CN104055751A - 一种长循环和靶向协同的多功能抗肿瘤靶向纳米药物载体 - Google Patents
一种长循环和靶向协同的多功能抗肿瘤靶向纳米药物载体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104055751A CN104055751A CN201410241636.5A CN201410241636A CN104055751A CN 104055751 A CN104055751 A CN 104055751A CN 201410241636 A CN201410241636 A CN 201410241636A CN 104055751 A CN104055751 A CN 104055751A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pcl
- rgdfk
- poly
- targeting
- pae
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
一种长循环和靶向协同的多功能抗肿瘤靶向纳米药物载体，由粒径为30-200nm且均匀分布的复合胶束组成，所述复合胶束由两种双亲性嵌段共聚物组成，包括一种亲水端带有靶向基团修饰的pH响应性的双亲性嵌段共聚物和一种为亲水端为PEG的双亲性嵌段共聚物，该复合胶束在pH7.4下为核-壳结构，核层由双亲性嵌段共聚物的疏水端组成，壳层为PEG和靶向基团修饰的pH响应性的亲水端混合组成。本发明的优点：该药物载体表面结构可通过改变不同嵌段共聚物比例灵活调控，靶向基团针对肿瘤细胞具有特异性靶向作用，药物载体具有响应性释放能力，生物相容性较好，并具有生物可降解性；制备工艺简单、易于操作。
Description
技术领域
本发明属于生物医药和纳米医学技术领域，特别是一种长循环和靶向协同的多功能抗肿瘤靶向纳米药物载体。
背景技术
癌症是一种影响人类健康的恶性疾病，近三十年来，世界癌症发病率以每年3-5％的速度增加，严重危害着人们的身心健康。目前肿瘤的治疗策略是以化疗、手术切除、放疗和生物治疗等手段的综合治疗。其中药物化疗是治疗肿瘤的主要手段之一，所用的抗肿瘤化疗药物仍以小分子细胞毒性药物为主，给药后这些药物在体内分布广泛。同时，绝大多数抗肿瘤药物是疏水的，静脉给药后能够到达的肿瘤组织的很少，很多在肝、脾等健康器官和组织中分布，导致在治疗肿瘤的同时对机体正常组织也产生严重的毒副作用。如何提高化疗药物对肿瘤组织的选择性，减少其在正常组织的分布，降低其毒副作用，提高药物生物利用度是提高抗肿瘤化疗药物疗效的关键。
纳米药物载体在输送药物过程中面临诸多的障碍，靶向肿瘤的药物输送是一个体内5步串联的过程：1)在血液循环系统中保留较长时间(血液屏障)，以实现2)肿瘤组织中的高效富集(EPR效应)，3)在肿瘤组织渗透到各个部分以到达所有肿瘤细胞，4)能够快速进入肿瘤细胞，并5)在胞内将药物快速释放。然而，对于多功能的纳米药物载体，每一新的功能势必增加了体系的复杂性并带来新的问题，并且不同特定功能之间往往会产生一定的矛盾。例如，一些药物载体表面修饰亲水性较好的聚合物以避免网状内皮系统的快速清除，获得较好的长循环性能并提高肿瘤部位的富集量。但是，研究表明，这些载体不易被肿瘤细胞内吞，降低肿瘤治疗效果。与此同时，一些具有良好应用前景的靶向药物载体具有良好的肿瘤细胞内吞能力，然而长循环及肿瘤部位的高效富集难以实现，此外，对于一些表面修饰了靶向基团如c(RGDfK)的纳米粒子，c(RGDfK)直接暴露在纳米粒子表面，易于血液中的调理素相互作用，使得纳米粒子在调理素作用下，促使其被网状内皮系统快速清除，并可能会引起免疫反应，大大降低了抗肿瘤疗效。
目前解决长循环和细胞内吞的研究主要集中表面聚乙二醇(PEG)可脱离的纳米载体。这种纳米药物载体在血液循环过程中，在PEG的屏蔽作用下，载体材料可以在一定程度上避免体内网状内皮系统的快速清除，提高了血液循环时间。同时，在EPR效应发挥作用后，载体材料进入肿瘤组织，在肿瘤组织微环境如弱 酸性、过度表达的酶类等响应性刺激下，PEG响应性脱除，从而发生电荷转变或暴露出的靶向于肿瘤细胞的靶向基团，提高细胞内吞能力。尽管如此，目前大部分的PEG脱壳研究仍然处于细胞水平，体内的验证还没有实现。同时，脱壳过程及脱壳机理较为复杂，适用范围较窄。因此，为解决长循环和细胞内吞的矛盾，需要发展新型具有协同作用的纳米药物载体系统，提高抗肿瘤治疗效果。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在不足，提供一种长循环和靶向协同的多功能抗肿瘤靶向纳米药物载体，该药物载体保留了表面PEG修饰及表面结构所带来的长循环性能，同时可有效提高肿瘤细胞摄取能力，有效提高抗肿瘤治疗效果。
本发明的技术方案：
一种长循环和靶向协同的多功能抗肿瘤靶向纳米药物载体，由粒径为30-200nm且均匀分布的复合胶束组成，所述复合胶束由两种双亲性嵌段共聚物通过在水溶液中自组装形成，其中一种双亲性嵌段共聚物为聚乙二醇-b-聚环己内酯(PEG-b-PCL)，其亲水端为聚乙二醇(PEG)、疏水端为聚环己内酯(PCL)，另一种双亲性嵌段共聚物为聚环己内酯-b-聚β氨酯-c(RGDfK)[(PCL-b-PAE-c(RGDfK)]，式中c(RGDfK)为短链环肽[其氨基酸序列为cyclo(Arg-Gly-Asp-d-Phe-Lys)]，其亲水端为带有靶向基团修饰且具有pH响应的端基为c(RGDfK)的聚β氨酯[PAE-c(RGDfK)]、疏水端亦为聚环己内酯(PCL)，上述两种双亲性嵌段共聚物的疏水端的分子量为2-10kDa(千道尔顿)且相差＜5kDa；所述复合胶束在pH7.4水溶液中为核-壳结构，其中核为疏水端聚环己内酯(PCL)，壳层为聚乙二醇(PEG)和PAE-c(RGDfK)的复合壳层。
一种所述长循环和靶向协同的多功能抗肿瘤靶向纳米药物载体的制备方法，包括如下步骤：
1)聚乙二醇-b-聚环己内酯(PEG2k-b-PCL)的合成
以端羟基聚乙二醇(CH3O-PEG45-OH)为引发剂，以辛酸亚锡[Sn(Oct)2]为催化剂，以ε-己内酯(ε-CL)为单体，开环聚合制备，具体方法是：将干燥处理过的端羟基聚乙二醇和减蒸处理过的ε-CL溶于重蒸过的无水甲苯中，加入Sn(Oct)2，依次进行液氮冷冻、抽真空、通氮气、解冻，重复三次，110℃油浴中反应12h，反应后旋蒸除去甲苯，加入二氯甲烷溶解粘稠物后，在冰乙醚中沉淀，抽滤洗涤后，将固体产物置于真空烘箱中干燥，即可得到白色固体聚乙二醇-b-聚环己内酯(PEG2k-b-PCL)；
2)聚环己内酯-b-聚β氨酯-c(RGDfK)[PCL-b-PAE-c(RGDfK)]的合成
利用开环聚合和迈克尔加成反应通过连续反应制备，具体方法是：将叔丁氧羰基氨基乙醇(BOC-NH-C2H4OH)和减蒸过的ε-己内酯(ε-CL)混合，加入重蒸过的甲苯溶解，加入辛酸亚锡[Sn(Oct)2]，依次进行液氮冷冻、抽真空、通氮气、解冻，重复三次，然后在110℃油浴中反应12h，反应后旋蒸除去甲苯，加入二氯甲烷溶解粘稠物后，在冰乙醚中沉淀，抽滤洗涤后，将固体产物置于真空烘箱中干燥，得到PCL的均聚物PCL-OH；
将上述PCL-OH、三乙胺(TEA)和重蒸后的二氯甲烷混合均匀得到混合液a，然后将丙烯酰氯溶解于重蒸后的二氯甲烷中，混合均匀得到混合液b，将混合液b在氩气氛围下逐滴缓慢滴入到混合液a中，滴加完毕后封闭反应体系，缓慢升至室温，在氩气氛围下反应12h后，萃取反应液，用饱和碳酸钠溶液、0.1mol/L的盐酸溶液和纯水分别洗涤至少三次，取有机相，用无水硫酸镁干燥8-10h，抽滤，旋蒸浓缩后在冰乙醚中沉淀，静置8-10h后抽滤，用无水乙醚洗涤后，将固体置于真空烘箱中干燥，即可制得端基碳碳双键功能化的PCL-A；
将上述PCL-A、己烷-1,6-二醇-二丙烯酸酯(HDD)和4,4′-三亚甲基-二哌啶(TDP)混合后，加入氯仿溶解，55℃油浴中反应，72h后，在反应液中加入N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺(NAS)，继续反应12h，封端并终止反应，即可得到黄色固体PCL-b-PAE-NAS；
将上述PCL-b-PAE-NAS和短链环肽[c(RGDfK)]混合后，加入DMF和氯仿的混合溶剂，然后加入三乙胺(TEA)，30℃下搅拌反应8-10h，反应液旋蒸除去氯仿，在超纯水中透析，透析袋截留分子量为12-14k Da，每天换水四次，透析三天后，冷冻干燥，即可制得聚环己内酯-b-聚β氨酯-c(RGDfK)[PCL-b-PAE-c(RGDfK)]；
3)室温下分别将步骤1)和2)中所得到的两种嵌段共聚物PCL-b-PAE-c(RGDfK)和PEG-b-PCL分别溶解在有机溶剂氯仿中，得到两种聚合物溶液，这两种溶液的浓度均为2mg/mL；另外将阿霉素盐酸盐加入到氯仿中，再加入三乙胺中和阿霉素盐酸盐中的盐酸，制得浓度为2mg/mL的阿霉素溶液；
4)将步骤3)中制备得到的两种聚合物溶液和阿霉素溶液按照体积比为1：1：1均匀混合，得到混合溶液；
5)将上述混合溶液在超声搅拌下逐滴加入到pH为4.0、浓度为10-4mol/L的盐酸中，滴加完全后，在35℃下剧烈搅拌挥发至有机溶剂基本挥发完全，然后在室温下旋蒸至完全除去未挥发干净的有机溶剂，加入浓度为0.1mol/L的氢 氧化钠溶液调节pH至7.4，在超纯水中透析，所用透析袋截留分子量为12-14kDa，透析两天后，经超滤离心浓缩，即可制得所需浓度的负载阿霉素的纳米药物载体(载药胶束RMSM-DOX)。
所述步骤1)中端羟基聚乙二醇、ε-己内酯、甲苯、辛酸亚锡、二氯甲烷和冰乙醚的用量比为2.0g：5.0g：20mL：50μL：20mL：200mL。
所述步骤2)中BOC-NH-C2H4OH、ε-己内酯、甲苯、辛酸亚锡、二氯甲烷和冰乙醚的用量比为0.1g：3.5g：10mL：50μL：5mL：50mL；所述混合液a中PCL-OH、三乙胺与二氯甲烷的用量比为2.5g：0.25g：5mL；混合液b中丙烯酰氯与二氯甲烷的用量比为0.18g：10mL；混合液a与混合液b的质量比7:10；所述PCL-A、己烷-1,6-二醇-二丙烯酸酯(HDD)、4,4′-三亚甲基-二哌啶(TDP)、氯仿和4,4′-三亚甲基-二哌啶(TDP)的用量比为0.5g：0.68g：0.69g：10mL：0.305g；所述DMF与氯仿混合溶剂中DMF-氯仿的体积比3:2；PCL-b-PAE-NAS、c(RGDfK)、DMF-氯仿混和溶剂和TEA的用量比为80mg：16mg：5mL：200μL。
本发明的合成路线如下所示：
采用开环聚合(ROP)的方法合成生物可降解的嵌段共聚物PEG-b-PCL的合成路线如下所示：
本发明是工作机理：
嵌段共聚物PEG-b-PCL和PCL-b-PAE-c(RGDfK)在弱酸性水溶液中自组装负载阿霉素得到了以负载阿霉素的PCL为核，PEG和PAE-c(RGDfK)为混合壳层的复合载药体系。在pH7.4时，非均相的表面结构有利于复合胶束在体内的长循环，并且由于靶向分子隐藏在PEG壳层中，可以降低在血液循环过程中靶向分子带来的不利影响。从血液生理环境到肿瘤组织弱酸环境的改变过程中，复合胶束表面电荷出现由弱的负电转变到较强的正电的电荷反转现象，有利于载药胶束结合肿瘤细胞。同时，在肿瘤组织弱酸条件下，靶向分子伸展出来可进一步增强细胞的内吞作用。因此，这种新型的纳米药物载体可以兼顾血液长循环和肿瘤细胞有效摄取，进而提高抗肿瘤治疗效果。
本发明的优点是：
该抗肿瘤靶向纳米药物载体，表面结构可通过改变不同嵌段共聚物比例灵活调控；靶向基团针对肿瘤细胞具有特异性靶向作用；载药系统具有响应性释放能力，在酸性条件下释放相对较快，而在正常组织环境中释放较慢；载药体系生物相容性较好，并具有生物可降解性；制备工艺简单、易于操作。
附图说明
图1为PEG-b-PCL的1H NMR谱图，图中分别标出不同碳原子上的质子所对应的峰位置。
图2为PCL-b-PAE-c(RGDfK)的1H NMR谱图，图中c(RGDfK)上的苯环峰在δ＝7.3-7.4ppm之间。
图3为载药胶束组RMSM-DOX在三种不同pH(7.4，6.5和5.0)下的药物累积释放曲线，实验中研究了72小时之内的药物释放情况。其中，在pH7.4时药物释放较慢，药物释放速率随pH的降低而加快。
图4为自由阿霉素药物组(free DOX)和载药胶束组(RMSM-DOX)分别在pH7.4和6.5两种pH下的HepG2细胞存活率结果以及对应的半抑制率IC50值。其中自由药物组的IC50值在pH7.4和6.5下分别为6.64和8.60μg/mL，而RMSM-DOX组在pH7.4时IC50为17.9μg/mL，在pH6.5时下降到0.26μg/mL。
图5为自由阿霉素药物组(free DOX)、载药胶束组(RMSM-DOX)以及空白对照生理盐水组(Saline)的抗肿瘤活性曲线。第一次尾静脉注射30天之后，生理盐水组的肿瘤平均体积为初始体积的21.7倍，自由阿霉素药物组为18.1倍，而载药胶束组则仅为5.2倍，略小于生理盐水组的四分之一。
具体实施方式
下面结合具体实施例待遇本发明加以进一步的说明，但不限定本发明内容。
实施例：
一种长循环和靶向协同的多功能抗肿瘤靶向纳米药物载体，由粒径约为100nm且均匀分布的复合胶束组成，所述复合胶束由两种双亲性嵌段共聚物通过在水溶液中自组装形成，其中一种双亲性嵌段共聚物为聚乙二醇-b-聚环己内酯(PEG-b-PCL)，其亲水端为聚乙二醇(PEG)、疏水端为聚环己内酯(PCL)，另一种双亲性嵌段共聚物为聚环己内酯-b-聚β氨酯-c(RGDfK)[(PCL-b-PAE-c(RGDfK)]，式中c(RGDfK)为短链环肽[其氨基酸序列为cyclo(Arg-Gly-Asp-d-Phe-Lys)]，其亲水端为带有靶向基团修饰且具有pH响应的端基为c(RGDfK)的聚β氨酯[PAE-c(RGDfK)]、疏水端亦为聚环己内酯(PCL)，上述两种双亲性嵌段共聚物的疏水端的分子量为2-10kDa(千道尔顿)且相差＜5kDa；所述复合胶束在pH7.4水溶液中为核-壳结构，其中核为疏水端聚环己内酯(PCL)，壳层为聚乙二醇(PEG)和PAE-c(RGDfK)的复合壳层。
一种所述长循环和靶向协同的多功能抗肿瘤靶向纳米药物载体的制备方法，包括如下步骤：
1)聚乙二醇-b-聚环己内酯(PEG2k-b-PCL)的合成
以端羟基聚乙二醇(CH3O-PEG45-OH)为引发剂，以辛酸亚锡[Sn(Oct)2]为催化剂，以ε-己内酯(ε-CL)为单体，开环聚合制备，具体方法是：将干燥处理过的端羟基聚乙二醇2.0g和减蒸处理过的ε-CL5.0g溶于重蒸过的20mL无水甲苯中，加入50μL Sn(Oct)2，依次进行液氮冷冻、抽真空、通氮气、解冻，重复三次，110℃油浴中反应12h，反应后旋蒸除去甲苯，加入20mL二氯甲烷溶解粘稠物后，在200mL冰乙醚中沉淀，抽滤洗涤后，将固体产物置于真空烘箱中干燥，即可得到白色固体聚乙二醇-b-聚环己内酯(PEG2k-b-PCL)；
2)聚环己内酯-b-聚β氨酯-c(RGDfK)[PCL-b-PAE-c(RGDfK)]的合成
利用开环聚合和迈克尔加成反应通过连续反应制备，具体方法是：将叔丁氧羰基氨基乙醇(BOC-NH-C2H4OH)0.1g和减蒸过的ε-己内酯(ε-CL)3.5g置 于茄型瓶中，加入10m重蒸过的甲苯溶解，加入50μL辛酸亚锡[Sn(Oct)2]，依次进行液氮冷冻、抽真空、通氮气、解冻，重复三次，然后在110℃油浴中反应12h，反应后旋蒸除去甲苯，加入5mL二氯甲烷溶解粘稠物后，在50mL冰乙醚中沉淀，抽滤洗涤后，将固体产物置于真空烘箱中干燥，得到PCL的均聚物PCL-OH；
将上述2.5g PCL-OH、0.25g三乙胺(TEA)和5mL重蒸后的二氯甲烷混合均匀得到混合液a，将圆底烧瓶置于冰水浴中，然后将0.18g丙烯酰氯溶解于0.18g重蒸后的二氯甲烷中，混合均匀得到混合液b，加入到恒压滴液漏中，将混合液b在氩气氛围下逐滴缓慢滴入到圆底烧瓶混合液a中，混合液a与混合液b的质量比7:10，滴加完毕后封闭反应体系，缓慢升至室温，在氩气氛围下反应12h后，萃取反应液，用饱和碳酸钠溶液、0.1mol/L的盐酸溶液和纯水分别洗涤至少三次，取有机相，用无水硫酸镁干燥8-10h，抽滤，旋蒸浓缩后在冰乙醚中沉淀，静置8-10h后抽滤，用无水乙醚洗涤后，将固体置于真空烘箱中干燥，即可制得端基碳碳双键功能化的PCL-A；
将上述PCL-A0.5g、己烷-1,6-二醇-二丙烯酸酯(HDD)0.68g和4,4′-三亚甲基-二哌啶(TDP)0.69g混合后，加入10mL氯仿溶解，55℃油浴中反应，72h后，在反应液中加入0.305g N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺(NAS)，继续反应12h，封端并终止反应，即可得到黄色固体PCL-b-PAE-NAS；
将80mg上述PCL-b-PAE-NAS和16mg短链环肽[c(RGDfK)]混合后，加入5mL体积比为3:2的DMF和氯仿的混合溶剂，然后加入200μL三乙胺(TEA)，30℃下搅拌反应8-10h，反应液旋蒸除去氯仿，在超纯水中透析，透析袋截留分子量为12-14k Da，每天换水四次，透析三天后，冷冻干燥，即可制得聚环己内酯-b-聚β氨酯-c(RGDfK)[PCL-b-PAE-c(RGDfK)]；
3)室温下分别将步骤1)和2)中所得到的两种嵌段共聚物PCL-b-PAE-c(RGDfK)和PEG-b-PCL分别溶解在有机溶剂氯仿中，得到两种聚合物溶液，这两种溶液的浓度均为2mg/mL；另外将阿霉素盐酸盐加入到氯仿中，再加入三乙胺中和阿霉素盐酸盐中的盐酸，制得浓度为2mg/mL的阿霉素溶液；
4)将步骤3)中制备得到的两种聚合物溶液和阿霉素溶液按照体积比为1：1：1均匀混合，得到混合溶液；
5)将上述混合溶液在超声搅拌下逐滴加入到pH为4.0、浓度为10-4mol/L的盐酸中，滴加完全后，在35℃下剧烈搅拌挥发至有机溶剂基本挥发完全，然 后在室温下旋蒸至完全除去未挥发干净的有机溶剂，加入浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.4，在超纯水中透析，所用透析袋截留分子量为12-14kDa，透析两天后，经超滤离心浓缩，即可制得所需浓度的负载阿霉素的纳米药物载体(载药胶束RMSM-DOX)。
实验分析：
1)多功能抗肿瘤纳米载药胶束的体外阿霉素释放
分别取1mL载药胶束RMSM-DOX溶液于透析袋(透析袋截留分子量：12-14kDa)中，置于3mL的缓冲溶液中，在三种不同pH(pH7.4，6.5和5.0)37℃电磁搅拌下，每隔一段时间取出1mL缓冲溶液用荧光分光光度计测定其波长在592nm处的荧光强度，并加入1mL新的缓冲溶液，保证透析袋外溶液体积不变，利用阿霉素在水中的标准曲线来计算阿霉素的累积释放量。
图3为载药胶束组RMSM-DOX在三种不同pH(7.4，6.5和5.0)下的药物累积释放曲线，实验中研究了72小时之内的药物释放情况，图中表明：在pH7.4时药物释放较慢，药物释放速率随pH的降低而加快。
2)多功能抗肿瘤纳米载药胶束的细胞毒性实验
采用MTT法，以HepG2细胞为研究对象评价载药胶束的细胞毒性。将HepG2细胞以每孔4000个分别接种到96孔板中。加入500μL RPMI1640的细胞培养液，在5％CO2，在37℃下分别孵育24h。之后每孔加入不同浓度(0.001,0.01,0.1,0.5,1,5,10和50μg/mL)的自由阿霉素药物组(free DOX)和载药胶束组(RMSM-DOX)。分别在两个pH(7.4和6.5)下继续培养2h，之后弃去培养液，加入500μL新鲜的培养基，继续培养24h，之后每孔加入25μL5mg/mL的MTT溶液，4h后弃去培养液，每孔加入150μL DMSO，室温孵育15～20min，振荡培养板，用酶联检测仪在570mm波长检测光吸收值，计算细胞相对增殖百分率，并根据结果估测半抑制率IC50。
图4为自由阿霉素药物组(free DOX)和载药胶束组(RMSM-DOX)分别在pH7.4和6.5两种pH下的HepG2细胞存活率结果以及对应的半抑制率IC50值。其中自由药物组的IC50值在pH7.4和6.5下分别为6.64和8.60μg/mL，而RMSM-DOX组在pH7.4时IC50为17.9μg/mL，在pH6.5时下降到0.26μg/mL。
3)多功能抗肿瘤纳米载药胶束的细胞摄取实验
将HepG2细胞以每孔105个接种到96孔板中，每孔均加入500μL RPMI-1640培养基，培养24h后，弃去原培养基并加入500μL新鲜培养基，其中分别含10 μg/mL阿霉素的自由阿霉素药物组(free DOX)和载药胶束组(RMSM-DOX)。分别在两个pH(7.4和6.5)下继续培养2h，之后弃去培养液，并用500μL PBS缓冲溶液洗涤三次。在倒置荧光显微镜(DMI6000B,Leica,Wetzlar,Germany)下观察不同胶束的细胞摄取情况。研究结果显示，自由阿霉素药物组在pH7.4和6.5下，细胞中阿霉素的荧光强度均较弱且变化不大。载药胶束组在pH7.4时，阿霉素荧光强度较弱，而在pH6.5时荧光强度大大增加，并高于自由阿霉素药物组。
4)多功能抗肿瘤纳米载药胶束的抗肿瘤药效研究
将HepG2细胞以4×105的量移植到BALB/c裸鼠的腹部。培养4-5周，当荷瘤小鼠的肿瘤体积在200mm3后，将小鼠随机分为三组，分别为生理盐水组(Saline)、自由阿霉素药物组(free DOX)和载药胶束组(RMSM-DOX)，每组十只。DOX剂量为5mg/kg小鼠体重。五组小鼠分别通过尾静脉注射六次，每两天一次。在第一次注射后三十天内检测小鼠肿瘤的体积和重量。
图5为自由阿霉素药物组(free DOX)、载药胶束组(RMSM-DOX)以及空白对照生理盐水组(Saline)的抗肿瘤活性曲线。第一次尾静脉注射30天之后，生理盐水组的肿瘤平均体积为初始体积的21.7倍，自由阿霉素药物组为18.1倍，而载药胶束组则仅为5.2倍，略小于生理盐水组的四分之一。
检测：
取1mL RMSM-DOX冷干，冷干产物溶于1mL二甲基甲酰胺(DMF)中，荧光光谱测定DOX的荧光强度，利用DOX在DMF中的标准曲线，计算DOX含量，通过所测结果得到荧光强度(F)与阿霉素浓度(c)的关系式为F＝-183.1+438.8c。
药物负载率(DLC)和包封率(DLE)的计算公式如下：
DLC(wt％)＝(载药量/载药胶束总质量)×100％；
DLE(％)＝(载药量/初始投药量)×100％。
通过测定计算载药胶束组的DLC(wt％)为9.9％，DLE(％)为21.9％。
Claims (4)
1.一种长循环和靶向协同的多功能抗肿瘤靶向纳米药物载体，其特征在于：由粒径为30-200 nm且均匀分布的复合胶束组成，所述复合胶束由两种双亲性嵌段共聚物通过在水溶液中自组装形成，其中一种双亲性嵌段共聚物为聚乙二醇-b-聚环己内酯（PEG-b-PCL），其亲水端为聚乙二醇（PEG）、疏水端为聚环己内酯（PCL），另一种双亲性嵌段共聚物为聚环己内酯-b-聚β氨酯-c(RGDfK)[（PCL-b-PAE-c(RGDfK)]，式中c(RGDfK)为短链环肽[其氨基酸序列为cyclo(Arg-Gly-Asp-d-Phe-Lys)]，其亲水端为带有靶向基团修饰且具有pH响应的端基为c(RGDfK)的聚β氨酯[PAE-c(RGDfK)]、疏水端亦为聚环己内酯（PCL），上述两种双亲性嵌段共聚物的疏水端的分子量为2-10 kDa（千道尔顿）且相差＜5 kDa；所述复合胶束在pH 7.4水溶液中为核-壳结构，其中核为疏水端聚环己内酯（PCL），壳层为聚乙二醇（PEG）和PAE-c(RGDfK)的复合壳层。
2.一种如权利要求1所述长循环和靶向协同的多功能抗肿瘤靶向纳米药物载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1）聚乙二醇-b-聚环己内酯（PEG2k-b-PCL）的合成
以端羟基聚乙二醇（CH3O-PEG45-OH）为引发剂，以辛酸亚锡[Sn(Oct)2]为催化剂，以ε-己内酯（ε-CL）为单体，开环聚合制备，具体方法是：将干燥处理过的端羟基聚乙二醇和减蒸处理过的ε-CL溶于重蒸过的无水甲苯中，加入Sn(Oct)2，依次进行液氮冷冻、抽真空、通氮气、解冻，重复三次，110 °C油浴中反应12 h，反应后旋蒸除去甲苯，加入二氯甲烷溶解粘稠物后，在冰乙醚中沉淀，抽滤洗涤后，将固体产物置于真空烘箱中干燥，即可得到白色固体聚乙二醇-b-聚环己内酯（PEG2k-b-PCL）；
2）聚环己内酯-b-聚β氨酯-c(RGDfK)[ PCL-b-PAE-c(RGDfK)]的合成
利用开环聚合和迈克尔加成反应通过连续反应制备，具体方法是：将叔丁氧羰基氨基乙醇（BOC-NH-C2H4OH）和减蒸过的ε-己内酯（ε-CL）混合，加入重蒸过的甲苯溶解，加入辛酸亚锡[Sn(Oct)2]，依次进行液氮冷冻、抽真空、通氮气、解冻，重复三次，然后在110 °C油浴中反应12 h，反应后旋蒸除去甲苯，加入二氯甲烷溶解粘稠物后，在冰乙醚中沉淀，抽滤洗涤后，将固体产物置于真空烘箱中干燥，得到PCL的均聚物PCL-OH；
将上述PCL-OH、三乙胺（TEA）和重蒸后的二氯甲烷混合均匀得到混合液a，然后将丙烯酰氯溶解于重蒸后的二氯甲烷中，混合均匀得到混合液b，将混合液b在氩气氛围下逐滴缓慢滴入到混合液a中，滴加完毕后封闭反应体系，缓慢升至室温，在氩气氛围下反应12 h后，萃取反应液，用饱和碳酸钠溶液、0.1 mol/L的盐酸溶液和纯水分别洗涤至少三次，取有机相，用无水硫酸镁干燥8-10 h，抽滤，旋蒸浓缩后在冰乙醚中沉淀，静置8-10 h后抽滤，用无水乙醚洗涤后，将固体置于真空烘箱中干燥，即可制得端基碳碳双键功能化的PCL-A；
将上述PCL-A、 己烷-1,6-二醇-二丙烯酸酯（HDD）和4,4′-三亚甲基-二哌啶（TDP）混合后，加入氯仿溶解，55 °C油浴中反应，72 h后，在反应液中加入N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺（NAS），继续反应12 h，封端并终止反应，即可得到黄色固体PCL-b-PAE-NAS；
将上述PCL-b-PAE-NAS和短链环肽[c(RGDfK)]混合后，加入DMF和氯仿的混合溶剂，然后加入三乙胺（TEA），30 °C下搅拌反应8-10h，反应液旋蒸除去氯仿，在超纯水中透析，透析袋截留分子量为12-14k Da，每天换水四次，透析三天后，冷冻干燥，即可制得聚环己内酯-b-聚β氨酯-c(RGDfK)[ PCL-b-PAE-c(RGDfK)]；
3）室温下分别将步骤1）和2）中所得到的两种嵌段共聚物PCL-b-PAE-c(RGDfK)和PEG-b-PCL分别溶解在有机溶剂氯仿中，得到两种聚合物溶液，这两种溶液的浓度均为2 mg/mL；另外将阿霉素盐酸盐加入到氯仿中，再加入三乙胺中和阿霉素盐酸盐中的盐酸，制得浓度为2 mg/mL的阿霉素溶液；
4）将步骤3）中制备得到的两种聚合物溶液和阿霉素溶液按照体积比为1：1：1均匀混合，得到混合溶液；
5）将上述混合溶液在超声搅拌下逐滴加入到pH 为4.0、浓度为10-4 mol/L的盐酸中，滴加完全后，在35 °C下剧烈搅拌挥发至有机溶剂基本挥发完全，然后在室温下旋蒸至完全除去未挥发干净的有机溶剂，加入浓度为0.1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.4，在超纯水中透析，所用透析袋截留分子量为12-14 kDa，透析两天后，经超滤离心浓缩，即可制得所需浓度的负载阿霉素的纳米药物载体（载药胶束RMSM-DOX）。
3.根据权利要求2所述长循环和靶向协同的多功能抗肿瘤靶向纳米药物载体的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中端羟基聚乙二醇、ε-己内酯、甲苯、辛酸亚锡、二氯甲烷和冰乙醚的用量比为2.0 g：5.0 g ：20 mL：50 μL：20 mL：200 mL。
4.根据权利要求2所述长循环和靶向协同的多功能抗肿瘤靶向纳米药物载体的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中BOC-NH-C2H4OH、ε-己内酯、甲苯、辛酸亚锡、二氯甲烷和冰乙醚的用量比为0.1 g：3.5 g：10 mL：50 μL：5 mL：50 mL；所述混合液a中PCL-OH、三乙胺与二氯甲烷的用量比为2.5 g：0.25 g：5 mL；混合液b中丙烯酰氯与二氯甲烷的用量比为0.18 g：10 mL；混合液a与混合液b的质量比7:10；所述PCL-A、己烷-1,6-二醇-二丙烯酸酯（HDD）、4,4′-三亚甲基-二哌啶（TDP）、氯仿和4,4′-三亚甲基-二哌啶（TDP）的用量比为0.5 g：0.68 g：0.69 g：10 mL：0.305 g；所述DMF与氯仿混合溶剂中DMF-氯仿的体积比3:2； PCL-b-PAE-NAS、 c(RGDfK)、DMF-氯仿混和溶剂和TEA的用量比为80 mg：16 mg：5 mL：200 μL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410241636.5A CN104055751A (zh) | 2014-06-03 | 2014-06-03 | 一种长循环和靶向协同的多功能抗肿瘤靶向纳米药物载体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410241636.5A CN104055751A (zh) | 2014-06-03 | 2014-06-03 | 一种长循环和靶向协同的多功能抗肿瘤靶向纳米药物载体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104055751A true CN104055751A (zh) | 2014-09-24 |
Family
ID=51543873
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410241636.5A Pending CN104055751A (zh) | 2014-06-03 | 2014-06-03 | 一种长循环和靶向协同的多功能抗肿瘤靶向纳米药物载体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104055751A (zh) |
Cited By (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104382851A (zh) * | 2014-10-17 | 2015-03-04 | 南开大学 | 一种智能靶向载药复合胶束的制备方法 |
| CN105168130A (zh) * | 2015-08-06 | 2015-12-23 | 安徽医科大学 | 一种肿瘤靶向聚合物胶束及其制备方法 |
| CN105754107A (zh) * | 2016-04-25 | 2016-07-13 | 苏州大学 | 一种亲水性聚（ω-己内酯）及其制备方法 |
| CN106035351A (zh) * | 2016-06-03 | 2016-10-26 | 南开大学 | 一种负载光敏剂的聚合物胶束的制备方法及该胶束在浮游细菌、细菌生物被膜杀灭中的应用 |
| CN106619508A (zh) * | 2016-12-12 | 2017-05-10 | 中山大学 | 一种多功能纳米药物载体及其形成的载药胶束及载药胶束制备方法 |
| CN106750343A (zh) * | 2016-12-25 | 2017-05-31 | 河南师范大学 | Y型两亲嵌段共聚物及其制备方法和以该共聚物为载体靶向胞内释药的载药胶束 |
| CN106924749A (zh) * | 2017-05-16 | 2017-07-07 | 西南大学 | 一种pH响应与协同治疗的靶向小分子前药的制备方法 |
| CN107141741A (zh) * | 2017-06-26 | 2017-09-08 | 南开大学 | 一种可大幅提高包涵体蛋白复性效率的高分子复合胶束及其复性工艺 |
| CN107296790A (zh) * | 2017-06-30 | 2017-10-27 | 华中科技大学 | 一种基于聚磷酸酯的混合载药胶束及其制备方法和一种主动靶向基团修饰的混合载药胶束 |
| CN108329463A (zh) * | 2018-01-24 | 2018-07-27 | 东南大学 | 一种pH响应型维生素E载药材料及其制备方法和应用 |
| CN108363901A (zh) * | 2018-02-08 | 2018-08-03 | 中国石油大学(华东) | 一种pH响应型嵌段共聚物PAE-PEG装载与释放萘分子的模拟方法 |
| CN109568600A (zh) * | 2019-01-25 | 2019-04-05 | 南开大学 | 一种具有双配体可逆互屏蔽的靶向纳米胶束的结构及载药系统 |
| CN109718202A (zh) * | 2018-09-11 | 2019-05-07 | 上海交通大学 | 一种适用于载疏水性化学药物的靶向载药胶束 |
| CN110507825A (zh) * | 2018-05-21 | 2019-11-29 | 国家纳米科学中心 | 一种多肽聚合物及其制备方法和应用 |
| CN111228515A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-06-05 | 南京大学 | 一种单分子包覆的荧光素纳米粒子及其制备方法 |
| CN111939266A (zh) * | 2020-08-20 | 2020-11-17 | 常州工程职业技术学院 | 一种具有还原、近红外光双重响应的桦木酸前药胶束、制备方法和应用 |
| CN112353948A (zh) * | 2020-10-21 | 2021-02-12 | 四川大学 | 响应酸性微环境实现粒径减小和表面电荷翻转的载药胶束及其制备方法 |
| CN113549184A (zh) * | 2021-07-23 | 2021-10-26 | 南充市中心医院 | 同时具有pH和氧化还原双响应的聚合物载体、载药胶束及制备方法和应用 |
| CN114949255A (zh) * | 2022-06-07 | 2022-08-30 | 南京工业大学 | 一种聚肌氨酸修饰的金纳米囊泡及其制备方法和用途 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101732724A (zh) * | 2010-01-07 | 2010-06-16 | 浙江大学 | 一种携载抗肿瘤药物的复合胶束及其制备方法 |
| CN101940792A (zh) * | 2010-09-30 | 2011-01-12 | 中国医学科学院生物医学工程研究所 | PCL-b-PEG-b-PCL载疏水性药物聚合物囊泡及制备方法及用途 |
| US20130022545A1 (en) * | 2011-07-18 | 2013-01-24 | Research & Business Foundation Sungkyunkwan University | DRUG DELIVERY SYSTEM FOR TREATMENT OF LIVER CANCER BASED ON INTERVENTIONAL INJECTION OF TEMPERATURE AND pH-SENSITIVE HYDROGEL |
-
2014
- 2014-06-03 CN CN201410241636.5A patent/CN104055751A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101732724A (zh) * | 2010-01-07 | 2010-06-16 | 浙江大学 | 一种携载抗肿瘤药物的复合胶束及其制备方法 |
| CN101940792A (zh) * | 2010-09-30 | 2011-01-12 | 中国医学科学院生物医学工程研究所 | PCL-b-PEG-b-PCL载疏水性药物聚合物囊泡及制备方法及用途 |
| US20130022545A1 (en) * | 2011-07-18 | 2013-01-24 | Research & Business Foundation Sungkyunkwan University | DRUG DELIVERY SYSTEM FOR TREATMENT OF LIVER CANCER BASED ON INTERVENTIONAL INJECTION OF TEMPERATURE AND pH-SENSITIVE HYDROGEL |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| CHO H.,ET AL.: "Polymeric Micelles for Apoptosis-Targeted Optical imaging of cancer and intraoperative surgical guidance", 《PLOS ONE》, vol. 9, no. 2, 28 February 2014 (2014-02-28) * |
| GAO X.,ET AL.: "Preparation,characterization and application of star-shaped PCL/PEG micelles for the delivery of doxorubicin in the treatment of colon cancer", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF NANOMEDICINE》, vol. 8, no. 1, 7 March 2013 (2013-03-07) * |
| WANG F,ET AL.: "The Functions and Applications of RGD in Tumor Therapy and Tissue Engineering", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES》, vol. 14, 27 June 2013 (2013-06-27) * |
Cited By (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104382851A (zh) * | 2014-10-17 | 2015-03-04 | 南开大学 | 一种智能靶向载药复合胶束的制备方法 |
| CN104382851B (zh) * | 2014-10-17 | 2018-12-28 | 南开大学 | 一种智能靶向载药复合胶束的制备方法 |
| CN105168130A (zh) * | 2015-08-06 | 2015-12-23 | 安徽医科大学 | 一种肿瘤靶向聚合物胶束及其制备方法 |
| CN105168130B (zh) * | 2015-08-06 | 2017-10-27 | 安徽医科大学 | 一种肿瘤靶向聚合物胶束及其制备方法 |
| CN105754107B (zh) * | 2016-04-25 | 2018-08-07 | 苏州大学 | 一种亲水性聚（ω-己内酯）及其制备方法 |
| CN105754107A (zh) * | 2016-04-25 | 2016-07-13 | 苏州大学 | 一种亲水性聚（ω-己内酯）及其制备方法 |
| CN106035351A (zh) * | 2016-06-03 | 2016-10-26 | 南开大学 | 一种负载光敏剂的聚合物胶束的制备方法及该胶束在浮游细菌、细菌生物被膜杀灭中的应用 |
| CN106035351B (zh) * | 2016-06-03 | 2018-11-13 | 南开大学 | 一种负载光敏剂的聚合物胶束的制备方法及该胶束在浮游细菌、细菌生物被膜杀灭中的应用 |
| CN106619508A (zh) * | 2016-12-12 | 2017-05-10 | 中山大学 | 一种多功能纳米药物载体及其形成的载药胶束及载药胶束制备方法 |
| CN106750343A (zh) * | 2016-12-25 | 2017-05-31 | 河南师范大学 | Y型两亲嵌段共聚物及其制备方法和以该共聚物为载体靶向胞内释药的载药胶束 |
| CN106750343B (zh) * | 2016-12-25 | 2020-07-03 | 河南师范大学 | Y型两亲嵌段共聚物及其制备方法和以该共聚物为载体靶向胞内释药的载药胶束 |
| CN106924749A (zh) * | 2017-05-16 | 2017-07-07 | 西南大学 | 一种pH响应与协同治疗的靶向小分子前药的制备方法 |
| CN107141741A (zh) * | 2017-06-26 | 2017-09-08 | 南开大学 | 一种可大幅提高包涵体蛋白复性效率的高分子复合胶束及其复性工艺 |
| CN107296790A (zh) * | 2017-06-30 | 2017-10-27 | 华中科技大学 | 一种基于聚磷酸酯的混合载药胶束及其制备方法和一种主动靶向基团修饰的混合载药胶束 |
| CN107296790B (zh) * | 2017-06-30 | 2020-08-18 | 华中科技大学 | 一种基于聚磷酸酯的混合载药胶束及其制备方法和一种主动靶向基团修饰的混合载药胶束 |
| CN108329463A (zh) * | 2018-01-24 | 2018-07-27 | 东南大学 | 一种pH响应型维生素E载药材料及其制备方法和应用 |
| CN108363901A (zh) * | 2018-02-08 | 2018-08-03 | 中国石油大学(华东) | 一种pH响应型嵌段共聚物PAE-PEG装载与释放萘分子的模拟方法 |
| CN110507825A (zh) * | 2018-05-21 | 2019-11-29 | 国家纳米科学中心 | 一种多肽聚合物及其制备方法和应用 |
| CN110507825B (zh) * | 2018-05-21 | 2022-07-01 | 国家纳米科学中心 | 一种多肽聚合物及其制备方法和应用 |
| CN109718202B (zh) * | 2018-09-11 | 2021-07-06 | 上海交通大学 | 一种适用于载疏水性化学药物的靶向载药胶束 |
| CN109718202A (zh) * | 2018-09-11 | 2019-05-07 | 上海交通大学 | 一种适用于载疏水性化学药物的靶向载药胶束 |
| CN109568600A (zh) * | 2019-01-25 | 2019-04-05 | 南开大学 | 一种具有双配体可逆互屏蔽的靶向纳米胶束的结构及载药系统 |
| CN111228515A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-06-05 | 南京大学 | 一种单分子包覆的荧光素纳米粒子及其制备方法 |
| CN111939266A (zh) * | 2020-08-20 | 2020-11-17 | 常州工程职业技术学院 | 一种具有还原、近红外光双重响应的桦木酸前药胶束、制备方法和应用 |
| CN112353948B (zh) * | 2020-10-21 | 2021-08-27 | 四川大学 | 响应酸性微环境实现粒径减小和表面电荷翻转的载药胶束及其制备方法 |
| CN112353948A (zh) * | 2020-10-21 | 2021-02-12 | 四川大学 | 响应酸性微环境实现粒径减小和表面电荷翻转的载药胶束及其制备方法 |
| CN113549184A (zh) * | 2021-07-23 | 2021-10-26 | 南充市中心医院 | 同时具有pH和氧化还原双响应的聚合物载体、载药胶束及制备方法和应用 |
| CN114949255A (zh) * | 2022-06-07 | 2022-08-30 | 南京工业大学 | 一种聚肌氨酸修饰的金纳米囊泡及其制备方法和用途 |
| CN114949255B (zh) * | 2022-06-07 | 2023-08-18 | 南京工业大学 | 一种聚肌氨酸修饰的金纳米囊泡及其制备方法和用途 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104055751A (zh) | 一种长循环和靶向协同的多功能抗肿瘤靶向纳米药物载体 | |
| Zhang et al. | Pharmacokinetics, biodistribution, efficacy and safety of N-octyl-O-sulfate chitosan micelles loaded with paclitaxel | |
| CN103705940B (zh) | 一种天然活性药物-多糖靶向复合物的制备及其抗肿瘤的应用 | |
| Liu et al. | Camptothecine encapsulated composite drug delivery system for colorectal peritoneal carcinomatosis therapy: biodegradable microsphere in thermosensitive hydrogel | |
| CN106265510A (zh) | 一种肿瘤细胞内pH触发式释药的多级靶向聚合物胶束及其制备方法 | |
| CN106267229B (zh) | 一种肝靶向载铂纳米前药的结构及其制备方法 | |
| CN104888235A (zh) | 具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药及其制备方法与应用 | |
| CN105287383A (zh) | 新型米托蒽醌脂质体联合化疗药物在抗肿瘤治疗中的应用 | |
| CN103705943A (zh) | 一种还原响应型聚乙二醇化药物纳米组合物的制备及其应用 | |
| CN103705534A (zh) | 一种天然活性物质构建的高分子复合药物的制备及其在抑制血管生成中的应用 | |
| CN104530256A (zh) | 透明质酸维生素e琥珀酸酯聚合物及其制备和用途 | |
| CN103800915B (zh) | 一种靶向整合素受体的联合载药胶束及其制备方法 | |
| CN109793710B (zh) | 一种光热化疗联合治疗微环境响应的载药纳米胶束的制备方法及应用 | |
| CN103006539A (zh) | 一种聚合物胶束药物组合物及其制备方法 | |
| Yi et al. | Synthesis, characterization, and formulation of poly-puerarin as a biodegradable and biosafe drug delivery platform for anti-cancer therapy | |
| CN104162169A (zh) | 一种药物组合物及其制备方法和用途 | |
| Wu et al. | Synergistic action of doxorubicin and 7-Ethyl-10-hydroxycamptothecin polyphosphorylcholine polymer prodrug | |
| CN113952463A (zh) | 一种纳米诊疗剂及其制备方法与应用 | |
| Ma et al. | Multi-functionalized dendrimers for targeted co-delivery of sorafenib and paclitaxel in liver cancers | |
| CN106389355A (zh) | 一种紫杉烷类抗肿瘤药物的聚合物胶束冻干制剂及其制备方法和应用 | |
| CN107929279A (zh) | 一种新型黄酮衍生聚合物纳米药物及其在肿瘤治疗中的应用 | |
| Luo et al. | MPEG-PCL nanomicelles platform for synergistic metformin and chrysin delivery to breast cancer in mice | |
| CN107982217A (zh) | 一种包载疏水性药物的具靶向和放疗增敏双重功能脂质-聚合物、其制备方法及其应用 | |
| CN109593158A (zh) | 一种γ-谷氨酰转肽酶催化水解致电荷翻转的聚合物及其在药物输送领域的应用 | |
| CN105125495B (zh) | 聚酯类材料担载双硫仑的纳米粒及其应用、药物制剂及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| AD01 | Patent right deemed abandoned | ||
| AD01 | Patent right deemed abandoned |
Effective date of abandoning: 20170111 |