CN109134778B - 电荷翻转型聚合物胶束、载药胶束及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种电荷翻转型聚合物胶束、载药胶束及其制备方法，含保护基的碱性聚氨基酸和含保护基的酸性聚氨基酸在BACy交联剂的交联作用下发生交联反应得到交联聚合物，然后对其进行水解，使交联聚合物中碱性聚氨基酸和酸性聚氨基酸分别脱去保护基，最终得到由带正电聚氨基酸和带负电聚氨基酸交联在一起构成具有三维网状结构的电荷翻转型聚合物胶束。该电荷翻转型聚合物胶束及载药胶束不仅具有较好的结构稳定性、生物相容性、长期毒性小等优点，而且还具有还原响应性和pH响应性双重响应特性，能够实现胶束在肿瘤细胞中的长期蓄积及高渗透，并提高药物释放效率。

Description

电荷翻转型聚合物胶束、载药胶束及其制备方法
技术领域
本发明属于药物载体及其制备技术领域，涉及具有还原响应性、pH响应性的聚合物胶束以及具有肿瘤细胞微环境响应性的载药胶束，尤其涉及一种电荷翻转型聚合物胶束以及基于该电荷翻转型聚合物胶束的载药胶束及其制备方法。
背景技术
聚合物胶束是由两亲性聚合物在水溶液中自组装形成的纳米粒子，粒径一般为10～200nm，可通过实体瘤的高通透性和滞留EPR效应(enhanced pemeability andretention effect)，在肿瘤区域聚集。同时，聚合物胶束不仅可利用疏水内核包载药物分子，而亲水外壳又能使其在水溶液中稳定分散，因此，聚合物胶束在抗癌药物传递中被广泛的应用。然而，要完成药物在体内的传递，聚合物胶束作为载体不仅需具有优良的生物相容性，更重要的是需要其在血液循环输送、肿瘤蓄积、肿瘤渗透以及药物释放等各个环节中都表现出优良的性能。而载体的表面性质是决定聚合物胶束药物传递系统在上述各个环节中的性能是否优良的主要因素。
由于不同传递环节中生理环境对纳米粒子表面性质要求不同，导致传统聚合物胶束在药物传递过程中往往顾此失彼，难以发挥最佳效能，其主要体现在以下几个方面：(1)生物相容性差。传统的聚合物载药胶束结构中为了增加其生物相容性，其外壳往往需使用亲水性的合成材料，如聚乙二醇(PEG)等。PEG虽然被广泛应用于各类生物材料，但其在体内的长期毒性等问题尚未解决，如在大部分生化溶液中以及35℃以上时抗蛋白吸附功能会降低；盐溶液中的PEG化材料只有在低于临界溶解温度时才能形成稳定的纳米粒子。(2)血液循环稳定性不佳。传统的聚合物载药胶束通常利用线性聚合物制备而成，虽然具有制备工艺简单、纳米粒子结构清楚等优点，但其在体内血液循环时的稳定性较差，当聚合物载药胶束进入人体后，不仅会被体液稀释，而且容易受到温度、pH值和血液中生物分子等因素的影响，使胶束结构发生崩解，出现药物提取释放等现象，不能满足体内长循环稳定性要求。(3)肿瘤蓄积和渗透性差，血液中血清蛋白呈负电性，而实体瘤组织间液呈弱酸性环境(pH值在5.7～7.8 之间)。为了使药物载体发挥最佳效果，需要聚合物载药胶束在血液中带负电，以抑制它们与正常细胞和组织的作用，同时需要保证聚合物载药胶束到达肿瘤细胞或癌细胞内转变为带正电，以增加其对肿瘤的蓄积和渗透能力。然而传统聚合物载药胶束的表面性质不易控制，难以实现表面电荷的可控翻转，从而降低了聚合物胶束向肿瘤的蓄积和渗透性，减小了抗癌药物进入细胞核的效率；(4)药物释放效率低。研究发现，肿瘤细胞与正常细胞具有不同的内部微环境条件，如温度、pH值及GSH含量等，而传统聚合物载药胶束无法实现环境响应性，不能对肿瘤细胞内部特殊微环境的刺激进行应答，从而导致载药胶束在细胞内不能高效可控释药，致使药物递送效率偏低，影响抗肿瘤治疗效果。
发明内容
针对目前作为药物载体的聚合物胶束存在的生物相容性差、血液循环稳定性差、肿瘤蓄积和渗透性差、不具有环境响应性等问题，本发明的首要目的是提供一种电荷翻转型聚合物胶束及其制备方法，该方法能够制备出生物相容性好、毒副作用低、且肿瘤细胞微环境响应效率高的双重响应性(还原响应性和pH响应性)聚合物胶束。
本发明的次要目的是基于上述电荷翻转型聚合物胶束，提供一种电荷翻转型聚合物载药胶束及其制备方法，该方法能够制备出含聚氨基酸、同时兼具还原响应性和电荷翻转型的双响应性聚合物载药胶束。
本发明首先提供的一种电荷翻转型聚合物胶束的制备方法，该方法是以N,N'-双(丙烯酰) 胱胺(BACy)为交联剂，先使含保护基的碱性聚氨基酸和含保护基的酸性聚氨基酸交联构成交联聚合物，然后对其进行水解使之脱去保护基，得到由带正电聚氨基酸和带负电聚氨基酸交联所构成具有三维网状结构的电荷翻转型聚合物胶束。具体工艺步骤如下：将含保护基的碱性聚氨基酸和含保护基的酸性聚氨基酸溶解于溶剂I中，配置成溶质总浓度为 0.01～0.05g/mL的混合溶液，再向混合溶液中加入引发剂和交联剂BACy，之后在氮气保护下，于50～90℃下交联反应12～30h后去除溶剂Ⅰ，得到含有交联聚合物的反应液，再向其中加入沉淀剂进行沉淀至沉淀产物不再增加；所得沉淀产物即交联聚合物经抽滤、真空干燥后进行水解，使交联聚合物中碱性聚氨酸和酸性聚氨基酸分别脱去保护基，生成带正电聚氨基酸和带负电聚氨基酸交联构成的水解产物，将该水解产物滴入去离子水中形成胶束溶液，所得胶束溶液经透析、冷冻干燥，即得到由带正电聚氨基酸和带负电聚氨基酸交联所构成的电荷翻转型聚合物胶束。其中所述含保护基的碱性聚氨基酸和含保护基的酸性聚氨基酸摩尔比为1～4:1～3，所述引发剂的用量为含保护基的碱性聚氨基酸和含保护基的酸性聚氨基酸总质量的3～5％，所述交联剂BACy的用量为含保护基的碱性聚氨基酸和含保护基的酸性聚氨基酸总质量的3～5％。
上述电荷翻转型聚合物胶束的制备方法中所述含保护基的碱性聚氨基酸是由如下方法制备的：将含双官能团的开环聚合引发剂和含保护基的碱性氨基酸环内酸酐按摩尔比1: 20～70溶解于溶剂I中，配置成溶质总浓度为0.05～0.5g/mL的混合溶液，之后反应12～40h，再向反应产物中加入沉淀剂进行沉淀至沉淀产物不再增加，所得沉淀产物经抽滤后的滤饼经干燥即得到含保护基的碱性聚氨基酸。所述含保护基的碱性氨基酸环内酸酐为含保护基的赖氨酸环内酸酐、含保护基的精氨酸环内酸酐或含保护基的组氨酸环内酸酐。
上述电荷翻转型聚合物胶束的制备方法中所述含保护基的酸性聚氨基酸是由如下方法制备的：将含双官能团的开环聚合引发剂和含保护基的酸性氨基酸环内酸酐按摩尔比1:15～65 溶解于溶剂I中，配置成溶质总浓度为0.05～0.5g/mL的混合溶液，之后反应12～40h，再向反应产物中加入沉淀剂进行沉淀至沉淀产物不再增加，所得沉淀产物经抽滤后的滤饼经干燥即得到含保护基的酸性聚氨基酸。所述含保护基的酸性氨基酸环内酸酐为含保护基的谷氨酸环内酸酐或含保护基的天冬氨酸环内酸酐。
上述电荷翻转型聚合物胶束的制备方法所述含保护基的碱性聚氨基酸或含保护基的酸性聚氨基酸中的保护基为三苯甲基(Trt)、叔丁氧羰基(Boc)、芴甲氧羰基(Fmoc)、苄氧羰基 (Z)、烯丙氧羰基(Allyl)、芴甲基酯(OFm)、叔丁酯(OtBu)、苄酯(OBzl)烯丙酯(OAll) 和甲酯(OMe)基团中的至少一种。
上述电荷翻转型聚合物胶束的制备方法中制备含保护基的碱性聚氨基酸或含保护基的酸性聚氨基酸过程中所使用的含保护基的谷氨酸环内酸酐、含保护基的天冬氨酸环内酸酐、含保护基的赖氨酸环内酸酐、含保护基的精氨酸环内酸酐或含保护基的组氨酸环内酸酐等含保护基的氨基酸环内酸酐为市售产品或按照现有技术制备得到。为了更好的解释本发明，本发明所使用的含保护基的谷氨酸环内酸酐、含保护基的天冬氨酸环内酸酐、含保护基的赖氨酸环内酸酐、含保护基的精氨酸环内酸酐或含保护基的组氨酸环内酸酐等含保护基的氨基酸环内酸酐为文献“屈婧，陈康隆，王秋月等还原、温度和pH三重响应性交联载药胶束的制备及其释药性能研究[J].生物医学工程学杂志.2018,2”所公开的制备方法得到的。
上述电荷翻转型聚合物胶束的制备方法中制备含保护基的碱性聚氨基酸或含保护基的酸性聚氨基酸过程中所使用的开环聚合引发剂为丙烯胺、乙烯胺、丁烯胺、3-甲基-2-丁烯胺、戊烯胺或氨基环戊烷。
上述电荷翻转型聚合物胶束的制备方法中制备含保护基的碱性聚氨基酸或含保护基的酸性聚氨基酸过程中对含双官能团的开环聚合引发剂和含保护基的碱性氨基酸环内酸酐/含保护基的酸性氨基酸环内酸酐反应温度为25～40℃。
上述电荷翻转型聚合物胶束的制备方法中制备含保护基的碱性聚氨基酸或含保护基的酸性聚氨基酸过程中为了不破坏其分子结构，在对抽滤后的滤饼进行真空干燥时温度不宜过高，一般在40～60℃、0.01～0.018MPa干燥至少24h即可。
上述电荷翻转型聚合物胶束的制备方法中所述交联剂BACy可以参考本领域已经披露的常规手段得到，例如Shou C H,Wei D H,Jian L,et al.ReduciblePolyethylenimine Hydrogels with Disulfide Crosslinkers Prepared by MichaelAddition Chemistryas Drug Delivery Carriers: Synthesis,Properties,and InVitro Release[J].J.Poly.Sci.:Part A:Poly.Sci..2009,4:4074-4075中公开的制备方法。
上述电荷翻转型聚合物胶束的制备方法中所述溶剂I为二氯甲烷(CH2Cl2)、去离子水、二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)或二甲基亚砜(DMSO)；所述引发剂为过氧化 (二)苯甲酰、月桂酰过氧化物、偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、偶氮二异丁酸二甲酯、过硫酸钾、过硫酸铵或偶氮二异丁脒盐酸盐；所述沉淀剂为乙醚、甲醇、乙醇、四氢呋喃和去离子水中的至少一种。
本发明提供的通过上述方法制备得到的电荷翻转型聚合物胶束，该聚合物胶束是由带正电聚氨基酸和带负电聚氨基酸经BACy交联构成，以聚氨基酸作为亲水性外壳稳定胶束，不仅具有良好的生物相容性同时可在体内完全降解，长期毒性小；以BACy为交联剂得到的胶束具有三维网状结构，各组分之间由化学键联接，具有很好的稳定性。
本发明进一步提供一种电荷翻转型聚合物载药胶束的制备方法，该方法是先将上述制备的电荷翻转型聚合物胶束溶解，然后用形成的溶液包覆药物，继后滴入去离子水中形成载药胶束。具体工艺步骤如下：先将药物与上述电荷翻转型聚合物胶束按质量比1：10～50溶解于溶剂II中，配置成溶质总浓度为0.1～0.8g/mL的混合溶液，之后用碱性溶液调节混合溶液的 pH至8～10，搅拌均匀后，将混合溶液滴入去离子水中形成胶束溶液，所得胶束溶液经透析、冷冻干燥，即得到电荷翻转型聚合物载药胶束。
上述电荷翻转型聚合物载药胶束的制备方法中所述药物为盐酸阿霉素(DOX)、紫杉醇或喜树碱。
上述电荷翻转型聚合物载药胶束的制备方法中所述溶剂II为四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)。
上述电荷翻转型聚合物载药胶束的制备方法中所述碱性溶液为三乙胺、氢氧化钠溶液等。
上述电荷翻转型聚合物载药胶束的制备方法中不管制备电荷翻转型聚合物胶束还是电荷翻转型聚合物载药胶束过程中，透析都是为了截留分子量为3500的胶束溶液，因而采用截留分子量为3500的透析袋即可实现。冷冻干燥则是采用本领域已经披露的常规手段来实现。本发明采用的冷冻干燥方式为：采用冻干机，于不高于-20℃、气压不高于10Pa下冷冻干燥至少36h即可。
本发明提供的通过上述电荷翻转型聚合物载药胶束方法制备得到的聚合物载药胶束，该载药胶束在具有上述电荷翻转型聚合物胶束优势的同时，由于是将带正电聚氨基酸和带负电聚氨基酸作为胶束外壳，因而不仅使所制备的聚合物载药胶束在正常生理环境中(pH＝7.4)呈负电性，可抑制其与蛋白、正常细胞和组织的作用，且还会在微酸性环境(pH＝6.8) 的肿瘤部位发生电荷翻转，增强了其与负电性肿瘤细胞的作用，进而实现高效入胞。此外， BACy具有的强还原响应性，使二硫键能够在高浓度谷胱甘肽作用下发生断裂，进而使胶束崩解，释放抗癌药物，大大提高药物释放效率。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、由于本发明提供的电荷翻转型聚合物胶束及聚合物载药胶束采用了聚氨基酸作为亲水性外壳来稳定纳米胶束，不仅使聚合物胶束及聚合物载药胶束具有良好的生物相容性，同时可以在体内降解，且长期毒性小，从而解决了传统聚合物胶束使用合成材料(如PEG)作为亲水性外壳导致的载体生物相容性差、体内毒性等问题。
2、由于本发明提供的电荷翻转型聚合物胶束及聚合物载药胶束采用了带正电的聚氨基酸及带负电的聚氨基酸作为胶束外壳，使聚合物胶束及聚合物载药胶束既能在正常生理环境中 (pH＝7.4)呈负电性，抑制其与蛋白、正常细胞和组织的作用，又能在转变为微酸性环境 (pH＝6.8)的肿瘤部位时，发生电荷翻转呈正电性，从而增强了胶束与负电性肿瘤细胞的作用，进而实现高效入胞，解决了传统聚合物胶束肿瘤蓄积和渗透性差的问题。
3、由于本发明提供的电荷翻转型聚合物胶束及聚合物载药胶束，采用具有二硫键的N,N'- 双(丙烯酰)胱胺(BACy)为交联剂，先将含保护基的碱性聚氨基酸和含保护基的酸性聚氨基酸发生交联得到交联聚合物，然后对其进行水解，使交联聚合物中碱性聚氨基酸和酸性聚氨基酸分别脱去保护基，最终得到由带正电聚氨基酸和带负电聚氨基酸交联在一起构成具有三维网状结构的电荷翻转型聚合物胶束，确保了聚合物胶束及聚合物载药胶束的结构稳定性，从而克服了线性胶束在体液稀释、温度、pH值等影响易崩解、稳定性差等问题，特别是对于聚合物载药胶束，药物在三维网状结构中被稳定包裹，避免了提前释药对正常组织的副作用，从而解决了传统聚合物胶束血液循环稳定性不佳的问题。
4、由于本发明提供的电荷翻转型聚合物胶束及聚合物载药胶束采用的交联剂含有二硫键结构，不仅使聚合物胶束及聚合物载药胶束具有还原响应的靶向性，二硫键还能够在肿瘤细胞中高浓度谷胱甘肽作用下发生断裂，从而使胶束崩解，释放抗癌药物，大大提高了药物释放效率，如在体外模拟肿瘤细胞微环境条件下药物释放率达84.2％，远高于目前传统载药胶束的释放率，解决了传统聚合物载药胶束释放性能差的问题。
5、由于本发明主要基于自由基聚合(ATRP)来实现电荷翻转型聚合物胶束及聚合物载药胶束的制备，因而制备工艺简单、操作方便、条件温和、可控性强、且原料便宜易得，适于在生物医药领域内加以推广应用。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的聚谷氨酸苄酯(a )、聚苄氧羰基赖氨酸(b )、交联剂BACy(c )和电荷翻转型聚合物胶束(d )的核磁(H1-NMR)谱图。
图2为本发明实施例1制备电荷翻转型聚合物胶束过程中水解前后产物的红外(IR)谱图，其中(a)为水解前胶束的红外谱图，(b)为水解后胶束的红外谱图。
图3为本发明实施例1制备的电荷翻转型聚合物胶束分别在pH＝2(a)和pH＝12(b)调节下的核磁(H1-NMR)谱图。
图4为本发明实施例1制备的电荷翻转型聚合物胶束在不同浓度下的荧光图谱(A)及电荷翻转型聚合物胶束的临界胶束浓度CMC标定曲线(B)。
图5为本发明实施例1制备的电荷翻转型聚合物胶束(a)和经GSH降解处理后的电荷翻转型聚合物胶束(b)透射电镜照片。
图6本发明实施例1制备的电荷翻转型聚合物胶束在10mmol/L GSH作用下降解的动态光散射(DLS)谱图(A)和胶束粒径随时间变化曲线(B)。
图7为本发明实施例1制备的电荷翻转型聚合物胶束在10mmol/L GSH作用下所得产物的相对吸光度图。
图8为本发明实施例1制备的电荷翻转型聚合物胶束在不同浓度NaCl溶液中的动态光散射(DLS)谱图(A)和胶束粒径随NaCl溶液浓度变化曲线(B)。
图9为应用例1中，采用本发明实施例1制备的电荷翻转型聚合物胶束在胎牛血清中的动态光散射(DLS)谱图(A)和胎牛血清中胶束粒径随时间变化曲线(B)。
图10为本发明实施例1制备的电荷翻转型聚合物胶束电动电势值随pH值的变化谱图。
图11为应用例2中，不同浓度的牛血清蛋白(BSA)吸光度标准曲线(a)和本发明实施例1制备的电荷翻转型聚合物胶束表面牛血清蛋白(BSA)吸附量随pH值的变化谱图(b)。
图12为本发明应用例3中，采用本发明实施例1制备的电荷翻转型聚合物载药胶束的药物释放谱图。
图13为应用例4中，采用本发明实施例1制备的电荷翻转型聚合物载药胶束进行人脐静脉内皮细胞(HUVEC)毒性试验的细胞活性柱状图。
图14为应用例5中，采用本发明实施例1制备的电荷翻转型聚合物载药胶束对人宫颈癌细胞(HeLa)进行处理后的细胞活性表征谱图；其中(a)为采用CCK8法对电荷翻转型聚合物载药胶束的体外细胞活性随DOX浓度的变化曲线，(b)为游离DOX与负载等量DOX 的电荷翻转型聚合物载药胶束在不同pH环境下对HeLa细胞的半抑制浓度柱状图。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明给出的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。
以下实施例红外表征采用的是Themo公司的Nicolet is50型傅里叶转换红外光谱仪 (FTIR)，测试范围为400～4000cm-1。
以下实施例核磁表征采用的是BRUKER-400MHz的核磁共振谱仪(NMR)，其以TMS 为内标。
以下实施例和应用例动态光散射(DLS)表征采用的是Nano-zs90动态光散射测量仪，其测量温度为室温。
以下实施例和应用例吸光度表征采用的是型号为TU1950的紫外可见光光度计(UV-Vis)，其测量波长为480nm。
以下实施例形貌表征采用的是型号为日立H-600的扫描透射电子显微镜(TEM)，其加速电压为75kv。
以下实施例采用的交联剂N,N'-双(丙烯酰)胱胺(BACy)交联剂是参考Shou C H,Wei D H,Jian L,et al.Reducible Polyethylenimine Hydrogels with DisulfideCrosslinkers Prepared by Michael Addition Chemistryas Drug Delivery Carriers:Synthesis,Properties,and In Vitro Release [J].J.Poly.Sci.:Part A:Poly.Sci.2009,4:4074-4075所公开的方法制备得到，具体操作为：将胱胺二盐酸盐与丙烯酰氯以摩尔比1:2混合溶于碳酸氢钠碱性溶液中配置成溶质总浓度为0.15 g/mL的溶液，之后于室温下反应3h，所得反应液用二氯甲烷进行萃取有机相，萃取所得有机相经无水硫酸镁干燥、抽滤，再用正己烷和乙酸乙酯进行重结晶，所得产物于25℃、0.010 MPa下干燥12h，即得N,N'-双(丙烯酰)胱胺交联剂(BACy)。
以下实施例所采用的谷氨酸苄酯环内酸酐是参考“屈婧，陈康隆，王秋月等.还原、温度和pH三重响应性交联载药胶束的制备及其释药性能研究[J].生物医学工程学杂志.2018,2”所公开的制备方法得到的。具体操作为：以乙酸乙酯为溶剂，在三口烧瓶中加入谷氨酸苄酯 7.12g，在氮气保护下于85℃搅拌回流0.5h，加入三光气后继续搅拌2h，待溶液澄清。利用正己烷作为溶剂进行纯化，纯化所得产物进一步经干燥后即得谷氨酸苄酯环内酸酐。含保护基的天冬氨酸环内酸酐、含保护基的赖氨酸环内酸酐、含保护基的精氨酸环内酸酐或含保护基的组氨酸环内酸酐等含保护基的氨基酸环内酸酐均参照上述方法制备。
以下实施例所采用的PBS缓冲液配制方法为：各取Na2HPO4·12H2O 2.937g、NaCl0.9g 和KH2PO4 0.165g，加去离子水80mL，全部溶解后，加入去离子水定容至100mL。设置pH计室温25℃，标准品调试后，分别用NaOH和HCl调节成所需的pH溶液。
实施例1
(1)制备聚苄氧羰基赖氨酸
将丙烯胺与苄氧羰基赖氨酸环内酸酐以摩尔比1:15溶解于DMF中，配置成溶质总浓度为0.50g/mL的混合溶液，之后于25℃反应12h，再向反应产物中加入乙醚进行沉淀至沉淀产物不再增加，所得沉淀产物经抽滤后的滤饼于60℃、0.010MPa干燥24h即得到聚苄氧羰基赖氨酸。
(2)制备聚谷氨酸苄酯
将丙烯胺与谷氨酸苄酯环内酸酐以摩尔比1：20溶解于DMF中，配置成溶质总浓度为 0.50g/mL的混合溶液，之后于25℃反应12h，再向反应产物中加入乙醚进行沉淀至沉淀产物不再增加，所得沉淀产物经抽滤后的滤饼于60℃、0.010MPa干燥24h即得到聚谷氨酸苄酯。
(3)制备电荷翻转型聚合物胶束
将聚苄氧羰基赖氨酸和聚谷氨酸苄酯以摩尔比1：1溶解于DMF中，配置成溶质总浓度为0.01g/mL的混合溶液，再向混合溶液中加入引发剂偶氮二异丁腈和交联剂BACy，之后在氮气保护下、于90℃下反应24h，反应结束后旋蒸去除DMF，再向去除DMF的反应液中加入乙醚进行沉淀至沉淀产物不再增加，所得沉淀产物经抽滤后的滤饼于 60℃、0.010MPa干燥24h，真空干燥所得产物用三氟乙酸进行水解，水解产物滴入去离子水中形成胶束溶液，所得胶束溶液经透析、冷冻干燥，即得到电荷翻转型聚合物胶束；所述引发剂偶氮二异丁腈和交联剂BACy的用量均为聚苄氧羰基赖氨酸和聚谷氨酸苄酯总质量的3％。
(4)制备电荷翻转型聚合物载药胶束
将盐酸阿霉素(DOX)与步骤(3)得到的电荷翻转型聚合物胶束按质量比1：10溶解于DMF中，配置成溶质总浓度为0.1g/mL的混合溶液，之后用三乙胺调节混合溶液的pH至 9，搅拌1h后，将混合溶液逐滴滴入去离子水中形成胶束溶液，所得胶束溶液经透析、冷冻干燥，即得到电荷翻转型聚合物载药胶束。
(一)结构表征
对步骤(1)制备的聚谷氨酸苄酯、步骤(2)制备的聚苄氧羰基赖氨酸、交联剂BACy和步骤(3)得到的电荷翻转型聚合物胶束进行核磁(H1-NMR)分析【以氘代氯仿(CDCl3) 为溶剂】，分析结果如图1所示。从图1(A)看出，聚谷氨酸苄酯中δ(ppm)：7.8-7.9(b：单峰，环内氨基)，δ(ppm)：7.2-7.4(g：双重峰，苯环)，δ(ppm)：5.1-5.2(f：单峰，苄基)，δ(ppm)：4.5-4.6(c：单峰，次甲基)，δ(ppm)：2.9-3.0(a：单峰，引发剂残基上亚甲基)，δ(ppm)：1.9-2.6(e、d：α-亚甲基及γ-亚甲基)；由此，聚谷氨酸苄酯上的苯环、胺基、苄基及都能够找到相对应的峰，说明已成功制备出聚谷氨酸苄酯(记为PBLG)。从图1(B) 看出，聚苄氧羰基赖氨酸中δ(ppm)：7.55-7.85(b’：单峰，环内氨基)，δ(ppm)：7.2-7.4 (g’：双重峰，苯环)，δ(ppm)：5.0-5.2(f’：单峰，苄基)，δ(ppm)：4.3-4.5(c’：单峰，次甲基)，δ(ppm)：3.2-3.3(i：α-亚甲基)，δ(ppm)：3.0-3.2(a’：单峰，引发剂残基上亚甲基)，δ(ppm)：1.15-1.9(e’，d’，h：亚甲基)；由此，聚苄氧羰基赖氨酸(记为PZLL) 已成功制备出。从图1(C)看出，交联剂BACy中δ(ppm)：7.0-7.15对应于N-H(c”：单峰，氨基)，δ(ppm)：5.9-6.4(a”，b”：上的氢)，δ(ppm)：3.7-3.85(d”：单峰，二硫键旁α-碳原子上的氢)，δ(ppm)：2.8-2.9(e”：单峰，二硫键旁β-碳原子上的氢)；由此，含二硫键的交联剂BACy已经成功制备出。从图(D)中，电荷翻转型聚合物胶束中δ(ppm)： 7.8-7.9(b：单峰，PBLG中环内氨基)，δ(ppm)：7.6-7.7(b’：单峰，PZLL中环内氨基)，δ(ppm)：7.15-7.4(g，g’：双重峰，苯环)，δ(ppm)：5.0-5.2(f，f’：单峰，苄基)，δ(ppm)： 4.3-4.5(c，c’：单峰，次甲基)，δ(ppm)：3.85-3.95(d″：单峰，BACy中二硫键旁α-碳原子上的氢)，δ(ppm)：3.05-3.2(i：单峰，PZLL中α-亚甲基)，δ(ppm)：2.85-2.95(e”：单峰，BACy中二硫键旁β-碳原子上的氢)，δ(ppm)：1.15-2.6(e，e’，d，d’，h：亚甲基)，由此表明，电荷翻转型聚合物胶束已被成功制备。
在部分步骤(3)制备电荷翻转型聚合物胶束过程中，将真空干燥所得滤饼(即水解前产物)及步骤(3)得到的电荷翻转型聚合物胶束(即水解后产物)进行红外分析，分析结果如图2所示。水解前产物对应IR图中，3200-3500cm-1为N-H的伸缩振动吸收峰，3090cm-1为苯环上C-H的伸缩振动吸收峰，1750cm-1为酯中C＝O的伸缩振动吸收峰，1650cm-1为酰胺中C＝O的伸缩振动吸收峰，700cm-1为-C-S-的伸缩振动吸收峰；水解后产物对应IR图中，3200-3500cm-1为N-H的伸缩振动吸收峰，1680cm-1为羧酸中C＝O的伸缩振动吸收峰， 1650cm-1为酰胺中C＝O的伸缩振动吸收峰，700cm-1为-C-S-的伸缩振动吸收峰。通过对比可知，水解后产物的IR图中1750cm-1的酯的特征峰消失，说明在步骤(3)制备电荷翻转型聚合物胶束过程中真空干燥所得滤饼已经水解完全，成功暴露出氨基和羧基。
(二)结构稳定性、还原响应性和pH响应性表征
1、结构稳定性
将部分步骤(3)得到的电荷翻转型聚合物胶束溶于去离子水中配置成一系列浓度的胶束溶液，然后对该一系列浓度的胶束溶液进行荧光分析，分析结果如图4(A)所示，从图中可以看出，随着胶束浓度的增大，请荧光强度也随之增强。图4(B)为各浓度对应荧光强度曲线中337nm和334nm处的荧光强度比值随浓度对数的变化，如图4(B)所示，可以看出该电荷翻转型聚合物胶束的临界胶束浓度CMC值为0.5mg/L，说明即使浓度很低的胶束溶液也表现出极好的稳定性。
分别将5mg步骤(3)得到的电荷翻转型聚合物胶束溶解于5mL不同浓度的NaCl溶液中，之后对溶解于NaCl中的胶束进行动态光散射(DLS)分析，分析结果如图8所示，从图中可以看出，随着NaCl浓度的增加，胶束的粒径变化很小，说明胶束在NaCl测试浓度下结构是稳定的，符合电荷翻转型聚合物胶束稳定性的要求。
2、还原响应性
(1)将5mg电荷翻转型聚合物胶束在5mL谷胱甘胺(GSH)浓度为10mmol/L的水溶液中降解处理24h，得到经GSH降解处理后的电荷翻转型聚合物胶束溶液。
将部分步骤(3)电荷翻转型聚合物胶束和经GSH降解处理后的电荷翻转型聚合物胶束溶液进行形貌表征，如图5所示，从图中可以看出，步骤(3)得到的电荷翻转型聚合物胶束呈球形结构，平均粒径在70nm左右，且分散稳定性良好，符合载药胶束粒径为20～200nm的要求；经GSH降解处理后的电荷翻转型聚合物胶束已被降解成不规则形状。通过图5(a)和(b)的对比可以说明经GSH处理，电荷翻转型聚合物胶束发生了降解，电荷翻转型聚合物胶束含有其还原作用的二硫键，电荷翻转型聚合物胶束具有还原响应性。
(2)将5mg电荷翻转型聚合物胶束在5mL谷胱甘胺(GSH)浓度为10mmol/L的水溶液中降解处理，将未经GSH降解处理和经GSH降解处理不同时间的电荷翻转型聚合物胶束进行动态光散射分析，分析结果如图6所示。从图中可以看出，未经GSH处理的电荷翻转型聚合物胶束在0h和24h时的粒径均为120nm左右，粒径没有明显变化，比较稳定。经GSH 处理后，胶束粒径先增大，这是因为GSH的作用，使得胶束中二硫键断裂，胶束发生溶胀，粒径增大；GSH处理4h后胶束粒径开始减小，这是由于胶束中断裂的链段发生脱落，胶束粒径变小。这一现象进一步说明制备的电荷翻转型聚合物胶束具有还原响应性。
(3)将5mg电荷翻转型聚合物胶束在5mL谷胱甘胺(GSH)浓度为10mmol/L的水溶液中降解处理，将未经GSH降解处理和经GSH降解处理不同时间的电荷翻转型聚合物胶束进行吸光度分析，分析结果如图7所示。从图中可以看出，经GSH降解处理后的胶束相对吸光度随处理时间增加逐渐降低，说明电荷翻转型聚合物胶束在加入GSH后开始降解，这一现象也说明制备的电荷翻转型聚合物胶束具有还原响应性。
4、pH响应性
将部分步骤(3)得到的电荷翻转型聚合物胶束分别溶于pH＝2的CDCl3溶剂(用盐酸调节CDCl3的pH至pH＝2得到pH＝2的CDCl3溶剂)和pH＝12的氘代氢氧化钠溶剂，进行核磁分析，分析结果如图3所示。从图中可以看出，当溶剂为于pH＝2的CDCl3时，δ(ppm)：4.4-4.5(c’：单峰，PZLL中次甲基)，2.5-2.7(i：单峰，PZLL中α-亚甲基)，2.0-2.3(e、d： PBLG中α-亚甲基及γ-亚甲基)，0.75-1.4(PZLL中e’，d’，h：亚甲基)；当溶剂为pH＝12的氘代氢氧化钠时，δ(ppm)：4.05-4.2(c：单峰，PBLG中次甲基)，2.6-2.85(i：单峰，PZLL 中α-亚甲基)，2.2-2.6(e、d：PBLG中α-亚甲基及γ-亚甲基)，1.6-1.7(d’：单峰，PZLL中亚甲基)。由此看出，可以进一步确定电荷翻转型聚合物胶束在不同pH环境下的结构，从而表现出不同的pH响应性。
将5mg步骤(3)制备得到的电荷翻转型聚合物胶束分别溶解到5mL不同pH值的PBS缓冲液中，观察PBS缓冲液电动电势随时间的变化，测试结果如图10所示。从图中可以看出，2h以后，PBS缓冲液的电动电势不再变化，此时酸性PBS缓冲液电动电势为正，碱性 PBS缓冲液电动电势为负，即随着外界环境pH值由碱至酸的过程中，胶束的电位都是由负值逐渐转为正值；由此可见，溶液的pH环境可以使胶束溶液的电位值发生翻转，说明本发明制备的电荷翻转型聚合物胶束具有pH响应的电荷翻转性能。
实施例2
(1)制备聚苄氧羰基赖氨酸
将丙烯胺与苄氧羰基赖氨酸环内酸酐以摩尔比1:25溶解于CH2Cl2中，配置成溶质总浓度为0.40g/mL的混合溶液，之后于30℃反应18h，再向反应产物中加入乙醚进行沉淀至沉淀产物不再增加，所得沉淀产物经抽滤后的滤饼于60℃、0.012MPa干燥24h即得到聚苄氧羰基赖氨酸。
(2)制备聚谷氨酸苄酯
将丙烯胺与谷氨酸苄酯环内酸酐以摩尔比1：30溶解于CH2Cl2中，配置成溶质总浓度为0.40g/mL的混合溶液，之后于30℃反应18h，再向反应产物中加入乙醚进行沉淀至沉淀产物不再增加，所得沉淀产物经抽滤后的滤饼于60℃、0.012MPa干燥24h即得到聚谷氨酸苄酯。
(3)制备电荷翻转型聚合物胶束
将聚苄氧羰基赖氨酸和聚谷氨酸苄酯以摩尔比2：1溶解于DMSO中，配置成溶质总浓度为0.02g/mL的混合溶液，再向混合溶液中加入引发剂偶氮二异丁腈和交联剂BACy，之后在氮气保护下、于80℃下反应18h，反应结束后旋蒸去除DMSO，再向去除DMSO的反应液中加入乙醚进行沉淀至沉淀产物不再增加，所得沉淀产物经抽滤后的滤饼于 60℃、0.012MPa干燥24h，真空干燥所得产物用三氟乙酸进行水解，水解产物滴入去离子水中形成胶束溶液，所得胶束溶液经透析、冷冻干燥，即得到电荷翻转型聚合物胶束；引发剂偶氮二异丁腈的用量为聚苄氧羰基赖氨酸和聚谷氨酸苄酯总质量的4％，交联剂BACy的用量为聚苄氧羰基赖氨酸和聚谷氨酸苄酯总质量的3％。
(4)制备电荷翻转型聚合物载药胶束
将盐酸阿霉素与步骤(3)得到的电荷翻转型聚合物胶束按质量比1：11溶解于DMF中，配置成溶质总浓度为0.2g/mL的混合溶液，之后用三乙胺调节混合溶液的pH至10，搅拌1h 后，将混合溶液逐滴滴入去离子水中形成胶束溶液，所得胶束溶液经透析、冷冻干燥，即得到电荷翻转型聚合物载药胶束。
实施例3
(1)制备聚叔丁氧羰基赖氨酸
将丙烯胺与叔丁氧羰基赖氨酸环内酸酐以摩尔比1:35溶解于DMSO中，配置成溶质总浓度为0.30g/mL的混合溶液，之后于35℃反应24h，再向反应产物中加入乙醚进行沉淀至沉淀产物不再增加，所得沉淀产物经抽滤后的滤饼于60℃、0.014MPa干燥24h即得到聚叔丁氧羰基赖氨酸。
(2)制备聚谷氨酸叔丁酯
将丙烯胺与谷氨酸叔丁酯环内酸酐以摩尔比1：40溶解于THF中，配置成溶质总浓度为 0.25g/mL的混合溶液，之后于25℃反应24h，再向反应产物中加入乙醚进行沉淀至沉淀产物不再增加，所得沉淀产物经抽滤后的滤饼于60℃、0.014MPa干燥24h即得到聚谷氨酸叔丁酯。
(3)制备电荷翻转型聚合物胶束
将聚叔丁氧羰基赖氨酸和聚谷氨酸叔丁酯以摩尔比3：1溶解于THF中，配置成溶质总浓度为0.03g/mL的混合溶液，再向混合溶液中加入引发剂偶氮二异丁腈和交联剂BACy，之后在氮气保护下、于70℃下反应16h，反应结束后旋蒸去除THF，再向去除THF的反应液中加入乙醚进行沉淀至沉淀产物不再增加，所得沉淀产物经抽滤后的滤饼于 60℃、0.014MPa干燥24h，真空干燥所得产物用三氟乙酸进行水解，水解产物滴入去离子水中形成胶束溶液，所得胶束溶液经透析、冷冻干燥，即得到电荷翻转型聚合物胶束；引发剂偶氮二异丁腈和交联剂BACy的用量均为聚叔丁氧羰基赖氨酸和聚谷氨酸叔丁酯总质量的4％。
(4)制备电荷翻转型聚合物载药胶束
将盐酸阿霉素与步骤(3)得到的电荷翻转型聚合物胶束按质量比1：20溶解于DMSO中，配置成溶质总浓度为0.3g/mL的混合溶液，之后用氢氧化钠调节混合溶液的pH至8，搅拌1h后，将混合溶液逐滴滴入去离子水中形成胶束溶液，所得胶束溶液经透析、冷冻干燥，即得到电荷翻转型聚合物载药胶束。
实施例4
(1)制备聚苄氧羰基精氨酸
将乙烯胺与苄氧羰基精氨酸环内酸酐以摩尔比1:45溶解于去离子水中，配置成溶质总浓度为0.20g/mL的混合溶液，之后于40℃反应30h，再向反应产物中加入甲醇进行沉淀至沉淀产物不再增加，所得沉淀产物经抽滤后的滤饼于60℃、0.016MPa干燥24h即得到聚苄氧羰基精氨酸。
(2)制备聚天冬氨酸苄酯
将乙烯胺与天冬氨酸苄酯环内酸酐以摩尔比1：50溶解于去离子水中，配置成溶质总浓度为0.20g/mL的混合溶液，之后于40℃反应30h，再向反应产物中加入甲醇进行沉淀至沉淀产物不再增加，所得沉淀产物经抽滤后的滤饼于60℃、0.016MPa干燥24h即得到聚天冬氨酸苄酯。
(3)制备电荷翻转型聚合物胶束
将聚苄氧羰基精氨酸和聚天冬氨酸苄酯以摩尔比1：3溶解于DMF中，配置成溶质总浓度为0.04g/mL的混合溶液，再向混合溶液中加入引发剂偶氮二异庚腈和交联剂BACy，之后在氮气保护下、于60℃下反应12h，反应结束后旋蒸去除DMF，再向去除DMF的反应液中加入甲醇进行沉淀至沉淀产物不再增加，所得沉淀产物经抽滤后的滤饼于 60℃、0.016MPa干燥24h，真空干燥所得产物用三氟乙酸进行水解，水解产物滴入去离子水中形成胶束溶液，所得胶束溶液经透析、冷冻干燥，即得到电荷翻转型聚合物胶束；引发剂偶氮二异庚腈的用量为聚苄氧羰基精氨酸和聚天冬氨酸苄酯总质量的3％，交联剂 BACy的用量为聚苄氧羰基精氨酸和聚天冬氨酸苄酯总质量的4％。
(4)制备电荷翻转型聚合物载药胶束
将紫杉醇与步骤(3)得到的电荷翻转型聚合物胶束按质量比1：30溶解于THF中，配置成溶质总浓度为0.4g/mL的混合溶液，之后用氢氧化钠调节混合溶液的pH至10，搅拌1h后，将混合溶液逐滴滴入去离子水中形成胶束溶液，所得胶束溶液经透析、冷冻干燥，即得到电荷翻转型聚合物载药胶束。
实施例5
(1)制备聚叔丁氧羰基组氨酸
将丙烯胺与叔丁氧羰基组氨酸环内酸酐以摩尔比1:55溶解于DMF中，配置成溶质总浓度为0.10g/mL的混合溶液，之后于25℃反应36h，再向反应产物中加入THF进行沉淀至沉淀产物不再增加，所得沉淀产物经抽滤后的滤饼于60℃、0.018MPa干燥24h即得到聚叔丁氧羰基组氨酸。
(2)制备聚天冬氨酸叔丁酯
将戊烯胺与天冬氨酸叔丁酯环内酸酐以摩尔比1：60溶解于DMF中，配置成溶质总浓度为0.10g/mL的混合溶液，之后于25℃反应36h，再向反应产物中加入THF进行沉淀至沉淀产物不再增加，所得沉淀产物经抽滤后的滤饼于60℃、0.018MPa干燥24h即得到聚天冬氨酸叔丁酯。
(3)制备电荷翻转型聚合物胶束
将聚叔丁氧羰基组氨酸和聚天冬氨酸叔丁酯以摩尔比1：2溶解于DMSO中，配置成溶质总浓度为0.05g/mL的混合溶液，再向混合溶液中加入引发剂过硫酸钾和交联剂BACy，之后在氮气保护下、于50℃下反应24h，反应结束后旋蒸去除DMSO，再向去除DMSO 的反应液中加入THF进行沉淀至沉淀产物不再增加，所得沉淀产物经抽滤后的滤饼于 60℃、0.018MPa干燥24h，真空干燥所得产物用三氟乙酸进行水解，水解产物滴入去离子水中形成胶束溶液，所得胶束溶液经透析、冷冻干燥，即得到电荷翻转型聚合物胶束；引发剂过硫酸钾的用量为聚叔丁氧羰基组氨酸和聚天冬氨酸叔丁酯总质量的4％，交联剂 BACy的用量为聚叔丁氧羰基组氨酸和聚天冬氨酸叔丁酯总质量的5％。
(4)制备电荷翻转型聚合物载药胶束
将喜树碱与步骤(3)得到的电荷翻转型聚合物胶束按质量比1：40溶解于DMF中，配置成溶质总浓度为0.8g/mL的混合溶液，之后用三乙胺调节混合溶液的pH至9，搅拌1h后，将混合溶液逐滴滴入去离子水中形成胶束溶液，所得胶束经透析、冷冻干燥，即得到电荷翻转型聚合物载药胶束。
实施例6
(1)制备聚芴甲氧羰基赖氨酸
将丙烯胺与芴甲氧羰基赖氨酸环内酸酐以摩尔比1:65溶解于THF中，配置成溶质总浓度为0.05g/mL的混合溶液，之后于30℃反应40h，再向反应产物中加入乙醚进行沉淀至沉淀产物不再增加，所得沉淀产物经抽滤后的滤饼于60℃、0.010MPa干燥24h即得到聚芴甲氧羰基赖氨酸。
(2)制备聚谷氨酸芴甲基酯
将丙烯胺与谷氨酸芴甲基酯环内酸酐以摩尔比1：70溶解于THF中，配置成溶质总浓度为0.05g/mL的混合溶液，之后于30℃反应40h，再向反应产物中加入乙醚进行沉淀至沉淀产物不再增加，所得沉淀产物经抽滤后的滤饼于60℃、0.010MPa干燥24h即得到聚谷氨酸芴甲基酯。
(3)制备电荷翻转型聚合物胶束
将聚芴甲氧羰基赖氨酸和聚谷氨酸芴甲基酯以摩尔比4：1溶解于THF中，配置成溶质总浓度为0.01g/mL的混合溶液，再向混合溶液中加入引发剂偶氮二异丁腈和交联剂BACy，之后在氮气保护下、于85℃下反应30h，反应结束后旋蒸去除THF，再向去除THF的反应液中加入乙醚进行沉淀至沉淀产物不再增加，所得沉淀产物经抽滤后的滤饼于 60℃、0.010MPa干燥24h，真空干燥所得产物用三氟乙酸进行水解，水解产物滴入去离子水中形成胶束溶液，所得胶束溶液经透析、冷冻干燥，即得到电荷翻转型聚合物胶束；引发剂偶氮二异丁腈的用量为聚芴甲氧羰基赖氨酸和聚谷氨酸芴甲基酯总质量的5％，交联剂BACy的用量为聚芴甲氧羰基赖氨酸和聚谷氨酸芴甲基酯总质量的4％。
(4)制备电荷翻转型聚合物载药胶束
将盐酸阿霉素与步骤(3)得到的电荷翻转型聚合物胶束按质量比1：50溶解于DMSO中，配置成溶质总浓度为0.6g/mL的混合溶液，之后用氢氧化钠调节混合溶液的pH至9，搅拌1h后，将混合溶液逐滴滴入去离子水中形成胶束溶液，所得胶束溶液经透析、冷冻干燥，即得到电荷翻转型聚合物载药胶束。
应用例1
将4mg实施例1步骤(3)制备的电荷翻转型聚合物胶束溶解于20mL胎牛血清液中，之后对溶解于胎牛血清中的胶束进行动态光散射(DLS)分析，分析结果如图9所示，从图中可以看出，随着时间的增加，胶束的粒径几乎并未发生明显变化，说明胶束在胎牛血清环境中能够保持长期稳定性。
应用例2
将牛血清蛋白(BSA)分别溶解到PBS缓冲液中配置一系列含不同浓度BSA的 PBS缓冲液。利用该一系列含不同浓度BSA的PBS缓冲液进行吸光度分析，得到不同浓度的牛血清蛋白(BSA)吸光度标准曲线，如图11(a)所示。
分别将10mg实施例1步骤(3)得到的电荷翻转型聚合物胶束加入到过量含BSA(浓度为0.1mg/mL)、不同pH值的PBS缓冲液(四等份PBS缓冲液pH值分别为7.4、7、6.5和 5)中，混合均匀。对上述四份溶液进行吸光度分析，结合牛血清蛋白(BSA)吸光度标准曲线计算得到BSA在电荷翻转型聚合物胶束的吸附量，结果如图11(b)所示。从图中可以看出，随着pH的减小，BSA在胶束载体表面的吸附量增加。这是由于胶束在酸性条件下表现为正电荷，然而血液中的血清蛋白大多具有负电荷，很容易附着在带正电的纳米颗粒上，增加了牛血清蛋白的吸附量。而当胶束在生理pH条件(pH＝7.4)下时表现为负电荷，阻止了胶束对血液中带有负电荷的血清蛋白BSA的吸附，保证了静脉注射的体内长循环时间。BSA吸附实验能够进一步说明胶束的电荷翻转特性，同时也表现了胶束在血液中稳定的特性。
应用例3
分别将盛有2mg实施例1步骤(4)得到的电荷翻转型聚合物载药胶束的透析袋放入2mL pH＝7.4的PBS缓冲液、pH＝5.0的PBS缓冲液、pH＝7.4且含GSH(浓度为10mmol/L)的PBS缓冲液、pH＝5.0且含GSH(浓度为10mmol/L)的PBS缓冲液中，同时将盛有与2mg 载药胶束中等量游离DOX(即纯DOX)的透析袋放入到pH＝7.4的PBS缓冲液中，测量DOX 和载药胶束在各PBS缓冲液中的累积释放效率，如图12所示。
从图中可以看出，在pH＝7.4条件下，载药胶束48h的累积释放率仅为25.4％；对于在 pH＝7.4、GSH(浓度为10mmol/L)处理条件下，载药胶束48h累积释放率为56.8％；在pH＝5.0条件下，载药胶束48h累积释放率为67.0％；在pH＝5.0、GSH(浓度为10mmol/L)处理条件下，载药胶束48h累积释放率为84.2％。然而，游离DOX在5小时内快速释放，其 48h累积释放率最高可达97.0％。综上所述，本发明制备得到的电荷翻转型聚合物载药胶束在无刺激条件下仅存在少量的药物释放，表明其具有优异的药物稳定性。并且在还原、pH条件刺激下，载药胶束的累积释放率显著增大，表明聚合物胶束具有双重敏感性。
应用例4
将实施例1步骤(4)得到的电荷翻转型聚合物载药胶束加入pH＝7.4的PBS缓冲液中配置一系列含不同浓度载药胶束的PBS缓冲液中，然后将100μL含不同浓度载药胶束的PBS 缓冲液加入到100μL含人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的1640液体培养基中进行细胞毒性实验，分析结果如图13所示。从图中可以看出，随着载药胶束浓度的增加，HUVEC细胞均保持较高的细胞存活率，证明该载药胶束对于正常细胞几乎无毒性，故具有良好的生物相容性。
应用例5
本应用例为人宫颈癌细胞(HeLa)为模型。
将实施例1步骤(4)得到的电荷翻转型聚合物载药胶束加入pH＝7.4的PBS缓冲液和 pH＝6.5的PBS缓冲液中配置一系列含不同浓度载药胶束(以其中DOX含量计)的PBS缓冲液，将游离DOX加入pH＝7.4的PBS缓冲液和pH＝6.5的PBS缓冲液中配置一系列含不同浓度DOX的PBS缓冲液，将步骤(3)得到的电荷翻转型聚合物胶束加入pH＝7.4的PBS缓冲液中配置一系列含不同浓度聚合物胶束的PBS缓冲液。将100μL含不同浓度载药胶束和游离 DOX的PBS缓冲液加入到100μL含人宫颈癌细胞(HeLa)的1640液体培养基中进行细胞毒性实验，同时将100μL含不同浓度聚合物胶束的PBS缓冲液加入到100μL含人宫颈癌细胞 (HeLa)的1640液体培养基中作为空白对照组，采用CCK8法对体外细胞毒性进行评价，分析结果如图14所示。
由载药胶束对HeLa细胞的存活率随浓度的变化曲线可知，随着浓度的增大，HeLa细胞的存活率在载药胶束和阿霉素的作用下逐渐下降,并且在pH6.5的环境条件下HeLa细胞的存活率更低。这是由于载药胶束在肿瘤细胞的酸性条件下发生电荷翻转并且在肿瘤细胞的还原条件下降解释放出药物分子进而杀死了癌细胞，说明其具备有效的抗癌活性，能达到治疗癌症的目的。而随着胶束浓度的增强，空白胶束保持着相当低的抑制率，未产生显著的细胞毒作用，具备良好的生物相容性。

Claims (10)

1.一种电荷翻转型聚合物胶束的制备方法，其特征在于该方法的工艺步骤如下：
将含保护基的碱性聚氨基酸和含保护基的酸性聚氨基酸溶解于溶剂I中，配置成溶质总浓度为0.01~0.05g/mL的混合溶液，再向混合溶液中加入引发剂和交联剂N,N'-双（丙烯酰）胱胺，之后在氮气保护下，于50~90℃下交联反应12~30h后去除溶剂Ⅰ，得到含有交联聚合物的反应液，再向其中加入沉淀剂进行沉淀至沉淀产物不再增加；所得沉淀产物即交联聚合物经抽滤、真空干燥后进行水解，使交联聚合物中碱性聚氨酸和酸性聚氨基酸分别脱去保护基，生成带正电聚氨基酸和带负电聚氨基酸交联构成的水解产物，将水解产物滴入去离子水中形成胶束溶液，所得胶束溶液经透析、冷冻干燥，即得到由带正电聚氨基酸和带负电聚氨基酸交联所构成的电荷翻转型聚合物胶束，
其中所述含保护基的碱性聚氨基酸和含保护基的酸性聚氨基酸摩尔比为1~4: 1，所述引发剂的用量为含保护基的碱性聚氨基酸和含保护基的酸性聚氨基酸总质量的3~5%，所述交联剂BACy的用量为含保护基的碱性聚氨基酸和含保护基的酸性聚氨基酸总质量的3~5%。
2.根据权利要求1所述电荷翻转型聚合物胶束的制备方法，其特征在于该方法中所述含保护基的碱性聚氨基酸是由如下方法制备：将含双官能团的开环聚合引发剂和含保护基的碱性氨基酸环内酸酐按摩尔比1: 20~70溶解于溶剂I中，配置成溶质总浓度为0.05~0.5g/mL的混合溶液，之后反应12~40h，再向反应产物中加入沉淀剂进行沉淀至沉淀产物不再增加，所得沉淀产物经抽滤后的滤饼经干燥即得到含保护基的碱性聚氨基酸；所述含保护基的碱性氨基酸环内酸酐为含保护基的赖氨酸环内酸酐、含保护基的精氨酸环内酸酐或含保护基的组氨酸环内酸酐。
3.根据权利要求1所述电荷翻转型聚合物胶束的制备方法，其特征在于该方法中所述含保护基的酸性聚氨基酸是由如下方法制备：将含双官能团的开环聚合引发剂和含保护基的酸性氨基酸环内酸酐按摩尔比1:15~65溶解于溶剂I中，配置成溶质总浓度为0.05~0.5g/mL的混合溶液，之后反应12~40h，再向反应产物中加入沉淀剂进行沉淀至沉淀产物不再增加，所得沉淀产物经抽滤后的滤饼经干燥即得到含保护基的酸性聚氨基酸；所述含保护基的酸性氨基酸环内酸酐为含保护基的谷氨酸环内酸酐或含保护基的天冬氨酸环内酸酐。
4.根据权利要求2或3所述电荷翻转型聚合物胶束的制备方法，其特征在于该方法中所述开环聚合引发剂为丙烯胺、乙烯胺、丁烯胺、3-甲基-2-丁烯胺、戊烯胺或氨基环戊烷。
5.根据权利要求1或2或3所述电荷翻转型聚合物胶束的制备方法，其特征在于该方法中所述含保护基的碱性聚氨基酸或含保护基的酸性聚氨基酸中的保护基为三苯甲基、叔丁氧羰基、芴甲氧羰基、苄氧羰基、烯丙氧羰基、芴甲基酯、叔丁酯、苄酯、烯丙酯和甲酯中的至少一种。
6.根据权利要求4所述电荷翻转型聚合物胶束的制备方法，其特征在于该方法中所述含保护基的碱性聚氨基酸或含保护基的酸性聚氨基酸中的保护基为三苯甲基、叔丁氧羰基、芴甲氧羰基、苄氧羰基、烯丙氧羰基、芴甲基酯、叔丁酯、苄酯、烯丙酯和甲酯中的至少一种。
7.根据权利要求1或2或3所述电荷翻转型聚合物胶束的制备方法，其特征在于该方法中所述溶剂I为二氯甲烷、去离子水、二甲基甲酰胺、四氢呋喃或二甲基亚砜中；所述引发剂为过氧化二苯甲酰、过氧化月桂酰、偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、偶氮二异丁酸二甲酯、过硫酸钾、过硫酸铵或偶氮二异丁基脒盐酸盐；所述沉淀剂为乙醚、甲醇、乙醇、四氢呋喃和去离子水中的至少一种。
8.一种由权利要求1至7中的任一项所述方法制备得到的电荷翻转型聚合物胶束。
9.一种电荷翻转型聚合物载药胶束的制备方法，其特征在于步骤如下：先将药物与权利要求8的电荷翻转型聚合物胶束按质量比1：10~50溶解于溶剂II中，配置成溶质总浓度为0.1~0.8g/mL的混合溶液，之后用碱性溶液调节混合溶液的pH至8~10，搅拌均匀后，将混合溶液滴入去离子水中形成胶束溶液，所得胶束溶液经透析、冷冻干燥，即得到电荷翻转型聚合物载药胶束。
10.一种由权利要求9所述方法制备得到的电荷翻转型聚合物载药胶束。
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