CN106035351B - 一种负载光敏剂的聚合物胶束的制备方法及该胶束在浮游细菌、细菌生物被膜杀灭中的应用 - Google Patents
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Abstract
一种负载光敏剂的聚合物胶束的制备方法及该胶束在浮游细菌、细菌生物被膜杀灭中的应用,是由两种嵌段聚合物PEG‑b‑PCL和PCL‑b‑PAE制得负载光敏剂的聚合物胶束,并用于多耐药细菌和生物被膜的杀灭。本发明的复合壳层胶束负载的光敏剂对卡那霉素有耐药性的生物发光基因转染的金黄色葡萄球菌S.aureus Xen36以及对生物被膜中的耐药细菌均有很好的杀菌效率。本发明的胶束体系有如下的优势:1)制备简单;2)光源简单,不需要像激光一样的复杂控制器,而且光能量很低,容易向临床方向转化;3)有很好的单线态氧产生效率;4)对耐药的细菌和生物被膜有很好的杀灭效果,具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物医药材料领域,涉及一种负载光敏剂的聚合物胶束用于多耐药细菌和生物被膜杀灭方法。
背景技术
自从1929年偶然发现青霉素(penicillin)可以治疗革兰氏阳性病原菌链球菌和葡萄球菌以及1943年发现链霉素可以抑制结核杆菌以来,抗生素开启了它的黄金时代。在随后的几十年里,新的抗生素和不断发展的衍生合成方法将抗生素库发展完善。但不幸的是,自古以来细菌都存在着耐药性。过去三十年病原菌对抗生素的耐药性发展速度远远大于新的抗生素的发现。造成细菌耐药性的原因主要是由于抗生素的滥用,尤其在中国。2009年从门诊病人提取的金黄色葡萄球菌有60%都对甲氧西林(methicillin)有耐药性,而这一数值在2004年的时候只有40%。而普遍认为造成细菌耐药性的罪魁祸首是生物被膜。生物被膜如前所述是一些由细菌、细菌分泌的胞外大分子物质(extracellular polymericsubstances,EPS)组成,EPS主要包括多糖、蛋白、DNA和一些细胞器。由生物被膜导致细菌耐药性的详细机理还不健全,但人们一致认为生物被膜的排外效应(heterogeneity)应该是主要原因,这就包括了外排泵(efflux pumps)、修饰性的酶(modifying enzymes)和靶向抑制剂(target mutations)。如果想针对于生物被膜发展一些高效的治疗手段则应遵循以下一些方案:1)药物需要渗透和停留在生物被膜内部;2)通过药物隐身手段减少药物和生物被膜内部酶的相互作用,从而不被其识别;3)一些新颖的不会产生耐药性的杀菌机理。因此,光动力抗菌疗法(photodynamic antimicrobial chemotherapy,PACT)可以为人们提供一种局部的,有别于抗菌剂的特殊治疗感染的手段。
光动力疗法(Photodynamic therapy,PDT)是将本身无毒的光敏剂(photosensitizer,PS)、光源结合在一起将组织氧转化为有细胞毒性的活性氧成分(reactive oxygen species,ROS)。ROS可以破坏一些本发明不需要的肿瘤或者病原菌。同其他的疗法如手术,放射治疗以及化学治疗相比,光动力疗法更加的方便,带给患者的伤痛也更小,也更易实现其靶向治疗。光动力疗法在最近几十年的癌症治疗中大放异彩,而在抗菌和抗感染方面则始终少有起色,尤其是针对于生物被膜的研究少之又少。由于光动力疗法是依靠产生的活性氧成分去破坏细胞或细菌组成,因此细菌不会对光动力疗法产生耐药性。因此这一特性在细菌耐药性日益恶化的今天显得尤为重要。之前人们的大部分工作都集中在如何用光动力疗法治疗浮游细菌,怎样提高能量的吸收和转化效率以及单线态氧的转化效率。使用光动力疗法用于生物被膜的研究甚少,而且效率一般都很低。
光动力疗法中一个很重要的因素是光敏剂。时至今日,人们已经从天然的或人工合成的化合物中挑选出成千上万个化合物可以吸收和转化光能。单真正能作为光敏剂运用于光动力疗法的微乎其微。原卟啉(protoporphyrin IX,PpIX)是一种内源性物质,是血红素、细胞色素C和叶绿体的前体。此外5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid,ALA)作为四氢吡咯(四氢吡咯是构成原卟啉、血红素、细胞色素、维生素B12的重要单元)的前缀化合物作为光动力疗法的光敏剂使用最为广泛。基于原卟啉的光敏剂在临床应用时遇到最大的障碍是其水溶性低(25℃时水溶性1μg mL–1),这极大地限制了其生物分布和活性氧成分的产生效率。基于这些现状,目前人们研究的重点集中在如何将光敏剂以单分子的状态分布在水相体系里。目前火热的纳米科学技术可以提高光动力疗法的效率的同时减少其本身存在的诸多弊端。人们发展了多种多样的纳米技术用于光敏剂的负载,其中包括磁性纳米颗粒(magnets),沸石分子筛(zeolite L nanocrystals),金纳米颗粒(gold nanoparticles)和聚合物胶束体系用于负载光敏剂并用于抗菌研究。纳米-PDT药物(nano-PDT-agents)有多样化的亲疏水性,尺寸可调,表面可修饰等特点。但纳米药物用于PDT治疗还需要从以下一些方面进行努力:1)发展一些更高效的光敏剂载体;2)能够实时并无损地观测治疗效果;3)发展一些新的非激光的光源用于光动力疗法。
发明内容:
本发明的目的是将利用活体成像技术(living imaging system)对本发明体系在光照条件下的杀菌效率进行评估。并且本发明将对耐药的浮游细菌(S.aureus Xen36)和其生物被膜进行杀菌测试。本发明的聚合物胶束体系将具备以下一些优势:1)能够提高疏水性的原卟啉在水中的溶解性、分散性和稳定性;2)通过胶束的表面自适应可以渗透和停留在生物被膜内部,并增强和细菌的相互作用;3)便宜易得的LED阵列可以为以后的临床应用提供方便;4)活体成像技术可以提供无损、高通量地检测抗菌效率和光敏剂投递体系的晒选。
本发明的技术方案:
一种负载光敏剂的聚合物胶束的制备方法,步骤如下:
1)将同重量比的嵌段共聚物PEG-b-PCL和PCL-b-PAE混合,溶解于4mL四氢呋喃中,配制得到2.5mg mL–1的溶液,取200μL原卟啉的DMF溶液与4mL含有聚合物的THF溶液混合均匀;
2)将聚合物有机溶液逐滴缓慢地加入到剧烈的搅拌条件下的12mL醋酸盐
缓冲液中,水溶液逐渐由无色透明变为泛着微弱蓝色乳光,证明胶束的形成;
3)将得到的胶束溶液在磷酸盐缓冲液中用截留分子量为7000的透析袋透析三天,以除去有机溶剂。最后加入磷酸盐缓冲液定容到20mL,得到浓度为0.5mg mL–1的复合壳层胶束溶液MSPMs。
进一步的,所述的聚乙二醇-b-聚环己内酯的制备步骤如下:
1)将2.0g CH3O-PEG114-OH和4.2g重蒸处理过的ε-CL加入到50mL干燥的Schlenk瓶中;
2)加入15mL重蒸过的无水甲苯溶解,加入一滴Sn(Oct)2;
3)通过液氮冷冻—抽真空—充氮气—解冻,循环三次;
4)氮气保护下于100℃的油浴中反应过夜;
5)反应完毕后冷至室温,加入适量二氯甲烷稀释,然后在冰乙醚中沉淀。待沉淀完全后,抽滤,滤饼用冰乙醚洗涤三次,真空干燥后所得到的白色粉末状固体即为PEG5k-b-PCL。
进一步的,所述的聚环己内酯-b-聚β-氨酯制备步骤如下:
1)将127mg苯甲醇和11.4g重蒸过ε-CL加入干燥过的Schlenk瓶中,然后加入15mL无水甲苯溶解均匀,加入230mg Sn(Oct)2;
2)液氮冷冻,抽真空,通氮气,解冻,重复此过程三次,之后在氮气保护下,于100℃的油浴中反应过夜;
3)反应结束后冷至室温,加入适量的二氯甲烷稀释,然后冰乙醚沉淀,在冰箱中静置过夜使其沉淀完全,经抽滤洗涤,真空干燥后得到白色粉末状固体PCL-OH;
4)称取3.0g PCL-OH置于50mL干燥的圆底烧瓶中,用6mL无水二氯甲烷溶解,然后加入0.15g无水三乙胺,将圆底烧瓶置于冰水浴中搅拌使其混合均匀;
5)用10mL无水二氯甲烷将0.108g丙烯酰氯缓慢地逐滴滴入到圆底烧瓶中,滴完后,逐步升温至室温,在氮气气氛下继续室温反应12h;
6)反应完毕后,反应液用二氯甲烷稀释,依次用稀盐酸、饱和碳酸钠水溶液和蒸馏水洗涤,分离得到的有机相用无水硫酸镁干燥过夜,有机相过滤之后将滤液旋蒸浓缩,并在冰乙醚中沉淀;
7)将沉淀抽滤后置于真空烘箱中干燥,即可得聚合物末端基团为丙烯酸酯功能化的PCL-A;
8)称取1.0g PCL-A,0.68g HDD和0.65g TDP置于50mL干燥的圆底烧瓶中,加入10mL重蒸的氯仿溶解使其混合均匀,然后在55℃的油浴中反应72h;
9)反应结束后,加入适量的氯仿稀释并用冰乙醚沉淀,抽滤并用冰乙醚洗涤,真空干燥后得到淡黄色粉末状固体,即为PCL-b-PAE。
本方法的优点是:本发明利用能量极低的LED作为激发光源激发光敏剂产生单线态氧来杀灭耐药性细菌,有如下的优势:1)制备简单;2)光源简单,不需要像激光一样的复杂控制器,而且光能量很低,容易向临床方向转化;3)有很好的单线态氧产生效率;4)对耐药的细菌和生物被膜有很好的疗效,综上本发明的胶束体系有很好的应用前景。
附图说明
图1为负载光敏剂的聚合物胶束制备及作用机制示意图。
图2为负载光敏剂的胶束单线态氧产生能力测定图片。
图3为负载光敏剂的胶束对卡那霉素有耐药性的生物发光基因转染的金黄色葡萄球菌的杀灭。
图4为负载光敏剂的胶束对卡那霉素有耐药性的生物发光基因转染的金黄色葡萄球菌的生物被膜杀灭。
具体实施方式
实施例:
(一)聚乙二醇-b-聚环己内酯(PEG-b-PCL)的制备,步骤如下:
1)将2.0g CH3O-PEG114-OH(0.4mmol,PDI:1.04)和4.2g重蒸处理过的ε-CL(36.8mmol,92eq.)加入到50mL干燥的Schlenk瓶中。
2)加入15mL重蒸过的无水甲苯溶解,加入一滴Sn(Oct)2(0.5mol%)。
3)通过液氮冷冻—抽真空—充氮气—解冻,循环三次。
4)氮气保护下于100℃的油浴中反应过夜。
5)反应完毕后冷至室温,加入适量二氯甲烷稀释,然后在冰乙醚中沉淀。待沉淀完全后,抽滤,滤饼用冰乙醚洗涤三次,真空干燥后所得到的白色粉末状固体即为PEG5k-b-PCL。
(二)聚环己内酯-b-聚β-氨酯(PCL-b-PAE)制备,步骤如下:
1)将127mg苯甲醇(1.18mmol)和11.4g重蒸过ε-CL(100mmol,85eq.)加入干燥过的Schlenk瓶中,然后加入15mL无水甲苯溶解均匀,加入230mg Sn(Oct)2(0.59mmol,0.5eq.)。
2)液氮冷冻,抽真空,通氮气,解冻,重复此过程三次,之后在氮气保护下,于100℃的油浴中反应过夜;
3)反应结束后冷至室温,加入适量的二氯甲烷稀释,然后冰乙醚沉淀,在冰箱中静置过夜使其沉淀完全,经抽滤洗涤,真空干燥后得到白色粉末状固体PCL-OH;
4)称取3.0g PCL-OH(10k,0.3mmol)置于50mL干燥的圆底烧瓶中,用6mL无水二氯甲烷溶解,然后加入0.15g无水三乙胺(TEA,1.48mmol,5.0eq.),将圆底烧瓶置于冰水浴中搅拌使其混合均匀;
5)用10mL无水二氯甲烷将0.108g丙烯酰氯(1.2mmol,4eq.)缓慢地逐滴滴入到圆底烧瓶中(0℃,~2h),滴完后,逐步升温至室温,在氮气气氛下继续室温反应12h;
6)反应完毕后,反应液用二氯甲烷稀释,依次用稀盐酸(1M)、饱和碳酸钠水溶液和蒸馏水洗涤,分离得到的有机相用无水硫酸镁干燥过夜;有机相过滤之后将滤液旋蒸浓缩,并在冰乙醚中沉淀;
7)将沉淀抽滤后置于真空烘箱中干燥,即可得聚合物末端基团为丙烯酸酯功能化的PCL-A;
8)称取1.0g PCL-A(0.1mmol),0.68g HDD(3mmol,30eq.)和0.65g TDP(3.1mmol,31eq.)置于50mL干燥的圆底烧瓶中,加入10mL重蒸的氯仿溶解使其混合均匀,然后在55℃的油浴中反应72h;
9)反应结束后,加入适量的氯仿稀释并用冰乙醚沉淀,抽滤并用冰乙醚洗涤,真空干燥后得到淡黄色粉末状固体,即为PCL-b-PAE。
(三)响应性含有原卟啉(PpIX)的复合壳层胶束的制备,步骤如下:
1)将上述(一)和(二)中所得的同重量比的嵌段共聚物PEG-b-PCL和PCL-b-PAE混合,溶解于4mL四氢呋喃中,配制得到2.5mg mL–1的溶液,取200μL原卟啉的DMF溶液与4mL含有聚合物的THF溶液混合均匀;
2)将聚合物有机溶液逐滴缓慢地加入到剧烈的搅拌条件下的12mL醋酸盐缓冲液(pH 4.5,100mM)中(控制滴速为20秒/滴),水溶液逐渐由无色透明变为泛着微弱蓝色乳光,证明胶束的形成;
3)将得到的胶束溶液在磷酸盐缓冲液(pH 7.4,10mM)中用截留分子量为7000的透析袋透析三天,以除去有机溶剂。最后加入磷酸盐缓冲液(pH 7.4,10mM)定容到20mL,得到浓度为0.5mg mL–1的复合壳层胶束溶液(MSPMs)。
参见附图2,给出了响应性含有原卟啉(PpIX)的复合壳层胶束单线态氧产生能力的测定,步骤如下:
1)将新制备的负载了原卟啉后的胶束与水溶性的蒽环化合物9,10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸(9,10-anthracenediyl-bis(methylene)dimalonic acid,ADA)在测试池中混合;
2)得到的混合溶液中胶束的浓度为0.2mg mL–1而ADA的浓度为10μM;
3)测试池用LED阵列灯照射,照射条件为12×8LED阵列,波长630±30nm,能量密度20mW cm–2;
4)每照射一分钟后用岛津公司UV–2550型紫外可见分光光度计测量ADA的紫外吸收。并记录紫外吸收谱图上380nm和401nm两处的吸收值;
5)通过不同光照时间点两处吸收值和初始时刻ADA在两处吸收值得比值来衡量单线态氧的产生能力。
附图3通过负载光敏剂的胶束对卡那霉素有耐药性的生物发光基因转染的金黄色葡萄球菌的杀灭,对浮游细菌杀灭能力评估,步骤如下:
1)将100μL对卡那霉素有耐药性的生物发光基因转染的金黄色葡萄球菌S.aureusXen36(1010bacteria mL–1,PBS,pH 7.4)与新制备的负载有原卟啉的胶束100μL(胶束浓度0–160μg mL–1,PB,pH 7.4)混合;
2)光照条件(波长:630±30nm,12×8LED矩阵,光照强度:20mW cm–2)每隔5分钟用小动物活体成像仪(Lumina II,Imaging System,Perkin Elmer)拍摄生物发光照片一直到30分钟;
3)培养板里每个孔的生物发光强度可以利用仪器软件进行定量化的测定;
4)将不同时刻板内每个孔的发光强度和最初始时刻的发光强度进行比较得到其杀菌效率。
图4通过负载光敏剂的胶束对卡那霉素有耐药性的生物发光基因转染的金黄色葡萄球菌的生物被膜杀灭,对浮游细菌生物被膜能力评估,步骤如下:
1)将对卡那霉素有耐药性的生物发光基因转染的金黄色葡萄球菌S.aureusXen36培养的生物被膜与新制备的负载有原卟啉的胶束100μL(胶束浓度0–160μg mL–1,PB,pH 7.4)混合;
2)光照条件(波长:630±30nm,12×8LED矩阵,光照强度:20mW cm–2)每隔5分钟用小动物活体成像仪(Lumina II,Imaging System,Perkin Elmer)拍摄生物发光照片一直到60分钟;
3)培养板里每个孔的生物发光强度可以利用仪器软件进行定量化的测定;
4)将不同时刻板内每个孔的发光强度和最初始时刻的发光强度进行比较得到其对生物被膜细菌的杀菌效率。
本发明由两种嵌段聚合物聚乙二醇-b-聚环己内酯PEG-b-PCL和聚β-氨酯-b-聚环己内酯PCL-b-PAE所组成的复合胶束在本发明之前的工作中已经验证了它的长循环性能和表面自适应可调性,其制备及作用机制参见附图1。至于光源,本发明选取便宜易得的LED,在96孔板盖上本发明安置了12×8的LED阵列,这样正好可以照在96孔板中。由于LED光源不需要和激光一样的庞大体积的控制器,易于制备、使用,而且便于携带,可以根据需要来设计光源的形状,而且造价便宜,其优势明显。
需要说明的是,本发明是针对负载光敏剂的聚合物胶束的制备方法,其目的是得到响应性含有原卟啉(PpIX)的复合壳层胶束,同时将该复合壳层胶束用于浮游细菌和细菌生物被膜的杀灭,指出了本发明产品所具有的特点,但并非属于对疾病的针对及治疗。背景技术中所描述的相关治疗等内容,只是为了起到对本发明的背景的了解作用。另外,本发明不限于这里的实施例,本领域技术人员根据本发明的揭示,对于本发明做出的显而易见的改进和修饰都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种负载光敏剂的聚合物胶束的制备方法,其特征在于步骤如下:
1)将同重量比的嵌段共聚物PEG-b-PCL和PCL-b-PAE混合,溶解于4mL四氢呋喃中,配制得到2.5mg mL–1的溶液,取200μL原卟啉的DMF溶液与4mL含有聚合物的THF溶液混合均匀;
2)将聚合物有机溶液逐滴缓慢地加入到剧烈的搅拌条件下的12mL醋酸盐缓冲液中,水溶液逐渐由无色透明变为泛着微弱蓝色乳光,证明胶束的形成;
3)将得到的胶束溶液在磷酸盐缓冲液中用截留分子量为7000的透析袋透析三天,以除去有机溶剂;最后加入磷酸盐缓冲液定容到20mL,得到浓度为0.5mg mL–1的复合壳层胶束溶液MSPMs;
聚乙二醇-b-聚环己内酯的制备步骤如下:
1)将2.0g CH3O-PEG114-OH和4.2g重蒸处理过的ε-CL加入到50mL干燥的Schlenk瓶中;
2)加入15mL重蒸过的无水甲苯溶解,加入一滴Sn(Oct)2;
3)通过液氮冷冻—抽真空—充氮气—解冻,循环三次;
4)氮气保护下于100℃的油浴中反应过夜;
5)反应完毕后冷至室温,加入适量二氯甲烷稀释,然后在冰乙醚中沉淀;待沉淀完全后,抽滤,滤饼用冰乙醚洗涤三次,真空干燥后所得到的白色粉末状固体即为PEG5k-b-PCL;
聚环己内酯-b-聚β-氨酯制备步骤如下:
1)将127mg苯甲醇和11.4g重蒸过ε-CL加入干燥过的Schlenk瓶中,然后加入15mL无水甲苯溶解均匀,加入230mg Sn(Oct)2;
2)液氮冷冻,抽真空,通氮气,解冻,重复此过程三次,之后在氮气保护下,于100℃的油浴中反应过夜;
3)反应结束后冷至室温,加入适量的二氯甲烷稀释,然后冰乙醚沉淀,在冰箱中静置过夜使其沉淀完全,经抽滤洗涤,真空干燥后得到白色粉末状固体PCL-OH;
4)称取3.0g PCL-OH置于50mL干燥的圆底烧瓶中,用6mL无水二氯甲烷溶解,然后加入0.15g无水三乙胺,将圆底烧瓶置于冰水浴中搅拌使其混合均匀;
5)用10mL无水二氯甲烷将0.108g丙烯酰氯缓慢地逐滴滴入到圆底烧瓶中,滴完后,逐步升温至室温,在氮气气氛下继续室温反应12h;
6)反应完毕后,反应液用二氯甲烷稀释,依次用稀盐酸、饱和碳酸钠水溶液和蒸馏水洗涤,分离得到的有机相用无水硫酸镁干燥过夜,有机相过滤之后将滤液旋蒸浓缩,并在冰乙醚中沉淀;
7)将沉淀抽滤后置于真空烘箱中干燥,即可得聚合物末端基团为丙烯酸酯功能化的PCL-A;
8)称取1.0g PCL-A,0.68g HDD和0.65g TDP置于50mL干燥的圆底烧瓶中,加入10mL重蒸的氯仿溶解使其混合均匀,然后在55℃的油浴中反应72h;
9)反应结束后,加入适量的氯仿稀释并用冰乙醚沉淀,抽滤并用冰乙醚洗涤,真空干燥后得到淡黄色粉末状固体,即为PCL-b-PAE。
2.根据权利要求1所述的负载光敏剂的聚合物胶束的制备方法,其特征在于:所述的醋酸盐缓冲液为pH 4.5,100mM,控制滴速为20秒/滴。
3.根据权利要求1所述的负载光敏剂的聚合物胶束的制备方法,其特征在于:所述的磷酸盐缓冲液为pH 7.4,10mM。
4.一种如权利要求1所述负载光敏剂的聚合物胶束对浮游细菌杀灭的应用,其特征在于用于杀灭耐药的浮游细菌,步骤如下:
1)将100μL对卡那霉素有耐药性的生物发光基因转染的金黄色葡萄球菌S.aureusXen36与如权利要求2制备的负载有原卟啉的胶束100μL混合;
2)光照条件为波长:630±30nm,12×8LED矩阵,光照强度:20mW cm–2,每隔5分钟用小动物活体成像仪拍摄生物发光照片一直到30分钟;
3)培养板里每个孔的生物发光强度可以利用仪器软件进行定量化的测定;
4)将不同时刻板内每个孔的发光强度和最初始时刻的发光强度进行比较得到其杀菌效率。
5.一种如权利要求1所述负载光敏剂的聚合物胶束对细菌生物被膜杀灭的应用,其特征在于用于杀灭耐药的浮游细菌,步骤如下:
1)将对卡那霉素有耐药性的生物发光基因转染的金黄色葡萄球菌S.aureus Xen36培养的生物被膜与新制备的负载有原卟啉的胶束100μL混合;
2)光照条件每隔5分钟用小动物活体成像仪拍摄生物发光照片一直到60分钟;所述光照条件为波长:630±30nm,12×8LED矩阵,光照强度:20mW cm–2;
3)培养板里每个孔的生物发光强度可以利用仪器软件进行定量化的测定;
4)将不同时刻板内每个孔的发光强度和最初始时刻的发光强度进行比较得到其对生物被膜细菌的杀菌效率。
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CN (1) | CN106035351B (zh) |
Families Citing this family (3)
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CN109966491B (zh) * | 2019-04-02 | 2022-03-08 | 南京师范大学 | 一种释放光敏剂的抗菌纳米胶束及其制备方法和应用 |
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Citations (3)
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-
2016
- 2016-06-03 CN CN201610394945.5A patent/CN106035351B/zh active Active
Patent Citations (3)
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Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
"Surface-Adaptive, Antimicrobially Loaded, Micellar Nanocarriers with Enhanced Penetration and Killing Efficiency in Staphylococcal Biofilms";刘勇 等;《ACS Nano》;20160321;第10卷(第4期);第4781页、第4786页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN106035351A (zh) | 2016-10-26 |
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