CN104382851B - 一种智能靶向载药复合胶束的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种智能靶向载药复合胶束的制备方法，所述复合胶束表面同时修饰有靶向配体和pH/温度协同敏感聚合物，实现靶向配体在血液循环时（37℃，pH7.4）的“屏蔽”状态和在肿瘤组织时（热疗温度40‑44℃，pH6.5‑6.8）的“去屏蔽”状态的可逆转变。本专利使用的pH与温度双重敏感具有协同性，更适用于人体的复杂生理环境。本发明的优点是：该复合胶束充分利用了靶向配体的靶向性和pH/温度协同敏感聚合物的灵敏相转变性质，构建了兼具肿瘤靶向特异性和血液循环稳定性的靶向可逆屏蔽纳米给药系统。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是一种智能靶向载药复合胶束的制备方法。
背景技术
靶向纳米给药系统可以将包载的“药物”定点输送至病变部位，提高对肿瘤组织的特异性治疗效果、降低化疗药物的副作用。然而目前广泛使用的靶向配体大多是疏水性和外源性的，导致靶向纳米给药系统容易被单核吞噬系统(MPS)清除，降低药物在肿瘤区域的富集量。实现靶向配体在血液循环环境下的屏蔽状态和在肿瘤环境下的去屏蔽状态，可有效地避免纳米给药系统被单核吞噬系统(MPS)清除和提高纳米给药系统的肿瘤细胞靶向能力，是提高靶向纳米给药系统的肿瘤富集量和治疗效果的重要方法。
研究者设计了多种屏蔽-去屏蔽靶向配体的智能药物传递系统,。屏蔽靶向配体的方法主要包括PEG掩埋，聚合物修饰，调控靶向配体电性等，然后利用肿瘤部位的特异性微环境例如低pH(6.5-6.8)和过量表达的酶等，触发脱PEG，表面电荷翻转，靶向配体的弹出以及使失活的配体恢复活性等，从而实现靶向配体的去屏蔽。例如，Zhuo等利用酸敏感键在载体中修饰上PEG以屏蔽靶向配体，到达肿瘤微酸部位后(pH6.5-6.8)，酸敏感键断裂脱去PEG，暴露靶向配体，发挥靶向作用，参见：QUAN C Y,CHEN J X,WANG H Y,et al.Core-Shell Nanosized Assemblies Mediated by the α-β Cyclodextrin Dimer with aTumor-Triggered Targeting Property[J].ACS nano,2010,4(7):4211-4219；Jin等利用血液与肿瘤环境的微小pH差异，使中性环境失活的细胞穿膜肽在肿瘤弱酸性条件下恢复活性，参见：JIN E,ZHANG B,SUN X,et al.Acid-active cell-penetrating peptides forin vivo tumor-targeted drug del ivery[J].Journal of the American ChemicalSociety,2013,135(2):933-940；Zhang等利用肿瘤环境中过表达的MMP酶实现了纳米粒表面的聚天冬氨酸屏蔽层在肿瘤部位的定点脱落从而恢复靶向能力，参见：ZHANG J,YUAN ZF,WANG Y,et al.Multifunctional envelope-type mesoporous silica nanoparticlesfor tumor-triggered targeting drug delivery[J].Journal of the AmericanChemical Society,2013,135(13):5068-5073。这些精巧的设计均实现了靶向配体在血液循环环境中的屏蔽状态和在肿瘤部位的去屏蔽状态，从而赋予纳米粒子以血液循环稳定性和肿瘤部位的靶向性。尽管如此，最近的研究(Deng C,Jiang Y,Cheng R,Meng F,ZhongZ.Biodegradable polymeric micelles for targeted and controlled anticancerdrug delivery:Promises,progress and prospects[J].Nano Today 2012；7:467–480.)表明，肿瘤组织的药物富集量仍不足注射量的5％。
我们认为，肿瘤组织的药物富集量较低的一个重要原因是，靶向配体的屏蔽和去屏蔽效果不具有可逆性。那些去屏蔽但未能被肿瘤细胞摄取的载药纳米粒子再次回到血液循环时，容易被单核吞噬系统(MPS)清除。因此发展一种靶向配体具有可逆屏蔽-去屏蔽效果的载药纳米系统十分必要。
利用温敏聚合物的可逆相转变，可以实现靶向配体在血液循环环境和肿瘤热疗区域的可逆屏蔽和去屏蔽效果。Salmaso等人和Park等人使用温敏聚合物聚N-异丙基丙烯酰胺，利用温度敏感控制金纳米粒或者量子点的促融合蛋白介导的可控的细胞摄取，参见Mastrotto F,Caliceti P,Amendola V,Bersani S,Magnusson JP,Meneghetti M,etal.Polymer control of ligand display on gold nanoparticles for multimodalswitchable cell targeting.Chem Commun2011；47:9846–9848.和Kim C,Lee Y,Kim JS,Jeong JH,Park TG.Thermally triggered cellular uptake of quantum dotsimmobilized with poly(N-isopropylacrylamide)and cell penetratingpeptide.Langmuir2010；26:14965–1499.温和热疗下的肿瘤部位温度在40-44℃之间，人体正常温度是37℃，据此研究者通过亲水单体与N-异丙基丙烯酰胺共聚等方法(参见文献LiW,Li J,Gao J,Li B,Xia Y,Meng Y,et al.The fine-tuning of thermosensitive anddegradable polymer micelles for enhancing intracellular uptake and drugrelease in tumors.Biomaterials2011；32:3832-3844)，提高温敏体系的最低临界溶解温度到40℃左右，从而实现温和热疗下的靶向配体的可逆屏蔽和去屏蔽转变，但是这种单一利用温敏可逆相转变实现聚合物的伸展和收缩变化的可逆性不佳，响应速度慢(参见文献Lutz J-FF,Akdemir,Hoth A,Akdemir O.Point by point comparison of twothermosensitive polymers exhibiting a similar LCST:Is the age of poly(NIPAM)over？J Am Chem Soc 2006；128:13046–13047.)，难以适用于复杂的人体生理环境。因此，提高温敏靶向可逆屏蔽体系在复杂生理环境下的实用性十分有必要。
本发明利用肿瘤组织的微酸环境，构建一种具有温度和pH双重刺激的靶向可逆屏蔽体系，这种具有协同性的双重敏感提高了该体系在复杂生理环境下的相转变灵敏性。靶向配体在血液循环时(37℃，pH7.4)处于“屏蔽”状态，在肿瘤组织时(热疗温度40-44℃，pH6.5-6.8)处于“去屏蔽”状态；这种靶向配体的“屏蔽”和“去屏蔽”转变具有可逆性，实现了在肿瘤组织中未被细胞摄取而重新回到血液循环中的靶向纳米粒靶向配体再次处于“屏蔽”状态，从而获得兼具高效血液循环稳定性和肿瘤靶向性的靶向纳米给药系统。
发明内容
本发明针对靶向纳米给药粒子在肿瘤细胞中的药物累积量不足的问题，提供一种智能靶向载药复合胶束的制备方法。该纳米粒子表面的靶向配体在血液循环时处于“屏蔽”状态，从而提高血液循环稳定性，在到达肿瘤组织时(温和热疗40-44℃、微酸环境pH6.5-6.8)处于“去屏蔽”状态，从而恢复纳米粒的靶向能力。这种靶向配体的“屏蔽”和“去屏蔽”状态的转变，具有可逆性。同时，本发明中使用的pH/温度协同敏感聚合物，提高了靶向纳米系统在复杂生理环境下的相转变灵敏性，进而赋予靶向配体更快的“屏蔽”和“去屏蔽”可逆转变，从而获得兼具长效的血液循环性和高效靶向性的靶向纳米给药系统。
本发明的技术方案:
一种智能靶向载药复合胶束的制备方法，其特征在于：所述智能靶向载药复合胶束使用pH/温度协同敏感聚合物可逆控制纳米粒子表面靶向配体的“屏蔽”与“去屏蔽”状态，即该纳米粒子表面的靶向配体在正常血液循环时处于“屏蔽”状态，提高纳米粒的血液循环稳定性，在到达肿瘤组织时靶向配体处于“去屏蔽”状态，从而恢复纳米粒的靶向能力，这种靶向配体的“屏蔽”和“去屏蔽”状态的转变具有可逆性，因此可以兼具长效血液循环和高效肿瘤细胞靶向性，其制备方法包括如下步骤：
1)温敏嵌段共聚物、pH/温度协同敏感嵌段共聚物、非靶向两亲性嵌段共聚物和靶向两亲性嵌段共聚物的合成
首先制备由亲水嵌段和疏水嵌段组成的非靶向两亲性嵌段共聚物；使用同样方法，制备末端含有靶向配体(TLs)的靶向两亲性嵌段共聚物，其中靶向配体偶联在亲水嵌段末端；制备温敏嵌段共聚物，其中一段为具有温度敏感性的嵌段，一段为疏水嵌段，通过调控投料比等参数，获得不同的嵌段长度和不同最低临界溶解温度(LCST)的嵌段共聚物；制备pH/温度协同敏感嵌段共聚物，其中一段是具有pH/温度协同敏感的共聚物，一段为疏水嵌段，通过调控投料比等参数，获得不同的嵌段长度、不同pH敏感性和不同最低临界溶解温度(LCST)的嵌段共聚物；
2)载药复合胶束的制备
在低于最低临界溶解温度的条件下，通过透析方法，将以上制备的温敏嵌段共聚物和靶向嵌段共聚物与药物混合制成复合胶束，通过调节嵌段共聚物的投料比例和种类，控制复合胶束的两嵌段比例和嵌段长度，即可制得智能靶向载药复合胶束。
所述靶向配体(TLs)是具有肿瘤细胞靶向作用的物质，包括实体瘤组织表面具有相应高表达特异性受体的配体-叶酸(FA)、甘草次酸、甘草酸、生物素(biotin)和RGD多肽。
所述非靶向两亲性嵌段共聚物是包括亲水嵌段和疏水嵌段的两嵌段共聚物，其中亲水嵌段为聚乙二醇(PEG)，聚羟乙基丙烯酸甲酯(PHEMA)、聚甲基丙烯酸β羟丙酯(PHPMA)或聚乙烯醇(PVA)；疏水嵌段为聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)或聚(乙交酯-丙交酯)(PLGA)。
所述靶向两亲性嵌段共聚物为亲水嵌段末端修饰有靶向配体(TLs)的两亲性嵌段共聚物，包括亲水嵌段和疏水嵌段两部分，其中亲水嵌段为聚乙二醇(PEG)，聚羟乙基丙烯酸甲酯(PHEMA)、聚甲基丙烯酸β羟丙酯(PHPMA)或聚乙烯醇(PVA)；疏水嵌段为聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)或聚(乙交酯-丙交酯)(PLGA)。
所述温敏嵌段共聚物是包含温敏嵌段和疏水嵌段的两嵌段共聚物，其中温敏嵌段由温敏单体和亲水性调节单体聚合而成，其中温敏单体为N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、N,N-二乙基丙烯酰胺、甲基乙烯基醚、2-(2-甲氧基乙氧基)乙基甲基丙烯酸酯(MEO2MA)或寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)；亲水性调节单体为丙烯酰胺或N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAAm)单体；疏水嵌段为聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)或聚(乙交酯-丙交酯)(PLGA)。
所述温敏嵌段共聚物的最低临界溶解温度(LCST)受共聚比例、盐浓度和溶液pH的影响，当温敏单体为N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、亲水单体为N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAAm)且N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)与N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAAm)的共聚比例为5:1-1:1、pH为7.4、NaCl浓度为135mM时，该嵌段共聚物自组装得到的聚合物胶束的最低临界溶解温度(LCST)为38-41℃。
所述pH/温度协同敏感嵌段共聚物是包含pH/温度协同敏感嵌段和疏水嵌段的两嵌段共聚物，其中pH/温度协同敏感嵌段是有温敏单体、调节单体和pH敏感单体共聚而成，温敏单体为N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、N,N-二乙基丙烯酰胺、甲基乙烯基醚、2-(2-甲氧基乙氧基)乙基甲基丙烯酸酯(MEO2MA)或寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)，调节单体为丙烯酰胺(AAm)、N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAAm)、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸乙酯单体，pH敏感单体为丙烯酸(AA)或甲基丙烯酸(MAA)，疏水嵌段为聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)或聚(乙交酯-丙交酯)(PLGA)。
所述最低临界溶解温度(LCST)受共聚比例、盐浓度和溶液pH的影响，当温敏单体为N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、亲水性调节单体为N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAAm)且N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)与N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAAm)的共聚比例为5:1-1:1、pH为7.4、NaCl浓度为135mM时，该温敏嵌段共聚物的最低临界溶解温度(LCST)为38-41℃；当温敏单体为N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、调节单体为甲基丙烯酸乙酯、pH敏感单体是丙烯酸(AA)，且N-异丙基丙烯酰胺：甲基丙烯酸乙酯：丙烯酸的三单体共聚比例为1:0.04-0.15:0.04-0.15，在离子强度为150mM的PBS中，pH/温度协同敏感共聚物在pH7.4下的LCST大于50℃，在pH6.5下的LCST为36.4℃。
所述亲水嵌段的分子量为500-5000，温敏嵌段和pH/温度协同敏感嵌段的分子量为2000-50000，疏水嵌段的分子量为2000-100000。
一种所制备的智能靶向载药复合胶束的应用，用于包封药物，所述药物为阿霉素、紫杉醇或喜树碱。
本发明的技术分析：
嵌段共聚物的亲水段优选为聚乙二醇(PEG)，PEG具有优异的水溶性和生物相容性，是FDA批准的生物医用材料，可长时间在体内循环，通过聚乙二醇(PEG)链端引入生物靶向分子可实现高效肿瘤细胞内吞；温敏单体优选为N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)，因聚合物聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)具有独特的温敏性而在生物医学上应用广泛，研究表明其分子量小于4万时，可以通过泌尿系统排出体外。所选用的pH敏感单体是丙烯酸或者甲基丙烯酸，溶液pH可以调节其质子化程度，进而调节亲疏水程度，pH降低质子化增强疏水性增强导致共聚物的LCST降低，同时这种pH对LCST的调节具有可逆性。
在低于最低临界溶解温度(LCST)的温度下，温敏段表现为亲水性，在水溶液中自由伸展；当温度上升到LCST以上时，温敏段转变为疏水性，在水溶液中坍塌。对于外壳中含有温敏嵌段的复合胶束来说，温敏嵌段在低于和高于其LCST时，其分别处于充分伸展和坍塌的状态，利用温敏嵌段伸展和坍塌的效果，可以分别赋予聚合物胶束表面的靶向配体的隐藏和暴露的状态，从而赋予靶向配体以屏蔽状态和去屏蔽状态的靶向能力。
本发明报道的pH/温度协同敏感聚合物，是一种三单体共聚物，由温敏单体、调节单体和pH敏感单体共聚而成。其中温敏单体赋予聚合物以温度敏感性，pH敏感单体赋予聚合物以pH敏感性，而调节单体的作用则是调节聚合物的最低临界溶解温度(LCST)到人体适用的环境范围。pH敏感单体具有质子化/去质子化官能团，因此pH刺激可以通过影响质子化程度调控聚合物的亲疏水性，进而调控pH/温度协同敏感聚合物的最低临界溶解温度(LCST)。因此，pH/温度协同敏感聚合物的最低临界溶解温度(LCST)具有pH依赖性。为了实现体内的应用，我们期望通过调控聚合物的单体比例等参数，实现了聚合物的最低临界溶解温度(LCST)在正常pH(人体正常生理环境，pH7.4)下高于人体正常温度37℃，在低pH下(肿瘤组织微酸环境pH6.5-6.8)低于人体正常温度37℃和温和热疗温度(40-44℃)，通过pH敏感进一步限制温敏敏感聚合物的相转变位置，可以避免人体温度的波动，对温敏聚合物的影响，另一方面，提高了温敏敏感聚合物的相转变灵敏性，提高对生理复杂环境的响应速度，进而有助于提高治疗效果。
所述三种嵌段共聚物的制备方法皆为本领域技术人员公知的技术，其中以生物素(biotin)为靶向配体，疏水嵌段为聚己内酯PCL，亲水嵌段为PEG，温敏嵌段为N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)与N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAAm)的共聚物，pH/温度协同敏感共聚物嵌段为N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和丙烯酰胺和丙烯酸的共聚物为例，得到的温敏嵌段共聚物P(NIPAAm-co-DMAAm)-b-PCL，pH/温度协同敏感嵌段聚合物P(NIPAAm-co-AAm-co-AA)-b-PCL、非靶向两亲性嵌段共聚物mPEG-b-PCL和靶向两亲性嵌段共聚物Biotin-PEG-b-PCL的制备路线如下式所示：
本发明的优点和有益效果是：该制备方法构建了一种新型的pH/温度协同敏感聚合物，借助于临床的热疗仪器将肿瘤组织的温度升高到40-44℃，同时利用肿瘤组织的微酸环境，可以实现pH/温度协同敏感聚合物在肿瘤部位的快速相转变，利用pH/温度协同敏感聚合物的快速相转变性质，构建了靶向纳米粒子表面的靶向配体的可逆“屏蔽”和“去屏蔽”效果，克服了传统的靶向纳米粒的血液循环过程中容易被清除和在肿瘤部位靶向特异性不足的问题，同时热疗方法在临床上操作简单精确，因此这种温度敏感的靶向配体屏蔽去屏蔽纳米药物传递系统，兼具高效血液循环稳定性和靶向特异性的优点。与此同时，基于温敏聚合物实现的屏蔽和去屏蔽效果的靶向纳米粒，具有很好的可逆性，一方面可以保证未进入肿瘤细胞的靶向纳米粒的二次甚至多次重复靶向，另一方面具有增强所包载药物对实体瘤的深度杀伤效果的效果。
附图说明
图1是实施例1和实施例2的靶向复合胶束制备流程及其靶向可逆屏蔽示意图。
图2是实施例1所制备的靶向复合胶束的TEM示意图。
图3是实施例1制备的靶向复合胶束分别在25℃和42℃下的ELISA结果图。
图4是实施例1制备的靶向复合胶束反复低温(25℃)和高温(42℃)处理过程中的粒径变化图。
图5是实施例1制备的靶向复合胶束在经历不同循环次数后的25℃和42℃的ELISA测试结果。
图6是实施例2制备的温敏嵌段共聚物P(NIPAAm-co-DMAAm)-b-PCL的紫外相转变曲线。
图7是实施例3制备的pH/温度协同敏感聚合物P(NIPAAm-co-AAm-AA)-b-PCL的紫外相转变曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：
一种智能靶向载药复合胶束的制备方法，所述智能靶向载药复合胶束使用温度敏感聚合物控制纳米粒子表面靶向配体的“屏蔽”与“去屏蔽”状态，即该纳米粒子表面的靶向配体在正常血液循环时处于“屏蔽”状态，在被局部加热到40-44℃的肿瘤部位时，纳米粒子表面的靶向配体处于“去屏蔽”状态，从而恢复纳米粒的靶向能力，制备方法包括如下步骤：
(1)温敏嵌段共聚物、非靶向两亲性嵌段共聚物和靶向两亲性嵌段共聚物的合成
1)开环聚合(ROP)合成非靶向两亲性嵌段共聚物聚乙二醇-聚ε-己内酯(mPEG-b-PCL)
将1g真空干燥除水后的聚乙二醇单甲醚(mPEG-OH)(数均分子量约为2000)、精制的ε-己内酯9g和辛酸亚锡0.159g加入干燥的25mL单口圆底烧瓶，进行无水无氧处理，即依次进行冷冻-抽真空-充高纯氮气-融化并循环三次，电磁搅拌下在130℃油浴下反应25h。在反应进行2-3h时磁子停止转动，说明聚合发生了。反应完毕，用氯仿溶解，再用体积比为4:1的无水乙醚-正己烷混合溶液沉淀，产生白色沉淀。再用氯仿溶解，重复沉淀操作三次。真空干燥，得固体产物a。
2)开环聚合(ROP)合成靶向两亲性嵌段共聚物生物素-聚乙二醇-聚ε-己内酯(Biotin-PEG-b-PCL)
将0.2g两端分别为羟基和生物素的聚乙二醇生物素(Biotin-PEG-OH)(数均分子量约为2000)和10mL除水的甲苯在常压情况下放入25mL单口圆底烧瓶中，加热共沸除水，蒸出溶剂至剩下约3mL，再加入精制的ε-己内酯1.8g和辛酸亚锡0.052g，加入球形冷凝管，进行无水无氧处理，即依次进行冷冻-抽真空-充高纯氮气-融化并循环三次，电磁搅拌下在116℃油浴下加热回流反应38h。在反应进行4-5h时磁子停止转动，说明聚合发生了。反应完毕，用氯仿溶解，再用体积比为3:1的无水乙醚-正己烷的混合溶液沉淀，产生白色沉淀。再用氯仿溶解，重复沉淀操作三次。真空干燥，制得固体产物b。
3)开环聚合(ROP)合成单羟基聚ε-己内酯(mPCL-OH)
将2-甲氧基乙醇47mg和3mL除水的甲苯在常压情况下放入25mL单口圆底烧瓶中，加入精制的ε-己内酯8.8g和辛酸亚锡0.19g，加入球形冷凝管，进行无水无氧处理，即依次进行冷冻-抽真空-充高纯氮气-融化并循环三次，电磁搅拌下在116℃油浴下加热回流反应25h。在反应进行6-7h时磁子停止转动，说明聚合发生了。反应完毕，用氯仿溶解，无水甲醇沉淀，产生白色沉淀。再用氯仿溶解，重沉淀。最后氯仿溶解后，用正己烷沉淀。真空干燥，制得固体产物c。
4)合成大分子引发剂单端为溴官能团的聚ε-己内酯(mPCL-Br)
称取6.8g步骤3)制备的固体产物a单羟基聚ε-己内酯(PCL-OH)，用45mL无水二氯溶解，加入三乙胺0.5mL，冰水浴冷却，0℃下逐滴加入2-溴异丁酰溴的二氯溶液，该溶液中由0.25mL二溴丙酰溴溶于15mL无水二氯中制得，1h内滴完，电磁搅拌，在室温下反应20h。反应完毕，旋干，加入50mL二氯溶解，用50mL饱和氯化钠水溶液清洗两次，然后用饱和碳酸氢钠溶液清洗一次，再用双蒸水清洗两次，旋蒸浓缩，用无水甲醇沉淀，真空干燥，制得固体产物d。
5)ATRP聚合合成温敏嵌段共聚物聚ε-己内酯-聚(N-异丙基丙烯酰胺)(mPCL-b-PNIPAAm)
称取0.45g步骤4)制得的固体产物d单端溴取代的聚ε-己内酯(mPCL-Br)(分子量1.41万，按1.5万计算)和2.9g的N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)单体，加入3mL的异丙醇和3mL的1,4-二氧六烷，加热使之完全溶解，然后加入26.8mg溴化亚铜(CuBr)，冻抽循环两次后，注射加入含有82.8mg配体三(2-二甲氨基乙基)胺(Me6TREN)的异丙醇溶液0.3mL，冻抽循环一次，于41℃反应46h。用四氢呋喃(THF)稀释反应液，过中性三氧化二铝柱子，四氢呋喃淋洗，收集淋洗液约300mL，旋蒸浓缩，无水乙醚沉淀，四氢呋喃溶解，重沉淀1次，真空干燥，制得固体产物e。
(2)复合胶束的制备
1)准确称量质量比为1:1的的固体产物e(mPCL-b-PNIPAAm)和固体产物b(Biotin-PEG-b-PCL)混和，用丙酮溶解，搅拌状态下逐滴滴入超纯水溶液中，静置8-10h以促进丙酮挥发，用截留分子量为7000的透析柱透析2天，过0.44μm膜，制得复合胶束并于4℃下保存，得到靶向复合胶束。通过控制固体产物e和固体产物b的质量比，制备不同表面生物素和温敏聚合物含量的靶向复合胶束
2)准确称量质量比为1:1的的固体产物e(mPCL-b-PNIPAAm)和固体产物a(mPEG-b-PCL)混和，用丙酮溶解，搅拌状态下逐滴滴入超纯水溶液中，静置8-10h以促进丙酮挥发，用截留分子量为7000的透析柱透析2天，过0.44μm膜，制得复合胶束并于4℃下保存，得到非靶向复合胶束。通过控制固体产物e和固体产物b的质量比，制备不同表面温敏聚合物含量的非靶向复合胶束
图1是实施例1靶向复合胶束制备流程及其靶向可逆屏蔽示意图。
图2是实施例1所制备的靶向复合胶束的TEM示意图，图中显示：复合胶束成规则的球形分别，其粒径约为150-220nm。
复合胶束的可逆靶向性表征：
1)ELISA对复合胶束温敏屏蔽效果的评价
实验的基本过程：在96孔板上固载上蛋白-亲和素(Avidin)，并用BSA填充剩余的空隙，之后在两个温度下25℃和42℃加预处理的复合胶束，使之与固相抗体结合，洗涤除去游离的复合胶束后加入辣根过氧化物酶修饰的链霉亲和素(即酶标抗体)，使酶标抗体与吸附了的复合胶束生物素结合；最后加入底物显色。溶液颜色的深浅与吸附上的复合胶束量成正比。
图3是实施例1制备的靶向复合胶束分别在25℃和42℃下的ELISA结果图，图中表明：复合胶束在42℃下的表面生物素要高于25℃下的表面生物素含量，同时随着浓度的提高，生物素含量的增强程度越小，其可能的原因是浓度增大，复合胶束的在25℃下的结合力增强所致。
图4是实施例1制备的靶向复合胶束反复低温(25℃)和高温(42℃)处理过程中的粒径变化图，图中表明：靶向复合胶束在低温(25℃)下的粒径要高于在高温(42℃)下的粒径，同时，靶向复合胶束在25℃和42℃之间的变化具有可逆性，随着连续的升温和降温过程，复合胶束在25℃和42℃下的粒径没有明显差异。
图5是实施例1制备的靶向复合胶束在经历不同循环次数后的25℃和42℃的ELISA测试结果，图中表明：42℃下检测的复合胶束表面的生物素含量要高于25℃下的生物素含量，同时这种生物素表面含量受温度调控的过程具有可逆性。
2)载阿霉素复合胶束的制备
制备载阿霉素复合胶束的路线和实施例1中的步骤(2)基本相同，区别在于，预先将定量的阿霉素溶解在丙酮溶液中，阿霉素浓度为0.1mg/mL。
3)载阿霉素纳米粒子的细胞摄取实验
取对数期细胞进行培养，加入含有载阿霉素复合胶束的培养液2mL，置于25℃和40℃下培养2h，PBS洗三次，胰酶消化，培养基中和，吹散细胞，离心后将细胞分散到流式固定液中，使用流式细胞仪检测。使用4％的甲醛溶液固定细胞后，使用荧光显微镜检查细胞。
4)温敏屏蔽的可逆性评价
取0.05mg/mL制备的复合胶束溶液，在25℃下稳定30min后测试粒径，再将温度升至42℃稳定30min测试粒径，低温和高温循环测试数次，得到纳米粒子的低温高温粒径可逆变化曲线。同时分别取不同循环次数和温度下的复合胶束溶液，使用ELISA测试其表面的靶向配体含量，得到靶向配体的表面含量，具体操作和实施例1中的步骤7基本相同，从而得到靶向纳米复合胶束的靶向能力随温度的可逆变化曲线。
实施例2：
一种可用于体内温度环境的温敏靶向复合胶束的制备方法，制备复合胶束的操作以及ELISA表征等操作与实施例1基本相同，不同之处在于所用的温敏嵌段共聚物为聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-N,N-二甲基丙烯酰胺)-b-聚ε-己内酯(P(NIPAAm-co-DMAAm)-b-PCL)，其低临界溶液温度调节至39-40℃之间，制备路线如下所示
1)普通自由基合成大分子引发剂聚(N-异丙基丙烯酰胺-N,N-二甲基丙烯酰胺)P(NIPAAm-co-DMAAm)-OH
将链转移剂巯基乙醇0.230mmol、引发剂偶氮二异丁氰(AIBN)0.08mmol、单体N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)2.3mmol和N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAAm)1mmol置于25mL的单口圆底烧瓶中，再加入2mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，进行无水无氧处理，即依次进行冷冻-抽真空-充高纯氮气-融化并循环三次。最后在70℃油浴锅下反应12h。用N,N-二甲基甲酰胺溶解之后，无水乙醚沉淀，用截留分子量为3500的透析柱透析1天，冻干，称重,得到固体产物，即为单端为羟基基团的聚(N-异丙基丙烯酰胺-N,N-二甲基丙烯酰胺)。
2)开环聚合制备聚(N-异丙基丙烯酰胺-N,N-二甲基丙烯酰胺)-聚ε-己内酯(P(NIPAAm-co-DMAAm)-b-PCL)
取步骤1得到的大分子引发剂P(NIPAAm-co-DMAAm)-OH 0.70g、精炼的单体ε-己内酯(ε-CL)0.93g、催化剂辛酸亚锡0.02g和无水甲苯3mL加入到25mL单口圆底烧瓶，球形冷凝回流管回流，冷冻-抽真空-充高纯氮气-融化循环三次，在氮气氛围下于120℃加热回流24h。二氯溶解，无水乙醚沉淀。重复两次。真空干燥，得到固体产物，即为聚(N-异丙基丙烯酰胺-N,N-二甲基丙烯酰胺)-聚ε-己内酯。
图6是实施例2制备的温敏嵌段共聚物P(NIPAAm-co-DMAAm)-b-PCL的紫外相转变曲线，图中表明，所制备的嵌段共聚物聚(N-异丙基丙烯酰胺-N,N-二甲基丙烯酰胺)-聚ε-己内酯的最低临界溶解温度(LCST)在40℃左右，该温度正好处于人体正常组织温度(37℃)和肿瘤热疗温度(40-44℃)之间，因此使用该嵌段共聚物制备的温敏靶向复合胶束，可以获得人体环境下可用的可逆靶向效果。
实施例3：
一种同时具有温度和pH敏感的靶向复合胶束的制备方法，制备复合胶束的操作机器ELISA表征等操作和实施例1基本相同，不同之处在于所用的温敏嵌段共聚物为聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-丙烯酰胺-co-丙烯酸)-b-聚ε-己内酯(P(NIPAAm-co-AAm-co-AA)-b-PCL),其低临界温度同时受到pH和温度的调控，考虑到人体的复杂环境，使用多种环境刺激调控聚合物的相转变，就会可以进行更加精确的调控，从而具有更好的临床使用前景。
pH/温度协同敏感嵌段共聚物的制备路线如下所示。
1)普通自由基合成大分子引发剂聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-丙烯酰胺-co-丙烯酸)P(NIPAAm-co-AAm-co-AA)-OH
将链转移剂巯基乙醇0.230mmol、引发剂偶氮二异丁氰(AIBN)0.08mmol、单体N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)2.3mmol、N,N-丙烯酰胺(AAm)0.14mol、1mmol和丙烯酸(AA)0.14mol置于25mL的单口圆底烧瓶中，再加入2mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，进行无水无氧处理，即依次进行冷冻-抽真空-充高纯氮气-融化并循环三次。最后在70℃油浴锅下反应12h。用N,N-二甲基甲酰胺溶解之后，无水乙醚沉淀，用截留分子量为3500的透析柱透析1天，冻干，称重,得到固体产物，即为单端为羟基基团的聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-丙烯酰胺-co-丙烯酸)。
2)开环聚合制备聚(N-异丙基丙烯酰胺-N,N-二甲基丙烯酰胺)-聚ε-己内酯P(NIPAAm-co-AAm-co-AA)-b-PCL
取步骤1得到的大分子引发剂P(NIPAAm-co-AAm-co-AA)-OH 0.70g、精炼的单体ε-己内酯(ε-CL)0.93g、催化剂辛酸亚锡0.02g和无水甲苯3mL加入到25mL单口圆底烧瓶，球形冷凝回流管回流，冷冻-抽真空-充高纯氮气-融化循环三次，在氮气氛围下于120℃加热回流24h。二氯溶解，无水乙醚沉淀。重复两次。真空干燥，得到固体产物，即为聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-丙烯酰胺-co-丙烯酸)-b-聚ε-己内酯。
图7是实施例3制备的pH/温度协同敏感嵌段聚合物P(NIPAAm-co-AAm-co-AA)-b-PCL的紫外相转变曲线，图中表明，在pH7.4下，所制备的pH/温度协同敏感嵌段共聚物聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-丙烯酰胺-co-丙烯酸)-聚ε-己内酯的最低临界溶解温度(LCST)要远大于40℃，这样可以保证pH/温度协同敏感嵌段在复杂的生理环境下依旧保持亲水状态；而在肿瘤组织的微酸环境pH6.5下，所制备的pH/温度协同敏感嵌段共聚物的LCST为36.4℃左右，同时考虑到肿瘤组织温度被提高到40-44℃，因此pH/温度协同敏感嵌段在肿瘤部位可以保持充分的疏水状态。这种充分的亲水到充分的疏水之间的转变，有助于提高靶向配体在靶向载药纳米粒子表面的充分的“屏蔽”与“去屏蔽”的可逆转变，进而有助于得到兼具高效血液循环和高效肿瘤靶向能力的靶向给药系统。
Claims (3)
1.一种智能靶向载药复合胶束的制备方法，其特征在于：所述智能靶向载药复合胶束使用pH/温度协同敏感聚合物可逆控制纳米粒子表面靶向配体的“屏蔽”与“去屏蔽”状态，即该纳米粒子表面的靶向配体在正常血液循环时处于“屏蔽”状态，提高纳米粒的血液循环稳定性，在到达肿瘤组织时靶向配体处于“去屏蔽”状态，从而恢复纳米粒的靶向能力，这种靶向配体的“屏蔽”和“去屏蔽”状态的转变具有可逆性，因此可以兼具长效血液循环和高效肿瘤细胞靶向性，其制备方法包括如下步骤：
1)pH/温度协同敏感嵌段共聚物、非靶向两亲性嵌段共聚物和靶向两亲性嵌段共聚物的合成
首先制备由亲水嵌段和疏水嵌段组成的非靶向两亲性嵌段共聚物，所述亲水嵌段为聚乙二醇，所述疏水嵌段为聚己内酯，所述非靶向两亲性嵌段共聚物为mPEG-b-PCL；
使用同样方法，制备末端含有靶向配体的靶向两亲性嵌段共聚物，所述靶向两亲性嵌段共聚物包括亲水嵌段和疏水嵌段，其中靶向配体偶联在亲水嵌段末端，所述靶向配体为生物素，所述亲水嵌段为聚乙二醇，所述疏水嵌段为聚己内酯，所述靶向两亲性嵌段共聚物为Biotin-PEG-b-PCL；
制备pH/温度协同敏感嵌段共聚物，所述pH/温度协同敏感嵌段共聚物是包含pH/温度协同敏感嵌段和疏水嵌段的两嵌段共聚物，其中所述pH/温度协同敏感嵌段是由温敏单体、调节单体和pH敏感单体共聚而成，所述温敏单体为N-异丙基丙烯酰胺，所述调节单体为丙烯酰胺，所述pH敏感单体为丙烯酸，所述疏水嵌段为聚己内酯，所述pH/温度协同敏感嵌段共聚物为P(NIPAAm-co-AAm-co-AA)-b-PCL，当所述温敏单体为N-异丙基丙烯酰胺，所述调节单体为丙烯酰胺，所述pH敏感单体为丙烯酸，且所述N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺和丙烯酸的共聚比例为1:0.04-0.15:0.04-0.15时，在离子强度为150mM的PBS中，pH/温度协同敏感嵌段共聚物在pH7.4下的最低临界溶解温度大于50℃，在pH6.5下的最低临界溶解温度为36.4℃；
2)载药复合胶束的制备
在低于最低临界溶解温度的条件下，通过透析方法，将以上制备的pH/温度协同敏感嵌段共聚物和靶向两亲性嵌段共聚物与药物混合制成复合胶束，通过调节嵌段共聚物的投料比例，控制复合胶束的两嵌段比例和嵌段长度，即可制得智能靶向载药复合胶束。
2.根据权利要求1所述智能靶向载药复合胶束的制备方法，其特征在于：所述亲水嵌段的分子量为500-5000，pH/温度协同敏感嵌段的分子量为2000-50000，疏水嵌段的分子量为2000-100000。
3.一种权利要求1所制备的智能靶向载药复合胶束的应用，其特征在于：用于包封药物，所述药物为阿霉素、紫杉醇或喜树碱。
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