CN114984330A - 一种兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架及其制备方法,该方法包括以下步骤:S1、用交联剂联合明胶对脱细胞血管材料进行预处理;S2、将S1预处理后的血管材料与多巴胺溶液进行避光反应,之后浸泡于替罗非班溶液中,取出后干燥;S3、将S2处理后的血管材料浸泡于降钙素混悬液中,取出后干燥;S4、重复S2、S3步骤若干次,即得。通过使用交联剂联合明胶对脱细胞血管支架材料进行填充,然后通过多巴胺避光沉积后形成聚多巴胺,提高替罗非班和降钙素在脱细胞血管支架内部的负载成功率,以解决长期缓释达到抗钙化和抗凝的目的。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程支架技术领域,具体涉及一种兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架及其制备方法。
背景技术
心血管疾病致死率居高不下,并且一直呈增长趋势,严重威胁到人类的生命健康安全。目前,外科治疗冠心病的有效方法为冠状动脉搭桥手术,其中使用的移植物血管是以病人的自体血管为主,例如,大隐静脉或乳内动脉。但是当病人自体血管出现狭窄、钙化、破损等原因不能使用时,目前没有可用于临床的小口径人工血管(内径小于6mm),市场缺口大。
组织工程是一种制备小口径人工血管的重要方法。脱细胞血管支架能促进血管细胞的增殖与组织再生,在体外或者体内诱导形成织工程人工血管。脱细胞血管支架还有很多问题需要解决,例如,移植后短期内因为抗凝效果不佳出现再狭窄或者阻塞,或者出现移植后的钙化问题等。
替罗非班是一种常见的抗凝血药物,能够有效的防止血小板聚集,避免血栓形成。降钙素由甲状腺滤泡旁细胞分泌的一种多肽激素,能降低血钙和血磷,减轻植入材料的钙化。但是采用传统的方法通过简单的表面改性是无法直接将药物载在血管内部,究其原因,一方面是因为载药率低并且容易脱落分离,另一方面是因为短期内药物释放完全,不能很好的解决长期抗钙化和抗凝的问题。因此,有必要改进替罗非班和降钙素在脱细胞血管支架内部的有效固定技术,兼具抗凝与抗钙化双重性能,以解决长期缓释达到抗钙化和抗凝的目的。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明的主要目的是提供一种兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架的制备方法,通过使用交联剂联合明胶对脱细胞血管材料进行填充,解决了以往单纯脱细胞血管支架的机械性能低的问题;然后通过多巴胺避光沉积后形成聚多巴胺,在提高粘附性的同时,增加活性键,提高替罗非班和降钙素在组织工程血管支架内部的负载成功率,以解决长期缓释达到抗钙化和抗凝的目的。
为实现上述目的,本发明的技术方案如下。
一种兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架的制备方法,包括以下步骤:
S1、用交联剂联合明胶对脱细胞血管材料进行预处理;
S2、将S1预处理后的血管材料与多巴胺溶液进行避光反应,之后浸泡于替罗非班溶液中,取出后干燥;
S3、将S2处理后的血管材料浸泡于降钙素混悬液中,取出后干燥;
S4、重复S2、S3步骤若干次,即得。
进一步,S2中,所述多巴胺溶液的浓度为1~3.5mg/mL,pH=8~9.5;
所述替罗非班溶液的浓度为0.8~3.0mg/mL。
S2中,避光反应的时间为12~24h;浸泡于替罗非班溶液中的时间为12~24h。
进一步,S3中,降钙素混悬液的制备方法如下:
步骤一、将降钙素与水混合后,加入PLGA溶液,再超声破碎;
步骤二、将步骤一处理后的溶液与PVA溶液混合均匀,再超声破碎,干燥得到固化物;
步骤三、将固化物与Tris缓冲液进行超声混匀,得到降钙素混悬液。
更进一步,降钙素、PLGA、PVA的质量比为2~4:10~50:20~60。
其中,PLGA溶液是将PLGA溶于有机溶剂中得到的,有机溶剂选用二氯甲烷、二氯乙烷、四氢呋喃、乙酸乙酯中的任意一种。PVA溶液是PVA水溶液。步骤一与步骤二中,超声破碎的时间为1~8min。
更进一步,降钙素与水的质量比1:15~20;
固化物与Tris缓冲液的质量比为1:50~100;
PLGA溶液的质量百分浓度为1.5~2.0%;
PVA溶液的质量百分浓度为1.5~2.0%。
进一步,S1的具体操作如下:
将脱细胞的血管材料进行脱水处理8~24h,然后置于明胶溶液中振荡处理1.5~4h;经冷冻干燥后,置于交联剂中振荡处理12~32h,之后置于磷酸二氢钠溶液中浸泡1~3h,以终止交联;再清洗干净。
更进一步,明胶溶液的质量浓度为1~7%;交联剂为EDC/NHS,交联剂的质量浓度为1~5‰;磷酸二氢钠溶液的质量浓度为0.5~2.5%。
进一步,所述血管材料为哺乳动物血管材料。
进一步,血管材料的脱细胞处理过程如下:
将血管材料置于血管保存液中进行振荡处理12~24h;之后用PBS缓冲液冲洗后,置于脱细胞溶液中进行振荡处理12~36h;然后用血管保存液漂洗,并置于核酸酶终液中进行消化处理6~24h,再用PBS缓冲液漂洗,逐级冷冻保存,备用。
更进一步,血管保存液是将青霉素、链霉素、两性霉素中的一种或多种溶于PBS缓冲液中,即得;
脱细胞溶液是将TritonX-100、SDS、脱氧胆酸钠盐、EDTA、DNA酶、RNA酶中的一种或多种溶于PBS缓冲液中,即得;
核酸酶终液是将DNA酶与RNA酶溶于PBS缓冲液与生理盐水按照体积比1:1的混合液中;核酸酶终液中,DNA酶与RNA酶的浓度均为1~3mg/mL。
本发明还提供一种采用上述制备方法制备得到的兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架。
通过多巴胺避光沉积后,提高组织工程血管支架内壁的粘附性,并增加活性键,使替罗非班和降钙素沉积、接枝在血管支架的内表面,制备出具有免疫原性低、抗凝、抗钙化的组织工程血管支架,可以有望丰富临床血管移植物来源,可成为临床血管修复及移植的替代品。
降钙素包埋在由聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙烯醇(PVA)形成的缓释微球中,并通过多巴胺接枝在血管支架的内部,可以有效延长血管支架的抗钙化时间,由此通过替罗非班和降钙素的共同作用,可以有效增加脱细胞血管支架的抗凝性能和长期抗钙化性能。其中,聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)用于包裹降钙素形成微球(初乳,油包水),聚乙烯醇溶液是水相,用于包裹上述的微球,形成W/O/W微球。
本发明的有益效果:
1、本发明是基于哺乳动物(大鼠、羊、猪等)的动脉血管,首先应用脱细胞溶液+核酸酶终液进行脱细胞处理,去除天然血管的免疫原性;然后使用交联剂联合明胶进行填充,解决了以往单纯脱细胞血管支架的机械性能低的问题;通过多巴胺沉积为小口径组织工程血管内表面载药提供了新的一种聚合方案,将制备的脱细胞血管支架与抗血小板药物(替罗非班)、降钙素抗钙化缓释颗粒进行结合,为组织工程血管支架设计提供了新的方案。
2、本发明制备出的兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架具有免疫原性低、抗凝、抗钙化的性能,有利于移植后血管内的畅通、延缓移植物的钙化,有望丰富临床血管移植物来源,可成为临床血管修复及移植的替代品,具有非常好的科研和临床应用前景。
3、本发明通过多巴胺避光沉积后形成聚多巴胺的粘附性和多活性键,将替罗非班沉积在组织工程血管支架内部。根据降钙素对血管钙化有一定程度的抑制作用,将提前通过聚乳酸-羟基乙酸、聚乙烯醇、降钙素等物质构建的抗钙化缓释颗粒也同时通过聚多巴胺接枝在血管支架内部,以解决长期缓释达到抗钙化和抗凝的目的。
附图说明
图1是兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架(改性支架)的结构示意图。其中,DECELL+GEL是指脱细胞血管支架+凝胶;PDA是指聚多巴胺(Polydopamine);Tirofiban是指替罗非班;Anti-calcification granules是指抗钙化颗粒。
图2是改性支架的扫描电镜图。其中,A图的比例尺为50um;B图的比例尺为100um。
图3是脱细胞血管支架的血液相容性的实验结果。其中,A为溶血率的柱形图;B为部分活化凝血酶原时间的柱形图。Water为阳性对照组;Decell为脱细胞组;Modifiedscaffold为改性支架组;TCP为空白对照组。
图4是细胞与脱细胞血管支架共同培养的荧光染色结果。其中,A为脱细胞组;B为改性支架组。
图5是动物皮下包埋后脱细胞血管支架的钙含量变化趋势曲线。Decell为脱细胞组;Modified scaffold为改性支架组。Trend of Ca2+content为钙离子含量的变化趋势。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
降钙素;PBS缓冲液;Tris缓冲液。
血管保存液是将青霉素溶于PBS缓冲液,混合均匀,即得。
脱细胞溶液是将TritonX-100溶于PBS缓冲液中,得到脱细胞溶液。
核酸酶终液是将DNA酶与RNA酶溶于PBS缓冲液与生理盐水按照体积比1:1的混合液中;核酸酶终液中,DNA酶与RNA酶的浓度均为1~3mg/mL。
聚乙烯醇溶液是将聚乙烯醇加入到蒸馏水中,得到聚乙烯醇溶液。
多巴胺溶液;替罗非班溶液。
本发明实施例中材料及设备,如无特殊说明,均可在市场上购买得到。
实施例1
一种兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架的制备方法,包括以下步骤:
S1、制备哺乳动物血管材料
取哺乳动物(大鼠)的腹主动脉,使用PBS缓冲液反复冲洗后浸泡于血管保存液中。将浸泡后的动脉血管经过恒温震荡仪(25℃)震荡12h,并在无菌实验台上对其进行清洗修剪,去除血管外膜结缔组织、脂肪及管腔内血栓,注意避免工具对血管主体结构造成损伤,清洗修剪结束后,使用无菌PBS液冲洗3次,直至血管肉眼可见无血栓及多余附着物后,置于血管保存液中。
S2、制备脱细胞血管支架
将血管保存液中的血管使用恒温振荡器匀速振荡12h;使用无菌PBS缓冲液冲洗后置于脱细胞溶液中,再进行匀速振荡12h进行脱细胞处理;脱细胞结束后用血管保存液漂洗3遍;然后将漂洗后的血管置于核酸酶终液中进行消化处理6h后取出,经PBS缓冲液漂洗后置于无菌培养皿中,逐级降温至-80℃无菌冻存。使用冷冻干燥机将逐级冷冻的血管进行脱水处理8h,然后置于预先准备好的质量浓度1%的明胶溶液中,匀速振荡1.5h;然后使用冷冻干燥机将结合明胶后的血管处理6h,将血管置于质量浓度1‰的交联剂EDC/NHS中恒温匀速振荡12h;置于质量浓度0.5%的磷酸二氢钠溶液中2h后,漂洗干净。
S3、制备抗凝脱细胞血管支架
将脱细胞血管支架与多巴胺溶液(浓度1mg/mL、pH=8)进行封闭反应12h,使用蒸馏水对血管支架进行4次超声清洗,并进行紫外灭菌1h,然后浸没于浓度0.8mg/mL的替罗非班溶液中充分接触12h后氮气干燥。
S4、制备降钙素混悬液
将降钙素与双蒸水以质量比1:18混合均匀后,加入质量百分浓度为1.8%的PLGA-二氯甲烷溶液,经旋涡混合器充分混合(1000转/分),再经过超声细胞破碎仪(0℃,100w,6s间歇)破碎1min得到溶液C。再将溶液C加入质量百分浓度为1.8%的聚乙烯醇溶液中,经过超声破碎仪破碎制得复乳,然后充分搅拌后挥发二氯甲烷,静置后收集固化物,其中,降钙素、PLGA、PVA的质量比为3:40:20。将收集到的固化物按照质量比1:80加入Tris缓冲液中,超声混合均匀,制得降钙素混悬液。
S5、制备兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架
将干燥后的抗凝脱血管支架放置于降钙素混悬液中静置2h,取出后冷冻干燥1h,然后继续置于降钙素混悬溶液中静置2h,浸泡结束后氮气干燥,然后放置于超低温冰箱中冷藏备用。
实施例2
一种兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架的制备方法,包括以下步骤:
S1、制备哺乳动物血管材料
取哺乳动物(羊)的颈动脉,使用PBS缓冲液反复冲洗后浸泡于血管保存液中。将浸泡后的动脉血管经过恒温震荡仪(30℃)震荡24h,并在无菌实验台上对其进行清洗修剪,去除血管外膜结缔组织、脂肪及管腔内血栓,注意避免工具对血管主体结构造成损伤,清洗修剪结束后,使用无菌PBS液冲洗3次,直至血管肉眼可见无血栓及多余附着物后,置于血管保存液中。
S2、制备脱细胞血管支架
将血管保存液中的血管使用恒温振荡器匀速振荡18h;使用无菌PBS冲洗后置于脱细胞溶液中,再进行匀速振荡24h进行脱细胞处理;脱细胞结束后用血管保存液漂洗4遍;然后将漂洗后的血管置于核酸酶终液中进行消化处理12h后取出,经PBS缓冲液漂洗后置于无菌培养皿中,逐级降温至-80℃无菌冻存。使用冷冻干燥机将逐级冷冻的血管进行脱水处理12h,然后置于预先准备好的质量浓度3%的明胶溶液中,匀速振荡2.5h;然后使用冷冻干燥机将结合明胶后的血管处理8h,将血管置于质量浓度3‰的交联剂EDC/NHS中恒温匀速振荡19h;置于质量浓度1.5%的磷酸二氢钠溶液中2h后,漂洗干净。
S3、制备抗凝脱细胞血管支架
将脱细胞血管支架与多巴胺溶液(浓度2mg/mL、pH=8.5)进行封闭反应18h,使用蒸馏水对血管支架进行4次超声清洗,并进行紫外灭菌1h,然后浸没于浓度2.5mg/mL的替罗非班溶液中充分接触18h后氮气干燥。
S4、制备降钙素混悬液
将降钙素与双蒸水以质量比1:15混合均匀后,加入质量百分浓度为1.5%的PLGA-二氯甲烷溶液,经旋涡混合器充分混合(1000转/分),再经过超声细胞破碎仪(0℃,100w,6s间歇)破碎5min得到溶液C。再将溶液C加入质量百分浓度为1.5%的聚乙烯醇溶液中,经过超声破碎仪破碎制得复乳,然后充分搅拌后挥发二氯甲烷,静置后收集固化物,其中,降钙素、PLGA、PVA的质量比为2:10:20。将收集到的固化物按照质量比1:100加入Tris缓冲液中,超声混合均匀,制得降钙素混悬液。
S5、制备兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架
将干燥后的抗凝脱细胞血管支架放置于降钙素混悬液中静置5h,取出后冷冻干燥3h,然后继续置于降钙素混悬溶液中静置4h,浸泡结束后氮气干燥,然后放置于超低温冰箱中冷藏备用。
实施例3
一种兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架的制备方法,包括以下步骤:
S1、制备哺乳动物血管材料
取哺乳动物(猪)的颈动脉,使用PBS缓冲液反复冲洗后浸泡于血管保存液中。将浸泡后的动脉血管经过恒温震荡仪(38℃)震荡36h,并在无菌实验台上对其进行清洗修剪,去除血管外膜结缔组织、脂肪及管腔内血栓,注意避免工具对血管主体结构造成损伤,清洗修剪结束后,使用无菌PBS液冲洗3次,直至血管肉眼可见无血栓及多余附着物后,置于血管保存液中。
S2、制备脱细胞的哺乳动物血管材料
将血管保存液中的血管使用恒温振荡器匀速振荡24h;使用无菌PBS冲洗后置于脱细胞溶液中,再进行匀速振荡36h进行脱细胞处理;脱细胞结束后用血管保存液漂洗5遍;然后将漂洗后的血管置于核酸酶终液中进行消化处理24h后取出,经PBS缓冲液漂洗后置于无菌培养皿中,逐级降温至-80℃无菌冻存。使用冷冻干燥机将逐级冷冻的血管进行脱水处理24h,然后置于预先准备好的质量浓度7%的明胶溶液中,匀速振荡4h;然后使用冷冻干燥机将结合明胶后的血管处理10h,将血管置于质量浓度5‰的交联剂EDC/NHS中恒温匀速振荡32h;置于质量浓度2.5%的磷酸二氢钠溶液中2h后,漂洗干净。
S3、制备抗凝脱细胞血管支架
将脱细胞血管支架与多巴胺溶液(浓度3.5mg/mL、pH=9.5)进行封闭反应24h,使用蒸馏水对血管支架进行4次超声清洗,并进行紫外灭菌1h,然后浸没于浓度3.0mg/mL的替罗非班溶液中充分接触24h后氮气干燥。
S4、制备降钙素混悬液
将降钙素与双蒸水以质量比1:20混合均匀后,加入质量百分浓度为2%的PLGA-二氯甲烷溶液,经旋涡混合器充分混合(1000转/分),再经过超声细胞破碎仪(0℃,100w,6s间歇)破碎8min得到溶液C。再将溶液C加入质量百分浓度为2%的聚乙烯醇溶液中,经过超声破碎仪破碎制得复乳,然后充分搅拌后挥发二氯甲烷,静置后收集固化物,其中,降钙素、PLGA、PVA的质量比为4:50:60。将收集到的固化物按照质量比1:50加入Tris缓冲液中,超声混合均匀,制得降钙素混悬液。
S5、制备兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架
将干燥后的抗凝脱细胞血管支架放置于降钙素混悬液中静置10h,取出后冷冻干燥5h,然后继续置于降钙素混悬溶液中静置6h,浸泡结束后氮气干燥,然后放置于超低温冰箱中冷藏备用。
对比例1
一种脱细胞血管支架的制备方法,包括以下步骤:
S1、制备哺乳动物血管材料
取哺乳动物(大鼠)的腹主动脉,使用PBS缓冲液反复冲洗后浸泡于血管保存液中。将浸泡后的动脉血管经过恒温震荡仪(25℃)震荡12h,并在无菌实验台上对其进行清洗修剪,去除血管外膜结缔组织、脂肪及管腔内血栓,注意避免工具对血管主体结构造成损伤,清洗修剪结束后,使用无菌PBS液冲洗3次,直至血管肉眼可见无血栓及多余附着物后,置于血管保存液中。
S2、制备脱细胞血管支架
将血管保存液中的血管使用恒温振荡器匀速振荡12h;使用无菌PBS缓冲液冲洗后置于脱细胞溶液中,再进行匀速振荡12h进行脱细胞处理;脱细胞结束后用血管保存液漂洗3遍;然后将漂洗后的血管置于核酸酶终液中进行消化处理6h后取出,经PBS缓冲液漂洗后置于无菌培养皿中,逐级降温至-80℃无菌冻存。使用冷冻干燥机将逐级冷冻的血管进行脱水处理8h,然后置于预先准备好的质量浓度1%的明胶溶液中,匀速振荡1.5h;然后使用冷冻干燥机将结合明胶后的血管处理6h,将血管置于质量浓度1‰的交联剂EDC/NHS中恒温匀速振荡12h;置于质量浓度0.5%的磷酸二氢钠溶液中2h后,漂洗干净,氮气干燥,然后放置于超低温冰箱中冷藏备用。
本发明实施例1~3得到的兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架的性能基本相同,下面仅以实施例1制备的兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架进行性能测试。
1、兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架示意图
本发明实施例1是基于大鼠的动脉血管,首先应用TritonX-100+DNA/RNA酶进行脱细胞处理,去除天然血管的免疫原性;然后使用交联剂联合明胶进行填充;通过多巴胺沉积聚合将制备的脱细胞血管支架与抗血小板药物(替罗非班)、抗钙化缓释颗粒进行结合,得出最终品,结构如图1所示。
2、扫描电子显微镜观察脱细胞血管支架的微观形态
使用扫描电子显微镜(日本日立SU-8100),用于观察实施例1的兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架的微观特征。
取实施例1的兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架样本作为待测样本,将待测样本切割成1.0mm(宽)×2.0mm(长),采用扫描电子显微镜在3.0kV的加速电压下采集图片,以观察血管支架的微观结构情况,结果如图2所示。
从图2中可以看出,脱细胞血管支架的纤维致密,孔隙率良好。
3、脱细胞血管支架的血液相容性
3.1、溶血率测试
利用吸光度来检测脱细胞血管支架的血液相容性。
从SD大鼠的腹主动脉收集血液,并将其放入含有肝素的离心管中。然后以2000rpm的转速离心15分钟,丢弃上清液。然后将生理盐水和沉淀的红细胞稀释成适当浓度的红细胞悬液。
实验组:将脱细胞组(对比例1)和改性支架组(实施例1)制备的血管支架切成1cm×1cm大小,分别加入5mL生理盐水中;使用蒸馏水作为阳性对照组,使用生理盐水作为阴性对照组。37℃水浴中恒温30min后,加稀释血液0.2mL,再于37℃水浴中处理1.5小时,然后以2000rpm离心10分钟。在孔板中加入适量上清液,放入酶标仪(美国赛默飞世尔)在540nm处检测吸光度。
溶血率(HR)的计算公式如下:
其中,A0表示实验组的吸光度;A1表示阳性对照组的吸光度;A2表示阴性对照组的吸光度。
脱细胞组和改性支架组的脱细胞血管支架的溶血率的测试结果如图3A。其中,Water为阳性对照组;Decell为脱细胞组(对比例1);Modified scaffold为改性支架组(实施例1)。
由图3A可以看出,兼具抗凝抗钙化的脱细胞血管支架的溶血率低于5%,血液相容性良好。
3.2、部分活化凝血酶原时间(APTT)测试
实验组:将脱细胞组和改性支架组的脱细胞血管支架取1cm×1cm标本,置于PBS缓冲液(37℃)中1h。然后取出,在37℃下与1mL贫血小板血浆孵育1h。
空白对照组:采用空白组织培养板(TCP)作为对照组。
各组均采用凝血分析系统(日本Sysmex)进行APTT测定。测试结果如图3B所示。图3B是APTT的柱形图。其中,TCP为空白对照组;Decell为脱细胞组(对比例1);Modifiedscaffold为改性支架组(实施例1)。
由图3B可以看出,与脱细胞组相比,改性支架组的APTT值更高,APTT值越高,血管堵塞的可能性越小,改性支架组脱细胞血管支架的抗凝效果更佳。
4、脱细胞血管支架的细胞相容性评价
利用共同培养后免疫荧光测试来观察血管支架材料和细胞共同生长情况。
将脱细胞组和改性支架组的血管支架用紫外线灯照射45min,置于24孔板中。每孔中加入500μL浓度为1×104个/mL的BMSCs(骨髓间充质干细胞)悬液,然后在37℃(5%CO2)培养箱中培养。培养5天后,取出培养板,用PBS缓冲液洗涤3次,以去除未附着的细胞。
在每个孔中加入4%多聚甲醛溶液固定材料20分钟。然后用PBS缓冲液洗涤两次,并加入0.5%Triton X-100溶液渗透20分钟。然后在24℃下用5%FBS(胎牛血清)封闭这些材料30分钟。然后在24孔板中加入兔抗鼠actin抗体和抗体稀释剂(1:500)。30分钟后,用PBS缓冲液清洗多余的抗体,并转移到暗室加入山羊抗兔二抗和抗体稀释液(1:500),继续孵育40分钟。
用PBS缓冲液清洗细胞两次后,在每个孔中加入50μL DAPI染色液并染色5分钟。然后吸出DAPI染色液,生理盐水清洗后在荧光显微镜下观察细胞并拍照。实验结果如图4所示。
图4是细胞与血管支架共同培养的荧光染色结果。其中,A为Decell(脱细胞组);B为Modified scaffold(改性支架组)。
由图4可以看出,荧光显微镜下肌动蛋白呈红色,细胞核呈蓝色,细胞在改性支架组的增殖更加活跃,表明实施例1的兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架的细胞相容性更佳。
5、钙含量变化趋势测定
利用原子吸收分光光度法测定钙含量。
皮下包埋后的血管支架分别于四个不同的时间点,采用10%的水合氯醛将SD大鼠麻醉取材后并处死,将脱细胞组、改性支架组的血管支架样品每组随机选取5段,每段样本重约0.1g,用灭菌PBS反复冲洗,直接置于冷冻管里低温保存。
称取两组血管标本(脱细胞组、改性支架组)中每个样品的质量,然后将样品置于聚四氟乙烯的坩埚中,加入5mL的硝酸和1mL高氯酸,再将坩埚放在电热板上,加盖,加热到微沸,保持2小时。消解结束后静置冷却到室温,用实验用水转移到50mL容量瓶中,定容,摇匀,待测。
分别移取适量的钙标准溶液至100mL容量瓶中,用1%的硝酸定容量至刻度后摇匀,使钙元素的质量浓度分别是0mg/L、1mg/L、2mg/L、5mg/L、8mg/L、10mg/L。由低到高浓度,依次测定标准溶液的吸光度,并建立标准曲线。
按照与标准曲线建立相同的仪器条件进行样品和空白的测定。若样品浓度范围超过标准曲线范围,则用1%硝酸溶液稀释后测定。
血管支架样品中钙元素的含量w(mg/kg)计算如下:
其中,w—样品中钙元素的含量;P—由标准曲线计算所得试样中钙的质量浓度mg/L;P0—空白试样中钙镁的质量浓度mg/L;V——试样的定容体积mL,D——试样的稀释倍数;m——样品的称样量g。实验结果如图5所示。图5是动物皮下包埋后脱细胞血管支架的钙含量变化趋势曲线。Decell为脱细胞组;Modified scaffold为改性支架组。Trend of Ca2+content为钙离子含量的变化趋势。
由图5可以看出,两组血管支架钙含量随着时间推移都呈现不断增加的趋势,尤其在术后15d之后显著升高,但是改性支架组钙含量在术后不同时间点均低于脱细胞组,这表明改性支架组(实施例1)的脱细胞血管支架的抗钙化性能优于单纯的脱细胞支架(对比例1)。
以上仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、用交联剂联合明胶对脱细胞血管材料进行预处理;
S2、将S1预处理后的血管材料与多巴胺溶液进行避光反应,之后浸泡于替罗非班溶液中,取出后干燥;
S3、将S2处理后的血管材料浸泡于降钙素混悬液中,取出后干燥;
S4、重复S2、S3步骤若干次,即得。
2.根据权利要求1所述的兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架的制备方法,其特征在于,S2中,所述多巴胺溶液的浓度为1~3.5mg/mL,pH=8~9.5;
所述替罗非班溶液的浓度为0.8~3.0mg/mL。
3.根据权利要求1所述的兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架的制备方法,其特征在于,S3中,降钙素混悬液的制备方法如下:
步骤一、将降钙素与水混合后,加入PLGA溶液,再超声破碎;
步骤二、将步骤一处理后的溶液与PVA溶液混合均匀,再超声破碎,干燥得到固化物;
步骤三、将固化物与Tris缓冲液进行超声混匀,得到降钙素混悬液。
4.根据权利要求3所述的兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架的制备方法,其特征在于,降钙素、PLGA、PVA的质量比为2~4:10~50:20~60。
5.根据权利要求1所述的兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架的制备方法,其特征在于,S1的具体操作如下:
将脱细胞的血管材料进行脱水处理,然后置于明胶溶液中振荡处理1.5~4h;干燥后,置于交联剂中振荡处理12~32h,之后置于磷酸二氢钠溶液中浸泡,以终止交联;再清洗干净。
6.根据权利要求5所述的兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架的制备方法,其特征在于,明胶溶液的质量浓度为1~7%;交联剂为EDC/NHS,交联剂的质量浓度为1~5‰;磷酸二氢钠溶液的质量浓度为0.5~2.5%。
7.根据权利要求1所述的兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架的制备方法,其特征在于,所述血管材料为哺乳动物血管材料。
8.采用权利要求1~7任意一项所述的制备方法制备得到的兼具抗凝与抗钙化的脱细胞血管支架。
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