CN116603077A - 双重响应性多肽修饰载药zif-8纳米粒子及其制备方法和应用 - Google Patents

双重响应性多肽修饰载药zif-8纳米粒子及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于载药MOF纳米粒子技术领域，提供一种双重响应性多肽修饰载药ZIF‑8纳米粒子及其制备方法和应用，其制备方法是先在制备ZIF‑8所使用的原料锌盐中混合药物甲后，按照常规制备工艺制备得到负载药物甲的ZIF‑8；然后将聚谷氨酸苄酯脱除多肽的保护基团制备得到聚谷氨酸；最后将负载药物甲的ZIF‑8、聚谷氨酸、药物乙中添加脂肪酶响应性交联剂和引发剂后，在一定条件下反应制备得到双重响应性多肽修饰载药ZIF‑8纳米粒子。该双重响应性多肽修饰载药ZIF‑8纳米粒子解决了传统聚合物载药纳米粒子生物相容性差、体内毒性的问题；此外还具有脂肪酶响应的靶向性，大幅提高了药物释放效率。

Description

双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于载药MOF纳米粒子技术领域，涉及一种双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子及其制备方法和应用，具体涉及具有pH响应性和脂肪酶响应性的聚谷氨酸修饰载药ZIF-8纳米粒子及其制备方法和应用。
背景技术
纳米药物递送系统(NDDS)是由不同种类的材料组成的功能性载药纳米载体，可以控制药物释放，增加生物膜的通透性，提高抗生素的生物利用度。在纳米药物递送系统(NDDS)中，金属-有机骨架(MOF)是一种新型的多孔晶体，由金属和有机化合物通过配位键结合而自组装，已被广泛应用于催化、能量储存和药物传递。通过锌离子与2-甲基咪唑(2-MIM)的配位合成了MOF的代表物沸石咪唑骨架材料-8 (ZIF-8)。ZIF-8表现出对酸性条件的敏感性，在生理条件下保持结构稳定，在酸性条件(pH 5.5~6.8)下解体。因此，由于ZIF-8在体内具有pH敏感的药物递送功能，因此在生物成像、药物递送和光动力治疗等方面有巨大的应用潜力，也得到了广泛研究。
然而，基于以上研究，现有的载药ZIF-8纳米粒子对耐药菌的治疗还存在以下问题，如：（1）生物相容性差，易对正常细胞造成损伤；生物相容性是指材料与宿主之间的相容性，生物相容性是生物材料研究中始终贯穿的主题。在以往的研究领域中，传统载药纳米粒子经常通过表面改性来提高生物相容性，例如使用亲水性聚合物来接枝到材料表面、吸附一些物质改变表面特征。传统的增加生物相容性的合成材料有壳聚糖（CS）、聚乙二醇（PEG）等。壳聚糖（CS）、聚乙二醇（PEG）等材料虽被广泛使用，但其也有其内在的毒性和缺陷。例如壳聚糖的促凝血作用也使其血液相容性较差，作为生物材料在体内使用时容易引起血栓，进而限制了其在生物医学材料特别是与血液相关领域的应用。聚乙二醇（PEG）也存在相应问题，有研究发现长期给药会使聚乙二醇（PEG）在组织内富集，可能会导致潜在的组织毒性和不良反应。小于400 Da的聚乙二醇（PEG）链在体内被醇脱氢酶代谢为有毒代谢物，如聚乙二醇（PEG）在体内能被代谢为相关酸类代谢物，可能引起危险的高钙血症和酸中毒。（2）细菌靶向性差，药物传递效率低；经过长久的研究，已知感染组织和细菌生物膜具有与正常组织不同的特定微环境，如低pH、过度表达的酶、高活性氧等，而现有的载药ZIF-8纳米粒子无法实现微环境响应性，不能对细菌的特殊微环境的刺激进行应答，从而导致载药粒子在感染部位内不能高效可控释药，致使药物靶向性差、递送效率偏低，从而导致低的治疗效果（3）单化学药物治疗效率低，以及多药耐药性的产生。抗生素作为目前临床上用于治疗细菌及生物膜感染的最常用药物，但由于抗生素的滥用，造成越来越多具有多重耐药性(MDR)的“超级细菌”产生，单纯的化学药物治疗效果明显降低甚至无效。而现有的载药ZIF-8纳米粒子大多采用化学药物治疗，导致得不到优异的治疗效果。
发明内容
本发明的目的是解决上述背景技术中的问题，提供一种双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子及其制备方法和应用，本发明制备所得双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子采用了聚氨基酸作为亲水性外壳来稳定纳米粒子，使聚合物载药纳米粒子既能在正常生理环境中（pH=7.4）呈负电性，抑制其与蛋白、正常细胞和组织的作用，从而解决了传统聚合物载药纳米粒子使用合成材料（如壳聚糖、聚乙二醇）作为亲水性外壳导致的载体生物相容性差、体内毒性的问题。
为实现上述目的，本发明是采用由以下技术措施构成的技术方案来实现的。
一种双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备负载药物甲的沸石咪唑骨架材料-8（ZIF-8）
在制备沸石咪唑骨架材料-8所使用的原料锌盐中混合药物甲后，按照常规沸石咪唑骨架材料-8制备工艺制备得到负载药物甲的沸石咪唑骨架材料-8；
（2）制备聚谷氨酸
将聚谷氨酸苄酯脱除多肽的保护基团制备得到聚谷氨酸；
（3）制备双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子
按重量份数，包括下述组分作为原料进行备料：
负载药物甲的沸石咪唑骨架材料-8 100~105份，
聚谷氨酸 100~105份，
药物乙 10~11份，
将上述原料溶解于有机溶剂中，并添加脂肪酶响应性交联剂和引发剂后，混合均匀后于氮气保护条件下，加热至70~72℃搅拌反应至少24h，待反应时间到达后，离心取沉淀物，洗涤并干燥沉淀物，得到蓝色粉末，即为双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子；该双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子分别负载有药物甲和药物乙。
在本文中，步骤（1）中所述常规沸石咪唑骨架材料-8制备工艺，为本技术领域中公知常识的沸石咪唑骨架材料-8制备工艺，例如利用现有技术中所记载的溶剂热合成法、微波辅助法和微流控法制备沸石咪唑骨架材料-8（ZIF-8）。因沸石咪唑骨架材料-8是由锌离子与2-甲基咪唑配位形成的多孔结晶材料，基于本发明原理，其制备工艺的选择对于最终制备产物的性能影响较小，本领域技术人员可自行根据当前实验条件或参考现有技术记载选择适宜的制备工艺。
为了更好地说明本发明，提供一种可供参考的技术方案，在实验室条件下，步骤（1）中所述按照常规沸石咪唑骨架材料-8制备工艺制备得到负载药物甲的沸石咪唑骨架材料-8，具体为：将1.5g的六水合硝酸锌和药物甲溶于70mL甲醇中，在搅拌的情况下逐渐加入均匀分散好的70mL的2-甲基咪唑溶液，反应24h后将混合物溶液离心，并除去上清液得到白色反应产物，洗涤并干燥后获得负载药物甲的沸石咪唑骨架材料-8。
在本文中，步骤（1）中所述药物甲为本技术领域中沸石咪唑骨架材料-8常规可负载的小分子药物选择，注意的是，本发明限定了是由所述在制备沸石咪唑骨架材料-8所使用的原料锌盐中混合药物甲后，制备得到负载药物甲的沸石咪唑骨架材料-8，因此基于该制备原理，其药物甲的选择可参考本技术领域中采用相同制备工艺的现有技术记载中的药物选择。
在其中一种优选的技术方案中，所述药物甲为环丙沙星、万古霉素、阿奇霉素、紫杉醇其中任意一种。
在本文中，步骤（2）中所述聚谷氨酸苄酯（PBLG），可通过市售获取，或是本领域技术人员根据现有技术制备得到，例如通过γ-苄基-L-谷氨酸N-羧基-酸酐（Bz-L-Glu NCA）制备得到。本领域技术人员可自行根据当前实验条件或参考现有技术记载选择适宜的制备工艺。
在本文中，步骤（2）中所述将聚谷氨酸苄酯脱除多肽的保护基团制备得到聚谷氨酸，本领域技术人员可参考现有技术中所记载制备工艺进行操作。
为了更好地说明本发明，提供一种可供参考的技术方案，步骤（2）中所述聚谷氨酸苄酯（PBLG）的制备，及将聚谷氨酸苄酯脱除多肽的保护基团制备得到聚谷氨酸，具体可以参考本发明的发明人发表在先的论文文献记载：
周庆翰,林娟,廖戎等.聚L-谷氨酸γ-苄酯的合成及其结晶结构的研究[J].化学研究与应用,2011,23(07):877-881.
Qu J, Wang R, Peng S, et al. Stepwise dual pH and redox-responsivecross-linked polypeptide nanoparticles for enhanced cellular uptake andeffective cancer therapy[J]. Journal of Materials Chemistry B, 2019, 7(45):7129-7140.
Huang S, Peng S, Wang Q, et al. Gold nanorods conjugated withbiocompatible zwitterionic polypeptide for combined chemo-photothermaltherapy of cervical cancer[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2021,207: 112014.
需要额外说明的是，经本发明的发明人调研发现，市售聚谷氨酸苄酯（PBLG）与本发明的发明人所在课题组制备所得聚谷氨酸苄酯，采用了不同的引发剂制备，且制备所得聚谷氨酸苄酯的分子量存在差异，但基于本发明的发明原理，推测上述差异对于最终制备产物的功能差异影响较小，但性能上具有一定的影响。
因此为了获得与本发明下述实施例优异性能一致的最终制备产物，提供一种可供参考的优选技术方案，步骤（2）中所述聚谷氨酸苄酯，具体制备方法如下：
称取γ-苄基-L-谷氨酸N-羧基-酸酐（Bz-L-Glu NCA，2.10g，8.85mmol）加入具支磨口反应管，置入菱形聚四氟乙烯磁力搅拌子，随后加入4 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）以及加入15 μL的丙烯胺超声溶解，作为反应溶液；
密封具支磨口反应管的上磨口，将其支磨口与双排管连接，双排管的两端接口分别连接氮气瓶和真空泵；
冷冻-解冻步骤：首先是将双排管的阀门调整至双排管与氮气瓶连通，通入氮气保护，在液氮中将反应溶液冷冻，后将双排管的阀门调整至双排管与真空泵连通，打开真空泵，抽真空1-2分钟，最后继续通入氮气保护的情况下解冻；
解冻后再次重复上述冷冻-解冻步骤2次即可完成，最后关闭具支磨口反应管的支磨口，搅拌反应24小时后，将反应溶液倒入0~4℃的乙醚内沉淀，静置12h之后减压抽滤，可得到产品聚谷氨酸苄酯（PBLG）。
为了获得与本发明下述实施例优异性能一致的最终制备产物，提供一种可供参考的优选技术方案，步骤（2）中所述将聚谷氨酸苄酯脱除多肽的保护基团制备得到聚谷氨酸，具体如下：
将1.40 g聚谷氨酸苄酯（PBLG）和60 mL三氟乙酸（TFA）转移到100 mL的圆底烧瓶中，置入菱形聚四氟乙烯磁力搅拌子，搅拌溶解，作为混合物溶液；然后将7.20 mL的溴化氢醋酸溶液逐滴添加到混合物溶液中搅拌24小时，倒入0~4℃的乙醚内沉淀粗产物，用水和甲醇洗涤粗产物，放置真空干燥箱中烘干得到产物聚谷氨酸。
在本文中，步骤（3）中所述双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子中的药物乙为小分子药物，且药物乙为通过化学键和/或静电吸附作用负载。
基于上述药物乙为通过化学键和/或静电吸附作用负载的原理，所述药物乙可选择为能够通过脂肪酶响应性交联剂和引发剂接枝于交联剂或ZIF-8上的小分子药物选择。本领域技术人员根据上述原理可自行选择现有技术中适宜的小分子药物。
在其中一种优选的技术方案中，本发明的发明人经实验发现，通过对聚谷氨酸和药物乙的选择限定，通过电荷差实现效果更佳的静电吸附作用，可大幅提高药物乙的负载量，基于此，所述药物乙选择为吲哚菁绿、姜黄素、亚甲基蓝其中任意一种。
在本文中，步骤（3）中所述有机溶剂选择为本技术领域常规有机溶剂，例如乙腈、N,N-二甲基甲酰胺，以适宜有机合成制备药物的有机溶剂为佳。所述有机溶剂的添加量通常以上述原料、脂肪酶响应性交联剂和引发剂能够充分溶解为准。
在其中一种技术方案中，所述有机溶剂的添加量是以每100mg原料加入9~10ml有机溶剂为宜。
在本文中，步骤（3）中所述脂肪酶响应性交联剂为本技术领域中具有脂肪酶响应性的常规交联剂选择。
在其中一种技术方案中，步骤（3）中所述脂肪酶响应性交联剂选择为聚己内酯或乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）。
经对比实验发现，脂肪酶响应性交联剂的添加量会显著影响到最终制备产物的功能表现、性能及副反应的产生，基于对比实验的结果，当所述脂肪酶响应性交联剂选择为乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）时，其添加量优选为原料总量的4~5wt%。
在本文中，步骤（3）中所述引发剂选择为本技术领域常规使用的引发剂，尤其优选为所述脂肪酶响应性交联剂所常规搭配使用的引发剂，例如偶氮类引发剂；所述引发剂的添加量可根据引发剂的具体选择，参考现有技术中常规添加量。
在其中一种技术方案中，所述引发剂选择为偶氮二异丁氰、偶氮二异庚腈、偶氮二异丁酸二甲酯其中任意一种。
在其中一种技术方案中，所述引发剂的添加量优选为原料总量的5~6wt%。
在本文中，步骤（3）中所述洗涤并干燥沉淀物，为本技术领域常规工艺操作，例如在实验室条件下，通过去离子水和乙醇对沉淀物进行洗涤，并采用真空干燥箱进行干燥。
在其中一种优选的技术方案中，所述药物甲和药物乙为不同药物。
上述技术方案中最终制备所得双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子在制药中的应用。
本发明具有以下有益效果：
（1）本发明制备所得双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子采用了聚氨基酸作为亲水性外壳来稳定纳米粒子，使聚合物载药纳米粒子既能在正常生理环境中（pH=7.4）呈负电性，抑制其与蛋白、正常细胞和组织的作用，从而解决了传统聚合物载药纳米粒子使用合成材料（如壳聚糖、聚乙二醇）作为亲水性外壳导致的载体生物相容性差、体内毒性的问题；此外，本发明制备方法中所添加的聚谷氨酸对比在沸石咪唑骨架材料-8制备过程中掺杂多肽的方式，具有显著更佳的生物相容性并进一步有利于降低细胞毒性。
（2）本发明制备所得双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子具有脂肪酶响应的靶向性，交联剂能够在细菌体内高浓度脂肪酶的作用下发生断裂，从而使聚合物载药纳米粒子裂解，释放抗生素，大大提高了药物释放效率，如在体外模拟细菌微环境条件下药物释放率达76%，远高于目前传统聚合物载药纳米粒子的释放率，解决了传统聚合物载药纳米粒子释放性能差的问题。
（3）本发明制备所得双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子将多种治疗因子负载到复合纳米粒子中，对耐药菌感染部位进行协同治疗，加入吲哚菁绿、姜黄素、亚甲基蓝其中任意一种光敏剂，在波长为660nm的近红外光照下释放单线态氧（1O2）进行抗菌治疗，从而形成化学-光动力协同治疗。
附图说明
图1为实施例1所用试剂、中间产物和最终产物以及对比例2最终产物的核磁谱图。图中，a）分别采用实施例1中间产物聚谷氨酸苄酯（PBLG），聚谷氨酸（PGA）；b）分别采用实施例1所用试剂环丙沙星（CIP）、亚甲基蓝（MB），以及对比例2最终产物沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸（ZIF-8/PGA），实施例1最终产物双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（ZIF-8/PGA-CIP/MB）。
图2为实施例1、对比例1以及对比例2最终产物的SEM图和TEM图。图中，a）分别为对比例1最终产物沸石咪唑骨架材料-8（ZIF-8），对比例2最终产物沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸（ZIF-8/PGA），以及实施例1最终产物双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（ZIF-8/PGA-CIP/MB）的SEM图；b）分别为对比例1最终产物，对比例2最终产物，以及实施例1最终产物的TEM图。
图3为对比例1最终产物沸石咪唑骨架材料-8的EDS元素图谱分析图。图中，a）分别为对比例1最终产物沸石咪唑骨架材料-8中各元素的分布数据图；b）为对比例1最终产物沸石咪唑骨架材料-8中各元素的总分布数据图。
图4为实施例1最终产物双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子的EDS元素图谱分析图。图中，a）分别为实施例1最终产物双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子中各元素的分布数据图；b）为实施例1最终产物双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子中各元素的总分布数据图。
图5为实施例1所用试剂、中间产物和最终产物以及对比例1、2最终产物的粒径对比图、粒径分布图、粒径时间变化图、电位对比图、电位时间变化图。图中，a）为对比例1最终产物沸石咪唑骨架材料-8（ZIF-8），实施例1所用试剂环丙沙星（CIP）、亚甲基蓝（MB），以及对比例2最终产物沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸（ZIF-8/PGA），实施例1最终产物双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（ZIF-8/PGA-CIP/MB）电位对比图；b）为pH 7.4时对比例2最终产物沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸（ZIF-8/PGA），实施例1最终产物双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（ZIF-8/PGA-CIP/MB），在加入脂肪酶（LIP）和不加脂肪酶情况下，其电位时间变化图；c）为对比例1最终产物沸石咪唑骨架材料-8（ZIF-8），对比例2最终产物沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸（ZIF-8/PGA），实施例1最终产物双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（ZIF-8/PGA-CIP/MB）的粒径对比图及粒径分布图；d）为pH 7.4时对比例2最终产物沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸（ZIF-8/PGA），实施例1最终产物双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（ZIF-8/PGA-CIP/MB），在加入脂肪酶（LIP）和不加脂肪酶情况下，其粒径时间变化图。
图6为实施例1所用试剂、中间产物和最终产物以及对比例1、2最终产物的FT-IR对比图和紫外光谱图。图中，a）为实施例1中间产物聚谷氨酸（PGA）以及对比例1最终产物沸石咪唑骨架材料-8（ZIF-8），对比例2最终产物沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸（ZIF-8/PGA），实施例1最终产物双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（ZIF-8/PGA-CIP/MB）的FT-IR对比图；b）为实施例1所用试剂亚甲基蓝（MB）、环丙沙星（CIP）以及对比例2最终产物沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸（ZIF-8/PGA），实施例1最终产物双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（ZIF-8/PGA-CIP/MB）的紫外光谱图。
图7为实施例1中间产物和最终产物以及对比例1、2最终产物的XPS全扫描光谱图、高分辨能谱图和XRD光谱图。图中，a）为对比例1最终产物沸石咪唑骨架材料-8（ZIF-8），对比例2最终产物沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸（ZIF-8/PGA），实施例1最终产物双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（ZIF-8/PGA-CIP/MB）的XPS全扫描光谱；b）为对比例1、对比例2以及实施例1最终产物的C 1s的高分辨能谱；c）为对比例1、对比例2以及实施例1最终产物的N 1s的高分辨能谱；d）为对比例1、对比例2以及实施例1最终产物的O 1s的高分辨能谱；e）为对比例1、对比例2以及实施例1最终产物的Zn 2p的高分辨能谱；f）为对比例1最终产物沸石咪唑骨架材料-8（ZIF-8），实施例1中间产物聚谷氨酸（PGA），对比例2最终产物沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸（ZIF-8/PGA），实施例1最终产物双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（ZIF-8/PGA-CIP/MB）的XRD光谱图。
图8为实施例1最终产物以及对比例1、2最终产物的N2吸附-脱附等温对比图、孔径大小对比图和热重分析对比图。图中，a）为对比例1最终产物沸石咪唑骨架材料-8（ZIF-8），对比例2最终产物沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸（ZIF-8/PGA），实施例1最终产物双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（ZIF-8/PGA-CIP/MB）的N2吸附-脱附等温对比图以及孔径大小对比图； b）为对比例1、对比例2以及实施例1最终产物的热重分析对比图。
图9为在10 mW/cm2 660 nm激光照射下，实施例1最终产物以及对比例1、2最终产物的紫外吸收变化图。图中，a）在pH 7.4条件下，对比例2最终产物沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸（ZIF-8/PGA）；b）在pH 5.5条件下，对比例2最终产物；c）在pH 7.4条件下，实施例1最终产物双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（ZIF-8/PGA-CIP/MB）；d）在pH 5.5条件下，实施例1最终产物；e）为将二苯基异苯并呋喃（DPBF）作为对照样；f）吸光度下降趋势归一化图。
图10为实施例1最终产物在不同pH条件下加入二苯基异苯并呋喃(DPBF)降解的颜色变化趋势图。图中，7.4是pH为7.4条件下，5.5是pH为5.5条件下，N,N-二甲基甲酰胺（DMF）为空白对照样。
图11为实施例1最终产物在不同条件下环丙沙星和亚甲基蓝的药物累计释放率对比图。图中，a）为实施例1最终产物双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（ZIF-8/PGA-CIP/MB），在加入脂肪酶（LIP）和不加脂肪酶情况下，以及pH值不同条件下环丙沙星（CIP）的累计释放率对比图；b）为实施例1最终产物双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（ZIF-8/PGA-CIP/MB），在加入脂肪酶（LIP）和不加脂肪酶情况下，以及pH值不同条件下亚甲基蓝（MB）的累计释放率对比图。
图12为实施例1所用试剂和最终产物在不同载药浓度下与血细胞共培养2小时离心后的对比照片和溶血率对比图。图中，a）为实施例1所用试剂环丙沙星（CIP）和亚甲基蓝（MB），以及实施例1最终产物双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（ZIF-8/PGA-CIP/MB）在不同载药浓度下加入PBS缓冲溶液与血细胞共培养2小时离心后的对比照片；b）为实施例1最终产物双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（ZIF-8/PGA-CIP/MB），以及实施例1所用试剂环丙沙星（CIP）和亚甲基蓝（MB）的溶血率对比图。
图13为实施例1所用试剂和最终产物在不同条件下的涂板对比示意图。图中，a）为在pH 7.4条件下，实施例1所用试剂环丙沙星（CIP）以及实施例1最终产物双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（ZIF-8/PGA-CIP/MB），在加入脂肪酶（LIP）和不加脂肪酶情况下，以及在近红外光照射（NIR）和近红外光不照射情况下的涂板对比示意图；b）为在pH 5.5条件下，实施例1所用试剂和最终产物，在加入脂肪酶（LIP）和不加脂肪酶情况下，以及在近红外光照射（NIR）和近红外光不照射情况下的涂板对比示意图。
图14为实施例1所用试剂和最终产物的荧光显微观察图。图中，PBS缓冲液作为对照，分别采用了实施例1所用试剂环丙沙星（CIP），实施例1最终产物双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（ZIF-8/PGA-CIP/MB），以及实施例1最终产物在加入脂肪酶（LIP）和不加脂肪酶情况下，以及在近红外光照射（NIR）和近红外光不照射情况下的对比。
图15为实施例1中间产物和最终产物以及对比例1、2最终产物的细胞毒性对比柱图。图中，采用了对比例2最终产物沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸（ZIF-8/PGA），实施例1最终产物双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（ZIF-8/PGA-CIP/MB），实施例1中间产物沸石咪唑骨架材料-8/环丙沙星粒子（ZIF-8/CIP），对比例1最终产物沸石咪唑骨架材料-8（ZIF-8）。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对发明权利要求的限制。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。虽然相信本领域普通技术人员充分了解以下术语，但仍陈述以下定义以有助于说明本发明所公开的主题。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本申请不应解释为受限于所述的具体实施例。
1、原料
实施例1
（1）制备负载环丙沙星的沸石咪唑骨架材料-8
将1.5g的六水合硝酸锌和250mg环丙沙星溶于70mL甲醇中，在搅拌的情况下逐渐加入均匀分散好的70mL的2-甲基咪唑溶液，反应24h后将混合物溶液离心，并除去上清液得到白色反应产物，洗涤并干燥后获得负载环丙沙星的沸石咪唑骨架材料-8；为方便描述，将制备所得负载环丙沙星的沸石咪唑骨架材料-8命名为沸石咪唑骨架材料-8/环丙沙星粒子；
（2）制备聚谷氨酸
称取γ-苄基-L-谷氨酸N-羧基-酸酐（Bz-L-Glu NCA，2.10g，8.85mmol）加入具支磨口反应管，置入菱形聚四氟乙烯磁力搅拌子，随后加入4mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）以及加入15μL的丙烯胺超声溶解，作为反应溶液；
密封具支磨口反应管的上磨口，将其支磨口与双排管连接，双排管的两端接口分别连接氮气瓶和真空泵；
冷冻-解冻步骤：首先是将双排管的阀门调整至双排管与氮气瓶连通，通入氮气保护，在液氮中将反应溶液冷冻，后将双排管的阀门调整至双排管与真空泵连通，打开真空泵，抽真空1-2分钟，最后继续通入氮气保护的情况下解冻；
解冻后再次重复上述冷冻-解冻步骤2次即可完成，最后关闭具支磨口反应管的支磨口，搅拌反应24小时后，将反应溶液倒入0~4℃的乙醚内沉淀，静置12 h之后减压抽滤，可得到产品聚谷氨酸苄酯（PBLG）；
将1.40 g聚谷氨酸苄酯（PBLG）和60 mL三氟乙酸（TFA）转移到100 mL的圆底烧瓶中，置入菱形聚四氟乙烯磁力搅拌子，搅拌溶解，作为混合物溶液；然后将7.20 mL的溴化氢醋酸溶液逐滴添加到混合物溶液中搅拌24小时，倒入0~4℃的乙醚内沉淀粗产物，用水和甲醇洗涤粗产物，放置真空干燥箱中烘干得到产物聚谷氨酸。
（3）制备双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子
按重量份数，包括下述组分作为原料进行备料：
负载环丙沙星的沸石咪唑骨架材料-8 100份，
聚谷氨酸 100份，
亚甲基蓝 10份，
将上述原料溶解于40 mL 乙腈（ACN）中，并添加20μL的乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）和25 mg的偶氮二异丁腈（AIBN），混合均匀后于氮气保护条件下，加热至70℃搅拌反应24h，待反应时间到达后，离心取沉淀物，洗涤并干燥沉淀物，得到蓝色粉末，即为双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子；该双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子分别负载有环丙沙星和亚甲基蓝。
对比例1
制备沸石咪唑骨架材料-8：
将1.5g的六水合硝酸锌溶于70mL甲醇中，在搅拌的情况下逐渐加入均匀分散好的70mL的2-甲基咪唑溶液，反应24h后将混合物溶液离心，并除去上清液得到白色反应产物，洗涤并干燥后获得沸石咪唑骨架材料-8。
对比例2
按照对比例1一致的实施方案制备得到沸石咪唑骨架材料-8；
按照实施例1一致的实施方案制备得到聚谷氨酸；
按重量份数，包括下述组分作为原料进行备料：
沸石咪唑骨架材料-8 100份，
聚谷氨酸 100份，
将上述原料溶解于40 mL 乙腈（ACN）中，并添加20μL的乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）和25 mg的偶氮二异丁腈（AIBN），混合均匀后于氮气保护条件下，加热至70℃搅拌反应24h，待反应时间到达后，离心取沉淀物，洗涤并干燥沉淀物，即为沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸纳米粒子，简称沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸。
2、测试方法
①结构表征
通过核磁共振仪1H NMR对合成的样品结构进行表征，称取10-20 mg的待测样品放入1.5 mL的离心管内，加入氘代DMSO试剂超声溶解完全后转移到干净的核磁管内，采用Varian Inova-400（Bruker 400 MHz）的核磁共振仪进行测试。
通过傅里叶变换红外光谱仪FT-IR对样品的结构和化学键组成进行分析。称取适量的待测样品与光谱级的溴化钾研磨均匀成混合粉末，放入压片模具中，压成透光均匀薄片。采用傅里叶变换红外光谱仪IR2000（Thermo Electron，USA）以4cm-1分辨率从400至4000cm-1对样品进行分析。
通过X射线衍射XRD（D/MAX-2000 Rigaku）对样品的结构晶型进行检测。将干燥后的待测样品放入玻璃样品架样品槽内，采用逐步扫描法，将待测样品放入测试架上，注意保持样品和样品台的边缘在同一水平面上。测试条件：扫描角度为5°-40°，λ=1.540598A，Cu靶，扫描速度为 4°/min，加速电压为 36 kV， 2θ 角为 10°~70°，管电流为 20 mA，功率为2kw。
通过紫外-可见分光光度计（MAPADA UV-1800）测定材料的吸收光谱。称取适量样品溶解于超纯水溶液中，将溶液转移至两通石英比色皿中，用超纯水校正背景，然后在200- 800 nm波长范围内进行测试得到环丙沙星和亚甲基蓝的UV-Vis吸收光谱；本实验中环丙沙星和亚甲基蓝的释放曲线及1O2的生成检测也由UV-Vis测定。
通过X 射线光电子能谱XPS（Thermo Fisher Escalab Xi+ USA）探究样品的表面元素组成和化学结构。称取真空干燥后的适量样品，研磨成粉末。采用 X 射线光电子能谱对样品进行测定。所测得的谱图以结合能为284.8 eV 的 C1s 峰为标准，利用 Casa XPS软件对各元素进行位置校正以及分峰处理测试条件设置为真空度设置为 2×10-9亚甲基蓝ar，X 射线源为 Al Kα 射线。
采用热重分析仪TGA（Mettler Toledo Tga/Dsc 3+, Germany）对材料的热稳定性进行表征。将待测样品先在60 ℃真空干燥箱干燥 24 小时，然后在程序控温下，采用同步热分析仪使样品在氮气气流下以10℃/min的速率加热到1000℃。观察样品的质量随温度的变化情况。
用扫描电子显微镜SEM（FEI Inspect F50，USA）观察样品的表面形貌和粒径，同时进行能量射线光谱（EDS）分析。测试前将待测样品干燥 24 小时，将样品研磨成细粉，随后将样品使用导电胶粘贴在样品台上，喷金60s，使用场发射扫描电镜在不同的放大倍率下对样品进行测试观察，并进行EDS的测试。
用透射电子显微镜TEM（Hitachi H-600，Japan）测定了样品的形貌以及尺寸变化。将样品混悬于乙醇中，超声后取适量样品滴加到300目碳涂层铜网上，在室温下干燥后，并使用TEM观察样品特征。
② 1O2的测定
二苯基异苯并呋喃（DPBF）通常用作单线态氧的捕获剂，当1O2结合到二苯基异苯并呋喃时，二苯基异苯并呋喃能与1O2发生不可逆的反应，进行1,4-环加成反应，随着的产量增加，二苯基异苯并呋喃的消耗增多，二苯基异苯并呋喃在UV吸收光谱中410 nm处的吸收峰强度降低，因此可用UV-vis光谱法来定量检测1O2的产生。首先，将二苯基异苯并呋喃溶解于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，分别与pH 5.5和7.4下的样品溶液（沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子）混合均匀，随后用光密度为10 mW/cm 2的660 nm激光（M660 L2-C1 Deep Red，ThorLabs，USA）分别照射每种溶液20min，测定其每2min光照下每种样品的紫外吸收光谱的变化，同时以不含任何纳米颗粒的二苯基异苯并呋喃溶液为空白组，绘制各组样品在410 nm处二苯基异苯并呋喃的吸收强度随光照时间的变化曲线。
③环丙沙星和亚甲基蓝的释放曲线
评估在不同pH下有或没有脂肪酶存在的情况下亚甲基蓝以及环丙沙星从双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子的释放行为。将制备好的双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子悬浮于以下不同情况PBS缓冲液中：pH 7.4、pH 7.4+1mg/mL脂肪酶、pH 5.5和pH5.5+1mg/mL脂肪酶。采用透析法研究环丙沙星和亚甲基蓝的累积连续释放行为，然后将配置好的聚合物溶液转移至透析袋内，在温度为37℃，转速为1000 r/min的恒温振荡器中反应。用紫外-可见分光光度计检测1~72小时内释放液在277 nm和665 nm的吸收峰值，其分别为环丙沙星和亚甲基蓝的吸光度，并绘制对应释放曲线，研究环丙沙星以及亚甲基蓝的释放量。实验中所使用的脂肪酶浓度有利于证明对于脂肪酶介导的聚合物药物载体中的酯键的降解是有效的。
④细胞毒性
为了评价沸石咪唑骨架材料-8晶体、沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸以及双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子的细胞毒性，使用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行CCK-8法的体外细胞毒性测定。将人脐静脉内皮细胞（HUVEC）以每孔4.3×106个细胞的密度接种到96孔板中，加入含有10% 胎牛血清(FBS)和1 %青霉素/链霉素的RPMI培养基，并在37℃和5 %（v/v）CO2恒温箱中培养24 h以允许细胞粘附，然后用PBS洗涤细胞。处理完以后将含有沸石咪唑骨架材料-8晶体（10、20、50、100μg/mL）、沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸（10、20、50、100μg/mL）双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（10、20、50、100μg/mL）的样品溶液和CCK-8溶液转移到每个孔中。在孵育24 h后，使用酶标仪（H1M, BioTeK, USA）在450 nm波长下记录CCK-8的吸光度，细胞毒性表示为通过三次重复测定确定的细胞活力。细胞毒性计算公式如下：
细胞存活率（%）=（A样品/A 对照）×100%
⑤生物相容性
进行溶血测定以研究环丙沙星、亚甲基蓝以及双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子与血细胞的生物相容性。从KM小鼠收集全血并储存在含有肝素钠的抗凝剂管中，通过离心（1500 rpm，10min）分离红细胞（RBC）并用PBS洗涤至上清液无色确保没有血红蛋白释放为止，然后将得到的红细胞并稀释至原来红细胞的2-3倍，备用。设实验组、阴性对照组（PBS为阴性对照）和阳性对照组（去离子水为阳性对照），将稀释过的RBC悬浮液与所需样品按1:1比例混合，在37℃条件下孵育4h，将混合溶液离心（1200 rpm，10min）后的上清液等分至96孔板中。通过酶标仪（Varioskan lux，Thermo，USA）测量570 nm处的吸光度。使用以下公式记录RBC的溶血百分比：
溶血百分比（%）=（As - ANeg，Control）/（APos，Control - ANeg，Control）×100%
其中As，ANeg，Control和APos，Control分别为样品吸光度、阴性对照吸光度和阳性对照吸光度。
⑥体外抗菌
以耐药型细菌MRSA（ATCC 43300）作为模型细菌用于评估单药和纳米复合材料的抗菌活性。首先，将细菌在琼脂中37℃下进行传代培养，随后取细菌的单一菌落引入液体培养基进行培养过夜，最终细菌菌液在600 nm处的吸光度在0.8~1.0范围内。
采用微量肉汤稻释法和涂布平板法对耐药型细菌MRSA（ATCC 43300）最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）进行测定，如下建立6个实验组：（1）PBS；（2）环丙沙星；（3）双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子；（4）双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子+光照；（5）双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子+脂肪酶；（6）双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子+光照+脂肪酶。将浓度为1 × 107 CFU/mL的细菌悬浮液加入到96孔板中与以上实验组在不同条件下（如pH 7.4和pH 5.5 ）共培养12h。将培养完后的样品分别加入10μL 0.4%的红四氮唑溶液，静置30 min，以不显红色的最低浓度为样品的最低抑菌浓度（MIC）。在测定药物对细菌的MIC基础上，用扩散平板法将100μL各组细菌悬浮液涂布于琼脂培养板上过夜培养16 h，测定菌落数，以能够杀灭培养基内细菌（即杀死99.9%供试微生物）的最低浓度为最低杀菌浓度（MBC）。同时比较处理组与对照组菌落数对比以评估每个样品的抗菌效果。每项试验独立重复三次。
采用活死细菌染色法实验用于显示细菌的活性。同上建立6个实验组，取500 μL细菌培养液（1× 107CFU/mL）与1500 μL实验组溶液进行混合后在37℃下恒温培养12h。用8000 r/min的转速将细菌悬浮液离心，除去上层物质，取150μL下层物至96孔板中，随后加入 5 μL AO/EB双荧光染色剂于常温下共孵育5分钟。最后用移液枪移取5 μL的混合液滴加到载玻片上，以相同条件下的PBS作为对照，通过荧光显微镜（Axio Observer A1，ZEISS，德国）分别观察不同条件下（pH 7.4和pH 5.5）的各个样品的荧光效果。每项试验一式三份。
⑦生物膜培养及破坏活性
将MRSA细菌悬浮液（1×107CFU/mL）加入24孔板并放置于恒温培育箱中培养7天形成致密的生物膜，每24h换一次液体培养基，7天后弃去培养基，用PBS小心冲洗三次以除去浮游细菌。以PBS溶液处理的MRSA生物膜用作对照组，将获得的MRSA生物膜与环丙沙星、双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子在37℃下孵育24小时来研究生物膜破坏活性，其中双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子分为双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子、双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子+光照、双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子+脂肪酶、双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子+光照+脂肪酶 4个不同处理组，需要光照组用660 nm（10 mW/cm2，20min）的激光照射20min。为了定量活细菌，收集治疗后玻片上的生物被膜，用低功率超声处理20秒，将处理后的生物膜用PBS稀释适当倍数。取100 μL稀释液至营养琼脂培养基中，置于37 ℃培养箱中孵育16小时。通过计数固体培养基上的细菌菌落数来计算细菌生物膜的存活率。
采用酶标仪来定量测定生物膜生物量。用乙醇固定共孵育过的生物膜20min，然后用0.1%结晶紫溶液染色20min。随后，用PBS小心地洗涤两次以除去过量的染料，然后向孔板中加入乙醇，使用多功能酶标仪监测OD590值，并使用数码相机记录颜色。
扫描电子显微镜（SEM）用于监测生物膜微观形态变化，在4℃下用4.0%戊二醛溶液固定与不同样品孵育过的生物膜。用PBS重复冲洗三次后，使用梯度系列的乙醇溶液（30、50、70、80、90和100%）脱水10分钟。最后，将获得的生物膜爬片喷上金，成像。
为了使生物膜形态可视化，在黑暗中用双AO/EB荧光染色剂将在不同处理下生长的生物膜染色10分钟。用PBS洗涤三次以除去过量染料后，通过具有相同参数的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM，A1RMP，NIKON，Japan）观察观察生物膜。使用NIS-Elements软件分析所获取的荧光图像并获得生物膜的3D图像。生物膜生物量的百分比或抑制率计算如下：
生物膜生物量的比率/抑制率（%）=（1-ODtest/ODcontrol）×100%
其中ODtest和ODcontrol是通过使用酶标仪测定的每个样品组和对照组的吸光度。
⑧动物伤口愈合试验
KM小雌鼠（3-8周，24-26 g）购自四川成都达硕实验动物有限公司，动物实验遵循《实验动物护理与使用指南》，并经西南民族大学动物伦理委员会批准。
建立皮肤伤口感染模型，评价双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子+光照+脂肪酶的抗菌潜力以及伤口愈合效果。首先剃除每只小鼠上背部的毛发（约2 × 2 cm 2），在小鼠背部建立直径约10mm的创面，在创面处接种为1×109 CFU/的MRSA悬浮液，感染1天后，随机将小鼠分为5组（每组3只）：（1）PBS；（2）环丙沙星；（3）亚甲基蓝；（4）双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子；（5）双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子+光照。其中采用PBS注射的作为对照组，剩余作为治疗组，每3天（第1天，第4天，第7天）通过尾静脉注射给药，第（5）组所需光照是在注射治疗后6h，将脓肿区域暴露于光照激光（660 nm，10mW/cm2）照射20min。治疗的1、3、5、7、9和11 天，对伤口进行拍照并记录小鼠体重。通过Image J软件计算治疗期间感染皮肤的面积。随即处死所有小鼠，取脓肿组织样品在PBS中均质化、稀释，涂布在营养琼脂培养基上进行体内疗效评价；取小鼠的主要器官（即，心、肝、脾、肺和肾）以评估制剂的潜在毒性。将每个处理组的脓肿组织和心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏样品用4%多聚甲醛溶液固定以制备病理切片，用于用苏木精和伊红（H&E）染色、Masson三色染色进行组织学分析。
注意的是，上述测试结果数据以均数±标准差(mean±sd)表示，采用至少3次重复实验独立进行t检验。
具体测试结果如下：
①结构表征
利用1H-NMR图谱对合成的聚谷氨酸苄酯，聚谷氨酸，沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子的进行结构的验证，分析结果如图所示：图1a）显示了聚谷氨酸苄酯中1H-NMR （400 MHz）:（ppm）: 8.20 –8.46（a：单峰，环内氨基，–CONHCH–），（ppm）：7.25 - 7.44（b：双重峰，苯环，C6H5–），（ppm）：4.85 - 5.16 （e：苄基，C6H5CH2–），（ppm）：4.35 - 4.73 （b：单峰，次甲基，–CONHCH–），(ppm)：1.90 - 2.32 (d、c：-亚甲基和-亚甲基)，说明聚谷氨酸苄酯（PBLG）合成成功。由于聚谷氨酸苄酯中在7.25 -7.44有苯环1H的特征峰，4.85 - 5.16有苄基1H的特征峰，水解之后在聚谷氨酸（PGA）中这些特征峰消失，证明聚谷氨酸苄酯（PBLG）水解成功，可以用于下一步合成反应。图1 b）中双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子在3.25 - 3.58:（Piperazine，H-α）出现了环丙沙星的特征峰以及在1.05 - 1.37（–CH3CH3)出现了亚甲基蓝的特征峰，证明环丙沙星和亚甲基蓝装载成功，该聚合物制备成功。
为了观察样品的形貌状态，通过SEM，TEM来进行测定。如图2 a）、图2 b）所示，透射电镜和扫描电镜证实了沸石咪唑骨架材料-8晶体具有菱形十二面体形貌，具有活动边缘和顶点角，与之前的报道一致。复合纳米材料沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸和双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子也能观察到与沸石咪唑骨架材料-8相同的十二面晶体形状，并且能看到交联剂将其包裹，这与我们预期结果一致。
通过EDS分析不同样品表面的成分分析，如图3 a）~ b）所示，沸石咪唑骨架材料-8晶体的Zn的含量较高，而通过聚谷氨酸的修饰后，图4 a）~ b）中Zn含量下降并且新出现了Cl以及F元素，证明环丙沙星以及亚甲基蓝被装载上去，这近一步证明了纳米材料合成成功。
通过采用DLS测试不同样品的电位变化和粒径大小分布，如同图5 a）所示，沸石咪唑骨架材料-8，环丙沙星，亚甲基蓝，沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子的电位分别为+27.8mV，-17.2mV，+1.18 mV，-16.5 mV，-11.2 mV；由图5b）所得，将在pH 7.4以及加脂肪酶和不加脂肪酶的条件下，随着时间的变化，沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸和双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子的电位数值一直处于稳定的负值，这表明，沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子具有良好的生物相容性。图5 c）中，沸石咪唑骨架材料-8，沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子的粒径分别为162.2 nm，186.4 nm和246.8 nm，因此证明了复合纳米材料合成成功。图5 d）中，沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子在有脂肪酶的存在下，粒径变大，分别增加至310nm以及325nm，证明脂肪酶响应性交联剂成功合成。
为了进一步证明双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子合成成功，采用了FT-IR和UV-Vis进行表征。如图6 a）所示，沸石咪唑骨架材料-8晶体在427 cm-1都有Zn-N键的伸缩振动，而沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子中也出现了该特征峰，并且在1656 cm-1和3317 cm-1处出现了C=O键伸缩振动和N-H键伸缩振动，证明了复合纳米材料合成成功。为了印证环丙沙星和亚甲基蓝被成功的装载上到了复合纳米材料上，用UV-Vis测试了200-800 nm波长范围内沸石咪唑骨架材料-8晶体，沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸和双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子的紫外吸收谱图，如图6 b）所示。沸石咪唑骨架材料-8，沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸在该范围内没有吸收峰，在双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子则出现了环丙沙星（277 nm）和亚甲基蓝（665 nm）的紫外吸收峰，这证明了药物装载成功。
为了揭示双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子的化学结构和详细组成，我们进行了x射线衍射(XRD)和x射线光电子能谱(XPS)。如图7 a）显示了C 1s、N 1s、O 1s、和Zn2p的高分辨XPS光谱。从图7 b）~ e）中沸石咪唑骨架材料-8，沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸和双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子的C的出峰位分别为283~288 eV，283~290 eV和283 ~290 eV；N的峰位分别为396~401 eV，397~402 eV和397~402 eV；O的峰位分别为529~534 eV，530~534 eV和529~535 eV；Zn的结合能位置在1020~1025eV，1043~1046eV；从图中显示了沸石咪唑骨架材料-8的C、N和O与沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸和双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子相比处于不同的环境，这证明了成功合成了复合纳米材料。图7 f）中制备的沸石咪唑骨架材料-8纳米颗粒在2θ=7.40°、10.40°、12.75°、14.75°、16.48°以及18.05°处出现强衍射峰，这些峰表明制备的沸石咪唑骨架材料-8具有较高的结晶度，说明合成成功，而制备的复合纳米材料也出现了和沸石咪唑骨架材料-8一样的衍射峰，这表明复合纳米材料的晶体结构没有遭到破坏。
N2吸附-脱附等温线和BJH孔径分布曲线如图8 a）所示，沸石咪唑骨架材料-8，沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子样品都表现为II型等温线和毛细管冷凝，这是介孔材料的特征，其中ZIF-8的孔径为3.9nm，经过多肽修饰后ZIF-8/PGA孔径减小到1.76 nm，最后药物负载后ZIF-8/PGA-CIP/MB的孔径为0.58 nm。用热重分析（TGA）研究纳米聚合物的质量百分比，如图8 b）显示了沸石咪唑骨架材料-8，沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子的TGA失重曲线。100 -600℃时，沸石咪唑骨架材料-8稳定，失重几乎可以忽略不计，沸石咪唑骨架材料-8在580℃处开始失重结构坍塌，这与文献报道一致。结果表明，单分散沸石咪唑骨架材料-8晶体在研究的温度范围内表现出良好的热稳定性。而沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子的热重分析曲线明显不同于沸石咪唑骨架材料-8，在100到600℃之间沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子表面的多肽层发生了有机材料的分解，其中580℃时纳米材料中的沸石咪唑骨架材料-8框架发生结构上的坍塌，产生质量损失。
② 1O2的测定
由于在660 nm的激光照射下，亚甲基蓝受到激发产生的单线态氧(1O2)，因此利用二苯基异苯并呋喃（DPBF）作为1O2传感器用以检测双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子产生单线态氧的情况。首先将3 mL溶液和30 μL的二苯基异苯并呋喃（1 mg/mL）混合后在10mW/cm2的660 nm激光照射。由图9 a）~ b）所示，在照射20 min内，随着时间的变化，沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸内的二苯基异苯并呋喃（DPBF）吸收峰没有明显的下降。在图9 c）~d）中pH 7.4条件下，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子组加入等量的二苯基异苯并呋喃后显示出了二苯基异苯并呋喃的吸收峰，在激光照射20 min后二苯基异苯并呋喃的吸收峰下降得十分缓慢，而亚甲基蓝的吸收峰则在不断下降，这说明该状态下单线态氧产生较少，二苯基异苯并呋喃没有被消耗掉；在pH 5.5条件下，二苯基异苯并呋喃的吸收峰下降比较快，说明该状态下单线态氧产生较多。由图9 e）所得二苯基异苯并呋喃本身的吸收峰没有的变化，说明了二苯基异苯并呋喃不受激光影响。如图9 f）所示，通过二苯基异苯并呋喃在410 nm处的相对吸光度用公式（A-A样）/（A0-A样）进行归一化求得，可以直观的观察到二苯基异苯并呋喃和沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸在410 nm的吸光度几乎保持不变，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（pH 7.4）有一定的下降趋势，而双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（pH 5.5）下降的趋势最明显，由此说明了双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（pH 5.5）具备了pH响应性。如图10所示，可以看出随着时间的推移ZIF-8/PGA-CIP/MB（pH5.5）中二苯基异苯并呋喃的颜色越来越浅，亚甲基蓝正在被消耗，由此说明了本课题所合成的ZIF-8/PGA-CIP/MB具备了光动力以及pH响应性。
③环丙沙星和亚甲基蓝的释放曲线
通过模拟正常生理条件和细菌微环境，采用UV-Vis分析了双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子的体外释药行为。具体如下，如图11 a）~ b）所示，在pH 7.4的72 h内环丙沙星和亚甲基蓝的释放率分别为37.6%和22.6%，这表明该复合纳米材料具有良好的稳定性。在pH 7.4+脂肪酶72 h内环丙沙星和亚甲基蓝的释放率分别为50.6%和37.3%，这表明了双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子交联剂上的酯键发生断裂，药物释放变多；在弱酸pH 5.5的72 h内环丙沙星和亚甲基蓝的释放率分别为62.7%和40.0%，这是由于在酸性条件下，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子内的沸石咪唑骨架材料-8发生降解，使药物释放出来；pH 5.5+脂肪酶条件下，环丙沙星和亚甲基蓝的释放率达到最高，释放率分别为99.4%和76.0%。由此证明了所合成的双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子的具有pH和酶的响应性。
④细胞毒性
如附图15所示，沸石咪唑骨架材料-8/聚谷氨酸和双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子在100 μg•mL-1时，细胞存活率分别为62.8%和56.1%；而单独使用ZIF-8时，人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的存活率仅为9.6%。这可以归因于多肽被包裹在纳米复合物上，从而提高了生物相容性。
⑤生物相容性
图12为环丙沙星，亚甲基蓝以及双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子的溶血率表征图，从图中可以看出，在双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子的浓度小于等于768μg/mL环丙沙星（16 μg/mL 亚甲基蓝）时，抗凝血膜的溶血率都小于5%，符合生物材料的溶血性要求，表明了双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子作为具有良好的血液相容性。
⑥体外抗菌
为了验证双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子的抗菌效果，我们采用MRSA作为模型细菌用最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）来证明。为了体现出双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子的酶响应性以及化学-光动力协同抗耐药菌效果，在pH 7.4和pH5.5条件下，用环丙沙星、以及双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（光照或不光照，加脂肪酶或不加脂肪酶）等条件下进行实验，分别与MRSA共培养。如表1所示，在pH 7.4和pH5.5条件下，环丙沙星对MRSA的最低抑菌浓度（MIC）为192μg/mL ，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子在pH 7.4和5.5条件下对MRSA的最低抑菌浓度（MIC）都为48μg/mL环丙沙星（1 μg/mL 亚甲基蓝）；在pH 7.4条件下时，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（加脂肪酶或不加脂肪酶）在不光照的条件下最低抑菌浓度（MIC）都为48μg/mL环丙沙星（1 μg/mL亚甲基蓝），而双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子加脂肪酶和有光照存在的条件下最低抑菌浓度（MIC）为24μg/mL环丙沙星（0.5 μg/mL 亚甲基蓝）。在pH 5.5条件下时，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（加脂肪酶或不加脂肪酶）在光照条件下最低抑菌浓度（MIC）为24μg/mL环丙沙星（0.5μg/mL 亚甲基蓝），在pH 7.4和5.5的条件下时，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子加脂肪酶和有光照存在的条件下最低抑菌浓度（MIC）都为24μg/mL环丙沙星（0.5μg/mL 亚甲基蓝）。
采用标准平板计数法进一步测定样品的最低杀菌浓度（MBC），如图13 a）、图13 b）所示环丙沙星在pH 7.4和pH 5.5条件下对MRSA的最低杀菌浓度（MBC）>192μg/mL，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子在pH 7.4对MRSA的最低杀菌浓度（MBC）是192μg/mL（4μg/mL亚甲基蓝），在pH 5.5条件下对MRSA的最低杀菌浓度（MBC）是96μg/mL环丙沙星（2μg/mL 亚甲基蓝）。在pH 7.4，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子加脂肪酶或只加光照的情况下最低杀菌浓度（MBC）为96μg/mL环丙沙星（2μg/mL 亚甲基蓝），在pH 7.4的条件下时，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子加脂肪酶和有光照存在的条件下最低杀菌浓度（MBC）为48μg/mL环丙沙星（1μg/mL 亚甲基蓝）。在pH 5.5的条件下，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子在不加脂肪酶不光照的条件下最低杀菌浓度（MBC）是96μg/mL 环丙沙星（2μg/mL 亚甲基蓝），在光照或者加入脂肪酶的条件下最低杀菌浓度（MBC）是48μg/mL 环丙沙星（1μg/mL 亚甲基蓝）。在pH 5.5的条件下时，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子加脂肪酶和有光照存在的条件下最低杀菌浓度（MBC）为24μg/mL环丙沙星（0.5μg/mL 亚甲基蓝）。
综上所得，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子在加脂肪酶或加光照的条件下的最低抑菌浓度（MIC）值和最低杀菌浓度（MBC）值变化不大，且在涂板中细菌数量差距不大，这是由于MRSA内已经有了过表达的脂肪酶。而双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子在pH 7.4的条件下效果不如pH 5.5的原因是由于双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子在pH 5.5下沸石咪唑骨架材料-8框架发生了坍塌，释放出更多的药物。
从以上结果可以得出，在酸性条件下，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子与细菌的相互作用可以增强抗菌活性，进一步凸显了双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子纳米材料在治疗局部酸性感染方面的潜力。
表1不同样品对MRSA的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度
表1中，括号内数字代表亚甲基蓝浓度，例如48(1)为48μg/mL环丙沙星（1 μg/mL亚甲基蓝）。
采用活死细菌染色法实验来测量双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子（浓度为48μg/mL 环丙沙星（16μg/mL 亚甲基蓝））在不同pH（7.4或5.5）溶液中的抗菌效率，结果表明如图14所示，双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子在pH 7.4和pH 5.5条件下进行光照处理后的效果最佳，而这与标准平板计数法实验结果一致，说明化学-光动力联合治疗对pH诱导的抗菌作用。

Claims (10)

1.一种双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）制备负载药物甲的沸石咪唑骨架材料-8
在制备沸石咪唑骨架材料-8所使用的原料锌盐中混合药物甲后，按照常规沸石咪唑骨架材料-8制备工艺制备得到负载药物甲的沸石咪唑骨架材料-8；
（2）制备聚谷氨酸
将聚谷氨酸苄酯脱除多肽的保护基团制备得到聚谷氨酸；
（3）制备双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子
按重量份数，包括下述组分作为原料进行备料：
负载药物甲的沸石咪唑骨架材料-8 100~105份，
聚谷氨酸 100~105份，
药物乙 10~11份，
将上述原料溶解于有机溶剂中，并添加脂肪酶响应性交联剂和引发剂后，混合均匀后于氮气保护条件下，加热至70~72℃搅拌反应至少24h，待反应时间到达后，离心取沉淀物，洗涤并干燥沉淀物，得到蓝色粉末，即为双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子；该双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子分别负载有药物甲和药物乙。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述按照常规沸石咪唑骨架材料-8制备工艺制备得到负载药物甲的沸石咪唑骨架材料-8，具体为：将1.5 g的六水合硝酸锌和药物甲溶于70 mL甲醇中，在搅拌的情况下逐渐加入均匀分散好的70 mL的2-甲基咪唑溶液，反应24h后将混合物溶液离心，并除去上清液得到白色反应产物，洗涤并干燥后获得负载药物甲的沸石咪唑骨架材料-8。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述药物甲为环丙沙星、万古霉素、阿奇霉素、紫杉醇其中任意一种。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述聚谷氨酸苄酯，具体制备方法如下：
称取2.10g γ-苄基-L-谷氨酸N-羧基-酸酐加入具支磨口反应管，置入菱形聚四氟乙烯磁力搅拌子，随后加入4mL N,N-二甲基甲酰胺以及加入15 μL的丙烯胺超声溶解，作为反应溶液；
密封具支磨口反应管的上磨口，将其支磨口与双排管连接，双排管的两端接口分别连接氮气瓶和真空泵；
冷冻-解冻步骤：首先是将双排管的阀门调整至双排管与氮气瓶连通，通入氮气保护，在液氮中将反应溶液冷冻，后将双排管的阀门调整至双排管与真空泵连通，打开真空泵，抽真空1-2分钟，最后继续通入氮气保护的情况下解冻；
解冻后再次重复上述冷冻-解冻步骤2次即可完成，最后关闭具支磨口反应管的支磨口，搅拌反应24小时后，将反应溶液倒入0~4℃的乙醚内沉淀，静置12 h之后减压抽滤，可得到产品聚谷氨酸苄酯。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述将聚谷氨酸苄酯脱除多肽的保护基团制备得到聚谷氨酸，具体如下：
将1.40 g聚谷氨酸苄酯和60 mL三氟乙酸转移到100 mL的圆底烧瓶中，置入菱形聚四氟乙烯磁力搅拌子，搅拌溶解，作为混合物溶液；然后将7.20 mL的溴化氢醋酸溶液逐滴添加到混合物溶液中搅拌24小时，倒入0~4℃的乙醚内沉淀粗产物，用水和甲醇洗涤粗产物，放置真空干燥箱中烘干得到产物聚谷氨酸。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述药物乙选择为吲哚菁绿、姜黄素、亚甲基蓝其中任意一种。
7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述有机溶剂选择为乙腈或N,N-二甲基甲酰胺；所述有机溶剂的添加量是以每100 mg原料加入9~10 ml有机溶剂。
8.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述脂肪酶响应性交联剂选择为聚己内酯或乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述脂肪酶响应性交联剂添加量为原料总量的4~5wt%。
9.一种根据权利要求1所述双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子的制备方法所制备得到的双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子。
10.权利要求9所述双重响应性多肽修饰载药ZIF-8纳米粒子在制药中的应用。
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