CN105950551A - 趋磁性免疫细胞及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种趋磁性免疫细胞,其由免疫细胞与摄取入所述免疫细胞中的磁性纳米粒构成。本发明所述的趋磁性免疫细胞,其能够有效地富集在肿瘤部位,提高细胞免疫治疗的靶向性。
Description
技术领域
本发明涉及一种靶向性免疫细胞及其构建方法和应用,特别是涉及一种趋磁性免疫细胞及其构建方法和应用。
背景技术
自2015年初美国宣布启动精准医疗计划(Precision Medicine Initiative)以来,精准医疗为复杂慢性病的治疗打开了新的希望之门,受到医学界、科技界乃至普通医生与患者的广泛关注。在恶性肿瘤治疗方面,如何实现精准细胞免疫治疗(Precision Cell Immunotherapy,PCIT)成为国内外研究的大热点。目前以嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)技术为代表的免疫治疗的技术,利用肿瘤细胞的特定抗原来靶向清除肿瘤已取得突破性进展,为PCIT的发展奠定了坚实基础。可以预期,今后PCIT将根据每个患者的肿瘤个性特征,针对个体特定的肿瘤抗原进行更特异性地杀伤肿瘤细胞,而不损伤正常细胞。
原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,发病率占全球的50%以上,死亡率居恶性肿瘤第二位。目前手术和化疗是肝癌临床治疗的主要手段,然而因为肝癌发生隐匿、进展快,且恶性程度高,临床诊断发现时多为中晚期,失去了手术和局部治疗时机,且容易产生多药耐药(Multidrug Resistance,MDR)而导致化疗药物无效,所以,PCIT在肝癌患者的临床应用上具有更为重要的意义和价值。
众所周知,免疫细胞具有一定的生命周期,在静脉输注治疗用免疫细胞之后,如果大量细胞在体内循环时间过长而不能到达肿瘤部位,即会自身发生凋亡,无从发挥精准治疗作用。因此,是否能保证有效剂量的免疫细胞到达肿瘤组织部位是决定免疫细胞治疗效果的关键因素之一。为此,一方面是借助基因转染技术,在体外将相应的传递共刺激信号元件导入T细胞,从而延长回输后T细胞在体内的存活时间与治疗作用,但技术手段繁琐,操作流程耗时费力,成本较高;另一方面是借助靶向技术,包括被动靶向和主动靶向,但由于在一些缺乏血管的肿瘤中无法增强免疫细胞渗透和滞留效果导致被动靶向失能,而受体与配体一对一的严格对应关系也限制了主动靶向的普适性。上述的缺陷均制约着免疫细胞在肿瘤部位的富集效率,降低了免疫治疗的效果。
发明内容
基于此,本发明的目的在于,提供一种趋磁性免疫细胞,其能够有效地富集在肿瘤部位,提高细胞免疫治疗的靶向性。
本发明的另一个目的在于,提供所述的趋磁性免疫细胞的构建方法。
一种趋磁性免疫细胞,由免疫细胞与摄取入所述免疫细胞中的磁性纳米粒构成。
在其中一个实施例中,所述的磁性纳米粒为多糖修饰Fe3O4磁性纳米粒;其由多糖包裹或共价连接在Fe3O4纳米粒的表面形成。
在其中一个实施例中,所述的多糖修饰Fe3O4磁性纳米粒的粒径为40~200nm,更优选为40~100nm,其表面Zeta电势为5.0~30.0mV;所述的Fe3O4纳米粒的粒径为1~25nm。
在其中一个实施例中,所述的多糖与所述的Fe3O4纳米粒的质量比为1:1~9:1。
在其中一个实施例中,所述的多糖为普鲁兰多糖或者壳聚糖。
在其中一个实施例中,所述的多糖修饰Fe3O4磁性纳米粒为普鲁兰多糖修饰Fe3O4磁性纳米粒;所述的普鲁兰多糖的分子量为1万~20万道尔顿。
在其中一个实施例中,所述的免疫细胞包括T淋巴细胞、NK淋巴细胞、单核吞噬细胞等。
本发明所述的趋磁性免疫细胞的构建方法,包括以下步骤:将磁性纳米粒分散于细胞培养基中,然后加入免疫细胞的细胞悬液中,经共孵育后,离心收集细胞,即得到所述的趋磁性免疫细胞。
在其中一个实施例中,细胞悬液的免疫细胞浓度为1~20×105个/mL,磁性纳米粒在细胞悬液的终浓度为5~200μg/mL,共孵育的时间为2~48小时。
在其中一个实施例中,离心的转速为1000~1200rpm,离心的时间为3~10分钟。
在其中一个实施例中,所述磁性纳米粒的制备方法包括以下步骤:采用多元醇法制备Fe3O4纳米粒,分散于有机溶剂中,然后加入含有乳化剂、表面活性剂的多糖水溶液中,经充分乳化后将其固化,然后经透析处理后,得到所述的磁性纳米粒。
在其中一个实施例中,所述的多糖为普鲁兰多糖或壳聚糖;所述的乳化剂为聚乙烯醇(PVA);所述的表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠(SDBS);所述的有机溶剂为正己烷、氯仿或二氯甲烷。
本发明所述的趋磁性免疫细胞,可应用于制备抗肿瘤药物。
在其中一个实施例中,所述的抗肿瘤药物为抗肝癌药物。
本发明所述的趋磁性免疫细胞,具有以下优点:
1、通过将磁性纳米粒引入免疫细胞中,能够在外加磁场的作用下,在体外控制有效剂量的免疫细胞富集于肿瘤部位,提高细胞免疫治疗的靶向性,更有效地杀伤肿瘤细胞,减少对正常细胞的损伤。同时,能够在体外调控并跟踪机体血液中趋磁性免疫细胞的数量变化,对比观察其与肿瘤缩小或肿瘤复发、进展的关联性,并能实时监控肿瘤微环境中趋磁性免疫细胞的含量变化,从而实现临床对病情的实时准确判定,甚至实现预判的目标,以作出相应治疗对策的调整,达到精准细胞免疫治疗的效果。
2、磁性纳米粒采用Fe3O4纳米粒作为内核,其具有粒径小、灵敏度高、磁响应性高、生物相容性好、毒性低且性能稳定等优点。Fe3O4一般不会对人体产生毒副作用,摄入体内后,除部分被人体利用外,其余的均可通过皮肤、胆汁、肾脏等安全排出体外。而Fe3O4纳米粒经过多糖表面修饰后,能够在保证磁性的基础上增加纳米粒的生物亲和性,从而提高免疫细胞对磁性纳米粒的摄取。此外,由于多糖分子链含有丰富的羟基,经多糖表面修饰后有利于在纳米粒的表面作后续的修饰和标记。
3、经多糖表面修饰的Fe3O4纳米粒,具有粒径可控、粒径分布均匀、形态光滑圆整、分散性好等优点。由于Fe3O4纳米粒的粒径小,表面电荷绝对值小,其溶液状态下易于聚集沉淀,稳定性差。经多糖表面修饰后,使纳米粒的表面电荷绝对值增大,稳定性增强,不容易聚集沉淀。通过调整多糖与Fe3O4纳米粒的比例,还可以调控磁性纳米粒的粒径及形态。
4、通过将多糖修饰Fe3O4磁性纳米粒的粒径控制在40~200nm的范围,能够保证磁性纳米粒可通过细胞膜相互作用进入免疫细胞中,保证磁性纳米粒可被免疫细胞摄取,并能保证进入胞浆内的磁性纳米粒不会对免疫细胞的正常生理功能造成损害;而将其表面Zeta电势控制在5.0~30.0mV,能够进一步提高磁性纳米粒的稳定性,使之更容易与免疫细胞的表面受体相结合,提高免疫细胞对磁性纳米粒的摄取量。此外,通过将多糖与Fe3O4纳米粒的质量比控制在1:1~9:1,能够保证多糖可完全包覆Fe3O4纳米粒,并控制磁性纳米粒的粒径在40~200nm的范围内。
5、普鲁兰多糖是一种水溶性的中性直链多糖,其耐酸碱性好、可塑性强、成膜性好、透气性低、无吸湿性,水溶液粘度明显低于其它多糖溶液,而且无毒、无免疫原性、无致突变作用、无致畸作用,并具有良好的生物相容性和可生物降解性。此外,普鲁兰多糖是肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体的特异性配基,对肝脏具有主动靶向性。经普鲁兰多糖表面修饰的Fe3O4纳米粒,通过细胞摄取,一部分通过细胞膜进入胞浆,一部分黏附于细胞膜表面,能够进一步提高免疫细胞对肝脏的靶向性,提高肝脏肿瘤的免疫治疗效果。通过将普鲁兰多糖的分子量控制在1万~20万道尔顿,能够保证修饰后的磁性纳米粒具有良好的水溶性和粘度值,能够提高磁性纳米粒的分散性和稳定性。
本发明所述的趋磁性免疫细胞的构建方法,能够保证磁性纳米粒有效摄入免疫细胞内。其中,磁性纳米粒在细胞悬液的终浓度控制在5~200μg/mL,一方面保证了磁性纳米粒不会对免疫细胞的活性产生不良影响,另一方面保证了单位浓度的免疫细胞能够摄取有效剂量的磁性纳米粒,从而形成具有趋磁性的免疫细胞。离心收集细胞时,将离心转速控制在1000~1200rpm,能够保证最大限度地收集细胞,且不会对细胞活性产生不良影响,收集得到的细胞亦易于分散,不会聚集成团;同时,在该转速范围内,未摄取磁性纳米粒的免疫细胞不发生沉淀,因而能有效地分离收集所得到的趋磁性免疫细胞。
附图说明
图1为趋磁性T淋巴细胞的显微镜观察图;
图2为趋磁性T淋巴细胞的流式细胞图;
图3为Fe3O4纳米粒的透射电镜图;
图4为普鲁兰多糖修饰Fe3O4磁性纳米粒的透射电镜图;
图5为Fe3O4纳米粒的X射线衍射图;
图6为Fe3O4纳米粒的电子衍射环图;
图7为普鲁兰多糖修饰Fe3O4磁性纳米粒的粒径分布图;
图8为普鲁兰多糖修饰Fe3O4磁性纳米粒的细胞毒性效应图;
图9为无外加磁场作用下的趋磁性T淋巴细胞的显微镜观察图;
图10为有外加磁场作用下的趋磁性T淋巴细胞的显微镜观察图。
具体实施方式
实施例一:Fe3O4纳米粒的制备
采用多元醇法制备Fe3O4纳米粒:将720mg乙酰丙酮铁置于带有冷凝管的100mL三颈瓶中,抽真空、通氮气反复三次,然后将40mL三甘醇注射到反应体系中,磁力搅拌,沙浴加热,缓慢升温至180℃,保温30min;然后快速升温至278℃(三甘醇的沸点),回流30min,得黑色磁流体;冷至室温,用乙醇:乙酸乙酯(体积比为1∶10)的混合溶液反复洗涤三次,经磁分离后,得到粒径为1~25nm的Fe3O4纳米粒。将Fe3O4纳米粒复分散在乙醇中,低温保存备用。
实施例二:普鲁兰多糖修饰Fe3O4磁性纳米粒(MMNPs)的制备
取Fe3O4纳米粒100mg,分散在10mL正己烷中,将300mg分子量为2~10万道尔顿的普鲁兰多糖分散在30~100mL含有0.5~2.0wt%聚乙烯醇(PVA)和0.2~2.0wt%十二烷基苯磺酸钠(SDBS)的水溶液中,采用乳匀机在15000rpm的转速下充分乳化2分钟,而后采用机械搅拌器在600rpm的转速下搅拌4~8小时,使正己烷挥发,纳米粒固化成形,然后用去离子水透析48小时,得到纯化的普鲁兰多糖修饰Fe3O4磁性纳米粒。
通过调整Fe3O4米粒与多糖的比例、乳化剂及表面活性剂的浓度、乳化的强度以及分散溶剂的选择,可以调控磁性纳米粒的粒径(几十纳米到几百纳米)及形态(单颗纳米粒、团簇等)。
实施例三:趋磁性T淋巴细胞(mt-T)的构建
1、人外周血T淋巴细胞的分离扩增
采用Ficoll密度梯度离心法分离出人外周血单个核细胞,经尼龙毛柱分离纯化及免疫磁珠分选,分离出CD3+T细胞,然后用无血清低糖DMEM培养液,在37℃、5%CO2的条件下培养72小时。分离得到的T细胞活性好,如图1和图2所示。
2、趋磁性T淋巴细胞(mt-T)的构建
取指数生长期的密度为5~10×105个/mL的T细胞悬液5mL,在37℃、5%CO2的条件下培养24小时。取实施例二制得的MMNPs,分散于无血清低糖DMEM培养液中,然后加入培养后的T细胞悬液中,MMNPs在T细胞悬液中的终浓度为20~100μg/mL。在37℃、5%CO2的条件下,将MMNPs与T细胞共孵育12~36小时。取共孵育后的T细胞悬液,置于离心机中,在1000rpm的转速下离心5分钟,去上清液,加入5~10mL无血清低糖DMEM培养液后重复离心一次,去上清液,收集细胞,得到所述的趋磁性T淋巴细胞。
实施例四:普鲁兰多糖修饰Fe3O4磁性纳米粒(MMNPs)的性能测定
1、Fe3O4纳米粒和MMNPs的形态观察
分别取实施例一制得的Fe3O4纳米粒以及实施例二制得的MMNPs,置空气中自然干燥,然后分别置于透射电镜下观察其形态。结果分别如图3和图4所示,Fe3O4纳米粒以及MMNPs颗粒均分散均匀,无粘连,表面光滑圆整。
2、Fe3O4纳米粒的X射线衍射测定
取实施例一制得的Fe3O4纳米粒30mg,研磨成粉末,在40Kv、25mA、Cu/Kα(γ=0.154nm)的条件下对其晶型结构进行检测,其X射线衍射图谱如图5所示。由图5可见,2θ分别出现在30.28°、35.68°、43.30°、53.62°、57.22°和62.86°处,其分别对应于Fe3O4的(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)晶面,显示为反尖晶石结构的特征峰。但是2θ值相比于文献值偏小,根据Scherrer公式B=0.89λ/Dcosθ(B为半峰值强度处所测量得到的衍射线条的宽化度,D为晶粒直径,λ为所用射线的波长,θ为布拉格衍射角)可知,经多元醇法制备的Fe3O4纳米粒具有较小的晶体粒径。
3、Fe3O4纳米粒的电子衍射环测定
取实施例一制得的Fe3O4纳米粒,配制成5μg/mL的水溶液,用移液枪将其滴加在洁净的单晶硅片上,室温下自然干燥,将带有样品的单晶硅片粘附于导电胶带上,在加速电压200kV、束斑尺寸1.0~25nm、倾斜角为±35°的参数条件下,观察Fe3O4纳米粒的电子衍射图像,结果如图6所示。由图6可见,Fe3O4纳米粒的电子衍射环呈现规整的同心圆结构,据此推测Fe3O4纳米粒为规则的多晶结构。
4、MMNPs的粒径测定
采用动态光散射法(氩离子激光器,波长为670nm,动态光散射角为90°,温度为25±0.1℃),分别对实施例二制得的MMNPs的粒径、粒径分布进行测定,结果如图7所示。内层Fe3O4纳米粒的平均粒径为2.8~14.5nm,MMNPs的平均粒径为45.2~180.5nm。
5、MMNPs的稳定性测试
取实施例二制得的MMNPs,以5μg/mL的浓度分散于水溶液中,置于4℃下避光保存。采用激光粒度分析仪,测定MMNPs的粒径分布及Zeta电势。测定结果表明,在4℃条件下,MMNPs悬浮液的粒径以及Zeta电势在15天内未见明显改变,肉眼观察亦无可见沉淀等聚集现象,结果如表1所示(P<0.05)。测定结果表明,MMNPs在水溶液中分散均匀,具有良好的稳定性和分散性。
表1MMNPs的稳定性测试结果
实施例五:普鲁兰多糖修饰Fe3O4磁性纳米粒(MMNPs)的细胞毒性试验
取细胞密度为5×104个/mL的T细胞悬液,加入96孔培养板中,每孔100μL,在37℃、5%CO2的条件下培养24小时。取实施例二制得的MMNPs,分散于无血清低糖DMEM培养液中,然后加入培养板中,使MMNPs在T细胞悬液中的终浓度分别为1、10、50、100、200、500、1000和2000μg/mL,每个浓度梯度设置12个孔,继续在37℃、5%CO2的条件下培养24小时或48小时。然后向每孔加入10μL的CCK-8试剂盒中的2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐溶液,继续培养4小时。然后用酶标仪测定各孔细胞悬液在450nm处的吸光度A。
细胞活力(%)=[A1–A0]/[A2–A0]×100
A0表示无血清低糖DMEM培养液的吸光度,A1表示加入MMNPs的T细胞悬液的吸光度,A2表示未加入MMNPs的T细胞悬液的吸光度。
测定结果如图8所示,表明MMNPs的浓度小于等于1000μg/mL时,对T细胞的活力无显著性影响,细胞活力均在90%以上,无显著毒性。
实施例六:趋磁性T淋巴细胞(mt-T)的趋磁性能测定
取实施例三制得的趋磁性T淋巴细胞悬液5mL,其细胞浓度为5~10×105个/mL,接种于培养皿中,在37℃、5%CO2的条件下培养24小时。取一片圆形的钕铁硼永磁片(直径为5mm,厚度为2~5mm),固定于培养皿底部外侧部位,磁场强度控制为20~400mT。继续在37℃、5%CO2的条件下培养24小时,然后于显微镜下观察细胞的聚集情况。观察结果显示,磁场区域的细胞密度显著增加,如图9和图10所示,细胞计数结果表明,磁场区域的细胞密度相对于无磁场区域的细胞密度增加270%,表明在一定的磁场强度范围内,本发明的趋磁性T淋巴细胞具有明显的趋磁性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种趋磁性免疫细胞,其特征在于,由免疫细胞与摄取入所述免疫细胞中的磁性纳米粒构成。
2.根据权利要求1所述的趋磁性免疫细胞,其特征在于,所述的磁性纳米粒为多糖修饰Fe3O4磁性纳米粒;其由多糖包裹或共价连接在Fe3O4纳米粒的表面形成。
3.根据权利要求2所述的趋磁性免疫细胞,其特征在于,所述的多糖修饰Fe3O4磁性纳米粒的粒径为40~200nm,其表面Zeta电势为5.0~30.0mV;所述的Fe3O4纳米粒的粒径为1~25nm;所述的多糖与所述的Fe3O4纳米粒的质量比为1:1~9:1。
4.根据权利要求2或3所述的趋磁性免疫细胞,其特征在于,所述的多糖修饰Fe3O4磁性纳米粒为普鲁兰多糖修饰Fe3O4磁性纳米粒;所述的普鲁兰多糖的分子量为1万~20万道尔顿。
5.权利要求1所述的趋磁性免疫细胞的构建方法,包括以下步骤:将磁性纳米粒分散于细胞培养基中,然后加入免疫细胞的细胞悬液中,经共孵育后,离心收集细胞,即得到所述的趋磁性免疫细胞。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,细胞悬液的免疫细胞浓度为1~20×105个/mL,磁性纳米粒在细胞悬液的终浓度为5~200μg/mL,共孵育的时间为2~48小时;离心收集细胞的离心转速为1000~1200rpm,离心时间为3~10分钟。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法,其特征在于,所述磁性纳米粒的制备方法包括以下步骤:采用多元醇法制备Fe3O4纳米粒,分散于有机溶剂中,然后加入含有乳化剂、表面活性剂的多糖水溶液中,充分乳化后将其固化,然后经透析处理后,得到所述的磁性纳米粒。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述的多糖为普鲁兰多糖或壳聚糖;所述的乳化剂为聚乙烯醇;所述的表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠;所述的有机溶剂为正己烷、氯仿或二氯甲烷。
9.权利要求1所述的趋磁性免疫细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述的抗肿瘤药物为抗肝癌药物。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160921 |