CN117224737A - 一种用于促进骨修复的仿生压电支架及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种用于促进骨修复的仿生压电支架及其制备方法和应用。本发明提供的仿生压电支架将PLLA静电纺丝成定向的纳米纤维，并在纤维表面修饰上纳米羟基磷灰石，为了增强羟基磷灰石在纤维表面的粘附，在二者之间修饰一层聚多巴胺作为连接层，最终得到了一个高孔隙率、良好骨整合性、具有成骨促进作用的仿生压电支架。该支架在体外对MSCs招募、成骨分化试验和大鼠颅骨骨缺损的修复中表现出较好的骨再生促进作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种用于促进骨修复的仿生压电支架及其制备方法和应用。
背景技术
尽管急性或小型骨折通常无需任何手术治疗即可治愈，但巨大的骨缺损则需要整形外科手术，这给患者和整形外科医生带来了巨大的挑战。目前，骨移植有三种主要方法：自体、异体和人工支架移植。许多研究试图开发用于骨修复的合成材料，包括聚合物、水凝胶、陶瓷和金属支架。
根据骨骼的结构以及骨再生需要的条件，理想的骨移植生物材料需要满足较好的骨整合性、骨诱导性、可降解性、多孔性和生物相容性等。此外，早在1954年，日本科学家Yasuda首次报道了骨具有压电效应，即受压后其表面会产生电荷，并且电荷量正比于压力。之后人们发现这种压电效应在体内产生的内源性电场对于骨再生过程有重要影响，因此为了更好地促进骨再生过程，具有压电效应的骨植入材料成为一大研究热点。常见的压电材料有压电聚合物和压电陶瓷，压电陶瓷虽然具有较好的压电性能，但是压电陶瓷脆性大，加工难度大并且骨整合性差。因此，相比下压电聚合物具有更好的柔韧性和可加工性使其在骨植入材料方面具有更好的应用前景。常见的压电聚合物有聚偏氟乙烯(PVDF)以及其共聚物、聚左旋乳酸(PLLA)、3-羟基丁酸酯和其他天然聚合物(纤维素、胶原等)。相比于天然聚合物，人工合成的聚合物具有可调的机械性能以及成本低的优势，其中PVDF具有较高的压电输出，但是不可降解性限制了其在植入物方面的应用。聚左旋乳酸(PLLA)具有可降解性、无毒、无刺激性且具有可调的机械性能，是重要的生物可降解高分子材料，已经被美国食品和药品管理局批准用于临床，但是其压电系数相比聚偏氟乙烯较低，且存在骨整合性和成骨诱导性较差的问题。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明的第一目的在于提供一种用于促进骨修复的仿生压电支架的制备方法，该方法可以利用PLLA膜制备获得具有较高压电特性，且满足较好的骨整合性和骨诱导性的骨修复支架材料。
本发明的第二目的是提供利用上述方法制备得到的用于促进骨修复的仿生压电支架，该支架具有较高压电特性，且满足较好的骨整合性和骨诱导性的特点。
本发明的第三目的是提供上述仿生压电支架在制备促进骨修复的药物或医疗器械中的应用，表现出较好的骨再生促进作用。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
根据本发明第一个方面的内容，本发明提供一种用于促进骨修复的仿生压电支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)：提供具有压电特性、纤维定向排列的聚左旋乳酸纳米纤维膜；
步骤(2)：提供含有多巴胺的液体，将步骤(1)所述聚左旋乳酸纳米纤维膜置入所述含有多巴胺的液体中，所述多巴胺在纤维表面发生自聚得到聚多巴胺修饰纳米纤维膜；
步骤(3)：提供分散有羟基磷灰石的液体，将步骤(2)所述聚多巴胺修饰纳米纤维膜置入所述分散有羟基磷灰石的液体中，在聚多巴胺修饰纳米纤维膜表面进一步修饰羟基磷灰石得到所述仿生压电支架。
进一步地，步骤(1)所述聚左旋乳酸纳米纤维膜的制备过程包括以下步骤：
步骤(11)：以高分子量聚左旋乳酸为原料，利用静电纺丝法制备纤维定向排列的聚左旋乳酸纳米纤维膜；
步骤(12)：将步骤(11)中的聚左旋乳酸纳米纤维膜进行退火处理，得到具有压电特性、纤维定向排列的聚左旋乳酸纳米纤维膜；
和/或，步骤(1)中所述聚左旋乳酸纳米纤维膜，具有的压电系数大于0.5Pc/N；优选地，具有的压电系数大于1pC/N。
进一步地，步骤(11)中，所述高分子量聚左旋乳酸分子量为30万～50万。
进一步地，步骤(11)所述静电纺丝的方法为：纺丝采用正高压8kV～13kV，负高压2kV～5kV；纺丝距离为8cm～15cm，溶液挤出速度为0.5ml/L～1.5ml/h；
和/或，静电纺丝采用的接受装置是高速旋转的滚筒，旋转速度为800r/min～2000r/min。
进一步地，步骤(12)所述退火温度为120℃～150℃，退火时间为4h～8h。
进一步地，步骤(2)中多巴胺在纤维表面的自聚过程为在第一超声处理下进行；
和/或，步骤(3)中羟基磷灰石的修饰过程为在第二超声处理下进行。
进一步地，步骤(2)中所述含有多巴胺的液体按照以下方法制得：配制pH在8～8.5的Tris溶液，然后将盐酸多巴胺以2mg/ml的浓度分散到所述Tris溶液中；
和/或，所述第一超声处理，采用的超声功率为80W～100W，超声频率为20kHz～60kHz，超声处理时间为0.5h～2h。
进一步地，步骤(3)所述分散有羟基磷灰石的液体的制备方法为，将纳米羟基磷灰石以1mg/ml～10mg/ml的浓度分散到水中；
和/或，所述第二超声处理，采用的超声功率为80W～100W，超声频率为20kHz～60kHz，超声处理时间为0.5h～2h。
根据本发明第二个方面的内容，本发明提供一种用于促进骨修复的仿生压电支架，所述支架为根据上述的方法制备得到。
根据本发明第三个方面的内容，本发明提供上述仿生压电支架在制备促进骨修复的药物或医疗器械中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明提供的仿生压电支架的制备方法，先制备具有压电特性、纤维定向排列的聚左旋乳酸纳米纤维膜，并在纤维表面修饰上羟基磷灰石(HA)，为了增强羟基磷灰石在纤维表面的粘附，在二者之间修饰一层聚多巴胺(PDA)作为连接层。此外，压电特性的PLLA纳米纤维膜表面更容易产生电荷，吸引微小颗粒从而有利于其表面聚多巴胺和羟基磷灰石的修饰。最终得到了具有较高压电特性、良好骨整合性和骨诱导性的仿生压电支架。
2.本发明提供的仿生压电支架的制备方法，利用压电的PLLA纤维在超声作用下其表面更容易产生电荷，吸引多巴胺更快地接触纤维并与其之间形成氢键，多巴胺在短时间内聚集在纤维表面聚集成聚多巴胺(PDA)层，得到PDA-PLLA，该方法能够将修饰时间控制在2h之内，有利于缩短支架的制备时间和生产成本。
3.本发明提供的仿生压电支架，在早期能够快速招募内源性MSCs迁移至缺损位置，之后在超声压电的作用下促进成骨分化，实现一个程序性地促骨再生作用；该HPP支架的仿生结构以及高孔隙率有良好的骨整合性，能够诱导细胞定向排列，更有利于引导骨组织向天然骨生长。
4.本发明提供的仿生压电支架使用的原料PLLA、PDA和HA具有良好的生物相容性和生物可吸收性，最终可在体内降解，对生物体无毒副作用。
5.本发明提供的仿生压电支架在作为制备促进骨修复的药物或医疗器械中具有良好的应用前景，试验结果显示，在体外对MSCs招募、成骨分化试验和大鼠颅骨骨缺损的修复中，该HPP支架能够招募MSCs迁移，明显促进成骨分化，对骨再生具有促进作用。
说明书附图
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图；
图1为PLLA、PDA/PLLA和HPP的扫描电镜SEM图；
图2为HPP薄膜实物照片；
图3为PLLA、PDA/PLLA和HPP纤维直径分布图；
图4为PLLA、PDA/PLLA和HPP亲水性测试结果；
图5为PLLA、PDA/PLLA和HPP应力应变测试结果；
图6为PLLA-A和PLLA压电系数测试结果；
图7为PLLA-A和HPP的压电性能测试结果；
图8为PLLA、TCP、HPP生物相容性测试结果；
图9为MSCs招募测试的方案示意图；
图10为空白组、PLLA和HPP组迁移的细胞染色图；
图11为图10中对应的细胞个数统计图；
图12为TCP、PLLA和HPP组体外成骨分化诱导试验结果；
图13为空白组、PLLA和HPP组大鼠颅骨HE染色图；
图14为空白组、PLLA和HPP组颅骨修复情况的CT图；
图15为空白组、PLLA和HPP组新骨面积的统计图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供一种用于促进骨修复的仿生压电支架的制备方法，包括包括以下步骤：
步骤(1)：提供具有压电特性、纤维定向排列的聚左旋乳酸纳米纤维膜；
步骤(2)：提供含有多巴胺的液体，将步骤(1)所述聚左旋乳酸纳米纤维膜置入所述含有多巴胺的液体中，所述多巴胺在纤维表面发生自聚得到聚多巴胺修饰纳米纤维膜；
步骤(3)：提供分散有羟基磷灰石的液体，将步骤(2)所述聚多巴胺修饰纳米纤维膜置入所述分散有羟基磷灰石的液体中，在聚多巴胺修饰纳米纤维膜表面进一步修饰羟基磷灰石得到所述仿生压电支架。
上述技术方案中，以具有压电特性、纤维定向排列的聚左旋乳酸纳米纤维膜作为支架的基本材料，并在纤维表面修饰上羟基磷灰石(HA)，为了增强羟基磷灰石在纤维表面的粘附，在二者之间修饰一层聚多巴胺(PDA)作为连接层，最终得到了一个高孔隙率、良好骨整合性和骨诱导性的仿生压电支架。该支架具有仿生天然骨的结构，羟基磷灰石包覆在聚左旋乳酸纳米纤维膜在最外侧，在早期可以有效吸引内源性间充质干细胞MSCs迁移至支架上，产生压电信号刺激MSCs的成骨分化，促进骨组织的修复，定向排列的纤维结构能够诱导骨细胞沿着纤维结构生长，更有利于再生的骨组织形成定向从而更接近于天然骨组织的结构。
此外，压电特性的PLLA纳米纤维膜表面更容易产生电荷，容易吸引微小颗粒有利于其表面聚多巴胺和羟基磷灰石的修饰。该支架使用的原料PLLA、PDA和HA具有良好的生物相容性和生物可吸收性，最终可在体内降解，对生物体无毒副作用。
已有一些分析理论指出，聚左旋乳酸纳米纤维膜的压电性是由其分子链的不对称性分布导致，由于原料、制备方法和制备参数等不同使得聚左旋乳酸纳米纤维膜的压电特性会存在较大差异，一些方法制备的PLLA纤维膜是无定型的，或者结晶度较低，这种未经处理的PLLA纤维膜的压电性能是较低的或者压电特性趋近于无。作为进一步的限定，本发明所述具有压电特性的聚左旋乳酸纳米纤维膜，具有的压电系数大于0.5Pc/N；更进一步优选地，具有的压电系数大于1pC/N。
本发明提供上述仿生压电支架利用的是聚左旋乳酸纳米纤维膜的压电特性，需要指出的是，PLLA的分子量越大、纤维定向性越好，则越有利于压电性能的提高，然后对纳米纤维膜进行高温退火处理提高聚合物的结晶度，最终得到具有压电特性的聚左旋乳酸纳米纤维膜，作为优选的实施例，本发明提供以下可以获得较高压电特性的PLLA纤维膜的制备方法，其包括以下步骤：
步骤(11)：以高分子量聚左旋乳酸为原料，利用静电纺丝法制备纤维定向排列的聚左旋乳酸纳米纤维膜；
步骤(12)：将步骤(11)中的聚左旋乳酸纳米纤维膜进行退火处理提高聚合物的结晶度，得到具有压电特性、纤维定向排列的聚左旋乳酸纳米纤维膜。
虽然分子量大有利于PLLA压电性能的提高，但是分子量越高，则纺丝的难度会相应提高，作为优选的实施例，步骤(11)中，所述高分子量聚左旋乳酸的分子量为30万～50万，作为示例性地，其分子量例如可以是30万、35万、40万、45万和50万；作为进一步的优选例，本发明通过对纺丝工艺进行摸索，提出下述适配的纺丝条件，具体来说，纺丝采用正高压8kV～13kV，负高压2kV～5kV，作为示例性地，正高压可以为8kV、10kV、12kV和13kV等，负高压可以为2kV、3kV、4kV和5kV等；纺丝距离为8cm～15cm，溶液挤出速度为0.5ml/L～1.5ml/h，作为示例性地，纺丝距离例如可以为8cm、10cm、12cm和15cm；作为进一步的优选例，静电纺丝采用的接受装置是高速旋转的滚筒，旋转速度为800r/min～2000r/min，作为示例性地，旋转速度可以是800r/min、1000r/min、1200r/min、1500r/min、1800r/min、2000r/min。作为优选的实施例，所述退火温度为120℃～150℃，退火时间为4h～8h，作为示例性地，退火温度例如可以是120℃、130℃、140℃和150℃，退火时间例如可以是4h、5h、6h、7h和8h。
在本发明上述技术方案中，在PLLA表面制备聚多巴胺层能够作为连接桥将HA连接到PLLA纤维，申请人通过研究发现，在将上述具有压电特性的聚左旋乳酸纳米纤维膜中置入含有多巴胺的液体中，压电的PLLA纤维在超声的作用下产生表面电荷，吸引多巴胺更快地接触纤维并与其之间形成氢键，多巴胺在短时间内聚集在纤维表面聚集成聚多巴胺(PDA)层，得到PDA-PLLA，与一般的摇床条件下修饰多巴胺的方法相比，该方法将修饰时间从24h缩短到2h之内。作为优选地实施例，本发明步骤(2)中多巴胺在纤维表面的自聚过程为在第一超声处理下进行；和/或，步骤(3)中羟基磷灰石的修饰过程为在第二超声处理下进行。作为优选地实施例，所述第一超声处理和第二超声处理，可以各自独立地采用以下方法，采用的超声功率为80W～100W，超声频率为20kHz～60kHz，超声处理时间为0.5h～2h。作为示例性地，超声频率可以是80W、85W、90W、95W和100W；超声频率可以是20kHz、30kHz、40kHz、50kHz和60kHz；超声处理时间可以是0.5h、1h、1.5h和2h。
作为优选的实施例，本发明提供一种较佳的含有多巴胺的液体的配制方法，具体如下，配制pH在8～8.5的Tris溶液，然后将盐酸多巴胺以2mg/ml的浓度分散到所述Tris溶液中。
本发明中的支架利用PDA的连接作用将HA修饰到纤维膜的最外侧，具有天然骨仿生的结构，相比于现有的将HA与PLLA共同纺丝制备支架的方案，内部的HA分子需要在PLLA降解后才能释放，本发明中的支架在植入后，HA能够较快释放，从而有利于提高局部钙离子的浓度，在早期即可有效吸引内源性间充质干细胞MSCs迁移至支架上，产生压电信号刺激MSCs的成骨分化，促进骨组织的修复更有利于发挥HA提高成骨活性的作用。作为优选地实施例，所述分散有羟基磷灰石的液体的制备方法为，将纳米羟基磷灰石以1mg/ml～10mg/ml的浓度分散到水中。
本发明制备的仿生压电支架，可以根据实际使用场景对支架的厚度和形状进行加工，还可以延长纺丝时间增加薄膜厚度或者利用气体发泡技术将薄膜加工成三维形状。
本发明另一实施例还提供一种用于促进骨修复的仿生压电支架，所述支架为通过上述方法制备得到。所制备的仿生压电支架具有仿生天然骨的结构，具有较高的压电特性，且具有高孔隙率、良好骨整合性、具有成骨促进作用，纳米羟基磷灰石颗粒包覆在聚左旋乳酸纳米纤维的纤维表面，在早期可以有效吸引内源性间充质干细胞MSCs迁移至支架上，产生压电信号刺激MSCs的成骨分化，促进骨组织的修复，并且在该支架具有良好的生物相容性和生物可吸收性，最终在体内降解，对生物体无毒副作用。
本发明又一实施例还提供上述仿生压电支架在制备促进骨修复的药物或医疗器械中的应用。本发明提供了该仿生压电支架在体外对MSCs招募和成骨分化试验和大鼠颅骨骨缺损的修复中相关的实验验证。试验结果显示，HPP支架能够招募MSCs迁移，HPP支架能够明显促进成骨分化，HPP支架对骨再生具有促进作用。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：仿生压电支架的制备
(1)将医用级别分子量为35万PLLA粉末以10％的浓度溶解在六氟异丙醇溶液中，搅拌过夜后进行静电纺丝，纺丝的条件是正高压10kV，负高压3kV，纺丝距离是10cm，溶液挤出速度是1ml/h，接受装置是高速旋转的滚筒，旋转速度是1800r/min(此接受速度下得到的纤维是定向排列，这有利于提高纤维膜的压电性能)，纺丝时间是90min；纺丝完成后将得到的薄膜放在真空干燥箱中室温过夜，以充分挥发掉薄膜中残留的有机溶剂得到薄膜，所得薄膜命名为PLLA-A薄膜；
(2)将PLLA-A薄膜放在烘箱中140℃高温退火8h，以提高PLLA的结晶度从而提高PLLA薄膜的压电性能得到退火后的PLLA薄膜(命名为PLLA薄膜)，得到的纤维膜微观结构如图1a和图1d的扫描电镜SEM图所示，其中，图1a是该PLLA薄膜的表面结构，可以看出该PLLA薄膜具有非常大的孔隙率并且纤维定向排列；图1d是该薄膜的SEM截面图，可以看到该纤维直径在400nm～600nm；
(3)配制pH在8～8.5的Tris溶液，将盐酸多巴胺以2mg/ml的浓度溶解在该溶液中，将经退火处理的PLLA薄膜置于该溶液中，超声水浴下持续90min，超声的功率100W，频率为40kHz，压电的PLLA纤维在超声的作用下产生表面电荷，吸引多巴胺更快地接触纤维并与其之间形成氢键，多巴胺在短时间内聚集在纤维表面聚集成聚多巴胺(PDA)层，得到PDA/PLLA，与一般的摇床条件下修饰多巴胺的方法相比，该方法将修饰时间从24h缩短到2h之内，得到的PDA/PLLA薄膜微观结构如图1b和1e的扫描电镜SEM图所示，其中，图1b是PDA/PLLA薄膜的表面形貌SEM图，图1e是PDA/PLLA薄膜的SEM截面图，可以看到聚多巴胺层厚度在48nm左右。
(4)称量纳米羟基磷灰石(六方晶型，粒径10nm左右)粉末以5mg/ml分散在水溶液中，在超声水浴中充分分散10min，将上一步得到的PDA/PLLA薄膜浸入该溶液，然后在超声的功率100W，频率为40kHz继续超声1h，羟基磷灰石层被修饰，室温晾干后得到支架HA/PDA/PLLA(即HPP)，得到的HPP支架的微观结构如图1c和1f的扫描电镜SEM图所示，其中，图1c是该支架的表面SEM图，可以看到羟基磷灰石颗粒均匀包裹在纤维表面，图1f是该支架的SEM截面图，可以看出修饰层厚度在70nm左右，所制备的HPP薄膜实物照片如图2所示。
根据拍摄到的不同区域纤维SEM图片，利用ImageJ软件对图片中的纤维直径分别对上述PLLA薄膜、PDA/PLLA薄膜和HA/PDA/PLLA薄膜进行纤维直径分析，结果如图3所示，可以看出纤维直径整体上随着修饰层的进行依次增加，最终HPP支架的纤维直径大多分布在500nm～800nm范围内。
对上述PLLA薄膜、PDA/PLLA薄膜和HA/PDA/PLLA薄膜采用接触角测量仪进行纤维表面亲水性测试，亲水性测试结果如图4所示。结果显示，修饰过PDA和HA后，支架表面亲水性得到了极大地提高，其中原因包括PDA本身的亲水性和HA纳米颗粒对支架表面粗糙程度的增加，这有利于细胞的粘附和生长，其中HA作为骨的主要无机成分，对MSC的成骨向分化也具有促进作用，这两者协同下将大大提高支架的骨整合性。
对上述PLLA薄膜、PDA/PLLA薄膜和HA/PDA/PLLA薄膜使用薄膜应力测试仪进行应力应变测试，所得应力应变曲线如图5所示，可以看出支架在修饰的过程中杨氏模量逐渐增加。
实施例2：退火对于提高PLLA压电性能的测试
以上述实施例1中没有经过退火的PLLA-A薄膜和经过退火的PLLA薄膜进行试验，利用磁控溅射在薄膜两面镀一层金电极，然后利用D14压电测试仪对薄膜的D14方向上的压电系数进行测试，压电系数测试结果如图6所示。
结果显示，没有经过退火的PLLA-A的压电系数接近于0pC/N，退火后PLLA的压电系数达到2.22pC/N，说明退火过程有效提高了PLLA的压电性。
实施例3：压电性能测试
对实施例1中的HPP的压电性能进行测试，并以实施例1中没有经过退火的低压电性的PLLA-A薄膜作为空白对照，利用磁控溅射在PLLA-A或HPP两面镀一层金电极层，通过铜导线分别连接在示波器的正负极，然后用超声探头对支架施加功率1W/cm2的超声，压电性能测试结果如图7所示。
结果显示，没有经过退火的PLLA-A电信号输出几乎为零，说明其几乎没有压电性，HPP支架的电压信号为210mV左右，证实了该HPP支架的压电性。
实施例4：生物相容性测试
对实施例1的HPP支架进行生物相容性测试，并以细胞培养板(TCP)和实施例1中没有修饰HA的PLLA薄膜作为对照，在培养板、PLLA薄膜或HPP支架表面种上原代大鼠的MSCs细胞，在第1、3、5天对细胞进行CCK8测试(得到的吸光度数值与细胞活力成正比)，图8是得到的CCK8上清液在450nm波长的吸光度结果。
结果显示，HPP支架显示出优异的生物相容性，并且能有效促进细胞增殖。
实施例5：MSCs招募测试
对实施例1的HPP支架进行MSCs招募测试，并以空白和未修饰HA的PLLA膜作为对照，按照图9示出的测试方案示意图，将PLLA膜或者HPP支架放置于Transwell的下室，将MSCs种在上室，12h后对上室的底部的膜上细胞进行结晶紫染色，观察从上室迁移至膜上的细胞数量，图10是各组迁移的细胞染色图，图11是图10对应的细胞个数统计图；
结果显示，HPP支架能够招募MSCs迁移，猜测原因是HPP支架上修饰的HA会向溶液中缓慢释放钙离子，从而促进MSCs的迁移。
实施例6：体外对成骨分化的促进作用
对实施例1制备的HPP支架进行成骨分化诱导试验，以细胞培养板和未修饰HA的PLLA膜作为对照，将MSCs种植在其表面，待其贴壁后换用成骨分化培养基进行成骨分化诱导，用超声探头每天对细胞进行2min的超声刺激，超声功率为1W/cm2，在第3天和第7天利用碱性磷酸酶(ALP)提取试剂盒按照其要求对细胞的ALP进行提取和定量，ALP是成骨细胞中的特征酶，能够反应成骨分化程度，测试结果如图12所示，其中，图12a是ALP定量的统计图；相同的培养条件，在第7天对各组细胞进行BMP2和OCN(成骨细胞相关蛋白，显示出成骨分化程度)的免疫荧光染色，然后对荧光强度进行统计得到图12b和图12c；
结果显示，HPP支架在超声的作用下能够明显促进成骨分化。
实施例7：体内对内源性细胞的募集作用
在大鼠的头皮上竖向切开1cm左右的伤口，将颅骨上的结缔组织分离，暴露出颅骨后，避开颅骨的中缝在右侧利用环形钻头在颅骨上建立出圆形的骨缺损，得到SD大鼠的颅骨骨缺损模型，缺损区域为直径5mm的圆形，以空白和没有修饰HA的PLLA作为对照，在缺损处填充PLLA或者HPP支架，然后缝合伤口，术后十天对大鼠的颅骨进行取材固定脱钙后进行HE切片染色，如图13得到的是HE染色的结果。
可以看到HPP组已经有大量的细胞迁移到了支架位置并且生长入支架内部，这验证了HPP募集细胞的作用，与体外实验结果(实施例5)一致。
实施例8：在体内支架对骨再生的促进作用
手术过程同实施例7，术后10天内让支架对内源性细胞进行招募，第11天-第30天，每天对缺损部位进行0.8W/cm2的超声刺激2min，术后12周对大鼠的颅骨进行取材固定，然后进行CT拍摄，如图14是各组的颅骨修复情况的CT图，图15是对再生的新骨面积的统计图。
可以看到在术后12周，空白组还有大量缺损区域的情况下，HPP组大鼠的骨缺损区域几乎已经完全长满，验证了超声下HPP支架对骨再生的促进作用。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。
Claims (10)
1.一种用于促进骨修复的仿生压电支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：提供具有压电特性、纤维定向排列的聚左旋乳酸纳米纤维膜；
步骤(2)：提供含有多巴胺的液体，将步骤(1)所述聚左旋乳酸纳米纤维膜置入所述含有多巴胺的液体中，所述多巴胺在纤维表面发生自聚得到聚多巴胺修饰纳米纤维膜；
步骤(3)：提供分散有羟基磷灰石的液体，将步骤(2)所述聚多巴胺修饰纳米纤维膜置入所述分散有羟基磷灰石的液体中，在聚多巴胺修饰纳米纤维膜表面进一步修饰羟基磷灰石得到所述仿生压电支架。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述聚左旋乳酸纳米纤维膜的制备过程包括以下步骤：
步骤(11)：以高分子量聚左旋乳酸为原料，利用静电纺丝法制备纤维定向排列的聚左旋乳酸纳米纤维膜；
步骤(12)：将步骤(11)中的聚左旋乳酸纳米纤维膜进行退火处理，得到具有压电特性、纤维定向排列的聚左旋乳酸纳米纤维膜；
和/或，步骤(1)中所述聚左旋乳酸纳米纤维膜，具有的压电系数大于0.5Pc/N；优选地，具有的压电系数大于1pC/N。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(11)中，所述高分子量聚左旋乳酸分子量为30万～50万。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤(11)所述静电纺丝的方法为：纺丝采用正高压8kV～13kV，负高压2kV～5kV；纺丝距离为8cm～15cm，溶液挤出速度为0.5ml/L～1.5ml/h；
和/或，静电纺丝采用的接受装置是高速旋转的滚筒，旋转速度为800r/min～2000r/min。
5.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤(12)所述退火温度为120℃～150℃，退火时间为4h～8h。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中多巴胺在纤维表面的自聚过程为在第一超声处理下进行；
和/或，步骤(3)中羟基磷灰石的修饰过程为在第二超声处理下进行。
7.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述含有多巴胺的液体按照以下方法制得：配制pH在8～8.5的Tris溶液，然后将盐酸多巴胺以2mg/ml的浓度分散到所述Tris溶液中；
和/或，所述第一超声处理，采用的超声功率为80W～100W，超声频率为20kHz～60kHz，超声处理时间为0.5h～2h。
8.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述分散有羟基磷灰石的液体的制备方法为，将纳米羟基磷灰石以1mg/ml～10mg/ml的浓度分散到水中；
和/或，所述第二超声处理，采用的超声功率为80W～100W，超声频率为20kHz～60kHz，超声处理时间为0.5h～2h。
9.一种用于促进骨修复的仿生压电支架，其特征在于，所述支架由权利要求1～8任一项所述的方法制备得到。
10.权利要求9所述仿生压电支架在制备促进骨修复的药物或医疗器械中的应用。
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- 2023-11-02 CN CN202311445399.XA patent/CN117224737A/zh active Pending
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