CN114869846B - 一种提高光敏剂杀菌作用的悬浊液及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种提高光敏剂杀菌作用的悬浊液的制备方法。该方法其包括以下步骤：S1，将白蛋白溶于水，搅拌溶解，得到白蛋白水溶液；S2，取白蛋白水溶液，加入氯化钙水溶液和光敏剂，混合均匀，得到混合液；S3，将十二烷基硫酸钠溶于水中，得到十二烷基硫酸钠水溶液；S4，向混合液中加入十二烷基硫酸钠水溶液，混合均匀，获得包含光敏剂‑氯化钙‑白蛋白的悬浊液。该悬浊液依赖于白蛋白的生物相容性和氯化钙的细胞膜通透性调节作用，在有效、安全的光敏剂作用浓度范围内，能够促使更大量的光敏剂进入细菌内部，不仅提高细菌对光敏剂的摄取量，同时进入细菌内部的光敏剂还能够杀伤细菌DNA，实现更高效的细菌毒性作用，具有良好的应用前景。

Description

一种提高光敏剂杀菌作用的悬浊液及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及杀菌技术领域，特别涉及一种提高光敏剂杀菌作用的悬浊液及其制备方法与应用。

背景技术

当前，大量抗生素的不合理应用等问题已经导致细菌、真菌产生耐药性，从而引发更严峻的抗菌问题。抗菌治疗的难度提升严重影响疾病的治疗，威胁着人类的生命健康。光动力疗法是近几十年快速发展的一种新型抗菌方法，由光敏剂、氧气和特定光源三要素共同作用产生光动力效应。光敏剂虽然能够有效杀伤细菌，但更多作用于细菌表面和周围，通过产生单线态氧，其能够作用于有限距离内的生物分子，从而杀伤细菌。同时，目前光敏剂在抗菌应用和开发时，仍然存在瓶颈问题，尤其是其剂量过大导致的暗毒性问题，严重限制了光敏剂大范围推广。在安全的剂量前提下，其对细菌毒性作用有限。因此，迫切需要一种策略，能够在光敏剂安全浓度范围内，显著提升光敏剂对细菌的杀伤作用。

发明内容

基于目前光敏剂在抗菌应用时，存在在安全的剂量前提下，其对细菌毒性作用有限，剂量过大又会导致暗毒性的问题，发明人设计了一种提高光敏剂抗菌作用的方法，该方法在有效、安全的光敏剂作用浓度范围内，将光敏剂与氯化钙白蛋白混合液共聚，制备成包含光敏剂-氯化钙-白蛋白的悬浊液(该悬浊液包含光敏剂、氯化钙和白蛋白，也可记为光敏剂-氯化钙-白蛋白悬浊液)，为具有高效抗菌作用的光敏剂复合抗菌制剂。本发明所采用的方法具体如下。

本发明首先提出一种提高光敏剂杀菌作用的悬浊液的制备方法，其包括以下步骤：

S1，将白蛋白溶于水，充分搅拌溶解，得到白蛋白水溶液；

S2，取所述白蛋白水溶液，加入氯化钙水溶液中，同时加入光敏剂，混合均匀，得到混合液；所述光敏剂为酞菁锌；

S3，将十二烷基硫酸钠溶于水中，得到十二烷基硫酸钠水溶液；

S4，向所述混合液中加入所述十二烷基硫酸钠水溶液，混合均匀，获得包含光敏剂-氯化钙-白蛋白的悬浊液。

在上述方法中，依赖于白蛋白的生物相容性和氯化钙的细胞膜通透性调节作用，能够促使更大量的光敏剂进入细菌内部，提高细菌对光敏剂的摄取量，同时进入细菌内部的光敏剂还能够通过杀伤细菌DNA，实现更高效的细菌毒性作用。

作为本发明的提高光敏剂杀菌作用的悬浊液的制备方法的进一步改进，所述悬浊液中，光敏剂：氯化钙：白蛋白＝2.5：(0.5～1.5)：(1～2)(质量配比)，优选最佳配比为光敏剂：氯化钙：白蛋白＝2.5：1：1.5(质量配比)。

作为本发明的提高光敏剂杀菌作用的悬浊液的制备方法的进一步改进，所述悬浊液中，所添加的十二烷基硫酸钠和所述光敏剂的质量比为(5～10):2.5，进一步优选为7:2.5。

作为本发明的提高光敏剂杀菌作用的悬浊液的制备方法的进一步改进，步骤S4中，所述混合均匀包括磁力搅拌20～40min。

本发明其次提出一种提高光敏剂杀菌作用的悬浊液，其根据如上所述的制备方法所制备得到，所述悬浊液为包含光敏剂-氯化钙-白蛋白的悬浊液。

本发明最后提出一种如上所述的悬浊液的应用，其应用于杀伤细菌。

作为该悬浊液的应用的一种改进，所述细菌为大肠杆菌，所述悬浊液能侵入大肠杆菌的细胞核，并能杀伤大肠杆菌细胞核内的DNA。

作为该悬浊液的应用的一种改进，在杀伤所述所述大肠杆菌DNA的过程，控制所述光敏剂的终浓度为0.25～2μM。

作为该悬浊液的应用的一种改进，使用所述悬浊液浸泡所述大肠杆菌，浸泡时间为1～3h，使用红光光源照射所述悬浊液，光剂量为1～5J/cm²，光照射时间为0.5～2min。

本发明设计了一种提高光敏剂抗菌作用的方法，在有效、安全的光敏剂作用浓度范围内，将光敏剂与氯化钙白蛋白混合液共聚，制备成光敏剂-氯化钙-白蛋白悬浊液，研究出较佳配比，制备出具有高效抗菌作用的光敏剂复合抗菌制剂。制备出的悬浊液依赖白蛋白的生物相容性和氯化钙的细胞膜通透性调节作用，在有效、安全的光敏剂作用浓度范围内，能够促使更大量的光敏剂进入细菌内部，不仅提高细菌对光敏剂的摄取量，同时进入细菌内部的光敏剂还能够通过杀伤细菌DNA，实现更高效的细菌毒性作用，具有良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为试验例1中对照组和实验组的细胞摄取光敏剂的荧光对比图。

图2为试验例2中对照组和实验组的细菌存活率对比柱状图。

图3为试验例3中对照组和实验组的大肠杆菌DNA/光敏剂存量电泳图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1光敏剂-氯化钙-白蛋白悬浊液的制备

光敏剂-氯化钙-白蛋白悬浊液制备方法如下：

(1)将白蛋白溶于超纯水，调整其浓度为0.5mg/mL，充分搅拌保证白蛋白均匀溶解，得到白蛋白水溶液。

(2)取3mL上述白蛋白水溶液，将其加至30mL浓度为0.3μmol/mL的氯化钙水溶液中，同时向溶液中加入2mL浓度为2.15μmol/mL的酞菁锌光敏剂，充分混合。将上述混合液置于磁力搅拌器中快速搅拌5分钟，得到混合液。

(3)将十二烷基硫酸钠(SDS)溶于超纯水中，调整其浓度为质量分数6％的SDS超纯水溶液。

(4)向混合液中加入115mL SDS超纯水溶液，充分混合，置于磁力搅拌器上匀速搅拌30分钟。获得光敏剂-氯化钙-白蛋白悬浊液，其质量配比为，光敏剂：氯化钙：白蛋白＝2.5：1：1.5。

试验例1悬浊液对细胞摄取光敏剂的促进作用验证

培养宫颈癌细胞(Hela)作为宿主，研究实施例1制备的光敏剂-氯化钙-白蛋白悬浊液对光敏剂摄入至细胞的促进作用。使用生物显微镜低倍镜观察细胞状态，选取最佳状态的细胞作为实验对象。设计实验组和对照组，实验组为光敏剂-氯化钙-白蛋白悬浊液给药(调整光敏剂终浓度为1μM)，对照组为光敏剂单独给药(调整光敏剂终浓度1μM)，进行细胞定位分析。本试验例所用的光敏剂均为酞菁锌。取细胞液(约2×105个/ml)接种在盖玻片上，置于37℃培养箱中过夜培养，使细胞贴壁。然后移去培养基，细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，用含1％胎牛血清的培养基培养，然后对照组和实验组分别加入设定的药物孵育2小时。用激光共聚焦显微镜进行观察，光敏剂在显微镜下呈现红色荧光(如图1的显示亮色部分)。

结果如图1，在同终浓度的光敏剂给药量情况下，实验组Hela细胞能看到全细胞的荧光定位(细胞质基质+细胞核内)，对照组Hela细胞仅能看到细胞质基质中的荧光定位。由此可见，与单纯的光敏剂给药相比，光敏剂-氯化钙-白蛋白悬浊液的给药作用有助于促进光敏剂进入细胞核内，实现更大量的药物摄取。

试验例2抗菌效果对比验证

选取大肠杆菌ATCC25922标准菌作为实验菌。设计实验组和对照组，实验组为实施例1制备的光敏剂-氯化钙-白蛋白悬浊液进行给药(调节光敏剂终浓度为1μM)，对照组为光敏剂单独给药(调节光敏剂终浓度1μM)，研究各组大肠杆菌的抗菌作用。本试验例所用光敏剂均为酞菁锌。培养大肠杆菌ATCC25922，选取最佳状态的细菌作为实验对象。根据计数结果，加入适量新鲜的细菌基础培养液(LB)，稀释细菌至所需实验浓度(105个/ml)，吹打混匀后于96孔板铺板细菌，每孔加入200μl饲养细胞，于培养箱静置培养过夜。根据实验方案对照组和实验组，实验组细菌加光敏剂-氯化钙-白蛋白悬浊液给药(调节光敏剂终浓度为1μM)，对照组细菌加光敏剂(调节光敏剂终浓度1μM)，给予2小时孵育。2小时后，吸去96孔板培养孔内原有的药物培养液，加入200μl新鲜培养液清洗一次。吸去此清洗的细胞培养液，再加入200μl新鲜培养液，使用660nm波长的LED平板光源进行光动力照射，光照时间1分钟(光剂量为2.5J/cm²)。光照后，利用MTT法检测细菌存活率。MTT全称为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，是一种黄颜色的染料。MTT比色法可以检测细胞存活率。原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可以使外源性MTT变成水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)然后沉积在细胞中，通常已经死亡的细胞不存在这种现象。然后利用二甲基亚砜(DMSO)来溶解这些甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，计算出细菌的存活率。

试验结果如图2，在同等终浓度光敏剂给药量情况下，对照组大肠杆菌存活率高于实验组，实验组大肠杆菌的存活率显著降低。由此可见，光敏剂-氯化钙-白蛋白悬浊液的给药作用，更有助于实现更高效的光敏剂抗菌活性。

试验例3杀伤细菌DNA验证

提取足量的大肠杆菌DNA作为实验品，研究光敏剂对大肠杆菌DNA的杀伤作用。设置对照组1和实验2-5组，对照组1为未经处理的大肠杆菌DNA，实验组2-5在包含大肠杆菌DNA基础上，分别加入光敏剂终浓度为2、1、0.5、0.25μM的光敏剂-氯化钙-白蛋白悬浊液(实施例1制得)，对照组1和实验2-5组的大肠杆菌DNA体量相同，分别进行光动力大肠杆菌DNA降解实验，然后通过凝胶电泳实验，检测各组大肠杆菌DNA的含量。

实验结果如图3，图3中的通道标号1、2、3、4、5分别表示对照组1和实验2-5组，电泳图颜色越亮(亮色实际为红色，表示红色成分越多，红色代表光敏剂)，则表示光敏剂含量越多，大肠杆菌DNA的含量越少。电泳图颜色越暗(暗色实际为蓝色，表示蓝色成分越多，蓝色代表大肠杆菌DNA)，则表示光敏剂含量越少，大肠杆菌DNA的含量越多。从图3可以看出：对照组1的大肠杆菌DNA含量最多；实验2-5组，光敏剂含量逐渐减少，大肠杆菌DNA含量逐渐增多。试验表明光敏剂-氯化钙-白蛋白悬浊液能够显著杀伤、降解大肠杆菌DNA，并且光敏剂-氯化钙-白蛋白在悬浊液中的浓度越大，作用越明显，即与悬浊液的浓度呈正相关关系。光敏剂-氯化钙-白蛋白悬浊液能够在细菌外周光动力作用基础上，进一步靶向大肠杆菌内部的DNA分子，通过杀伤、降解大肠杆菌DNA实现了双重光敏剂抗菌作用。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的权利范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种提高光敏剂杀菌作用的悬浊液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，将白蛋白溶于水，充分搅拌溶解，得到白蛋白水溶液；

S2，取所述白蛋白水溶液，加入氯化钙水溶液中，同时加入光敏剂，混合均匀，得到混合液；所述光敏剂为酞菁锌；

S3，将十二烷基硫酸钠溶于水中，得到十二烷基硫酸钠水溶液；

S4，向所述混合液中加入所述十二烷基硫酸钠水溶液，混合均匀，获得包含光敏剂-氯化钙-白蛋白的悬浊液。

2.根据权利要求1所述的提高光敏剂杀菌作用的悬浊液的制备方法，其特征在于，所述悬浊液中，光敏剂：氯化钙：白蛋白＝2.5：1：1.5(质量配比)。

3.根据权利要求1或2所述的提高光敏剂杀菌作用的悬浊液的制备方法，其特征在于，所述悬浊液中，所添加的十二烷基硫酸钠和所述光敏剂的质量比为7:2.5。

4.根据权利要求1所述的提高光敏剂杀菌作用的悬浊液的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述混合均匀包括磁力搅拌20～40min。

5.一种提高光敏剂杀菌作用的悬浊液，其特征在于，根据权利要求1-4任一项所述的制备方法所制备得到，所述悬浊液为包含光敏剂-氯化钙-白蛋白的悬浊液。

6.一种如权利要求5所述的悬浊液在制备杀伤细菌的药物中的应用，其特征在于，应用于杀伤细菌。

7.根据权利要求6所述的悬浊液在制备杀伤细菌的药物中的应用，其特征在于，所述细菌为大肠杆菌，所述悬浊液能侵入大肠杆菌的细胞核，并能杀伤大肠杆菌细胞核内的DNA。

8.根据权利要求7所述的悬浊液在制备杀伤细菌的药物中的应用，其特征在于，在杀伤所述大肠杆菌DNA的过程，控制所述光敏剂的终浓度为0.25～2μM。

9.根据权利要求7所述的悬浊液在制备杀伤细菌的药物中的应用，其特征在于，使用所述悬浊液浸泡所述大肠杆菌，浸泡时间为1～3h，使用红光光源照射所述悬浊液，光剂量为1～5J/cm²，光照射时间为0.5～2min。