CN101423550B - 基因工程免疫抑制多肽及制备方法和用途 - Google Patents

基因工程免疫抑制多肽及制备方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN101423550B
CN101423550B CN2007100536790A CN200710053679A CN101423550B CN 101423550 B CN101423550 B CN 101423550B CN 2007100536790 A CN2007100536790 A CN 2007100536790A CN 200710053679 A CN200710053679 A CN 200710053679A CN 101423550 B CN101423550 B CN 101423550B
Authority
CN
China
Prior art keywords
lwx
polypeptide
primer
seq
pcr amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN2007100536790A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101423550A (zh
Inventor
李文鑫
吴英亮
曹志贱
韩松
尹世金
陈宗运
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan University WHU
Original Assignee
Wuhan University WHU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan University WHU filed Critical Wuhan University WHU
Priority to CN2007100536790A priority Critical patent/CN101423550B/zh
Priority to PCT/CN2008/001773 priority patent/WO2009065296A1/zh
Publication of CN101423550A publication Critical patent/CN101423550A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101423550B publication Critical patent/CN101423550B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基因工程免疫抑制多肽及制备方法和应用，本发明分离了一种蛋白质，其序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。基因工各所涉及的引物，将LWX-1和LWX-AD-1的核苷酸序列插入表达载体中pGEX-6P-1，构成重组表达质粒；重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，然后细胞裂解经GST亲和层析、小肠激酶切割和色谱纯化得到LWX-1和LWX-AD-1，通过质谱鉴定其分子分别为4073.1Da和4615.03Da。LWX-1和LWX-AD-1蛋白质在制备治疗或预防靶向钾通道Kv1.3、多发性硬化症、风湿性关节炎的药物中的应用。本发明方法简单易行，操作方便。

Description

基因工程免疫抑制多肽及制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，本发明涉及一种免疫抑制蝎毒多肽LWX-1和LWX-AD-1的序列，同时还涉及免疫抑制蝎毒多肽的基因工程制备方法，还涉及多肽鉴定钾通道Kv1.3的功能及其在制备治疗或预防多发性硬化症、I型糖尿病、风湿性关节炎等T细胞介导的自身免疫力性疾病的药物的用途。
背景技术
自身免疫性疾病(autoimmune disease)是指由机体自身产生的抗体或致敏淋巴细胞破坏、损伤自身的组织和细胞成分，导致组织损害和器官功能障碍的原发性免疫性疾病。全球约有5-8％的人口受到约40多种自身免疫性疾病的威胁。目前常用对抗自体免疫性疾病的方法，一是利用类固醇来减缓因免疫系统攻击组织所造成的炎症反应，二是使用免疫抑制药物，抑制免疫系统的作用。不过，这两种方法都会造成严重的副作用，而且都只能减缓病情的发展速度，非根治疾病。在自身免疫性疾病中，以T细胞介导为主的自身免疫性疾病包括寻常型银屑病、白塞病、自身免疫性甲状腺病、风湿性关节炎、I型糖尿病和多发性硬化症等。这类疾病在影响着数百万人的生命，针对这种人类难治疾病的发病机理，研发新型免疫抑制药物已成为全球制药公司激烈竞争的领域之一。
近年来，与疾病相关的记忆T细胞上钾通道Kv1.3被鉴定为治疗自身免疫病的新靶标[J.Clin.Invest.，2003，111：1703；Trends in Pharmacological Sciences，2004，25：280；Curr Pharm Des.2006，12(18)：2199]，为抢夺未来巨大的药物市场，现在国际上正掀起一轮以钾通道Kv1.3为靶标的新药研发热潮。有机小分子药物因价格低廉而成为研发的首选。Merck公司、澳大利亚Walter and Eliza Hall药物研究技术中心、美国加利福利亚大学等等机构筛选、分离、合成、改造和鉴定了大量的有机小分子药物候选物[Trends in Pharmacological Sciences 2004，25：280；Mol.Pharmacol.，2004，65：1364；Journal of Medicinal Chemistr，2006，49(4)：1433；Mol.Pharmacol.，2005，68：1254]。这些有机小分子药物作用同源通道Kv1.1，Kv1.2，Kv1.4，Kv1.5等活性比Kv.1.3通道低2-70倍。这种作用不同钾通道选择性差、潜在的毒副反应严重成为小分子药物研发的致病缺点，这主要是有机小分子候选药物作用Kv1.1-Kv1.7靶标区域的氨基酸残基序列几乎完全一致。与有机小分子靶点截然不同的是，多肽作用的靶区域呈现丰富的序列多样性，这就决定了多肽药物研发是必由之路。
在靶向通道Kv1.3小分子药物研发受阻情况下，国际上把眼光聚焦到钾通道Kv1.3特异性动物毒素多肽抑制剂。这类多肽分子内具有3-4对二硫键的结构共性。美国加利福利亚大学和霍普金斯医院正在联合研发以海葵毒素多肽ShK为分子骨架的先导药物[Curr Med Chem.2004，11：3041，Mol.Pharmacol.，2005，67(4)：1369]。ShK是从海葵中分离到的3对二硫键的35残基多肽，近两年正通过多肽化学合成方法修饰和合成20多种ShK多肽的类似物。在2006年，成功地发现了ShK类似物(ShK-L5)可较好地治疗风湿性关节炎和I型糖尿病(PNAS，2006，103：17414)，法国国家科学研究中心近年正在以通道Kv1.3特异性蝎毒素多肽OSK1及AOSK1[Biochem.J.，2005、385：95；Mol.Pharmacol.，2006，69：354]为分子骨架，设计和化学合成了30多种3对二硫键38个残基类似多肽，加速新型免疫抑制多肽药物研发。
同有机小分子相比，靶向钾通道Kv1.3的先导多肽药物具有极高的特异性。如法国国家科学研究中心研发的AOSK1的IC50值为3 pM，美国研发ShK多肽IC50值为16 pM，而目前报道最好的有机小分子先导药物的IC50值为3nM。可见，先导多肽药物比有机小分子先导药物的特异性提高了1000倍。同时，先导多肽药物的选择性也得到了极大提高。因此，潜在新型免疫抑制多肽药物研发已成为治疗T细胞介导自身免疫性疾病的新方向。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种基因工程免疫抑制多肽LWX-1和LWX-AD-1。该多肽分子内具有3对二硫键，在体外具有很强的稳定性，易于长期保存。
本发明的另一个目的是在于提供了一种基因工程免疫抑制多肽LWX-1和LWX-AD-1的制备方法。该方法简单易行，操作方便，易于生产和制备高纯度(色谱纯)的LWX-1和LWX-AD-1多肽。
本发明的再一个目的是在于提供了一种基因工程免疫抑制多肽LWX-1和LWX-AD-1在制备治疗或预防多发性硬化症、I型糖尿病、风湿性关节炎的药物中的应用。
本发明还涉及基因工程免疫抑制多肽高特异性结合药物靶标Kv1.3钾通道，不仅可用于有效地鉴定钾通道Kv1.3，而且可用于诊断和治疗多发性硬化症、I型糖尿病、风湿性关节炎等T细胞介导的自身免疫力性疾病。
钾通道kv1.3已被鉴定为诊断和治疗T细胞介导自身免疫性疾病的靶标，在有机分子药药研发严重受挫情况下，目前美国、法国、澳大利亚等国家正在研发免疫抑制多肽药物。本发明专利主要目的在于发明了具有自主知识产权的蝎毒免疫抑制多肽药物。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：
通过生物信息学方法，分子设计了基因工程免疫抑制多肽序列。通过蛋白质结构预测(http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html)SWISS-MODEL程序和蛋白质结构分析(http://swissmodel.expasy.org/spdbv/)Swiss-PdbViewer程序，基于本课题组对蝎毒多肽与钾通道相互作用多样性及机制的深刻认识，在此基础上，申请人分子设计了免疫抑制多肽LWX-1和LWX-AD-1。一种分离的多肽LWX-1，其序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；一种分离的多肽LWX-AD-1，其序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
LWX-1：VGINVKCKHSRQCLKPCKDAGMRFGKCTNGKCHCTPK(SEQ ID NO：1)
LWX-AD-1：NEAVPTGGCPFSDFFCAKRCKDMKFGNTGRCTGPNKTVCKCSI(SEQ ID NO：2)
LWX-1和LWX-AD-1多肽分子内具有3对二硫键，具有蝎毒多肽的共性，即结构性质稳定，易于长期保存。申请人发现LWX-1和LWX-AD-1多肽以干粉形式在4℃下保存6个月以上，生物活性不变。这初步稳定性检测也表明了LWX-1和LWX-AD-1多肽具有较强的稳定性。
一种制备基因工程免疫抑制多肽LWX-1和LWX-AD-1的方法，它包括下列步骤：
A、设计引物：对于LWX-1多肽，设计4条PCR扩增引物进行2轮PCR扩增获取目的基因，正向引物为引物P1：5，GTGAATTCGATGACGATGACAAGGTGGGTATTAATGTGAA3’，引物  P2：5′GGTATTAATGTGAAATGTAAGCATAGCCGCCAATGTCTGAAACCATGCAAGGATGCTG3′；反向引物为引物P35′GGTACAATGGCATTTGCCATTGGTGCATTTACCAAATCTCATTCCAGCATCCTTG3′，引物P4：5’TAGCTCGAGTCACGGGGTACAATGGCATTTGC3′。
对于LWX-AD-1多肽，设计了2条引物：
引物P1：5’GATGGATCCGATGACGATGACAAGAATGAAGCGGTGCCAACA 3’
引物P2：5’GCTCTCGAGTTAGATAGAACATTTACAAAC 3’
B、对LWX-1多肽，进行了两轮PCR扩增反应。
第一轮PCR扩增用引物P2和引物P3，第二轮PCR扩增用引物P1和引物P4。第一轮PCR反应的试剂和条件如下：
先将下列试剂混合：
10xTaq聚合酶缓冲液 5微升
dNTP混合物         4微升
引物P2             1微升
引物P3             1微升
TaqDNA聚合酶       0.25微升
无菌水             37.75微升
PCR反应条件：94℃预变性300秒、94℃变性45秒、55℃复性45秒、72℃延伸45秒、72℃最后延伸200秒，循环32次。第二轮PCR中使用引物P1和引物P4，加入第一轮PCR扩增产物稀释50倍的模板1微升，其它反应条件不变。
C、对LWX-AD-1多肽，只进行了一轮PCR扩增反应(条件同LWX-1多肽第一轮扩增反应相同)。
D、将最终PCR扩增产物凝胶电泳回收后用EcoRI和XhoI双酶切，将酶切后的片段插入经EcoRI和XhoI双酶切的表达载体pGEX-6p-1(购自Pharmacia公司)，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌DE3(中国典型培养物保藏中心)。对转化的大肠杆菌IPTG(华美生物工程公司)诱导培养后，收集菌体，悬浮于缓冲液中(50mM Tris-Cl，1.0mM EDTA，pH8.0)，超声波破菌并离心，所得上清通过GST亲和层析胶后可收集洗脱得到的融合蛋白。收集得到的融合蛋白溶液再经分离纯化、小肠激酶(EK)酶切、色谱分离。将纯化蛋白经SDS-PAGE电泳检测，LWX-1和LWX-AD-1多肽理论分子量分别为4073Da和4615Da，经质谱分析，它们分子量分别为4302.9Da和4615.03Da，与根据氨基酸序列推断的分子量一致。
通过膜片钳技术鉴定LWX-1和LWX-AD-1蛋白质对钾通道Kv1.3的药理学活性。
LWX-1和LWX-AD-1蛋白质可特异性抑制钾通道Kv1.3电流，它们的IC50值分别为1.08pM和0.52nM。药理学数据表明基因工程生产的LWX-1和LWX-AD-1多肽可特异性作用自身免疫疾病的靶标钾通道Kv1.3，因而，有望进一步被研发具有自主知识产权的治疗自身免疫抑制性疾病新药。
LWX-1和LWX-AD-1多肽作为药物在治疗类风湿性关节炎中的用途。
选取无特定病原体(SPF)级近交系Lewis大鼠(武汉大学实验动物中心)40只，♀，体重(150±10)g，在清洁级环境条件下适应性饲养1周后，以0.2ml/只剂量的降植烷(pristane)在实验组大鼠尾根部皮内注射。饲养2-3周即出现关节炎。然后将关节炎大鼠随机分为：模型鼠+生理盐水10只(模型阴性对照组)；模型鼠+MTX10只(模型阳性对照组)；模型鼠+多肽药物10只；另设正常对照组10只(阴性对照组)。给药组按100μg·kg-1剂量皮下注射，每天上午1次；模型阴性对照组和阴性对照组皮下注射等量生理盐水；模型阳性对照组1.75mg·kg-1。每天皮下注射MTX(氨甲喋呤)，连续给药。给药21天后，观察大鼠患关节炎状况。按照大鼠一个关节红肿计1分，大鼠二个关节红肿计2分，大鼠各个关节红肿计3分，大鼠整个肢体严重关节炎计4分的标准打分。
实验结果表明，在没有药物治疗情况下，模型阴性对照组得分最高(38分/10只)；多肽药物治疗后，大鼠的症状得到显著改善，得分分别为15分/10只(LWX 1多肽)和12分/10只(LWX-AD-1多肽)，仅比模型阳性对照组(药物氨甲喋呤治疗)高2～5分。由此可见，LWX-1和LWX-AD-1多肽能有效地治疗类风湿性关节炎。
LWX-1和LWX-AD-1多肽作为药物在治疗多发性硬化症中的用途。
选取近交系雌性Wistar大鼠(6-8周龄)，豚鼠(300 400g购自武汉大学实验动物中心)。主要试剂：福氏完全佐剂(Gibcol/BRL)，卡介苗、百日咳疫苗(上海生物制品所)，豚鼠MBP(Sigma)。GPSCH-CFA(全脊髓匀浆-福氏完全佐剂混合乳剂)的配制：将豚鼠处死后，迅速取出脊髓，用超声破碎仪(Sonics&Materials Inc，America)制成50％的PBS匀浆，与等量的福氏完全佐剂(卡介苗10mg/ml)混合，用注射器抽打至油包水乳剂。EAE的诱导Wistar大鼠EAE模型：Wistar大鼠双后腿足垫皮内注射0.4ml GPSCH-CFA乳剂，或同时皮内注射约1×1010百日咳疫苗。每日称重，观察神经症状。饲养2周即出现实验性自身免疫性脑脊髓炎。然后将实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠随机分为：模型鼠+生理盐水10只(模型阴性对照组)；模型鼠+多肽药物10只；另设正常对照组10只(阴性对照组)。给药组按100μg·kg-1剂量皮下注射，每天上午1次；模型阴性对照组和阴性对照组皮下注射等量生理盐水；连续给药。给药21天后，观察大鼠患实验性自身免疫性脑脊髓炎状况。评分标准为0分：无任何临床症状；1分：尾部张力消失；2分：后肢无力；3分：后肢完全瘫痪；4分：四肢瘫痪或濒死状态。
实验结果表明：在没有药物治疗情况下，模型阴性对照组得分最高(37分/10只)；多肽药物治疗后，大鼠的症状得到显著改善，得分分别为12分/10只(LWX-1多肽)和10分/10只(LWX-AD-1多肽)，由此可见，LWX-1和LWX-AD-1多肽能有效地治疗多发性硬化症。
可见，本发明专利具有如下特点：(1)特异性强。重组LWX-1和LWX-AD-1多肽作用药物靶标钾通道Kv1.3的IC50值分别为1.08 pM和0.5 nM，是目前国际上已发现的活性极强的多肽药物；(2)稳定性高。分子内具有3对二硫键使LWX-1和LWX-AD-1具有很高的稳定性，不易变质；(3)易于生产。使用目前常用的蛋白质基因工程生产方法均可生产LWX-1和LWX-AD-1多肽；(4)药物效果显著。动物实验表明，重组LWX-1和LWX-AD-1多肽均可以有效治疗类风湿性关节炎和多发性硬化症。由于大多数自身免疫性疾病具有共同的发病机制，钾通道Kv1.3已成为治疗T-细胞介导的自身免疫性疾病的药物靶标，因此，重组LWX-1和LWX-AD-1多肽多肽极具有潜力研发成为新药，用于治疗多发性硬化症、I型糖尿病、风湿性关节炎等T细胞介导的自身免疫力性疾病。
附图说明
图1 LWX-1及其融合表达蛋白GST-LWX-1的电泳检测分析图
1、溶菌酶(分子量14KD作为marker)；2、GST蛋白质；3、经色谱纯化的LWX-1蛋白质；4、GST-LWX-1蛋白质；5、经色谱纯化的LWX-AD-1蛋白质
图2重组LWX-1和LWX-AD-1多肽与GST蛋白质的色谱分离纯化图
图3重组LWX-1多肽的质谱分析图。
图4不同浓度LWX-1多肽对钾通道Kv1.3电流的抑制图
图5重组LWX-1多肽抑制钾通道Kv1.3电流的浓度依赖性
图6不同浓度LWX-AD-1多肽对钾通道Kv1.3电流的抑制图
图7重组LWX-AD-1多肽抑制钾通道Kv1.3电流的浓度依赖性
具体实施方式
实施例1 LWX-1和LWX-AD-1多肽序列的分子设计
通过蛋白质结构预测(http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html)SWISS-MODEL程序和蛋白质结构分析(http://swissmodel.expasy.org/spdbv/)Swiss-PdbViewer程序，基于本课题组对蝎毒多肽与钾通道相互作用多样性及机制的深刻认识(Biophysical Journal，2004，87：105；J.Proteome.Res.2007，6：611；J.Chem.Inf.Model.，2007，47(5)：1967；Proteins-In press)，分子设计了特异性作用于钾通道Kv1.3的蛋白质多肽序列：
LWX-1：VGINVKC(1)KHSRQC(2)LKPC(3)KDAGMRFGKC(4)TNGKC(5)HC(6)TPK(SEQ ID NO：1)
LWX-AD-1：NEAVPTGGC(1)PFSDFFC(2)AKRC(3)KDMKFGNTGRC(4)TGPNKTVC(5)KC(6)SI(SEQ ID NO：2)
LWX-1和LWX-AD-1多肽分子内均具有3对二硫键，它们配对方式如下：C(1)-C(4)；C(2)-C(5)；C(3)-C(6)。3对二硫键的存在使LWX-1多肽具有很强的结构和性质稳定性。
实施例2 LWX-1和LWX-AD-1多肽序列的表达、纯化及分析
根据LWX-1和LWX-AD-1多肽序列，利用常规方法推断编码蛋白质的核苷酸序列，在此基础上，分别设计引物进行PCR扩增获取目的基因。
LWX-1多肽的4条引物：
正向引物为：
引物P1：5’GTGAATTCGATGACGATGACAAGGTGGGTATTAATGTGAA3’；
引物P2：5′GGTATTAATGTGAAATGTAAGCATAGCCGCCAATGTCTGAAA
CCATGCAAGGATGCTG3′；
反向引物为：
引物P3：5′GGTACAATGGCATTTGCCATTGGTGCATTTACCAAATCTCATT
CCAGCATCCTTG3′；
引物P4：5’TAGCTCGAGTCACGGGGTACAATGGCATTTGC3′。
LWX-AD-1多肽的2条引物：
引物P1：5’GATGGATCCGATGACGATGACAAGAATGAAGCGGTGCCAACA 3’
引物P2：5’GCTCTCGAGTTAGATAGAACATTTACAAAC 3’
对LWX-1多肽，进行了两轮PCR扩增反应。
第一轮PCR扩增用引物P2和引物P3，第二轮PCR扩增用引物P1和引物P4。第一轮PCR反应的试剂和条件如下：
先将下列试剂混合：
10xTaq聚合酶缓冲液 5微升
dNTP混合物         4微升
引物2              1微升
引物3              1微升
TaqDNA聚合酶       0.25微升
无菌水             37.75微升
PCR反应条件：94℃预变性300秒、94℃变性45秒、55℃复性45秒、72℃延伸45秒、72℃最后延伸200秒，循环32次。第二轮PCR中使用引物P1和引物P4，加入第一轮PCR扩增产物稀释50倍的模板1微升，其它反应条件不变。
对LWX-AD-1多肽，只进行了-轮PCR扩增反应(条件同LWX-1多肽第一轮扩增反应相同)。
将最终PCR扩增产物凝胶电泳回收后用EcoRI和XhoI双酶切，将酶切后的片段插入经EcoRI和XhoI双酶切的表达载体pGEX-6p-1(购自Pharmacia公司)，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌DE3。对转化的大肠杆菌IPTG诱导培养后，收集菌体，悬浮于缓冲液中(50mM Tris-Cl，1.0mM EDTA，pH8.0)，超声波破菌并离心，所得上清通过GST亲和层析胶后可收集洗脱得到的融合蛋白。收集得到的融合蛋白溶液再经分离纯化、小肠激酶(EK)酶切、，即得到LWX-1蛋白质与GST蛋白质的混合溶液。
通过高压液相色谱对LWX-1和LWX-AD-1多肽进一步分离，去除GST蛋白质，得到色谱纯LWX-1和LWX-AD-1色谱纯蛋白质(图2)，对不同阶段得到LWX-1和LWX-AD-1及其与GST融合蛋白进行了电泳分析(图1)。
对色谱纯LWX-1和LWX-AD-1蛋白质进行了质谱分析。LWX-1蛋白质的理论值为4073Da，质谱测定值为4073.1Da(图3)。LWX-AD-1蛋白质的理论值为4615Da，质谱测定值为4615.03Da。理论值与实验测定值一致，表明基因工程LWX-1和LWX-AD-1蛋白质是与理论设计吻合的蛋白质。
实施例3重组LWX-1和LWX-AD-1蛋白质对钾通道Kv1.3靶标的药理学活性分析
将COS-7细胞在含10％的胎牛血清的DMEM培养基37℃、5％CO2条件下培养，将钾通道Kv1.3重组质粒用SofastTM的转染试剂盒转染，转染细胞在0.8mg/ml Geneticin培养基上选择性培养。利用全细胞膜片钳用仪器(EPC-10双通道膜片钳放大器HEKA，Elektronik，Lambrecht，Germany)，对LWX-1和LWX-AD-1蛋白质的药理学活性进行测定和分析。实验参数的设置、数据的采集和刺激的施加均通过Pulse软件来控制。仪器的滤波器1设置为10kHz(Bessel)，滤波器2设置为2.9kHz(Bessel)，电极阻抗为2-5MΩ，在电极与细胞膜之间形成高阻(1-5GΩ)封接后，进行快电容自动补偿(c-fast)，稍加负压破膜后，进行慢电容自动补偿(c-slow)，在-70mV的钳制电位下，从-60mV起给予10mV步幅递增、80ms步宽的去极化脉冲刺激至+50mV，观察电流情况，LWX-1和LWX-AD-1通过MPS-2(INBIO Inc，Wuhan，China)灌注系统实现精确灌注。将LWX-1和LWX-AD-1蛋白质溶解后，经DAD给药系统(ALA)喷射给药，给药管尖端距记录细胞100μm左右。LWX-1和LWX-AD-1蛋白质对钾通道Kv1.3的药理学活性分别为1.08pM(图4和图5)和0.52 nM(图6和图7)。
实施例4 LWX-1和LWX-AD-1多肽药物治疗类风湿性关节炎
选取无特定病原体(SPF)级近交系Lewis大鼠(武汉大学实验动物中心)40只，♀，体重(150±10)g，在清洁级环境条件下适应性饲养1周后，以0.2ml/只剂量的降植烷(pristane)在实验组大鼠尾根部皮内注射。饲养2-3周即出现关节炎。然后将关节炎大鼠随机分为：模型鼠+生理盐水10只(模型阴性对照组)；模型鼠+MTX10只(模型阳性对照组)；模型鼠+多肽药物10只；另设正常对照组10只(阴性对照组)。给药组按100μg·kg-1剂量皮下注射，每天上午1次；模型阴性对照组和阴性对照组皮下注射等量生理盐水；模型阳性对照组1.75mg·kg-1。每天皮下注射MTX(氨甲喋呤)，连续给药。给药21天后，观察大鼠患关节炎状况。按照大鼠一个关节红肿计1分，大鼠二个关节红肿计2分，大鼠各个关节红肿计3分，大鼠整个肢体严重关节炎计4分的标准打分。打分结果如下表：
  模型阴性对照组   阴性对照组   模型阳性对照组   LWX-1多肽   LWX-AD-1多肽
得分   38/10只   0/10只   10/10只   15/10只   12/10只
实验结果表明，在没有药物治疗情况下，模型阴性对照组得分最高(38分/10只)；多肽药物治疗后，大鼠的症状得到显著改善，得分分别为15分/10只(LWX-1多肽)和12分/10只(LWX-AD-1多肽)，仅比模型阳性对照组(药物氨甲喋呤治疗)高2～5分。由此可见，LWX-1和LWX-AD-1多肽能有效地治疗类风湿性关节炎。
实施例5 LWX-1和LWX-AD-1多肽药物治疗多发性硬化症
选取近交系雌性Wistar大鼠(6-8周龄)，豚鼠(300-400g购自武汉大学实验动物中心)。主要试剂：福氏完全佐剂(Gibcol/BRL)，卡介苗、百日咳疫苗(上海生物制品所)，豚鼠MBP(Sigma)。GPSCH-CFA(全脊髓匀浆-福氏完全佐剂混合乳剂)的配制：将豚鼠处死后，迅速取出脊髓，用超声破碎仪(Sonics&Materials Inc，America)制成50％的PBS匀浆，与等量的福氏完全佐剂(卡介苗10mg/ml)混合，用注射器抽打至油包水乳剂。EAE的诱导Wistar大鼠EAE模型：Wistar大鼠双后腿足垫皮内注射0.4ml GPSCH-CFA乳剂，或同时皮内注射约1×1010百日咳疫苗。每日称重，观察神经症状。饲养2周即出现实验性自身免疫性脑脊髓炎。然后将实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠随机分为：模型鼠+生理盐水10只(模型阴性对照组)；模型鼠+多肽药物10只；另设正常对照组10只(阴性对照组)。给药组按100μg·kg-1剂量皮下注射，每天上午1次；模型阴性对照组和阴性对照组皮下注射等量生理盐水；连续给药。给药21天后，观察大鼠患实验性自身免疫性脑脊髓炎状况。评分标准为0分：无任何临床症状；1分：尾部张力消失；2分：后肢无力；3分：后肢完全瘫痪；4分：四肢瘫痪或濒死状态。打分结果如下表：
  模型阴性对照组   阴性对照组     LWX-1     LWX-AD-1
得分   37/10只   0/10只     12/10只     10/10只
实验结果表明：在没有药物治疗情况下，模型阴性对照组得分最高(37分/10只)；多肽药物治疗后，大鼠的症状得到显著改善，得分分别为12分/10只(LWX-1多肽)和10分/10只(LWX-AD-1多肽)，由此可见，LWX-1和LWX-AD-1多肽能有效地治疗多发性硬化症。
从以上实验可知，人工设计的LWX-1和LWX-AD-1蛋白质能够特异性作用自身免疫疾病的药物靶标钾通道Kv1.3，它的药理学活性远远高于目前报道有机小分子。同时，动物试验结果也表明，LWX-1和LWX-AD-1多肽可有效地治疗类风湿性关节炎和多发性硬化症，因此，重组LWX-1和LWX-AD-1多肽是靶向钾通道Kv1.3的先导免疫抑制药物，具有研发具有自主知识产权药物的价值。
SEQUENCE LISTING
<110>武汉大学
<120>基因工程免疫抑制多肽及制备方法和用途
<130>基因工程免疫抑制多肽及制备方法和用途
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>37
<212>PRT
<213>蝎
<400>1
Val Gly Ile Ash Val Lys Cys Lys His Ser Arg Gln Cys Leu Lys Pro
1               5                   10                  15
Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Thr Asn Gly Lys Cys
            20                  25                  30
His Cys Thr Pro Lys
        35
<210>2
<211>43
<212>PRT
<213>蝎
<400>2
Asn Glu Ala Val Pro Thr Gly Gly Cys Pro Phe Ser Asp Phe Phe Cys
1               5                   10                  15
Ala Lys Arg Cys Lys Asp Met Lys Phe Gly Asn Thr Gly Arg Cys Thr
            20                  25                  30
Gly Pro Asn Lys Thr Val Cys Lys Cys Ser Ile
        35                  40

Claims (6)

1.一种分离的多肽，其序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
2.一种分离的多肽，其序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
3.一种制备权利要求1或2所述多肽的方法，其步骤是：
A、设计引物：对于LWX-1多肽，设计4条PCR扩增引物进行2轮PCR扩增获取目的基因，正向引物为引物P1：5’GTGAATTCGATGACGATGACAAGGTGGGTATTAATGTGAA3’，引物P2：5′GGTATTAATGTGAAATGTAAGCATAGCCGCCAATGTCTGAAACCATGCAAGGATGCTG3′；反向引物为引物P3：5′GGTACAATGGCATTTGCCATTGGTGCATTTACCAAATCTCATTCCAGCATCCTTG3′，引物P4：5’TAGCTCGAGTCACGGGGTACAATGGCATTTGC3′；
B、对LWX-1多肽，进行两轮PCR扩增反应，第一轮PCR扩增用引物P2和引物P3，第二轮PCR扩增用引物P1和引物P4，第一轮PCR反应的试剂和条件如下：
先将下列试剂混合：
Figure FSB00000861637300011
PCR反应条件：94℃预变性300秒、94℃变性45秒、55℃复性45秒、72℃延伸45秒、72℃最后延伸200秒，循环32次，第二轮PCR中使用引物P1和引物P4，加入第一轮PCR扩增产物稀释50倍的模板1微升，其它反应条件不变；
C、对LWX-AD-1多肽，只进行了一轮PCR扩增反应，条件同LWX-1多肽第一轮扩增反应相同；
D、将PCR扩增产物凝胶电泳回收后用EcoRI和XhoI双酶切，将酶切后的片段插入经EcoRI和XhoI双酶切的表达载体pGEX-6p-1，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌DE3，对转化的大肠杆菌IPTG诱导培养后，收集菌体，悬浮于缓冲液中，50mM Tris-Cl，1.0mM EDTA，pH8.0，超声波破菌并离心，得上清通过GST亲和层析胶后可收集洗脱得到的融合蛋白，收集得到的融合蛋白溶液再经分离纯化、小肠激酶酶切、色谱分离，将纯化蛋白经SDS-PAGE电泳检测，得LWX-1和LWX-AD-1多肽。
4.一种基因工程免疫抑制多肽LWX-1和LWX-AD-1在制备治疗或预防靶向钾通道Kv1.3免疫抑制疾病的药物中的应用，所述LWX-1氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，所述LWX-AD-1氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
5.一种基因工程免疫抑制多肽LWX-1和LWX-AD-1在制备治疗或预防多发性硬化症的药物中的应用，所述LWX-1氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，所述LWX-AD-1氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
6.一种基因工程免疫抑制多肽LWX-1和LWX-AD-1在制备治疗或预防类风湿性关节炎的药物中的应用，所述LWX-1氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，所述LWX-AD-1氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
CN2007100536790A 2007-10-30 2007-10-30 基因工程免疫抑制多肽及制备方法和用途 Expired - Fee Related CN101423550B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2007100536790A CN101423550B (zh) 2007-10-30 2007-10-30 基因工程免疫抑制多肽及制备方法和用途
PCT/CN2008/001773 WO2009065296A1 (fr) 2007-10-30 2008-10-21 Polypeptides immunodépresseurs modifiés génétiquement, leurs procédés de préparation et leurs utilisations

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2007100536790A CN101423550B (zh) 2007-10-30 2007-10-30 基因工程免疫抑制多肽及制备方法和用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101423550A CN101423550A (zh) 2009-05-06
CN101423550B true CN101423550B (zh) 2012-11-21

Family

ID=40614453

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2007100536790A Expired - Fee Related CN101423550B (zh) 2007-10-30 2007-10-30 基因工程免疫抑制多肽及制备方法和用途

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN101423550B (zh)
WO (1) WO2009065296A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA112515C2 (uk) * 2009-06-03 2016-09-26 Дау Аґросаєнсиз Елелсі Спосіб виявлення присутності двох або більше білків, що становлять інтерес, в зразках рослинного походження
CN104211795B (zh) * 2013-05-30 2017-11-17 武汉大学 靶向钾离子通道Kv1.3活性多肽的分子设计及制备与应用
CN108329483B (zh) * 2018-02-09 2020-12-29 中国人民解放军陆军军医大学 两亲性超支化聚合物及其制备方法和应用
CN108047455B (zh) * 2018-02-09 2020-12-25 中国人民解放军陆军军医大学 用于抗原载体的两亲性超支化聚合物及其制备方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0414272D0 (en) * 2004-06-25 2004-07-28 Cellpep Sa OsK1 derivatives

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Andrew DeWan等.HTRA1 Promoter Polymorphism in Wet Age-Related Macular Degeneration.《SCIENCE》.2006,第314卷第989－992页. *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2009065296A1 (fr) 2009-05-28
CN101423550A (zh) 2009-05-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5665705A (en) Glucagon analogs with serine replacements
CN102020704A (zh) 治疗胃肠病的方法和组合物
CN1984668A (zh) 作为涉及盐和/或体液稳态的疾病的治疗剂和诊断剂的尿鸟苷蛋白原及合成的类似物或自其衍生的蛋白酶解产物
CN103483439A (zh) αO-超家族芋螺毒素肽、其药物组合物及用途
WO1998003547A1 (en) Antagonists of intestinotrophic glp-2 peptides
US20090209468A1 (en) Alpha-neurotoxin proteins with anti-inflammatory properties and uses thereof
CN101423550B (zh) 基因工程免疫抑制多肽及制备方法和用途
CN102875653A (zh) α-芋螺毒素肽、其药物组合物、其制备方法及用途
CN104211795B (zh) 靶向钾离子通道Kv1.3活性多肽的分子设计及制备与应用
JP5345929B2 (ja) 環状アルファ−コノトキシンペプチド
CN101048170B (zh) 源自响尾蛇crotalus durissus terrificus蛇毒的 止痛肽的类似化合物、它们的用途、组合物、 制备和纯化方法
EP2653477B1 (en) Scorpion active peptides and preparation methods and applications thereof
CN101381403B (zh) α型芋螺多肽衍生物及其应用
CN110300595A (zh) Pac1受体激动剂(maxcap)及其用途
WO2010022639A1 (zh) 靶特异性双突变体融合蛋白质
CN107987144B (zh) 一种蜈蚣多肽SLP_SsTx及其编码基因和应用
CN103665133A (zh) α-芋螺毒素肽LvIA/LvD21、其药物组合物及用途
CN103665130B (zh) α-芋螺毒素肽TxIC/Txd1、其药物组合物及用途
US7294697B2 (en) Short chain neurotoxin from sea snake-Lapemis hardwickii and genes encoding the neurotoxin
CN101602796B (zh) 一种含硒活性多肽及其制备方法与应用
CN102617723B (zh) 蝎活性多肽及其制备方法与应用
US7291600B2 (en) Non-T cell binding peptides and their uses
CN101422599B (zh) 蝎源免疫调节多肽在治疗类风湿性关节炎的药物中的应用
JP2012510518A (ja) 体液貯留障害を処置するための方法および組成物
CN112210569B (zh) 重组东亚钳蝎毒素多肽Makatoxin-3及其突变体的制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20121121

Termination date: 20161030