CN108329483B - 两亲性超支化聚合物及其制备方法和应用 - Google Patents

两亲性超支化聚合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种两亲性超支化聚合物及其制备方法和应用，两亲性超支化聚合物先由十二烷基三硫代碳酸酯与丙烯酸酯在4‑二甲氨基吡啶和EDC盐酸盐催化下酯化反应合成十二烷基三硫代碳酸酯‑丙烯酸酯，再将引发剂AIBN、十二烷基三硫代碳酸酯‑丙烯酸酯、聚乙二醇单乙醚乙酸酯和丙烯酸十八酯在摩尔比为1：10：40：20条件下超支化反应合成超支化聚合物1，该超支聚合物能刺激抗原提呈细胞活化，可以作为免疫佐剂应用，与多肽交联后开发治疗相应疾病的药物。

Description

两亲性超支化聚合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物化学领域，涉及两亲性超支化聚合物，还涉及该化合物的制备方法和应用。
背景技术
自身免疫病如多发性硬化症是自身反应性T细胞过度活化攻击自身组织引发的疾病，我们认为抗原特异性治疗手段，即通过诱导免疫耐受的方法靶向清除免疫系统中自身反应性T细胞的治疗手段将会是非常好的策略。利用可溶性自身表位特异性肽诱导免疫耐受以治疗自身免疫性疾病在动物模型上显示出一定的治疗效果，但多项临床试验宣布失败。其原因可能包括可溶性肽半衰期短、不能有效刺激抗原提呈进而诱导免疫耐受；可溶性肽在某些动物模型通过静脉给药可能引起过敏性休克等潜在安全性问题。因此，开发新形式的抗原载体附载抗原多肽以增强诱导免疫耐受能力的策略在治疗自身免疫性疾病如多发性硬化症的药物开发中具有应用前景。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供两亲性超支化聚合物；本发明的目的之二在于提供所述两亲性超支化聚合物的制备方法；本发明的目的之三在于提供基于两亲性超支化聚合物的超支化聚合多肽；本发明的目的之四在于提供超支化聚合多肽的合成方法；本发明的目的之五在于提供所述两亲性超支化聚合物在制备抗原载体提高抗原提呈能力的药物中的应用；本发明的目的之六在于提供超支化聚合多肽在制备多发性硬化症的药物中的应用；本发明的目的之七在于提供超支化聚合多肽在制备免疫佐剂增强免疫原性的药物中的应用。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
两亲性超支化聚合物，所述两亲性超支化聚合物先由十二烷基三硫代碳酸酯与丙烯酸酯在4-二甲氨基吡啶和EDC盐酸盐催化下酯化反应合成十二烷基三硫代碳酸酯-丙烯酸酯，再将引发剂AIBN、十二烷基三硫代碳酸酯-丙烯酸酯、聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯和4，4′-二氨基二苯醚在摩尔比为1∶10∶40∶20条件下超支化反应合成超支化聚合物，记为超支化聚合物1。
优选的，所述酯化反应条件是在氮气保护下反应20min，然后再加入二氯甲烷，40℃震荡反应48h，二氯甲烷在分离漏斗洗涤，有机层干燥后收集，通过旋转蒸发除去二氯甲烷，最终产品在真空下干燥，并回收为黄色油即可。
优选的，所述超支化反应具体为：通氮气保护反应20min，然后60℃搅拌油浴18h，反应结束后，冷水冷却，为了完全除去未反应的单体，产物在正己烷中搅拌6h，每2h更换溶剂，最后将己烷倒出，最终产物经真空干燥回收获得。
1、所述两亲性超支化聚合物的制备方法，合成路线如图1所示，包括如下步骤：
(1)十二烷基三硫代碳酸酯-丙烯酸酯合成：将十二烷基三硫代碳酸酯与丙烯酸酯在4-二甲氨基吡啶和EDC盐酸盐催化下酯化反应合成十二烷基三硫代碳酸酯-丙烯酸酯；
(2)超支化聚合物1合成：将引发剂AIBN、十二烷基三硫代碳酸酯-丙烯酸酯、聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯和4，4′-二氨基二苯醚在摩尔比为1∶10∶40∶20条件下超支化反应合成超支化聚合物，记为超支化聚合物1。
3、基于所述两亲性超支化聚合物的超支化聚合多肽，所述超支化聚合多肽由超支化聚合物1在氮气保护下通过丁胺氨解分解为聚硫醇，再在氮气保护下逐步加入硫醇烯将巯基转化为硫醚后与多肽聚合而得，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
或所述超支化聚合多肽由超支化聚合物1在氮气保护下通过丁胺氨解分解为聚硫醇，再在氮气保护下逐步加入硫醇烯将巯基转化为硫醚后与多肽聚合而得，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4、所述超支化聚合多肽的合成方法，包括如下步骤：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示多肽与超支化聚合物1和丁胺按质量比为1∶40∶0.1加入水中，然后装入截留分子量3500Da的透析袋，透析，纯化，得两亲性超支化聚合物的超支化聚合多肽。
5、所述两亲性超支化聚合物在制备抗原载体提高抗原提呈能力的药物中的应用。
6、所述超支化聚合多肽在制备多发性硬化症的药物中的应用。
7、所述超支化聚合多肽在制备免疫佐剂增强免疫原性的药物中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开了两亲性超支化聚合物，通过控制超支化聚合物合成中丙烯酸十八酯的添加量，获得亲脂性好的超支聚合物，并且获得的超支聚合物具有刺激抗原提呈细胞(包括BMDC细胞、巨噬细胞)活化，增强免疫原性，因此其超支化聚合物能够作为免疫佐剂应用，与MOG多肽交联后能改善EAE小鼠的发病严重程度，给药治疗后促使肢瘫痪小鼠恢复行走能力，因此可用于人多发性硬化症的治疗性药物开发。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为两亲性超支化聚合物及多肽交联合成路线。
图2为1H NMR光谱分析各化合物结构(a)DMATC，(b)DMATC-丙烯酸酯，(c)超支聚合物1，(d)超支聚合物2，(e)超支聚合物1-丙烯酸酯，(f)超支聚合物2-丙烯酸酯。
图3为水接触角分析疏水性(a：超支聚合物1；b：超支聚合物2；c：PEG对照，n＝3)。
图4为超支化聚合物多肽HB-MOG-1及HB-MOG-2在骨髓来源抗原提呈细胞的摄取情况(MOG多肽浓度为20ug/ml的罗丹明标记的HB-MOG-1及HB-MOG-2刺激BMDC细胞3小时，(a)流式分析细胞吞噬罗丹明的荧光强度；(b)罗丹明荧光强度的定量分析；(c)刺激3小时后共聚焦显微镜分析罗丹明荧光在细胞中的分布情况)。
图5为超支化聚合物多肽HB-MOG-1及HB-MOG-2刺激骨髓来源抗原提呈细胞活化情况((a)：从左到右分别为PBS、可溶性MOG多肽、HB-MOG-1、HB-MOG-2刺激BMDC细胞，流式分析抗原提呈相关分子MHCII及共刺激分子CD86共表达的细胞比例；(b)：MHCII及共刺激分子CD86双阳性的细胞百分比比较。
图6为超支化聚合物多肽HB-OVA-1及HB-OVA-2经抗原提呈诱导OVA抗原特异性DO11.10小鼠T细胞活化结果(从左到右分别OVA多肽、HB-OVA-1、HB-OVA-2刺激DO11.10小鼠脾来源幼稚T细胞的活化分子CD44及CD69的表达情况；a，c：流式分析DO11.10小鼠T细胞刺激后CD4+CD44+T细胞的频率；b，d：流式分析DO11.10小鼠T细胞刺激后CD4+CD69+T细胞的频率)。
图7为超支化聚合物HB-MOG-1及HB-MOG-2对小鼠EAE疾病治疗效果((a)EAE小鼠发病第15、17及19天尾静脉注射含40ugMOG的MOG多肽、HB-MOG-1、HB-MOG-2或安慰剂PBS，对小鼠发病病程进行评分；(b)小鼠脊髓组织HE染色结果表明：与安慰剂组相比，HB-MOG-1及HB-MOG-2给药后脊髓浸润炎性细胞减少，组织空泡减少。而MOG多肽治疗组仍有炎性细胞浸润。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
本发明以下实施例所用材料如下：2-羟乙基丙烯酸酯(97％，AlfaAesar)，聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯(480Da)，聚(乙二醇)酯(258da)、丙烯酸十八酯(ODA，97％，)，二氯甲烷(DCM)是由活化的3A分子筛预干燥72h制备而得。偶氮二异丁腈(AIBN)在甲醇中重结晶纯化。MOG多肽(氨基酸序列：CMEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK(SEQ ID NO.1))、OVA多肽(氨基酸序列：CISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO.2))由中肽生化有限公司合成。
本发明开发了功能性两亲性超支化聚合物，通过控制不同接枝度的疏水性丙烯酸十八酯侧链的比例以调整聚合物的疏水性，获得两亲性超支化聚合物1及两亲性超支化聚合物2。两种聚合物分别附载MOG多肽及OVA多肽。两种不同疏水性的聚合物交联MOG多肽主要用于多发性硬化症的药物治疗性药物开发及研究。两种不同疏水性的聚合物交联OVA多肽主要用于聚合物作为潜在免疫佐剂的基础研究。实验结果表明两亲性超支化聚合物1及两亲性超支化聚合物2均能有效促进抗原肽被抗原提呈细胞BMDC吞噬及提呈，并能有效活化幼稚T淋巴细胞、诱导已活化的抗原特性性致病性T淋巴细胞凋亡。且其诱导抗原提呈、活化、凋亡的能力均显著高于可溶性自由肽。两种附载MOG多肽的聚合物在多发性硬化症的动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)上均展示出显著治疗效果，能促使已后肢瘫痪发病小鼠在一个治疗周期后运动机能有效恢复。相反，同等剂量的可溶性自由肽在EAE模型上的治疗效果有限。因此，我们的实验结果表明：本研究设计的功能性两亲性超支化聚合物可以作为有效的抗原多肽载体，极大提高抗原提呈能力，在体外及体内通过诱导抗原特异性致病性T细胞发生凋亡的途径诱导免疫耐受，进而治疗自身免疫性疾病。本研究设计的两种具有不同疏水性的超支化聚合物可以作为抗原载体在通过诱导免疫耐受以治疗自身免疫病的抗原/多肽类药物开发中具有应用前景。
实施例1、超支化聚合物的合成方法
超支化聚合物的合成方法，包括如下步骤：
(1)合成S-Dodecyl-S’-(α，α’-dimethyl-α”-acetic acid)trithiocarbonate(DMATC)：其合成方法参见利用新型碳酸酯羧基封端作为三种高效的RAFT剂合成功能性聚合物(Macromolecules，2002，35(18)，pp 6754-6756)。
(2)合成DMATC-丙烯酸酯：DMATC链转移剂与丙烯酸酯交联通过DMAP/EDC催化的DMATC与丙烯酸羟乙酯的酯化作用，具体方法如下：在25ml圆底烧瓶中加入1.46g DMATC(十二烷基三硫代碳酸酯)，1.15gEDC盐酸盐(C8H17N3·HCl；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，0.073g DMAP(4-二甲氨基吡啶)，烧瓶常温(18～25℃)真空预干燥过夜；然后加入1.4g丙烯酸羟乙酯，烧瓶通氮气保护，反应20min，再用注射器加入15mL无水二氯甲烷(DCM)，溶液在40℃震荡反应48h，DCM溶液在分离漏斗中6次盐水洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥后收集，通过旋转蒸发除去DCM，最终产品在真空下干燥，并回收为黄色油，获得DMATC-丙烯酸酯。
(3)超支化聚合物合成(PEG-r-PODA-r-PTTC polytrithiocarbonates)：
方法1：将引发剂AIBN(偶氮二异丁腈)：DMATC-丙烯酸酯：聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯：ODA(丙烯酸十八酯)摩尔比为1∶10∶40∶20反应，具体为将0.011gAIBN，0.3g RAFT-丙烯酸酯，1.25g聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯、0.422g ODA和2ml甲苯加入10ml圆底烧瓶并用橡胶隔膜密封；通氮气保护反应20min，然后在60℃搅拌油浴18h，反应结束后，冷水冷却，为了完全除去未反应的单体，产物在正己烷中搅拌6h，每2h更换溶剂，最后将己烷倒出，最终产物经真空干燥回收获得超支聚合物1。
方法2：将引发剂AIBN∶DMATC-丙烯酸酯∶聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯∶ODA摩尔比为1∶10∶40∶10，将0.011gAIBN，0.3g RAFT-丙烯酸酯，1.25g聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯、0.211g ODA和2ml甲苯加入10ml圆底烧瓶并用橡胶隔膜密封；通氮气保护反应20min，然后在60℃搅拌油浴18h，反应结束后，冷水冷却，为了完全除去未反应的单体，产物在正己烷中搅拌6h，每2h更换溶剂，最后将己烷倒出，最终产物经真空干燥回收获得超支聚合物2。
该步骤中通过调节亲水单体聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯以及亲脂性ODA的投料比获得两亲性超支化聚合物，将获得的超支聚合物进行1H NMR光谱分析各化合物结构和水接触角分析疏水性，结果如图2和3所示。结果显示，超支聚合物1的水接触角高于超支聚合物2，说明超支聚合物1亲脂性更强，超支聚合物2的亲水性更强。
实施例2、超支化多聚三硫代碳酸酯修饰
得到的超支化多聚三硫代碳酸酯在氮气保护下通过丁胺氨解反应进一步分解为聚硫醇。为了阻止超支化聚硫醇通过巯基氧化发生交联，在氮气保护下通过逐步加入硫醇烯将巯基转化为硫醚，具体方法如下：0.6克的超支化多聚三硫代碳酸酯溶解于1.5ml DCM(二氯甲烷)，随后加入0.5ml丁胺(～20倍)，通氮气保护。30min后，黄色溶液褪成无色或淡黄色，然后氮气鼓泡到溶液中除去大部分DCM和丁胺。将氮脱气的己烷(～10毫升)转移到溶液中使产品沉淀。15min后，无色或淡黄色的产品在粘附在瓶底部，将大多数的溶剂在氮气保护下通过套管去除。接着，将2ml脱气DCM注入反应物重新溶解得到的聚硫醇，接着注入0.57ml PEGDA(0.63g，258Da)和0.01ml丁胺。4h后，反应停止，产物沉淀去除己烷，含丙烯酸酯的超支化聚硫醚通过真空干燥获得。
实施例3、制备超支化聚硫醚丙烯酸酯交联多肽
MOG及OVA多肽N端均带有半胱氨酸，80mg超支化聚合物，2毫克肽(OVA)、0.2mg丁胺混合5ml水搅拌过夜，然后将溶液装入透析袋(截留分子量：3500Da)在去离子水中透析2天，最后，产物经冷冻干燥纯化，得到超支化聚合多肽3(Hyper-branch polymer conjugatedMOG-1，HB-OVA-1)和超支化聚合多肽4(Hyper-branch polymer conjugated MOG-2，HB-OVA-2)。
按相同的方法，区别在于使用MOG多肽，分别得到超支化聚合多肽1(Hyper-branchpolymer conjugated MOG-1，HB-MOG-1)和超支化聚合多肽2(Hyper-branch polymerconjugated MOG-2，HB-MOG-2)。
实施例4、Rhodamine B荧光剂标记
Rhodamine B荧光剂标记超支化聚合MOG多肽是通过酰胺化赖氨酸或精氨酸位点的自由胺。将100mg超支化聚合物多肽1、2mg罗丹明B、NHS及EDC，避光在水中室温搅拌24小时，反应后，将溶液装入透析袋(截留分子量：3500Da)在去离子水中透析2天。最后，产物经冷冻干燥纯化。
按相同的方法用Rhodamine B荧光剂标记超支化聚合多肽2、超支化聚合多肽3和超支化聚合多肽4。
实施例5、治疗效果评估
(1)多发性硬化症小鼠模型EAE的制备
小鼠EAE是一种特异性致敏的CD4+ T细胞介导为主的，以中枢神经系统单核细胞浸润及脱髓鞘为特征的自身免疫疾病模型，是人多发性硬化症最经典的实验动物模型，制备方法为：
a.MOG/CFA乳化剂制备：将100mg结核菌素(Mtb)加入25ml弗氏完全佐剂混匀(Mtb终浓度为5mg/ml)；MOG35-55多肽使用PBS溶解为2mg/ml；1∶1混合MOG和CFA/Mtb(MOG终浓度为1mg/ml)；使用超声波匀质器按(output control 7％duty cycle 50)频率乳化，冰上操作；完全乳化后，将管倒置，乳剂不会流动，存于4℃冰箱，1周内使用。
b.小鼠免疫：准备10周龄C57BL/6雌鼠，第0天小鼠背部两点皮下各注射100μlMOG/CFA乳化剂，5小时后腹腔注射100μl百日咳毒素PTX(2ug/ml)；第1天腹腔注射100μlPTX每只小鼠。
c.免疫后第10天开始对小鼠进行评分，本实验采用的是双盲评分，即所有实验用EAE小鼠评分是由未参与本课题药物治疗的其它研究人员进行。评分采用(Hooke Lab)5分制：1，尾巴下垂无力；2，尾巴瘫痪；2.5，单侧后肢无力；3，单侧后肢瘫痪；3.5，双侧后肢瘫痪；4，双后肢完全瘫痪，前肢无力；4分以上小鼠实施安乐死。
(2)超支化聚合MOG多肽-1及超支化聚合MOG多肽-2对小鼠EAE的治疗效果评估
EAE小鼠发病峰值即免疫后第15天、17天、19天分别尾静脉注射40μg(标准化到MOG多肽质量)超支化聚合MOG多肽-1、超支化聚合MOG多肽-2或游离MOG多肽，PBS安慰剂做对照。
结果显示，超支化聚合物HB-MOG-1及HB-MOG-2多肽能被骨髓来源抗原提呈细胞快速摄取(图4)。超支化聚合物HB-MOG-1及HB-MOG-2能刺激骨髓来源抗原提呈细胞活化(图5)。超支化聚合物HB-MOG-1及HB-MOG-2对小鼠EAE疾病有显著治疗作用(图7)。上述结果表明，HB-MOG-1及HB-MOG-2能刺激抗原提呈细胞提呈多肽抗原诱导已活化的MOG抗原特异性2D2小鼠T淋巴细胞凋亡，提示其可能用于免疫耐受研究。以人多发性硬化症的EAE小鼠模型进行的治疗实验表明，HB-MOG-1及HB-MOG-2均能显著改善EAE小鼠的发病严重程度，两次静脉给药治疗促使后肢瘫痪小鼠恢复行走能力。该结果提示HB-MOG-1及HB-MOG-2可能用于人多发性硬化症的治疗性药物开发。
(3)超支化聚合OVA多肽-1及超支化聚OVA多肽-2对小鼠T细胞活化情况
取OVA抗原TCR转基因小鼠的脾细胞，加入20μg(标准化到OVA多肽质量)超支化聚合OVA多肽-1、超支化聚合OVA多肽-2，PBS安慰剂作对照，然后检测脾来源幼稚T细胞的活化分子CD44及CD69的表达情况。结果如图6所示。结果显示，超支化聚合物HB-OVA-1及HB-OVA-2能经抗原提呈诱导OVA抗原特异性DO11.10小鼠T细胞活化，提示其免疫原性强，提示超支化聚合物HB-OVA-1及HB-OVA-2具有作为免疫佐剂的潜在应用。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学
<120> 两亲性超支化聚合物及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Cys Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Ser Pro Phe Ser Arg Val Val His
1 5 10 15
Leu Tyr Arg Asn Gly Lys
20
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Cys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala
1 5 10 15
Gly Arg

Claims (7)

1.基于两亲性超支化聚合物的超支化聚合多肽， 其特征在于：所述超支化聚合多肽由超支化聚合物1在氮气保护下通过丁胺氨解分解为聚硫醇，再在氮气保护下逐步加入硫醇烯将巯基转化为硫醚后与多肽聚合而得，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述两亲性超支化聚合物先由十二烷基三硫代碳酸酯与丙烯酸酯在4-二甲氨基吡啶和EDC盐酸盐催化下酯化反应合成十二烷基三硫代碳酸酯-丙烯酸酯，再将引发剂AIBN、十二烷基三硫代碳酸酯-丙烯酸酯、聚（乙二醇）甲基醚丙烯酸酯和丙烯酸十八酯在摩尔比为1：10：40：20条件下超支化反应合成超支化聚合物，记为超支化聚合物1。
2.基于两亲性超支化聚合物的超支化聚合多肽， 其特征在于：所述超支化聚合多肽由超支化聚合物1在氮气保护下通过丁胺氨解分解为聚硫醇，再在氮气保护下逐步加入硫醇烯将巯基转化为硫醚后与多肽聚合而得，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述两亲性超支化聚合物先由十二烷基三硫代碳酸酯与丙烯酸酯在4-二甲氨基吡啶和EDC盐酸盐催化下酯化反应合成十二烷基三硫代碳酸酯-丙烯酸酯，再将引发剂AIBN、十二烷基三硫代碳酸酯-丙烯酸酯、聚乙二醇单乙醚乙酸酯和丙烯酸十八酯在摩尔比为1：10：40：20条件下超支化反应合成超支化聚合物，记为超支化聚合物1。
3.权利要求1或2所述超支化聚合多肽，其特征在于，所述酯化反应条件是在氮气保护下反应20min，然后再加入二氯甲烷，40 ℃震荡反应48 h，二氯甲烷在分离漏斗洗涤，有机层干燥后收集，通过旋转蒸发除去二氯甲烷，最终产品在真空下干燥，并回收黄色油即可。
4.权利要求1或2所述超支化聚合多肽，其特征在于，所述超支化反应具体为：通氮气保护反应20min，然后60℃搅拌油浴18h，反应结束后，冷水冷却，为了完全除去未反应的单体，产物在正己烷中搅拌6h，每2h更换溶剂，最后将己烷倒出，最终产物经真空干燥回收获得。
5.权利要求1或2所述的超支化聚合多肽的合成方法，包括如下步骤：
（1）十二烷基三硫代碳酸酯-丙烯酸酯合成：将十二烷基三硫代碳酸酯与丙烯酸酯在4-二甲氨基吡啶和EDC盐酸盐催化下酯化反应合成十二烷基三硫代碳酸酯-丙烯酸酯；
（2）超支化聚合物1合成：将引发剂AIBN、十二烷基三硫代碳酸酯-丙烯酸酯、聚（乙二醇）甲基醚丙烯酸酯和丙烯酸十八酯在摩尔比为1：10：40：20条件下超支化反应合成超支化聚合物，记为超支化聚合物1；
（3）将氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示多肽与超支化聚合物1和丁胺按质量比为1:40:0.1加入水中，然后装入截留分子量3500Da的透析袋，透析，纯化，得两亲性超支化聚合物的超支化聚合多肽。
6.权利要求1所述超支化聚合多肽在制备多发性硬化症的药物中的应用。
7.权利要求2所述超支化聚合多肽在制备免疫佐剂增强免疫原性的药物中的应用。
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