CN108159495B - 3d生物蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

3d生物蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种3D生物蛋白及其制备方法和应用，将荧光素标记的白蛋白与光敏剂混合形成的混合液，然后在氧分压为0.25Kpa～0.35Kpa、氧气浓度为70％～80％的条件下，采用激发光的波长为700nm～750nm，激发光的能量为10mW～30mW的激发光逐层扫描混合液，使得混合液固化得到3D生物蛋白。实验结果表明，这种方法制备的3D生物蛋白孔隙小、表面较光滑、硬度较高。

Description

3D生物蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物材料领域，特别是涉及一种3D生物蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
传统的体外培养干细胞的方式是将干细胞种植在培养皿中，但是这样的环境是单一的，仅仅给细胞提供了一个平铺的二维结构空间。为了能够更贴近人体三维空间效果，一些可降解的聚合物生物材料出现了，比如通过光刻技术，或者电纺技术等等制备一些三维图案给细胞生长，但是这类技术均存在制作工艺复杂，周期长，制作过程有毒性物质的加入，结构单一化随机化的缺点，并且聚合物材料本身并不受细胞青睐。因此还需要在材料表面镀一层蛋白，才使得细胞附着在上面。而基于双光子激发的光化学交联反应得出的生物蛋白材料不仅能够弥补这些缺点，还可以做到微纳米级别的形态控制，材料中添加多种蛋白材料，改变结构软硬度等特性，从而可以更好的模仿细胞在人体内真实的微环境。
然而传统的生物蛋白得到的具有多孔性且硬度不强，造成有些细胞种植在材料上时，自体所分泌的蛋白，生长因子和激素等不能够完全作用于细胞与细胞之间，有些会渗透进生物蛋白材料本身，影响实验效果。
综上，传统的3D生物蛋白孔隙较大、表面粗糙度较大、硬度不强。
发明内容
基于此，有必要提供一种孔隙小、表面较光滑、硬度较高的3D生物蛋白及其制备方法和应用。
一种3D生物蛋白的制备方法，包括如下步骤：
将荧光素标记的白蛋白与光敏剂混合得到混合液；以及
在氧分压为0.25Kpa～0.35Kpa、氧气浓度为70％～80％的条件下，采用激发光逐层扫描所述混合液使得所述混合液固化得到所述3D生物蛋白，其中，所述激发光的波长为700nm～750nm，所述激发光的能量为10mW～30mW。
在一个实施方式中，所述荧光素标记的白蛋白中，所述荧光素选自FITC和PE中的至少一种，所述白蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、人重组血清白蛋白、羊血清白蛋白和兔血清白蛋白中的至少一种。
在一个实施方式中，所述光敏剂为虎红钠盐。
在一个实施方式中，所述混合液中，所述荧光素标记的白蛋白的终浓度为50mg/mL～100mg/mL，所述光敏剂的终浓度为0.05w/v％～0.15w/v％。
在一个实施方式中，所述采用激发光逐层扫描所述混合液的操作中，逐层扫描时各层所述扫描截面相互平行，各层所述扫描截面的面积为0.05μm2～1μm2，相邻的两层所述扫描截面的间距为0.1μm～1.5μm。
在一个实施方式中，所述在氧分压为0.25Kpa～0.35Kpa、氧气浓度为70％～80％的条件下，采用激发光逐层扫描所述混合液使得所述混合液固化的操作具体包括：
将所述混合液置于高氧密封仓中，所述高氧密封仓内的氧分压为0.25Kpa～0.35Kpa、氧气浓度为70％～80％；以及
在所述高氧密封仓中采用激发光逐层扫描所述混合液使得所述混合液固化。
一种3D生物蛋白，通过上述任一项所述的3D生物蛋白的制备方法制备得到。
一种生物芯片，包括基底以及设置在所述基底表面上的3D生物蛋白，所述3D生物蛋白通过上述任一项所述的3D生物蛋白的制备方法制备得到。
在一个实施方式中，所述3D生物蛋白为多个且相互间隔。
上述的3D生物蛋白或上述任一项所述的生物芯片在制备医用功能材料中的应用。
上述3D生物蛋白的制备方法，将荧光素标记的白蛋白与光敏剂混合形成的混合液，然后在氧分压为0.25Kpa～0.35Kpa、氧气浓度为70％～80％的条件下，采用激发光的波长为700nm～750nm，激发光的能量为10mW～30mW的激发光逐层扫描混合液，使得混合液固化得到3D生物蛋白。实验结果表明，这种方法制备的3D生物蛋白孔隙小、表面较光滑、硬度较高。
附图说明
图1为一实施方式的制备3D生物蛋白的示意图；
图2为实施例1制备的3D生物蛋白阵列的扫描电镜图；
图3为另一个角度的实施例1制备的3D生物蛋白的扫描电镜图；
图4为另一个角度的实施例1制备的3D生物蛋白的扫描电镜图；
图5为对比例1制备的蛋白材料阵列的扫描电镜图；
图6为另一个角度的对比例1制备的3D生物蛋白的扫描电镜图；
图7为实施例1制备的3D生物蛋白与对比例1制备的3D生物蛋白的扫描电镜图对比图。
具体实施方式
下面主要结合附图及具体实施例对3D生物蛋白及其制备方法和应用作进一步详细的说明。
本文中所述的3D生物蛋白是指具有立体结构的蛋白材料，3D生物蛋白的形状可以是任意的，例如圆柱体、长方体过其它不规则的形状。
一实施方式的3D生物蛋白的制备方法，包括如下步骤S110～S120。
S110、将荧光素标记的白蛋白与光敏剂混合得到混合液。
在一个实施方式中，荧光素标记的白蛋白中，荧光素选自FITC(异硫氰酸荧光素)和PE(藻红蛋白)中的至少一种。白蛋白选自牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、人重组血清白蛋白、羊血清白蛋白和兔血清白蛋白中的至少一种。
在一个实施方式中，光敏剂为虎红钠盐(RB)。
具体地，混合液中，荧光素标记的白蛋白的终浓度为50mg/mL～100mg/mL。光敏剂的终浓度为0.05w/v％～0.15w/v％。
具体地，w/v％表示质量体积比，即光敏剂在混合液中的终浓度为0.5g/L～1.5g/L。
在一个实施方式中，荧光素标记的白蛋白与光敏剂混合后，还需要加入一定量的溶剂，以形成合适的浓度，具体地，溶剂为水。
荧光素标记的白蛋白与光敏剂能够在光照射下发生交联反应。
S120、在氧分压为0.25Kpa～0.35Kpa、氧气浓度为70％～80％的条件下，采用激发光逐层扫描S110中得到的混合液使得混合液固化得到3D生物蛋白，其中，激发光的波长为700nm～750nm，激发光的能量为10mW～30mW。
一种生物蛋白材料的制备方法是采用白蛋白与光敏剂在激光条件下发生交联反应制备，但是这制备的生物蛋白多孔、孔隙较大且硬度不强，造成有些细胞种植在材料上时，自体所分泌的蛋白，生长因子和激素等不能够完全作用于细胞与细胞之间，有些会渗透进生物蛋白材料本身，影响实验效果。
发现这一技术问题后，迫切需要一种制备3D生物蛋白的方法，以在保证3D生物蛋白的蛋白原有的性能基础上，使得减小3D生物蛋白的空隙、降低表面粗糙度并增强硬度。发明人通过不断的探索改进，意外发现在制备生物蛋白材料时，采用荧光素标记白蛋白，并在氧分压为0.25Kpa～0.35Kpa、氧气浓度为70％～80％的条件下，采用激发光的波长为700nm～750nm、激发光的能量为10mW～30mW的激发光逐层照射，制备得到的3D生物蛋白孔隙小、表面较光滑、硬度较高，很好的解决了细胞分泌的生长因子激素等进入生物蛋白材料本身的问题，具有预料不到的技术效果。
分析原因可能是荧光素标记的白蛋白与光敏剂在激光条件下发生交联反应，光敏剂被特定波长(700nm～750nm)和光能量(10mW～30mW)的激发光激发，光敏剂返回一个发射光，该发射光会进一步激发荧光素标记的白蛋白上的荧光素，使得荧光素标记的白蛋白、光敏剂以及周围氧气环境中的氧自由基三者发生共价重新结合，形成3D生物蛋白，这种3D生物蛋白内部结构交联更加紧密，从而使得制备的3D生物蛋白表面光滑，硬度高。
具体地，在氧分压为0.25Kpa～0.35Kpa、氧气浓度为70％～80％的条件下，采用激发光逐层扫描混合液使得混合液固化的操作具体包括：将混合液置于高氧密封仓中，高氧密封仓内的氧分压为0.25Kpa～0.35Kpa、氧气浓度为70％～80％。以及在高氧密封仓中采用激发光逐层扫描混合液使得混合液固化。
进一步地，氧分压为0.28Kpa～0.32Kpa、氧气浓度为73％～77％。
将混合液置于高氧密封仓中，通过高氧密封仓提供氧分压为0.25Kpa～0.35Kpa的氧分压，以及氧气浓度为70％～80％。在激发光逐层扫描的使得混合液固化的过程中，环境中的氧分压的较为稳定，提高制得的3D生物蛋白的光滑性。
具体的，氧气浓度是指氧气的体积百分比，例如氧气浓度为70％～80％，表示指氧气占高氧密封仓内气体的体积的70％～80％。
在一个实施方式中，采用激发光逐层扫描所述混合液使得混合液固化得到3D生物蛋白的操作中，还包括提供一定的湿度条件，进一步提高制得的3D生物蛋白的光滑性和硬度，具体地，湿度为45％～70％。
具体地，逐层扫描是指从一个方向到另一个方向，例如激发光先扫描混合液的液底，然后向上移动一定距离，继续扫描下一层液面，混合液逐渐固化形成3D生物蛋白。
在一个实施方式中，采用激发光逐层扫描混合液的操作中，激发光分为多束激光单元，多束激光单元同时逐层扫描混合液，以在混合液中同时形成多个3D生物蛋白，简便的实现批量化生产。例如在同一个混合液中，一次可成型6×7个3D生物蛋白。
具体地，采用激发光逐层扫描混合液的操作中，逐层扫描时各层扫描截面相互平行，各层扫描截面的面积为0.05μm2～1μm2，相邻的两层扫描截面的间距为0.1μm～1.5μm。逐层扫描使得形成的3D生物蛋白形成过程较为稳定，制得的3D生物蛋白硬度更强。
本实施方式中，各层扫描截面为矩形。当然在其他实施方式中，各层扫描截面还可以是圆形、三角形等任意的图形。
在一个实施方式中，激发光分为多束激光单元，每束激光单元扫描截面的面积为1μm2，激发光先扫描先混合液的液底，然后向上移动0.1μm，继续扫描下一层液面，总共移动距离为5μm，混合液逐渐固化形成6×7个长宽高为1μm×1μm×5μm的柱状3D生物蛋白。
一种3D生物蛋白，通过上述的3D生物蛋白的制备方法制备得到。
上述3D生物蛋白的制备方法至少具有如下有益效果：(1)采用荧光素标记白蛋白与光敏剂混合发生交联反应，并在氧分压为0.25Kpa～0.35Kpa、氧气浓度为70％～80％的条件下，用激光逐层照射，激发光激发光敏剂，光敏剂返回一个发射光，该发射光会进一步激发荧光素标记的白蛋白上的荧光素，使得荧光素标记的白蛋白、光敏剂以及周围的氧自由基三者发生共价重新结合，制备得到的3D生物蛋白孔隙小，很好的解决了细胞分泌的生长因子激素等进入生物蛋白材料本身的问题。(2)制备得3D生物蛋白表面较光滑、更真实的模仿体内有些光滑的微环境。(3)制备得3D生物蛋白硬度较高，能够模仿骨骼，更加接近人体内真实的微环境。(4)采用荧光素标记白蛋白，并在氧分压为0.25Kpa～0.35Kpa、氧气浓度为70％～80％的条件下，用激光逐层照射混合液使得混合液固化，制备过程简单，调节激光的照射路径即可方便的形成不同形状的三维图案，能够批量化的制备微米级别的3D生物蛋白。
一种生物芯片，包括基底以及设置在基底表面上的3D生物蛋白，3D生物蛋白通过上述的3D生物蛋白的制备方法制备得到。
在一个实施方式中，3D生物蛋白为多个且相互间隔。
该生物芯片，3D生物蛋白设置在基底上，3D生物蛋白具有一定的形状，孔隙小、表面较光滑、硬度较高。该生物芯片能够用于研究细胞的生长状况或牵引细胞生长形成适合的形状。
上述3D生物蛋白或上述生物芯片在制备医用功能材料中的应用。
医用功能材料例如为骨骼模型、血管模型等。
上述3D生物蛋白孔隙小、表面较光滑、硬度较高，能够很好的解决细胞分泌的生长因子激素等进入生物蛋白材料本身的问题，更真实的模仿体内有些光滑、坚硬的微环境。
下面为具体实施例。
未特别说明，以下实施例中所用的材料，胎牛血清(BSA)由life science公司提供，产品号为0332。异硫氰酸荧光素标记的胎牛血清(FITC-BSA)由nanocs公司提供，产品号为BS1-FC-1。光敏剂为虎红钠盐(RB)光敏剂由sigma公司提供，产品号为330000。
实施例1
将FITC-BSA与RB光敏剂混合，并加入一定量的纯净水配制成的混合液，混合液中FITC-BSA的终浓度为100mg/mL，RB光敏剂的终浓度为0.1w/v％。
请参见图1，在培养皿中放置一块玻片，将100μL的上述混合液通过移液枪滴加到玻片上。然后将培养皿移入高氧密闭仓中，设定高氧密闭仓中氧分压为0.3Kpa、氧气浓度为75％、湿度为60％。采用40×油性物镜，并利用双光子激发器在高氧密闭仓中逐层扫描混合液使得混合液固化。设定的激发光的波长为700nm，能量为20mW，每束激光扫描截面的面积为1μm2。通过激光透过玻片到混合液中，由玻片表面(混合液的液底)逐层向上扫描，扫描完一层后向上移动0.1μm，继续扫描下一层液面，总共移动距离为5μm。通过激发光激发使得混合液中的物质与周围的单氧相互发生共价键的重新结合，混合液交联固化结合为微米级固体结构，即得到3D生物蛋白。本实施例中一次成型6×7个阵列的长宽高为1μm×1μm×5μm大小的3D柱体生物蛋白。制得的3D生物蛋白阵列的扫描电镜图请参阅图2，局部放大图请见图3和图4。从图中可以看出本实施例制得的3D生物蛋白孔隙小、表面较光滑。用于细胞培养实验中，3D生物蛋白硬度高，能够很好的模拟骨骼条件并解决细胞分泌的生长因子激素等进入生物蛋白材料本身的问题。
实施例2
将FITC-BSA与RB光敏剂混合，并加入一定量的纯净水配制成的混合液，混合液中FITC-BSA的终浓度为75mg/mL，RB光敏剂的终浓度为0.15w/v％。
请参见图1，在培养皿中放置一块玻片，将100μL的上述混合液通过移液枪滴加到玻片上。然后将培养皿移入高氧密闭仓中，设定高氧密闭仓中氧分压为0.35Kpa、氧气浓度为80％、湿度为70％，采用40×油性物镜，并利用双光子激发器在高氧密闭仓中逐层扫描混合液使得混合液固化。设定的激发光的波长为750nm，能量为10mW，每束激光扫描截面的面积为0.8μm2。通过激光透过玻片到混合液中，由玻片表面(混合液的液底)逐层向上扫描，扫描完一层后向上移动0.5μm，继续扫描下一层液面，总共移动距离为8μm。通过激发光激发使得混合液中的物质与周围的单氧相互发生共价键的重新结合，混合液交联固化结合为微米级固体结构，即得到3D生物蛋白。本实施例中一次成型7×8个阵列的长宽高为1μm×0.8μm×8μm大小的3D柱体生物蛋白。本实施例制得的3D生物蛋白孔隙小、表面较光滑。用于细胞培养实验中，3D生物蛋白硬度高，能够很好的模拟骨骼条件并解决细胞分泌的生长因子激素等进入生物蛋白材料本身的问题。
实施例3
将FITC-BSA与RB光敏剂混合，并加入一定量的纯净水配制成的混合液，混合液中FITC-BSA的终浓度为50mg/mL，RB光敏剂的终浓度为0.05w/v％。
请参见图1，在培养皿中放置一块玻片，将100μL的上述混合液通过移液枪滴加到玻片上。然后将培养皿移入高氧密闭仓中，设定高氧密闭仓中氧分压为0.25Kpa、氧气浓度为70％、湿度为45％。采用40×油性物镜，并利用双光子激发器在高氧密闭仓中逐层扫描混合液使得混合液固化。设定的激发光的波长为700nm，能量为10mW，每束激光扫描截面的面积为0.05μm2。通过激光透过玻片到混合液中，由玻片表面(混合液的液底)逐层向上扫描，扫描完一层后向上移动0.1μm，继续扫描下一层液面，总共移动距离为3μm。通过激发光激发使得混合液中的物质与周围的单氧相互发生共价键的重新结合，混合液交联固化结合为微米级固体结构，即得到3D生物蛋白。本实施例中一次成型5×7个阵列的长宽高为1μm×0.05μm×3μm大小的3D柱体生物蛋白。本实施例制得的3D生物蛋白孔隙小、表面较光滑。用于细胞培养实验中，3D生物蛋白硬度高，能够很好的模拟骨骼条件并解决细胞分泌的生长因子激素等进入生物蛋白材料本身的问题。
实施例4
将FITC-BSA与RB光敏剂混合，并加入一定量的纯净水配制成的混合液，混合液中FITC-BSA的终浓度为80mg/mL，RB光敏剂的终浓度为0.1w/v％。
请参见图1，在培养皿中放置一块玻片，将100μL的上述混合液通过移液枪滴加到玻片上。然后将培养皿移入高氧密闭仓中，设定高氧密闭仓中氧分压为0.28Kpa、氧气浓度为78％、湿度为45％。采用40×油性物镜，并利用双光子激发器在高氧密闭仓中逐层扫描混合液使得混合液固化。设定的激发光的波长为750nm，能量为30mW，每束激光扫描截面的面积为1μm2。通过激光透过玻片到混合液中，由玻片表面(混合液的液底)逐层向上扫描，扫描完一层后向上移动1.5μm，继续扫描下一层液面，总共移动距离为10μm。通过激发光激发使得混合液中的物质与周围的单氧相互发生共价键的重新结合，混合液交联固化结合为微米级固体结构，即得到3D生物蛋白。本实施例中一次成型6×7个阵列的长宽高为1μm×1μm×10μm大小的3D柱体生物蛋白。本实施例制得的3D生物蛋白孔隙小、表面较光滑。用于细胞培养实验中，3D生物蛋白硬度高，能够很好的模拟骨骼条件并解决细胞分泌的生长因子激素等进入生物蛋白材料本身的问题。
对比例1
制备方法与实施例1相似，不同的是，在制备过程中直接采用BSA与RB光敏剂混合，并且激光扫描时没有氧分压、氧浓度以及湿度条件，即未在高氧密闭仓内进行。
制备过程如下：将BSA与RB光敏剂混合，并加入一定量的纯净水配制成的混合液，混合液中BSA的终浓度为100mg/mL，RB光敏剂的终浓度为0.1w/v％。
请参见图1，在培养皿中放置一块玻片，将100μL的上述混合液通过移液枪滴加到玻片上。采用40×油性物镜，并利用双光子激发器逐层扫描混合液使得混合液固化。激发光的扫描条件与实施例1一致，同样一次成型6×7个阵列的长宽高为1μm×1μm×5μm大小的蛋白材料。制得的蛋白材料阵列的扫描电镜图请参阅图5，局部放大图请参阅图6。可以看出，对比例1制备的蛋白材料孔隙较大、表面较粗糙。
实施例1制备的3D生物蛋白与对比例1制备的蛋白材料对比图如图7所示(图7中左边图(a)为实施例1制备的3D生物蛋白，右边图(b)为对比例1制备的蛋白材料)。从图7中明显看出，实施例1制备的3D生物蛋白孔隙小、表面较光滑。与对比例1制备的蛋白材料相比，将实施例1制备的3D生物蛋白用于细胞培养实验时，实施例1制备3D生物蛋白硬度较高，能够更好的模拟骨骼条件并解决细胞分泌的生长因子激素等进入生物蛋白材料本身的问题。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种3D生物蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将荧光素标记的白蛋白与光敏剂混合得到混合液；以及在氧分压为0.25Kpa～0.35Kpa、氧气体积百分比为70％～80％的条件下，采用激发光逐层扫描所述混合液使得所述混合液固化得到所述3D生物蛋白，其中，所述激发光的波长为700nm～750nm，所述激发光的能量为10mW～30mW；所述荧光素标记的白蛋白中，所述荧光素选自FITC和PE中的至少一种；所述光敏剂为虎红钠盐。
2.根据权利要求1所述的3D生物蛋白的制备方法，其特征在于，所述白蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、人重组血清白蛋白、羊血清白蛋白和兔血清白蛋白中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的3D生物蛋白的制备方法，其特征在于，所述混合液中，所述荧光素标记的白蛋白的终浓度为50mg/mL～100mg/mL，所述光敏剂的终浓度为0.05w/v％～0.15w/v％。
4.根据权利要求1所述的3D生物蛋白的制备方法，其特征在于，所述采用激发光逐层扫描所述混合液的操作中，逐层扫描时各层所述扫描截面相互平行，各层所述扫描截面的面积为0.05μm2～1μm2，相邻的两层所述扫描截面的间距为0.1μm～1.5μm。
5.根据权利要求1所述的3D生物蛋白的制备方法，其特征在于，所述在氧分压为0.25Kpa～0.35Kpa、氧气体积百分比为70％～80％的条件下，采用激发光逐层扫描所述混合液使得所述混合液固化的操作具体包括：将所述混合液置于高氧密封仓中，所述高氧密封仓内的氧分压为0.25Kpa～0.35Kpa、氧气体积百分比为70％～80％，以及在所述高氧密封仓中采用激发光逐层扫描所述混合液使得所述混合液固化。
6.一种3D生物蛋白，其特征在于，通过如权利要求1～5任一项所述的3D生物蛋白的制备方法制备得到。
7.一种生物芯片，其特征在于，包括基底以及设置在所述基底表面上的3D生物蛋白，所述3D生物蛋白通过如权利要求1～5任一项所述的3D生物蛋白的制备方法制备得到。
8.根据权利要求7所述的生物芯片，其特征在于，所述3D生物蛋白为多个且相互间隔。
9.如权利要求6所述的3D生物蛋白或如权利要求7～8任一项所述的生物芯片在制备医用功能材料中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述医用功能材料为骨骼模型或血管模型。
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