CN107556438B - 多重响应性交联聚合物及载药纳米胶束和它们的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及多重响应性交联聚合物及载药纳米胶束和它们的制备方法，具体是以N,N'‑双(丙烯酰)胱胺为交联剂，将包括苄酯类聚氨基酸衍生物基团、温度敏感基团交联所构成的多重响应性交联聚合物，将该多重响应性交联聚合物溶解后，与抗肿瘤药物通过腙键连接，再滴加入去离子水中形成胶束，经过透析、冷冻干燥，得多重响应性交联聚合物载药纳米胶束。本发明多重响应性交联聚合物及载药纳米胶束具有结构稳定，药物的负载稳定性好，载药率高，肿瘤细胞微环境响应效率高的特点。

Description

多重响应性交联聚合物及载药纳米胶束和它们的制备方法

技术领域

本发明属于载药体及其制备技术领域，具体涉及多重响应性交联聚合物及载药纳米胶束和它们的制备方法，特别涉及具有还原响应性、pH响应性以及温度敏感性的交联聚合物，及其作为肿瘤细胞微环境靶向功能的载药纳米胶束和它们的制备方法。

背景技术

聚合物纳米胶束是由两亲性聚合物在水溶液中自组装形成的具有疏水性内核和亲水性外壳的纳米粒子，粒径一般为10～200nm。其中，疏水性的内核能够有效包载药物分子，而亲水性的壳层可使胶束在水溶液中稳定分散。由于聚合物纳米胶束具有水溶性好以及对肿瘤组织的高通透性和滞留效应(EPR)，使其具有良好的生物相容性并能有效提高药物递送效率，近年来其作为药物载体的研究已受到广泛关注。然而，随着对聚合物纳米胶束的深入研究，发现在实现药物传递过程中其功能上还存在以下一些缺陷，从而制约了其大规模的实际应用。

一、体内循环稳定性不佳。传统的聚合物胶束通常利用线性聚合物制备而成，虽然具有方法简单，纳米粒子结构清楚等优点，但其在体内循环时稳定性较差。当胶束进入到人体后，容易受到体液稀释、温度、离子浓度、pH值和血液中生物分子等因素的影响，使胶束结构发生崩解，出现药物提前释放和肿瘤靶向效率降低等现象，不能达到体内长循环稳定性的要求(Ren T,Xia W,Dong H,Li Y.Sheddable micelles based on disulfide-linkedhybrid PEG-polypeptide copolymer for intracellular drugdelivery.Polymer.2011,20(52):3580-3586)。

二、载药稳定性低。传统聚合物胶束一般采用透析技术，利用聚合物与药物分子之间的亲疏水性、氢键等弱作用力来包埋药物，从而制备聚合物载药胶束。尽管该技术方法简便，同时可获得较大的载药效率，但是，该技术所制备的载药胶束中药物与聚合物之间的相互作用力较弱，药物的负载稳定性较差，药物常常会在体液循环中于正常组织处提前释放，对正常组织产生较大的毒副作用(Liu F,Kozlovskaya V,Medipelli S,etal.Temperature-sensitive polymersomes for controlled delivery of anticancerdrugs[J].Chemistry of Materials,2015,27(23):7945-7956)。

三、细胞微环境下响应性不足。研究发现，肿瘤细胞与正常细胞具有不同的内部微环境条件，如温度、pH以及GSH含量等。由于传统上所制备的聚合物载药胶束无环境响应性或仅具备单一响应性，不能对肿瘤细胞内部特殊微环境的刺激进行充分应答，导致载药胶束在细胞内不能高效可控释药，从而导致药物递送效率偏低，影响了抗肿瘤治疗效果(Li LD,Shang L,Chen K L,Wang Q Y,Luo J B,Zhou Q H,Lin J.Redox-Sensitive CoreCross-Linked Polyethylene Glycol-Polypeptide Hybrid Micelles for AnticancerDrug Delivery.J Nanosci Nanotechno,2017,17:4532-4541)。

美国文献(Wang Y,Nie J,Chang B,et al.Poly(Vinylcaprolactam)-BasedBiodegradable Multiresponsive Microgels for Drug Delivery[J].Biomacromolecules,2013,14:3034-3046.)中，Wang等以N,N'-双(丙烯酰)胱胺(BACy)为交联剂制备合成了生物相容的多响应性核交联胶束P(VCL-s-s-MAA-3)-PEG，在还原剂谷胱甘肽(GSH)或二硫苏糖醇(DTT)的存在下，该胶束中二硫键断裂形成单独的线性聚合物链，实现药物的特异性释放。但其技术方案中仍存在以下缺点：1、在无外界环境刺激下，其释药率就可达到26％，导致在患者体内循环稳定性不佳，提前释药会对患者的正常组织产生较大的毒副作用；2、其载药率偏低，仅为13.8％，从而导致所合成的药物纯度偏低而影响治疗癌症的效果。

发明内容

本发明的目的是针对背景技术中现有聚合物纳米胶束存在的缺陷，提供一种多重响应性交联聚合物，该交联聚合物是以N,N'-双(丙烯酰)胱胺(BACy)为交联剂制备合成的具有还原响应性、pH响应性以及温度敏感性的含聚氨基酸衍生物基团多重响应性交联聚合物，该交联聚合物具有结构稳定，药物的负载稳定性好，载药率高，肿瘤细胞微环境响应效率高的特点。

本发明的另一目的是提供上述多重响应性交联聚合物的制备方法。

本发明的又一目的是提供一种多重响应性交联聚合物载药纳米胶束。

本发明的再一目的是提供上述多重响应性交联聚合物载药纳米胶束的制备方法。

本发明提供的一种多重响应性交联聚合物，该交联聚合物是以N,N'-双(丙烯酰)胱胺(BACy)为交联剂，将包括苄酯类聚氨基酸衍生物基团、温度敏感性基团交联所构成的交联聚合物。

一种多重响应性交联聚合物载药纳米胶束，是以N,N'-双(丙烯酰)胱胺(BACy)为交联剂，将包括苄酯类聚氨基酸衍生物基团、温度敏感性基团交联所构成的交联聚合物，将该交联聚合物溶解后，与抗肿瘤药物通过腙键连接，再滴加入去离子水中形成胶束，经过透析、冷冻干燥，即得多重响应性交联聚合物载药纳米胶束。

上述苄酯类聚氨基酸衍生物基团为乙烯基聚氨基酸苄酯基团，具体为乙烯基聚谷氨酸苄酯基团、乙烯基聚赖氨酸苄酯基团、乙烯基聚酪氨酸苄酯基团、乙烯基聚甘氨酸苄酯基团、乙烯基聚丝氨酸苄酯基团、乙烯基聚色氨酸苄酯基团、乙烯基聚天冬氨酸苄酯基团和乙烯基聚组氨酸苄酯基团中的任一种。

上述温度敏感性基团为N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)基团、聚乙烯基己内酰胺(PVCL)基团和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)基团中的任一种。

上述抗肿瘤药物为盐酸阿霉素(DOX)、紫杉醇和喜树碱中的任一种。

上述透析为截留分子量范围为12000-14000的聚合物载药纳米胶束溶液，通常地，是通过截留分子量为12000-14000的透析袋来实现。

本发明提供的上述多重响应性交联聚合物的制备方法，该方法的工艺步骤和条件如下：

将聚氨基酸苄酯和温度敏感性化合物按摩尔比1：(1～200)溶解于溶剂Ⅰ中，配置成0.01～0.05g/mL的混合溶液，再加入以聚氨基酸苄酯与温度敏感性化合物的总质量计3～5％的引发剂和3～5％的N,N'-双(丙烯酰)胱胺交联剂，然后在氮气保护下，于50～100℃下反应5～24h，去除溶剂，再加入沉淀剂进行沉淀后分离出沉淀物，沉淀物于40～80℃下真空干燥至少24h，得到多重响应性交联聚合物。

本发明提供的上述多重响应性交联聚合物载药纳米胶束的制备方法，该方法的工艺步骤和条件如下：

将多重响应性交联聚合物与无水肼按质量比为(1～50)：1配料，溶解在溶剂Ⅱ中配置成浓度为0.01～0.06g/mL的混合胶束溶液，反应至少24h，然后将抗肿瘤药物与该混合胶束溶液以质量比1：(10～50)混合溶解于溶剂Ⅱ中，以抗肿瘤药物与该混合胶束溶液计配置为0.01～0.08g/mL浓度的混合载药胶束溶液，再将该混合载药胶束溶液进行透析，透析后的胶束溶液于-60～-80℃、气压不高于10Pa条件下冷冻干燥至少48h，即得多重响应性交联聚合物载药纳米胶束。

通常地，制备多重响应性交联聚合物中所述聚氨基酸苄酯为市售产品或按照现有技术制备，为了更好的说明本发明，本发明所述的聚氨基酸苄酯也可以替换为以下工艺条件所制备：

将氨基酸苄酯类化合物与三光气按质量比(1～5)：1配料溶解于乙酸乙酯中，配置成0.04～0.07g/mL的混合溶液，并于50～100℃下反应1～8h，反应产物依次用去离子水和pH 7～8的碱液分别洗涤，再依次经抽滤、旋蒸浓缩、重结晶处理，然后于不高于-20℃温度环境下冷冻至少16h，最后依次抽滤、真空干燥，得到氨基酸苄酯环内酸酐；

将含双官能团的开环聚合引发剂与氨基酸苄酯环内酸酐以摩尔比1：(10～80)配比混合溶解于溶剂Ⅰ中，配置成0.03～0.52g/mL的混合溶液，于10～50℃温度下反应10～48h，再加入沉淀剂进行沉淀并抽滤，滤饼于40～80℃下干燥至少24h，得到聚氨基酸苄酯。

其中氨基酸苄酯类化合物为谷氨酸苄酯、赖氨酸苄酯、酪氨酸苄酯、甘氨酸苄酯、丝氨酸苄酯、色氨酸苄酯、天冬氨酸苄酯或组氨酸苄酯；碱液为弱碱性溶液，优选碳酸氢钠；含双官能团的开环聚合引发剂为丙烯胺、乙烯胺、丁烯胺、3-甲基-2-丁烯胺、戊烯胺或氨基环戊烷。

制备多重响应性交联聚合物中所述温度敏感性化合物为N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、聚乙烯基己内酰胺(PVCL)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

制备多重响应性交联聚合物中所述N,N'-双(丙烯酰)胱胺(BACy)是参考(Shou CH,Wei D H,Jian L,et al.Reducible Polyethylenimine Hydrogels with DisulfideCrosslinkers Prepared by Michael Addition Chemistryas Drug Delivery Carriers:Synthesis,Properties,and In Vitro Release[J].J.Poly.Sci.:Part A:Poly.Sci..2009,4:4074-4075.)所公开的方法制备的。

制备多重响应性交联聚合物中所述的溶剂Ⅰ为二氯甲烷、去离子水、二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)或二甲基亚砜(DMSO)。

制备多重响应性交联聚合物中所述引发剂为过氧化苯甲酰、过氧化月桂酰、偶氮二异丁氰、偶氮二异庚腈、偶氮二异丁酸二甲酯、过硫酸钾、过硫酸铵或偶氮二异丁基脒盐酸盐。

制备多重响应性交联聚合物中所述沉淀剂为乙醚、甲醇、乙醇、四氢呋喃和去离子水中的一种或多种混合。

制备多重响应性交联聚合物载药纳米胶束中所述的溶剂Ⅱ为四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)。

制备多重响应性交联聚合物载药纳米胶束中所述的透析为截留分子量范围为12000-14000的聚合物载药纳米胶束溶液，通常地，是通过截留分子量为12000-14000的透析袋来实现的，且所述透析后的溶液于不高于-20℃、气压10Pa条件下冷冻干燥至少48h，是通过冻干机实现的。

制备多重响应性交联聚合物载药纳米胶束方法中所述的抗肿瘤药物为盐酸阿霉素(DOX)、紫杉醇和喜树碱中的任一种。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

(1)由于本发明提供的制备方法是采用交联聚合技术，使所制得的交联聚合物具有三维网状结构，各组分之间由化学键联接，具有良好的稳定性，因而不仅克服了线性胶束在体液稀释、温度、离子浓度、pH值等影响因素下易崩解，稳定性差，药物传递效率低的问题，而且载药后，还避免了因在患者体内循环稳定性不佳，所造成提前释药对患者的正常组织产生较大毒副作用问题。

(2)由于本发明在制备多重响应性交联聚合物载药纳米胶束的技术方案中，采用了聚氨基酸苄酯肼解反应技术，因此载药方式是在聚氨基酸苄酯基团上通过腙键接载药物，从而使聚合物胶束与药物分子形成稳定的腙键共价键连接，进一步提高了载药稳定性，克服了传统载药胶束中药物与聚合物之间的相互作用力弱，从而导致的药物提前释放以及毒副作用大等问题。同时相较传统载药胶束提高了载药率，可达到44.74％，且在人体正常生理条件下释药率仅1.12％，细胞毒性小，明显优于同类产品，还具有可准确定量接载药物的特点。

(3)由于本发明在制备多重响应性交联聚合物的技术方案中，以肿瘤细胞内部微环境条件为参考，将符合上述刺激条件的可还原基团、温度敏感性基团以及pH响应基团同时键连于聚合物纳米胶束中，使聚合物纳米胶束同时具有还原敏感性、温度响应性以及pH响应性，以其作为载药体所制备的载药纳米胶束可在刺激条件下使释药率达91.78％，高于同类产品。

(4)本发明提供的制备方法简单，条件温和，可控性强，易于操作，便于推广应用。

附图说明

图1为本发明实施例4用谷氨酸苄酯与三光气反应所制备的谷氨酸苄酯环内酸酐(BLG-NCA)的核磁(NMR)谱图，图中δ(ppm)：7.2-7.4(a：双重峰，苯环)，δ(ppm)：6.4(e：单峰，环内氨基)，δ(ppm)：5.1(b：单峰，苄基)，δ(ppm)：4.4(f：三重峰，α-亚甲基)，δ(ppm)：2.6(c：三重峰，γ-亚甲基)，δ(ppm)：2.1-2.2(d：多重峰，β-亚甲基的氢)。从图中可以看出，苯环、环内胺基、苄基等基团上的氢均可找到相对应的峰，因此表明所制备的谷氨酸苄酯环内酸酐与预期一致。

图2为本发明实施例4中用谷氨酸苄酯环内酸酐与丙烯胺反应所制备的乙烯基聚谷氨酸苄酯(PBLG)的红外(IR)谱图。由图可见，胺基(3446cm^-1)，亚甲基(2979cm^-1)，羰基(1650cm^-1)，醚键(3446cm^-1)等特征吸收峰，因此可表明所制备的聚谷氨酸苄酯与预期一致。

图3为本发明实施例4中所制备的乙烯基聚谷氨酸苄酯的核磁谱图，其中δ(ppm)：7.1-7.4(a：双重峰，苯环)，δ(ppm)：5.1(b：单峰，苄基)，δ(ppm)：2.0-2.6(c、d：α-亚甲基及γ-亚甲基)，δ(ppm)：5.2-5.3(f：乙烯基)，δ(ppm)：8.0(g：环内氨基)。由图可以看出，乙烯基聚谷氨酸苄酯上的苯环，胺基，苄基及乙烯基都能够找到相对应的峰，说明已成功制备出乙烯基聚谷氨酸苄酯。

图4为本发明实施例4中参照文献用胱胺盐酸盐与丙烯酰氯反应制得交联剂(BACy)的红外(IR)谱图，3266cm-1为N-H的伸缩振动吸收峰，1560.13cm-1为C＝O的伸缩振动吸收峰，1049.71cm-1为C-N的伸缩振动吸收峰，698.10cm-1为-C-S-的伸缩振动吸收峰。因此表明所制备的交联剂与预期一致。

图5为本发明实施例4所利用的交联剂(BACy)的核磁谱图，其中δ＝6.5-6.7对应于N-H，δ＝6.2-6.4对应于乙烯基上的氢，δ＝3.6-3.8为二硫键旁α-碳原子上的氢，δ＝2.7-2.9为二硫键旁β-碳原子上的氢。结果表明，成功制备含二硫键的交联剂。

图6为本发明实施例4制备的交联聚合物纳米胶束的透射电镜照片。从照片可见，胶束呈球形结构，且分散稳定性良好，聚合物胶束的平均粒径在70nm左右，符合载药胶束粒径为20～200nm的要求。

图7为本发明实施例4制备的交联聚合物纳米胶束的动态光散射(DLS)谱图。从图可见，在PBS(pH 7.4)未加入GSH的条件下，胶束的粒径为100nm左右。DLS实验测出的粒径数值大于TEM测出的粒径，是由于TEM实验过程中，胶束滴于铜网上，在干燥条件下进行实验，而胶束干燥过程中发生收缩，从而导致其粒径减小。

图8为本发明实施例4制备的交联聚合物纳米胶束在10mM GSH作用下降解的动态光散射(DLS)谱图。由图可知，没加GSH时胶束粒径为100nm左右，粒径没有变化，比较稳定，加入GSH后粒径增大，这是因为GSH的作用，使得胶束中二硫键断裂，胶束发生溶胀，粒径增大。这一现象说明制备的胶束具有还原响应性。

图9为本发明实施例4制备的交联聚合物纳米胶束在10mM GSH作用下所得的浊度图。从图可见，胶束在加入GSH后开始降解，浊度随时间增加而减小，这一现象也说明胶束具有还原响应性。

图10为本发明实施例4所制得的交联聚合物载药纳米胶束溶液利用紫外可见分光光度计于500nm波长处测量的透光率谱图与溶解度照片。实验测得胶束的LCST为39.4℃。同时，从溶解度照片中可以看出，当温度低于LCST时，纳米胶束可溶于水，形成透明溶液；而当温度高于LCST后，氢键被破坏，并从水中析出，溶液出现浑浊。实验测得的胶束有较高的LCST，其原因是纳米胶束核壳结构中氨基酸组分的存在，其酰胺键结构增强了纳米胶束与水分子间的氢键作用，这也更有利于胶束在人体正常温度下的循环稳定性和药物的传递。

图11为本发明实施例4所制得的交联聚合物纳米胶束随温度变化的粒径变化曲线图。由图可知，当将温度从25℃升高至45℃时，聚合物胶束的粒径从220nm下降至168nm，同时，当将温度由45℃冷却至25℃时，聚合物胶束的粒径从170nm增大至221nm，表明了胶束随温度变化的可逆性。结果说明聚合物胶束可在高温下发生收缩，证明了其具备温敏性。

图12为本发明实施例4所制得的交联聚合物载药纳米胶束在不同酸碱度下的吸光度实验表征图。由图可知，当将pH值从7.4减小到0.4时，载药胶束的吸光度值从0.2261增加到0.9199，显而易见，载药胶束在pH小于7.4时，腙键发生了断裂，致使药物释放。因此证明了该载药胶束具备pH响应性。

图13为用本发明实施例4制备的交联聚合物载药纳米胶束的药物释放图。图中可看出，游离DOX在5小时内快速释放，其累积释放率达95.04％。当载药胶束磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中，37℃条件下，24h的累积释放率仅为1.12％；在GSH 10mM(pH＝7.4)条件下，其24h累积释放率为43.78％；在pH 5.0条件下，其24h累积释放率为68.65％；在37℃，GSH 10mM(pH＝5.0)条件下，其释放率为86％。然而，42℃条件下，其24h累积释放率最高可达91.78％。综上所述，聚合物胶束在无刺激条件下仅存在微量的药物释放，表明其具有优异的药物稳定性。并且在还原、pH和温度条件刺激下，载药胶束的累积释放率显著增大，表明聚合物胶束具有多重敏感性。

图14为用本发明实施例4制备的交联聚合物载药纳米胶束进行HUVEC人脐静脉内皮细胞的毒性实验的细胞活性柱状图，由图可知，随着浓度的增加，细胞存活率均保持在95％以上，证明了该聚合物胶束对于正常细胞几乎无毒性，故具有良好的生物相容性。

图15为用本发明实施例4制备的交联聚合物载药纳米胶束以人宫颈癌HeLa细胞为模型，采用CCK8法对胶束的体外细胞毒性进行评价的细胞活性线图。由载药聚合物胶束对HeLa细胞的存活率随阿霉素浓度的变化曲线可知，随着浓度的增大，HeLa细胞的存活率在载药胶束和阿霉素的作用下逐渐下降。这是由于载药胶束在肿瘤细胞的酸性还原条件下发生降解释放出药物分子进而杀死了癌细胞，说明其具备有效的抗癌活性，能达到治疗癌症的目的。而随着胶束浓度的增强，空白胶束保持着相当低的抑制率，未产生显著的细胞毒作用，具备良好的生物相容性。

具体实施方式

下面给出实施例以对本发明作进一步说明。有必要在此指出的是以下实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，如果该领域的技术熟练人员根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整，仍属于本发明保护范围。

值得说明的是：(1)以下实施例红外表征所用傅里叶转换红外光谱仪(FTIR)：Thermo公司，Nicolet is50型号测试的，用KBr磨成粉，压片，测试范围400～4000cm^-1。(2)核磁表征所用核磁共振谱仪(NMR)：BRUKER-400MHz，以TMS为内标，氘代氯仿(CDCl₃)为溶剂。(3)动态光散射(DLS)：Nano-zs90，测量温度25℃。紫外可见光光度计(UV-Vis)：TU1950，测量波长为480nm。扫描透射电子显微镜(TEM)：日立H-600，加速电压为75kv，胶束浓度2mg/mL。

(4)所用交联剂为N,N'-双(丙烯酰)胱胺(BACy)交联剂，是参考Shou C H,Wei DH,Jian L,et al.Reducible Polyethylenimine Hydrogels with DisulfideCrosslinkers Prepared by Michael Addition Chemistryas Drug Delivery Carriers:Synthesis,Properties,and In Vitro Release[J].J.Poly.Sci.:Part A:Poly.Sci..2009,4:4074-4075.所公开的方法制备的，具体为将胱胺二盐酸盐与丙烯酰氯以摩尔比1:2混合溶于碱性溶液中配置成0.15g/mL的溶液，在室温下反应3h，用二氯甲烷进行萃取，然后无水硫酸镁干燥，过滤，用正己烷和乙酸乙酯做洗脱剂进行纯化，在25℃真空度0.010MPa下干燥12h，即得N,N'-双(丙烯酰)胱胺交联剂，洗脱剂为甲醇和二氯甲烷或乙酸乙酯和石油醚。(5)为了更好的对实施例产品进行表征测试，即为了对载药前的多重响应性交联聚合物进行测试，例如图6、7、8、9、11所进行的表征测试，实施例中在合成出多重响应性交联聚合物后，将多重响应性交联聚合物加入溶剂Ⅱ中搅拌溶解，配置成0.0005～0.001g/mL的溶液，再于1～3小时内滴加到去离子水中，以形成胶束溶液，然后将胶束溶液进行透析至少2天，透析后的胶束溶液于不高于-20℃环境下冷冻至少8h，再于-60～-80℃气压不高于10Pa条件下冷冻干燥至少48h，即得多重响应性交联聚合物纳米胶束

实施例1

将谷氨酸苄酯与三光气按质量比1：1以0.04g/mL溶解于乙酸乙酯中，然后在反应器中于75℃下反应2h，依次用水和碳酸氢钠溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤后旋蒸至原体积的三分之一，在正己烷中结晶，再将产物置于-20℃下冷冻24h，抽滤，在25℃、真空度0.010MPa下干燥24h即可。

将丙烯胺与所得谷氨酸苄酯环内酸酐以摩尔比1:40配比溶解于THF中配置成0.25g/mL的溶液，于25℃下反应24h，再利用冰乙醚进行沉淀、抽滤，并在60℃下干燥24h，得到聚谷氨酸苄酯；

将聚谷氨酸苄酯与N-异丙基丙烯酰胺以摩尔比1:1混合，溶解于DMF中配置为0.01g/mL的混合溶液，分别加入聚谷氨酸苄酯与N-异丙基丙烯酰胺总质量4％的交联剂和3％的引发剂偶氮二异丁氰，在氮气保护下于75℃反应12h，旋蒸出溶剂，用乙醚作为沉淀剂，抽滤，将产物在60℃真空度0.010MPa下干燥24h，得到多重响应性交联聚合物。

将多重响应性交联聚合物与无水肼按质量比为1：1在DMF中配置成浓度为0.01g/mL的混合胶束溶液，反应24h，然后将阿霉素与以上所制备的混合胶束溶液以质量比1:10在DMF中配置成浓度为0.01g/mL的混合载药胶束溶液，再将该混合载药胶束溶液放入去离子水中进行透析，透析后的胶束溶液在-60℃、气压10Pa下冷冻干燥48h，即得多重响应性交联聚合物载药纳米胶束。

实施例2

将谷氨酸苄酯与三光气按质量比2：1以0.05g/mL溶解于乙酸乙酯中，然后在反应器中于50℃下反应8h，依次用水和碳酸氢钠溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤后旋蒸至原体积的三分之一，在正己烷中结晶，再将产物置于-20℃下冷冻24h，抽滤，在25℃、真空度0.012MPa下干燥24h即可。

将丙烯胺与谷氨酸苄酯环内酸酐以摩尔比1:50配比混合溶解于二氯甲烷中配置成0.52g/mL的溶液，在反应器中于10℃下反应36h，然后用冰乙醚进行沉淀、抽滤、并在60℃下干燥24h，得到聚谷氨酸苄酯。

将聚谷氨酸苄酯与N-异丙基丙烯酰胺按摩尔比1:50混合，溶解于DMF中配置为0.02g/mL的混合溶液，分别加入聚谷氨酸苄酯与N-异丙基丙烯酰胺总质量3％的交联剂和3％的引发剂偶氮二异丁氰，在氮气保护下于80℃反应18h，旋蒸出溶剂，用1:8的四氢呋喃和乙醚的混合液沉淀产品，抽滤，将产物在60℃真空度0.010MPa下干燥24h，得到多重响应性交联聚合物。

将多重响应性交联聚合物与无水肼按质量比为20：1在THF中配置成浓度为0.02g/mL的混合胶束溶液，反应24h，然后将阿霉素与以上所制备的混合胶束溶液以质量比1:20在THF中配置成浓度为0.03g/mL的混合载药胶束溶液，再将该混合载药胶束溶液放入去离子水中进行透析，透析后的胶束溶液在-60℃、气压10Pa下冷冻干燥48h，即得多重响应性交联聚合物载药纳米胶束。

实施例3

将谷氨酸苄酯与三光气按质量比3：1以0.05g/mL溶解于乙酸乙酯中，然后在反应器中于85℃下反应3h，依次用水和碳酸氢钠溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤后旋蒸至原体积的三分之一，在正己烷中结晶，再将产物置于-20℃下冷冻24h，抽滤，在25℃、真空度0.014MPa下干燥16h即可。

将丙烯胺与谷氨酸环内酸酐按摩尔比1:60混合溶解于DMSO中配置成0.30g/mL的溶液，于50℃下反应48h，再利用冰乙醚进行沉淀、抽滤，并在60℃下干燥24h，得到聚谷氨酸苄酯。

将聚谷氨酸苄酯与N-异丙基丙烯酰胺以摩尔比1:20混合，溶解于DMSO中配置为0.05g/mL的混合溶液，分别加入聚谷氨酸苄酯与N-异丙基丙烯酰胺总质量5％的交联剂和5％的引发剂偶氮二异丁氰，在氮气保护下于100℃反应5h，旋蒸出溶剂，用1:9的四氢呋喃和乙醚的混合液进行沉淀，抽滤，将产物在60℃真空度0.014MPa下干燥24h，得到多重响应性交联聚合物。

将多重响应性交联聚合物与无水肼按质量比为50：1在DMSO中配置成浓度为0.06g/mL的混合胶束溶液，反应24h，然后将阿霉素与以上所制备的混合胶束溶液以质量比1:50在DMSO中配置成浓度为0.08g/mL的混合载药胶束溶液，再将该混合载药胶束溶液放入去离子水中进行透析，透析后的胶束溶液在-60℃、气压10Pa下冷冻干燥48h，即得多重响应性交联聚合物载药纳米胶束。

实施例4

将谷氨酸苄酯与三光气按质量比5：1以0.07g/mL混合溶解于乙酸乙酯中，然后在反应器中于100℃下反应5h，依次用水和碳酸氢钠溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤后旋蒸至原体积的三分之一，在正己烷中结晶，再将产物置于-20℃下冷冻24h，抽滤，在25℃、真空度0.016MPa下干燥20h即可。

将丙烯胺与谷氨酸环内酸酐按摩尔比1:80配比混合溶解于去离子水中配置成0.03g/mL的溶液，于40℃下反应10h，再利用冰乙醚进行沉淀、抽滤，并在60℃下干燥24h，得到聚谷氨酸苄酯。

将聚谷氨酸苄酯与N-异丙基丙烯酰胺以摩尔比1:100混合，溶解于THF中配置为0.03g/mL的混合溶液，分别加入聚谷氨酸苄酯与N-异丙基丙烯酰胺总质量4％的交联剂和4％的引发剂偶氮二异丁氰，在氮气保护下于50℃反应24h，旋蒸出溶剂，用1:10的四氢呋喃和乙醚的混合液进行沉淀，抽滤，将产物在60℃真空度0.016MPa下干燥24h，得到多重响应性交联聚合物。

将多重响应性交联聚合物与无水肼按质量比为40：1在THF中配置成浓度为0.05g/mL的混合胶束溶液，反应24h，然后将阿霉素与以上所制备的混合胶束溶液以质量比1:40在THF中配置成浓度为0.04g/mL的混合载药胶束溶液，再将该混合载药胶束溶液放入去离子水中进行透析，透析后的胶束溶液在-60℃、气压10Pa下冷冻干燥48h，即得多重响应性交联聚合物载药纳米胶束。

实施例5

将谷氨酸苄酯与三光气按质量比4：1以0.06g/mL溶解于乙酸乙酯中，然后在反应器中于95℃下反应1h，依次用水和碳酸氢钠溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤后旋蒸至原体积的三分之一，在正己烷中结晶，再将产物置于-20℃下冷冻24h，抽滤，在60℃、真空度0.018MPa下干燥24h即可。

将丙烯胺与谷氨酸环内酸酐按摩尔比1:10配比溶解于DMF中配置成0.03g/mL的溶液，于25℃下反应24h，再利用冰乙醚进行沉淀、抽滤，并在60℃下干燥24h，得到聚谷氨酸苄酯。

将聚谷氨酸苄酯与N-异丙基丙烯酰胺以摩尔比1:170混合，溶解于DMF中配置为0.04g/mL的混合溶液，分别加入聚谷氨酸苄酯与N-异丙基丙烯酰胺总质量3％的交联剂和5％的引发剂偶氮二异丁氰，在氮气保护下于95℃反应12h，旋蒸出溶剂，用1:11的四氢呋喃和乙醚的混合液进行沉淀，抽滤，将产物在60℃真空度0.018MPa下干燥24h，得到多重响应性交联聚合物。

将多重响应性交联聚合物与无水肼按质量比为30：1在DMF中配置成浓度为0.03g/mL的混合胶束溶液，反应24h，然后将阿霉素与以上所制备的混合胶束溶液以质量比1:30在DMF中配置成浓度为0.05g/mL的混合载药胶束溶液，再将该混合载药胶束溶液放入去离子水中进行透析，透析后的胶束溶液在-60℃、气压10Pa下冷冻干燥48h，即得多重响应性交联聚合物载药纳米胶束。

实施例6

将赖氨酸苄酯与三光气按质量比5：1以0.06g/mL混合溶解于乙酸乙酯中，然后在反应器中于75℃下反应2h，依次用水和碳酸氢钠溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤后旋蒸至原体积的三分之一，在正己烷中结晶，再将产物置于-20℃下冷冻24h，抽滤，在25℃、真空度0.010MPa下干燥24h即可。

将丙烯胺与所得赖氨酸苄酯环内酸酐以摩尔比1:40配比溶解于二氯甲烷中配置成0.15g/mL的溶液，于25℃下反应24h，再利用冰乙醚进行沉淀、抽滤，并在60℃下干燥24h，得到聚赖氨酸苄酯；

将聚赖氨酸苄酯与N-异丙基丙烯酰胺以摩尔比1:200混合，溶解于DMF中配置为0.01g/mL的混合溶液，分别加入聚赖氨酸苄酯与N-异丙基丙烯酰胺总质量4％的交联剂和3％的引发剂偶氮二异丁氰，在氮气保护下于75℃反应12h，旋蒸出溶剂，用乙醚作为沉淀剂，抽滤，将产物在60℃真空度0.010MPa下干燥24h，得到多重响应性交联聚合物。

将多重响应性交联聚合物与无水肼按质量比为40：1在DMSO中配置成浓度为0.05g/mL的混合胶束溶液，反应24h，然后将阿霉素与以上所制备的混合胶束溶液以质量比1:35在THF中配置成浓度为0.07g/mL的混合载药胶束溶液，再将该混合载药胶束溶液放入去离子水中进行透析，透析后的胶束溶液在-60℃、气压10Pa下冷冻干燥48h，即得多重响应性交联聚合物载药纳米胶束。

实施例7

将谷氨酸苄酯与三光气按质量比1：1以0.07g/mL溶解于乙酸乙酯中，然后在反应器中于50℃下反应8h，依次用水和碳酸氢钠溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤后旋蒸至原体积的三分之一，在正己烷中结晶，再将产物置于-20℃下冷冻24h，抽滤，在25℃、真空度0.012MPa下干燥24h即可。

将丙烯胺与谷氨酸苄酯环内酸酐按摩尔比1:50混合溶解于DMF中配置成0.40g/mL的溶液，在反应器中于10℃下反应36h，然后用冰乙醚进行沉淀、抽滤、并在60℃下干燥24h，得到聚谷氨酸苄酯。

将聚谷氨酸苄酯与N-异丙基丙烯酰胺以摩尔比1:150混合，溶解于DMF中配置为0.02g/mL的混合溶液，分别加入聚谷氨酸苄酯与N-异丙基丙烯酰胺总质量3％的交联剂和3％的引发剂过氧化苯甲酰，在氮气保护下于80℃反应18h，旋蒸出溶剂，用甲醇沉淀产品，抽滤，将产物在60℃真空度0.010MPa下干燥24h，得到多重响应性交联聚合物。

将多重响应性交联聚合物与无水肼按质量比为10：1在THF中配置成浓度为0.04g/mL的混合胶束溶液，反应24h，然后将阿霉素与以上所制备的混合胶束溶液以质量比1:25在THF中配置成浓度为0.02g/mL的混合载药胶束溶液，再将该混合载药胶束溶液放入去离子水中进行透析，透析后的胶束溶液在-60℃、气压10Pa下冷冻干燥48h，即得多重响应性交联聚合物载药纳米胶束。

Claims (9)

1.一种多重响应性交联聚合物，其特征在于该交联聚合物制备方法是将氨基酸苄酯类化合物与三光气按质量比(1～5)：1配料溶解于乙酸乙酯中，配置成0.04～0.07g/mL的混合溶液，并于50～100℃下反应1～8h，反应产物依次用去离子水和pH 7～8的碱液分别洗涤，再依次经抽滤、旋蒸浓缩、重结晶处理，然后于不高于20℃温度环境下冷冻至少16h，最后依次抽滤、真空干燥，得到氨基酸苄酯环内酸酐；

将含双官能团的开环聚合引发剂与氨基酸苄酯环内酸酐以摩尔比1：(10～80)配比混合溶解于溶剂I中，配置成0.03～0.52g/mL的混合溶液，于10～50℃温度下反应10～48h，再加入沉淀剂进行沉淀并抽滤，滤饼于40～80℃下干燥至少24h，得到聚氨基酸苄酯，

其中，氨基酸苄酯类化合物为谷氨酸苄酯、赖氨酸苄酯、酪氨酸苄酯、甘氨酸苄酯、丝氨酸苄酯、色氨酸苄酯、天冬氨酸苄酯或组氨酸苄酯；碱液为弱碱性溶液；含双官能团的开环聚合引发剂为丙烯胺、乙烯胺、丁烯胺、3-甲基-2-丁烯胺、戊烯胺，

聚氨基酸苄酯和温度敏感性化合物按摩尔比1：(1～200)溶解于溶剂Ⅰ中，配置成0.01～0.05g/mL的混合溶液，再加入以聚氨基酸苄酯与温度敏感性化合物的总质量计3～5％的引发剂和3～5％的N,N'-双(丙烯酰)胱胺交联剂，然后在氮气保护下，于50～100℃下反应5～24h，去除溶剂，再加入沉淀剂进行沉淀后分离出沉淀物，沉淀物于40～80℃下真空干燥至少24h，得到多重响应性交联聚合物，其中温度敏感性化合物为N-异丙基丙烯酰胺。

2.一种多重响应性交联聚合物载药纳米胶束，其制备方法是将氨基酸苄酯类化合物与三光气按质量比(1～5)：1配料溶解于乙酸乙酯中，配置成0.04～0.07g/mL的混合溶液，并于50～100℃下反应1～8h，反应产物依次用去离子水和pH 7～8的碱液分别洗涤，再依次经抽滤、旋蒸浓缩、重结晶处理，然后于不高于20℃温度环境下冷冻至少16h，最后依次抽滤、真空干燥，得到氨基酸苄酯环内酸酐；

将含双官能团的开环聚合引发剂与氨基酸苄酯环内酸酐以摩尔比1：(10～80)配比混合溶解于溶剂I中，配置成0.03～0.52g/mL的混合溶液，于10～50℃温度下反应10～48h，再加入沉淀剂进行沉淀并抽滤，滤饼于40～80℃下干燥至少24h，得到聚氨基酸苄酯，

其中，氨基酸苄酯类化合物为谷氨酸苄酯、赖氨酸苄酯、酪氨酸苄酯、甘氨酸苄酯、丝氨酸苄酯、色氨酸苄酯、天冬氨酸苄酯或组氨酸苄酯；碱液为弱碱性溶液；含双官能团的开环聚合引发剂为丙烯胺、乙烯胺、丁烯胺、3-甲基-2-丁烯胺、戊烯胺，

聚氨基酸苄酯和温度敏感性化合物按摩尔比1：(1～200)溶解于溶剂Ⅰ中，配置成0.01～0.05g/mL的混合溶液，再加入以聚氨基酸苄酯和温度敏感性化合物的总质量计3～5％的引发剂和3～5％的N,N'-双(丙烯酰)胱胺交联剂，然后在氮气保护下，于50～100℃下反应5～24h，去除溶剂，再加入沉淀剂进行沉淀后分离出沉淀物，沉淀物于40～80℃下真空干燥至少24h，得到多重响应性交联聚合物，其中温度敏感性化合物为N-异丙基丙烯酰胺，将多重响应性交联聚合物与无水肼按质量比为(1～50)：1配料，溶解在溶剂Ⅱ中配置成浓度为0.01～0.06g/mL的混合胶束溶液，反应至少24h，然后将抗肿瘤药物与该混合胶束溶液以质量比1：(10～50)混合溶解于溶剂Ⅱ中，以抗肿瘤药物与该混合胶束溶液计配置为0.01～0.08g/mL浓度的混合载药胶束溶液，再将该混合载药胶束溶液进行透析，透析后的胶束溶液于-60～-80℃、气压不高于10Pa条件下冷冻干燥至少48h，即得多重响应性交联聚合物载药纳米胶束。

3.根据权利要求2所述的多重响应性交联聚合物载药纳米胶束，其特征在于所述温度敏感性化合物为N-异丙基丙烯酰胺。

4.根据权利要求2或3所述的多重响应性交联聚合物载药纳米胶束，其特征在于所述抗肿瘤药物为盐酸阿霉素、紫杉醇和喜树碱中的任一种。

5.一种如权利要求1任一项所述多重响应性交联聚合物的制备方法，其特征在于该方法的工艺步骤和条件如下：

将氨基酸苄酯类化合物与三光气按质量比(1～5)：1配料溶解于乙酸乙酯中，配置成0.04～0.07g/mL的混合溶液，并于50～100℃下反应1～8h，反应产物依次用去离子水和pH7～8的碱液分别洗涤，再依次经抽滤、旋蒸浓缩、重结晶处理，然后于不高于20℃温度环境下冷冻至少16h，最后依次抽滤、真空干燥，得到氨基酸苄酯环内酸酐；

将含双官能团的开环聚合引发剂与氨基酸苄酯环内酸酐以摩尔比1：(10～80)配比混合溶解于溶剂I中，配置成0.03～0.52g/mL的混合溶液，于10～50℃温度下反应10～48h，再加入沉淀剂进行沉淀并抽滤，滤饼于40～80℃下干燥至少24h，得到聚氨基酸苄酯，

其中，氨基酸苄酯类化合物为谷氨酸苄酯、赖氨酸苄酯、酪氨酸苄酯、甘氨酸苄酯、丝氨酸苄酯、色氨酸苄酯、天冬氨酸苄酯或组氨酸苄酯；碱液为弱碱性溶液；含双官能团的开环聚合引发剂为丙烯胺、乙烯胺、丁烯胺、3-甲基-2-丁烯胺、戊烯胺，

将聚氨基酸苄酯和温度敏感性化合物按摩尔比1：(1～200)溶解于溶剂Ⅰ中，配置成0.01～0.05g/mL的混合溶液，再加入以聚氨基酸苄酯与温度敏感性化合物的总质量计3～5％的引发剂和3～5％的N,N'-双(丙烯酰)胱胺交联剂，然后在氮气保护下，于50～100℃下反应5～24h，去除溶剂，再加入沉淀剂进行沉淀后分离出沉淀物，沉淀物于40～80℃下真空干燥至少24h，得到多重响应性交联聚合物。

6.根据权利要求5所述多重响应性交联聚合物的制备方法，其特征在于所述温度敏感性化合物为N-异丙基丙烯酰胺。

7.根据权利要求5或6所述多重响应性交联聚合物的制备方法，其特征在于所述溶剂Ⅰ为二氯甲烷、去离子水、二甲基甲酰胺、四氢呋喃或二甲基亚砜；引发剂为过氧化苯甲酰、过氧化月桂酰、偶氮二异丁氰、偶氮二异庚腈、偶氮二异丁酸二甲酯、过硫酸钾、过硫酸铵或偶氮二异丁基脒盐酸盐；沉淀剂为乙醚、甲醇、乙醇、四氢呋喃和去离子水中的一种或多种混合。

8.一种如权利要求2-4任一项所述多重响应性交联聚合物载药纳米胶束的制备方法，其特征在于该方法的工艺步骤和条件如下：

将权利要求5-7任一项所制备的多重响应性交联聚合物与无水肼按质量比为(1～50)：1配料，溶解在溶剂Ⅱ中配置成浓度为0.01～0.06g/mL的混合胶束溶液，反应至少24h，然后将抗肿瘤药物与该混合胶束溶液以质量比1：(10～50)混合溶解于溶剂Ⅱ中，以抗肿瘤药物与该混合胶束溶液计配置为0.01～0.08g/mL浓度的混合载药胶束溶液，再将该混合载药胶束溶液进行透析，透析后的胶束溶液于-60～-80℃、气压不高于10Pa条件下冷冻干燥至少48h，即得多重响应性交联聚合物载药纳米胶束。

9.根据权利要求8所述多重响应性交联聚合物载药纳米胶束的制备方法，其特征在于所述抗肿瘤药物为盐酸阿霉素、紫杉醇或喜树碱中的任一种；溶剂Ⅱ为四氢呋喃、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。

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