产物d；
S4、人工血管的制备
将外层纺丝溶液装入装有16号针头的10ml注射器中，使用注射器泵以0.03mL/min等容流速注入，针被连接到一个高电压电源的正极，并安装在一个平行板的中心，接地芯轴式收集器(OD＝3.8mm，L＝15厘米)垂直放置在距针尖约15厘米处，并以3000转/分钟旋转。在静电纺丝过程中，电纺参数设置为：电压18kV、固化距离15cm、挤出速度1mL/h、转轴直径1.2mm、温度为30℃、相对湿度为50％，将外层纺丝纤维沉积在上述S3得到的负载有产物d的人工血管外层，制备得到均匀的管状支架。然后将带芯轴的静电纺丝管状支架用质量分数100％甲醇处理20min，在化学通风柜使乙醇挥发，然后小心地将其从芯轴上滑动而获得内径约为6mm的管状支架，即为负载RGD-pH响应二氧化硅载药纳米粒的抗凝血人工血管。
实施例6
一种具有促内皮化与抗凝双功能的的人工血管，是按照以下步骤制备得到的：
S1、静电纺丝液的制备：
内层纺丝液：分别称取0.04g pNSR16(重组蛛丝蛋白)、0.96g PCL(聚己内脂)，以98％甲酸为溶剂，配制pNSR16与PCL质量比为4∶96的混合电纺溶液作为内层纺丝液；
外层纺丝液：分别称取0.05g pNSR16、0.95g PLA(聚乳酸)，以98％甲酸为溶剂，配制pNSR16与PLA质量比为5∶95的混合电纺溶液作为外层纺丝液；
S2、人工血管内层的制备
静电纺丝时，将内层纺丝液装入装有10号针头的10ml注射器中，使用注射器泵以0.03mL/min流速注入，针被连接到一个高电压电源的正极，并安装在一个平行板的中心，接地芯轴式收集器(OD＝3.8mm，L＝15厘米)处置放置在距针尖约15厘米处，而后将轴式收集器在针尖所在平面内绕着针尖顺时针倾斜47°，并以3000r·min-1旋转。在静电纺丝过程中，电纺参数设置为：电压18kV、固化距离15cm、挤出速度1mL/h、转轴直径1.2mm、温度为30℃、相对湿度为50％，待内层纺丝纤维均匀沉积在旋转芯轴上后，再将轴式收集器在针尖所在平面内绕着针尖逆时针倾斜47°，重复上述操作，待内层纺丝纤维再次均匀沉淀在旋转芯轴上后，即得人工血管内层；
S3、粘附负载抗凝药利伐沙班的RGD-pH响应二氧化硅载药纳米粒(产物d)
将聚多巴胺均匀涂抹在人工血管内层外表面，再将产物d黏附于其上，使每1cm2人工血管内层的外表面上黏附1.5*10-3μg产物d(产物d的制备方法与实施例1相同)，待产物d固定后，将黏附有产物d的人工血管内层置于去离子水中超声处理5min，反复2-3次，以便除去多余的产物d；
S4、人工血管的制备
将外层纺丝溶液装入装有16号针头的10ml注射器中，使用注射器泵以0.03mL/min等容流速注入，针被连接到一个高电压电源的正极，并安装在一个平行板的中心，接地芯轴式收集器(OD＝3.8mm，L＝15厘米)垂直放置在距针尖约15厘米处，并以3000转/分钟旋转。在静电纺丝过程中，电纺参数设置为：电压18kV、固化距离15cm、挤出速度1mL/h、转轴直径1.2mm、温度为30℃、相对湿度为50％，将外层纺丝纤维沉积在上述S3得到的负载有产物d的人工血管外层，制备得到均匀的管状支架。然后将带芯轴的静电纺丝管状支架用质量分数100％甲醇处理20min，在化学通风柜使乙醇挥发，然后小心地将其从芯轴上滑动而获得内径约为6mm的管状支架，即为负载RGD-pH响应二氧化硅载药纳米粒的抗凝血人工血管。
实施例7
一种具有促内皮化与抗凝双功能的的人工血管，是按照以下步骤制备得到的：
S1、静电纺丝液的制备：
内层纺丝液：分别称取0.04g pNSR16(重组蛛丝蛋白)、0.96g PCL(聚己内脂)，以98％甲酸为溶剂，配制pNSR16与PCL质量比为4∶96的混合电纺溶液作为内层纺丝液；
外层纺丝液：分别称取0.05g pNSR16、0.95g PLA(聚乳酸)，以98％甲酸为溶剂，配制pNSR16与PLA质量比为5∶95的混合电纺溶液作为外层纺丝液；
S2、人工血管内层的制备
静电纺丝时，将内层纺丝液装入装有10号针头的10ml注射器中，使用注射器泵以0.03mL/min流速注入，针被连接到一个高电压电源的正极，并安装在一个平行板的中心，接地芯轴式收集器(OD＝3.8mm，L＝15厘米)处置放置在距针尖约15厘米处，而后将轴式收集器在针尖所在平面内绕着针尖顺时针倾斜50°，并以3000r·min-1旋转。在静电纺丝过程中，电纺参数设置为：电压18kV、固化距离15cm、挤出速度1mL/h、转轴直径1.2mm、温度为30℃、相对湿度为50％，待内层纺丝纤维均匀沉积在旋转芯轴上后，再将轴式收集器在针尖所在平面内绕着针尖逆时针倾斜50°，重复上述操作，待内层纺丝纤维再次均匀沉淀在旋转芯轴上后，即得人工血管内层；
S3、粘附负载抗凝药利伐沙班的RGD-pH响应二氧化硅载药纳米粒(产物d)
将聚多巴胺均匀涂抹在人工血管内层外表面，再将产物d黏附于其上，使每1cm2人工血管内层的外表面上黏附0.5*10-3μg产物d(产物d的制备方法与实施例1相同)，待产物d固定后，将黏附有产物d的人工血管内层置于去离子水中超声处理5min，反复2-3次，以便除去多余的产物d；
S4、人工血管的制备
将外层纺丝溶液装入装有16号针头的10ml注射器中，使用注射器泵以0.03mL/min等容流速注入，针被连接到一个高电压电源的正极，并安装在一个平行板的中心，接地芯轴式收集器(OD＝3.8mm，L＝15厘米)垂直放置在距针尖约15厘米处，并以2500转/分钟旋转。在静电纺丝过程中，电纺参数设置为：电压22kV、固化距离15cm、挤出速度2mL/h、转轴直径1.5mm、温度为22℃、相对湿度为50％，将外层纺丝纤维沉积在上述S3得到的负载有产物d的人工血管外层，制备得到均匀的管状支架。然后将带芯轴的静电纺丝管状支架用质量分数100％甲醇处理20min，在化学通风柜使乙醇挥发，然后小心地将其从芯轴上滑动而获得内径约为6mm的管状支架，即为负载RGD-pH响应二氧化硅载药纳米粒的抗凝血人工血管。
实施例8
一种具有促内皮化与抗凝双功能的的人工血管，是按照以下步骤制备得到的：
S1、静电纺丝液的制备：
内层纺丝液：分别称取0.04g pNSR16(重组蛛丝蛋白)、0.96g PCL(聚己内脂)，以98％甲酸为溶剂，配制pNSR16与PCL质量比为4∶96的混合电纺溶液作为内层纺丝液；
外层纺丝液：分别称取0.05g pNSR16、0.95g PLA(聚乳酸)，以98％甲酸为溶剂，配制pNSR16与PLA质量比为5∶95的混合电纺溶液作为外层纺丝液；
S2、人工血管内层的制备
静电纺丝时，将内层纺丝液装入装有10号针头的10ml注射器中，使用注射器泵以0.03mL/min流速注入，针被连接到一个高电压电源的正极，并安装在一个平行板的中心，接地芯轴式收集器(OD＝3.8mm，L＝15厘米)垂直放置在距针尖约15厘米处，而后将轴式收集器在针尖所在平面内绕着针尖顺时针倾斜50°，并以3000r·min-1旋转。在静电纺丝过程中，电纺参数设置为：电压18kV、固化距离15cm、挤出速度1mL/h、转轴直径1.2mm、温度为30℃、相对湿度为50％，待内层纺丝纤维均匀沉积在旋转芯轴上后，再将轴式收集器在针尖所在平面内绕着针尖逆时针倾斜50°，重复上述操作，待内层纺丝纤维再次均匀沉淀在旋转芯轴上后，即得人工血管内层；
S3、粘附负载抗凝药利伐沙班的RGD-pH响应二氧化硅载药纳米粒(产物d)
将聚多巴胺均匀涂抹在人工血管内层外表面，再将产物d黏附于其上，使每1cm2人工血管内层的外表面上黏附0.5*10-3μg产物d，待产物d固定后，将黏附有产物d的人工血管内层置于去离子水中超声处理5min，反复2-3次，以便除去多余的产物d；
其中，产物d是按照以下步骤进行制备的：
S31、称取中空介孔二氧化硅纳米粒子75mg、抗凝血药物利伐沙班(去除包衣，研磨成粉)50mg，将称取的中空介孔二氧化硅纳米粒子放入15ml去离子水中，超声30min后，加入已备好的利伐沙班粉末，边加边搅拌直至其混合均匀。然后将二者混合溶液在15000r·min-1下离心处理15min，取沉淀并用去离子水洗涤干净，37℃真空干燥后，即得负载利伐沙班的中空介孔二氧化硅纳米粒子(产物a)；
S32、称取产物a 75mg、盐酸多巴胺25mg，将二者置于40ml Tris-HCl缓冲液(10mmol，pH＝8.5)中，常温下暗搅拌24小时，15000r·min-1离心7min，取沉淀并用离子水洗净，37℃真空干燥后得中间产物b；
S33、称取50mg聚(2-乙基-2-噁唑啉)，与中间产物b一并溶于16ml Tris-HCl缓冲液中，常温下搅拌6小时，10000r·min-1离心10min，取沉淀用离子水洗净，37℃真空干燥后，制得中间产物c；
S34、称取50mg精氨酸(R)-甘氨酸(G)-天冬氨酸(D)多肽(RGD多肽)及75mg中间产物c，共溶于40ml Tris-HCl缓冲液(10mmol，pH＝8.5)中，室温下搅拌4h，10000r·min-1离心10min，取沉淀用离子水洗净，37℃真空干燥后，即得负载抗凝药利伐沙班的RGD-pH响应二氧化硅载药纳米粒(产物d)；
S4、人工血管的制备
将外层纺丝溶液装入装有16号针头的10ml注射器中，使用注射器泵以0.03mL/min等容流速注入，针被连接到一个高电压电源的正极，并安装在一个平行板的中心，接地芯轴式收集器(OD＝3.8mm，L＝15厘米)垂直放置在距针尖约15厘米处，并以3000转/分钟旋转。在静电纺丝过程中，电纺参数设置为：电压18kV、固化距离15cm、挤出速度1mL/h、转轴直径1.2mm、温度为30℃、相对湿度为50％，将外层纺丝纤维沉积在上述S3得到的负载有产物d的人工血管外层，制备得到均匀的管状支架。然后将带芯轴的静电纺丝管状支架用质量分数100％甲醇处理20min，在化学通风柜使乙醇挥发，然后小心地将其从芯轴上滑动而获得内径约为6mm的管状支架，即为负载RGD-pH响应二氧化硅载药纳米粒的抗凝血人工血管。
对比例
一种人工血管的制备方法，与实施例2的不同在于S3中，在人工血管内层的外表面未粘附负载抗凝药利伐沙班的RGD-pH响应二氧化硅载药纳米粒(产物d)。
实验例1
血液相容性体外实验：
分别对实施例1(由于实施例1-8制备得到的人工血管的性能基本相同，故仅以实施例1制备得到的人工血管为例进行效果说明，并将其标记为修饰组)及对比例制备得到的人工血管(将其标记为普通组)在体外进行了“活化部分凝血活酶时间(APTT)”、“凝血酶时间(TT)”、“溶血率(HR)”和“复钙时间(PRT)”的测定，各指标的具体测定方法如下：
APTT和TT测定方法：
取SD大鼠静脉血，放在抗凝管中备用；将普通组和修饰组人工血管切成1cm*1cm的样块，分别置于PBS中，37℃环境下孵育1h备用。将3ml血液常规稀释后盛于5ml离心管中，再把在PBS中孵育过的样块分别加入离心管，二者共同孵育1h后，进行常规离心操作，并用凝血分析试剂盒测APTT和TT。血液仅进行常规稀释、离心后进行凝血分析的，为空白对照组，记为TCP。
HR测定方法：
取SD大鼠腹主动脉血，制备适当浓度的红细胞悬液备用；将普通组和修饰组人工血管切成1cm*1cm的样块，分别置于PBS中，37℃环境下孵育1h备用。把在PBS中孵育过的样块分别加入盛有红细胞悬液的2ml离心管中，37℃环境下孵育1.5h，再2000r/min离心10min，加入到32孔板后，用酶标仪测得吸光度，再根据吸光度算出其HR值。
PRT的测定：
取SD大鼠静脉血，放在抗凝管中备用；将普通组和修饰组人工血管切成1cm*1cm的样块，分别置于PBS中，37℃环境下孵育1h备用。将3ml血液常规稀释后盛于5ml离心管中，再把在PBS中孵育过的样块分别加入离心管，二者共同孵育1h后，加入250μL 25mM CaCl2和3枚不锈钢钉，观察个样品最早出现纤维蛋白的时间。将3ml血液常规稀释后盛于5ml离心管中，不加入任何人工血管样块，仅加入250μL 25mM CaCl2和3枚不锈钢钉，作为空白对照组，记为TCP组。
如图2所示，A图为APTT数据，APTT值与血管阻塞率成反比，A图中，经RGD-pH响应二氧化硅载药纳米粒修饰的人工血管组(Modified artificial blood vessel，即“修饰组”)数值明显高于普通人工血管组(Artificial blood vessel，即“普通组”)，且略高于空白对照组(TCP)，表明本发明经修饰过的人工血管畅通性较好。B图为TT数据，TT作为指标参数与APTT所表明的意义类似，同样说明修饰组抗凝效果良好。C图中HR表征人工血管外周血红细胞破裂程度，数值越低说明外周血红细胞破裂越少，人工血管血液相容性越好；很显然，从实验数据来看，修饰组的血液相容性更好。D图为PRT数据，PRT表征血浆再钙化时间，复钙时间正常值：2.8±0.5min。从D图中可读出，修饰组的PRT值约在210s左右(实际平均测量值为207.25s)，落在正常范围内。
实验例2
内皮化效果体内实验：
内皮细胞由内皮祖细胞分化而来，是新生血管的重要组成部分。内皮细胞在人工血管内壁区域形成内皮化。于腹动主动脉而言，血管内皮化在其生理过程中具有重要作用，比如，内皮细胞有序、取向生长，有助于血管抗凝血、抗钙化。
本实验中，RGD多肽可诱导内皮细胞定向生长，因此，本发明将人工血管内皮细胞生长情况，作为一个效果指标，结果如图3所示。
图3为vWF(人工血管除亮斑点以外的部分)和DAPI(亮斑点部分)染色的免疫荧光图像，血管内皮细胞被染成红色，而血管细胞的细胞核显示蓝色。对比图3中A、B两图，修饰组内皮细胞量显著高于普通组，表明经RGD-pH响应二氧化硅载药纳米粒修饰的人工血管有益于血管内皮再生。
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (6)

1.一种具有促内皮化及抗凝双功能的人工血管的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将重组蛛丝蛋白的甲酸溶液与聚己内脂混合，得到内层纺丝液；
将重组蛛丝蛋白的甲酸溶液与聚乳酸混合，得到外层纺丝液；
所述重组蛛丝蛋白与所述聚己内脂的质量比为1∶15-35；
所述重组蛛丝蛋白与所述聚乳酸的质量比为1∶18-30；
S2、以所述内层纺丝液为原料，利用静电纺丝法制得人工血管内层；
S3、在所述人工血管内层的外表面涂覆厚度为0.025mm-0.05mm聚多巴胺层，按0.5-1.5*10-3μg/cm3的量继续在聚多巴胺层的上表面粘附RGD-pH响应型二氧化硅载药纳米粒，即得负载有二氧化硅载药纳米粒的人工血管内层；
其中，所述RGD-pH响应型二氧化硅载药纳米粒上负载的药物为抗凝药物；
S4、利用静电纺丝法向S3制得的负载有二氧化硅载药纳米粒的人工血管内层的外表面粘附所述外层纺丝液，即得具有促内皮化及抗凝双功能的人工血管。
2.根据权利要求1所述的人工血管的制备方法，其特征在于，所述RGD-pH响应型二氧化硅载药纳米粒是按照以下步骤制备得到：
S31、将介孔二氧化硅纳米粒子在水中分散，加入抗凝药物，得到的混合液离心，取沉淀依次清洗、干燥，得到负载药物的介孔二氧化硅纳米粒子；
S32、将所述负载药物的介孔二氧化硅纳米粒子与盐酸多巴胺置于缓冲液中，常温下暗搅拌24h，离心，取沉淀依次清洗、干燥，得中间产物A；
S33、将聚（2-乙基-2-噁唑啉）与所述中间产物A置于缓冲液中，常温搅拌5-6h后，离心，取沉淀依次清洗、干燥，得到中间产物B；
S34、将精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽与所述中间产物B置于缓冲液中，搅拌2-4ｈ，离心，取沉淀依次清洗、干燥，即得RGD-pH响应型二氧化硅载药纳米粒。
3.根据权利要求2所述的人工血管的制备方法，其特征在于，
S31中，所述介孔二氧化硅纳米粒子与所述抗凝药物的质量比为9∶4-6，所述离心是在15000r·min-1下离心15min，
S32中，所述负载药物的介孔二氧化硅纳米粒子与盐酸多巴胺的质量比为3∶1-2， 所述离心是在15000 r·min-1下离心7min；
S33中，所述聚（2-乙基-2-噁唑啉）与所述中间产物A的质量比为4-6∶9，所述离心是在10000 r·min-1下离心10min；
S34中，所述精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽与所述中间产物B的质量比为4-6∶9，所述离心是在10000 r·min-1下离心10min。
4.根据权利要求1所述的人工血管的制备方法，其特征在于，S2及S4中，所述静电纺丝过程中电纺参数设置为：电压18-22kV、固化距离15cm、挤出速度1-2mL/h、转轴直径1.2mm、温度为22-30℃、相对湿度为50%；
所述静电纺丝法的具体操作过程为：
人工血管内层制备：将所述内层纺丝液注入装有针头的注射器中，针与高电压电源的正极连接，在距针尖15cm处垂直放置轴式收集器，再以针尖所在平面为基准，将轴式收集器绕着针尖顺时针倾斜45-55°，并以2500-3500 r/min旋转；
待所述内层纺丝液均匀沉积在轴式收集器的旋转芯轴上后，再以针尖所在平面为基准，将轴式收集器绕着针尖逆时针倾斜45-55°；重复上述操作，待所述内层纺丝液再次均匀沉淀在旋转芯轴上后，即得人工血管内层；
人工血管的制备：将所述外层纺丝液注入装有针头的注射器中，针与高电压电源的正极连接，在距针尖15cm处垂直放置轴式收集器，并使轴式收集器以2500-3500 r/min旋转，待外层纺丝液均匀沉淀在所述人工血管内层的外周，即得所述人工血管。
5.根据权利要求1所述的人工血管的制备方法，其特征在于，所述抗凝药物为利伐沙班。
6.一种根据权利要求1-5任一项所述的方法制备得到的人工血管。
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