CN113209019B - Nk细胞协同刺激聚合物胶束的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了NK细胞协同刺激聚合物胶束的制备方法及应用，利用PEG‑PTMC聚合物将IL‑15和IL‑2同时负载，制备NK细胞协同刺激聚合物胶束(PEG‑PTMC‑IL‑2/IL‑15)，具有较高的肿瘤抑制率，同时可有效促进肿瘤细胞的凋亡。

Description

NK细胞协同刺激聚合物胶束的制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及NK细胞协同刺激聚合物胶束的制备方法及应用。
背景技术
癌症是当今社会严重影响人类健康、威胁生命的主要疾病之一。自然杀伤细胞(nature killer cell，NK cell)是机体抗肿瘤的主要免疫细胞之一，其无需预先致敏即可直接杀伤肿瘤、病毒感染等细胞，近年来受到广泛关注。然而，NK细胞对肿瘤细胞的杀伤功能受到多种因素限制，在免疫治疗过程中，如何高效激活NK细胞是亟待解决的问题之一。
NK细胞表面多种活化性受体的协同刺激是NK细胞充分活化的必要前提。白介素-15(Interleukin-15,IL-15)是由单核细胞等免疫细胞分泌的一种可溶性细胞因子，其不但是NK细胞定向发育的刺激因子，能从外周血单核细胞中将NK细胞纯化出来，对NK细胞具有潜在的靶向作用；同时还可显著提高NK细胞的杀伤活性。细胞因子白介素-2(Interleukin-2,IL-2)是主要由T细胞分泌的一种细胞因子，对于促进NK细胞在体内的稳态平衡、增强NK细胞的免疫应答具有重要意义。
有研究表明，与单纯细胞因子刺激相比，IL-15和IL-2复合可更加显著刺激NK细胞功能。但是游离细胞因子如IL-2在临床应用时由于生物半衰期太短，需要给患者体内较长时间高剂量注射，会引起严重的毛细血管渗漏等毒副作用。因此，实现多因子共刺激，同时提高药物半衰期，是实现NK细胞高效激活亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术所存在的不足之处，而提供了NK细胞协同刺激聚合物胶束的制备方法及应用。
为实现上述目的，本发明所提供的技术解决方案是：
一种NK细胞协同刺激聚合物胶束的制备方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：
1)向IL-2和IL-15的混合水溶液中加入催化量的TCEP，室温下进行反应，得到反应液；
2)向步骤1)得到的反应液中加入DBM-PEG-PTMC，室温下进行反应，得到反应物；
3)将步骤2)得到的反应物依次经透析、离心收集上清、浓缩后得NK细胞协同刺激聚合物胶束。
进一步地，IL-2和IL-15的质量之和与DBM-PEG-PTMC的质量之比为1∶5～20。在考虑成本及效果的同时，质量比优选1∶10，且IL-2与IL-15的质量比优选1∶1；催化量的TCEP占IL-2、IL-15、DBM-PEG-PTMC质量之和的0.1％～0.5％。
进一步地，骤1)中，室温下搅拌反应30～40min；
步骤2)中，室温下搅拌反应0.5～2h。
进一步地，骤3)的具体步骤为：
3.1)将步骤2)得到的反应物置于3000～3500Da透析袋中透析1～2天，除去催化剂以及杂质，期间每4±0.5h换一次透析水；
3.2)透析结束后收集样品，1000～2000rpm/min离心5～20min，弃去下层絮状沉淀，收集上清液；
3.3)对步骤3.2)得到的上清液进行超滤浓缩除去未反应的IL-2和IL-15，得到NK细胞协同刺激聚合物胶束，可采用30KD超滤管。
进一步地，骤2)中，所述DBM-PEG-PTMC采用以下方法获得：
S1.制备N3-PEG-PTMC和alkynyl-DBM：
在氮气氛围和催化剂TBD存在的条件下，N3-PEG-OH和TMC的DMF溶液在室温下反应制备N3-PEG-PTMC；TBD为有机催化剂，不含金属元素，不会造成金属离子残留
向碳酸钾和2,3-二溴马来酰亚胺的丙酮溶液中滴加入溴丙炔，室温反应制备alkynyl-DBM；
S2.DBM-PEG-PTMC的合成：
将步骤S1制备的N3-PEG-PTMC和alkynyl-DBM与dNbpy的DMF溶液通过多次冷冻-抽气-解冻循环除去反应管中的气体，并在最后一次循环中加入溴化亚铜；随后将反应体系处于氮气氛围下继续反应制备DBM-PEG-PTMC。
进一步地，制备N3-PEG-PTMC时，N3-PEG-OH、TBD、TMC的摩尔比为1：0.1～1：30～80，最优值为1：0.5：50，反应时间为12h～36h；
制备alkynyl-DBM时，2,3-二溴马来酰亚胺、碳酸钾、溴丙炔的摩尔比为1：1～1.5：1～1.5，最优值为1：1.1：1.1，反应时间为12h～36h；
合成DBM-PEG-PTMC时，N3-PEG-PTMC、dNbpy、溴化亚铜、alkynyl-DBM的摩尔比为1：0.1～1：0.1～0.5：1～1.5，最优值为1：0.5：0.25：1.1，反应时间为12h～36h。
本发明还提供了采用上述制备方法制得的NK细胞协同刺激聚合物胶束。
采用上述制备方法制得的NK细胞协同刺激聚合物胶束在制备治疗肿瘤药物的应用。
进一步地，所述肿瘤为乳腺肿瘤。
一种治疗肿瘤的药物，其特殊之处在于：其活性组分包括上述方法制备的NK细胞协同刺激聚合物胶束。
进一步地，所述NK细胞协同刺激聚合物胶束中的IL-15和IL-2的有效含量分别至少为100U/ml。
本发明的优点是：
1.本发明的协同刺激聚合物胶束具有较高的肿瘤抑制率，同时可有效促进肿瘤细胞的凋亡。
2.本发明利用PEG-PTMC聚合物将IL-15和IL-2同时负载，制备NK细胞协同刺激聚合物胶束(PEG-PTMC-IL-2/IL-15)，并且PEG-PTMC-IL-2/IL-15组的肿瘤抑制率(65.85±4.5％)显著高于游离药物组(IL-2+IL-15组，31.71±5.3％)；对小鼠肿瘤组织的HE染色及tunel染色结果也表明，经PEG-PTMC-IL-2/IL-15处理，可以更加有效促进肿瘤细胞的凋亡(由13.94±1.7％显著上升到23.62±2.6％)；而且，因为胶束负载以后粒径提高了，这样可以减少药物的肾小球滤过率，与IL-2+IL-15组相比，PEG-PTMC-IL-2/IL-15组中IL-15和IL-2的半衰期分别显著提高了约5.4倍和3.2倍。
附图说明
图1为本发明的合成机理；
图2为氢谱图及淋洗曲线，a为N3-PEG-PTMC的氢谱图，b为alkynyl-DBM的氢谱图，c为DBM-PEG-PTMC的氢谱图，d为聚合物N3-PEG-OH和DBM-PEG-PTMC的GPC淋洗曲线；
图3为细胞因子的负载率，其中，a为不同比例下分别负载；b为质量比10∶1时同时负载；
图4为扫描电镜图，a为纯聚合物胶束扫描电镜图，b为“协同刺激”聚合物胶束扫描电镜图；
图5为粒径分布图，a为纯聚合物胶束粒径分布图，b为“协同刺激”聚合物胶束粒径分布图；
图6为“协同刺激”聚合物胶束抑制肿瘤效果，a为肿瘤生长曲线；b为瘤体重量(x±s，n＝5)；NS表示处理组数据与对照组无显著差异，***及****均表示极显著差异(P<0.001)；
图7为小鼠肿瘤组织，a为HE染色10x，b为Tunel染色10x，c为Tunel荧光量化；
图8为“协同刺激”聚合物胶束对小鼠体重的影响(x±s，n＝5)；
图9为“协同刺激”聚合物胶束对小鼠血常规的影响，NS表示处理组数据与对照组无显著差异(x±s，n＝5)；
图10为小鼠脏器组织切片(20x)；
图11为IL-2+IL-15组和PEG-PTMC-IL-2/IL-15组IL-2和IL-15小鼠体内半衰期(x±s，n＝5)；
图12为不同浓度IL-15和IL-2对NK细胞杀伤活性的刺激效果，a为IL-15，b为IL-2。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明的内容作进一步的详细描述：
除非另有说明，本文中的术语或方法根据相关领域普通技术人员的理解或公知的相应方法实现。
术语/符号解释：
TCEP中文名：三(2-羰基乙基)磷盐酸盐
DBM-PEG-PTMC中文名：二溴马来酰亚胺-聚乙二醇-聚三亚甲基碳酸酯
N3-PEG-PTMC中文名：叠氮-聚乙二醇-聚三亚甲基碳酸酯
TBD中文名：1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯
N3-PEG-OH中文名：叠氮-聚乙二醇-羟基
TMC中文名：1,3-二氧杂环己烷-2-酮
alkynyl-DBM中文名：炔基-二溴马来酰亚胺
dNbpy中文名：4,4'-二壬基-2,2'-联吡啶
需要说明的是，本发明的DBM-PEG-PTMC可采用已知的方法制备(如文献“Reduction-responsive dithiomaleimide-based polymeric micelles for controlledanti-cancer drug delivery and bioimaging，公开时间2017年8月”中公开的相关方法)或基于所公开的方法在不违背本发明构思基础上改进后的方法，也可采用本发明提供的方法制备。
一、NK细胞协同刺激聚合物胶束PEG-PTMC-IL-2/IL-15的合成
实施例1：
将260μl 20万U/ml的IL-2和520μl 20万U/ml IL-15共同加入到水溶液中，然后加入TCEP(0.018μmol，北京伊诺凯科技有限公司)，在室温下搅拌反应30-40min；
然后向溶液中加入0.6mg的DBM-PEG-PTMC，继续在室温下搅拌反应1小时；反应结束后，将上述所有反应物置于3500Da(3000～3500Da)透析袋中透析1-2天(期间每4h换一次透析水)；
透析结束后收集样品，2000rpm/min(1000～2000rpm/min)离心10min(5～20min)，弃去下层絮状沉淀，收集上清液，用30KD超滤管超滤浓缩，得到PEG-PTMC-IL-2/IL-15协同刺激聚合物胶束。
具体工艺参数可在上述范围内调节。
实施例2：发明合成机理参见图1
该实施例与实施例1不同的是，所用DBM-PEG-PTMC采用以下方法合成：
1)两嵌段共聚物N3-PEG-PTMC的合成：在氮气氛围下将N3-PEG-OH(0.18mmol，900mg，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)、TMC(6.3mmol，643.14mg，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)溶于5mL DMF中，然后向溶液中加入催化剂TBD(0.09mmol，12.51mg，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)以引发聚合，室温下搅拌反应24h左右；反应完毕后，将反应液进行旋蒸，以除去部分DMF，然后将混合物在冰乙醚中沉淀两次，沉淀物于真空干燥箱中常温干燥得到白色固体产物N3-PEG-PTMC；
2)alkynyl-DBM的合成：将无水碳酸钾(1.79g，12.9mmol)、2,3-二溴马来酰亚胺(3g，11.8mmol，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)于室温下溶解在40mL丙酮中，充分搅拌5分钟左右；后于室温下在上述溶液中逐滴加入溴丙炔(1.11mL，12.9mmol)，搅拌24小时；反应结束后，通过减压蒸馏去除溶剂，并将粗产物溶于二氯甲烷后过滤以除去沉淀，并采用减压蒸馏以浓缩粗产物，最后将产物过硅胶柱(乙酸乙酯:正己烷＝10:1)分离提纯得到白色固体粉末为alkynyl-DBM；
3)DBM-PEG-PTMC的合成：N3-PEG-PTMC(0.04mmol,200mg)、alkynyl-DBM(0.12mmol，34.02mg)和dNbpy(0.04mmol，16.35mg，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)溶于5mLDMF中，将混合溶液通过三次冷冻-抽气-解冻循环除去反应管中的气体，并在最后一次循环中加入溴化亚铜(0.02mmol，2.87mg)，然后将反应体系处于氮气氛围下密封，在45℃下继续搅拌约24小时；反应结束后，在反应体系中加入二氯甲烷稀释，并敞口暴露于空气中以终止反应，然后将混合物通过中性氧化铝短柱以除去铜催化剂，最后将滤液减压蒸馏并在冰乙醚中沉淀两次，得到的沉淀物为DBM-PEG-PTMC。
二、实施例2制备的NK细胞协同刺激聚合物胶束的表征
1、小分子单体与聚合物的结构表征
a.单体和聚合物的1H NMR谱和13C NMR谱在25℃条件下进行测定，以CDCl3(广州金华大化学试剂有限公司)为溶剂，四甲基硅烷(广州金华大化学试剂有限公司)为内标。
b.聚合物样品的重均分子量(Mw)和多分散指数(PDI＝Mw/Mn)的测定在美国Waytt公司凝胶渗透色谱/多角度激光光散射联用检测装置(SEC-MALLs)上进行，该系统配备了Waters 515泵和两个凝胶柱(
Figure BDA0003060889760000091
和
Figure BDA0003060889760000092
MZ，Shimadzu Co.)。四氢呋喃(广州金华大化学试剂有限公司)作为流动相，进样量为0.2mL，测试温度为25℃，流速为0.5mL/min。聚合物在四氢呋喃中的折射率增量(dn/dc)由Wyatt的Optilab rEX差示折光检测器测量，并使用ASTRA软件获取和分析测试数据。
2、粒径测试
胶束的粒径以及粒径分布采用动态光散射(DLS)测试。将纯聚合物胶束和“协同刺激”聚合物胶束溶液分别置于粒度皿中，然后在25℃下上机测定并进行粒度数据收集记录。
3、形貌测试
胶束的形貌由扫描电镜(SEM)进行测试。SEM制样时，将纯聚合物胶束和“协同刺激”聚合物胶束溶液分别取10μL滴加在硅片上，干燥后用导电胶将硅片置于载物台上进行喷金，然后进行扫描电镜拍照。
4、酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)测定药物负载率
分别采用IL-2和IL-15Elisa检测试剂盒(北京蓝木科技有限公司)检测聚合物胶束中IL-2和IL-15负载率。
5、表征结果
(1)中间聚合物的性质表征
核磁表征聚合物中间体N3-PEG-PTMC，alkynyl-DBM和DBM-PEG-PTMC的结果如图2的a、b、c所示；
对于N3-PEG-PTMC，a峰归属于PEG链段的亚甲基质子峰，c和b峰归属于PTMC链段的亚甲基峰，且c和b的质子峰比例为1∶2，说明开环聚合的成功；对于alkynyl-DBM，a归属于炔基端的质子峰，b归属于与炔基相连的亚甲基质子峰；对于DBM-PEG-PTMC，炔基质子峰的消失以及三唑环质子峰的出现说明点击反应的成功，其结构式如下：
Figure BDA0003060889760000111
聚合物的分子量分布如图2的d所示，从GPC淋洗曲线可以看出DBM-PEG-PTMC显示出了向更高分子量的转变，再一次说明开环聚合的成功。其中N3-PEG-OH的分子量约为5.7K，PDI＝1.14；DBM-PEG-PTMC的分子量约为13K，PDI＝1.06。
(2)“协同刺激”聚合物胶束的形态、粒径分布及负载率
为了确定聚合物负载细胞因子时的最佳用量，本发明通过ELISA方法测定了聚合物与细胞因子不同比例条件下细胞因子的负载率，结果如图3的a所示。从图中可以看出，聚合物胶束分别对单因子IL-2和IL-15的负载率相似，且随着聚合物与细胞因子质量比的增大，所测得的负载率也相应有所提高。聚合物与细胞因子(IL-2和IL-15之和)的质量比从5:1提高至10:1时，两细胞因子的负载率均提高了10％左右，且负载率已达到85％以上；而质量比从10:1提高至20:1时，两细胞因子的负载率只提高了4％左右。综合考虑细胞因子的负载率和聚合物的用量，后续实验均选用聚合物与细胞因子10:1的比例制备“协同刺激”聚合物胶束。结合之前已确定的两种细胞因子的用量：IL-2为500U/ml、IL-15为100U/ml，发明人制备了10:1比例下的“协同刺激”聚合物胶束。两种细胞因子的负载率如图3的b所示，从图中可以看出，IL-2和IL-15各自的负载率均在80％左右，且同时负载的负载率与单独负载的负载率基本一致，说明同时负载的策略基本不会影响聚合物对IL-2和IL-15各自的负载率。
接着发明人使用扫描电镜和动态光散射对纯聚合物胶束和“协同刺激”聚合物胶束进行形态和粒径尺寸表征，且通过检测不同时间下“协同刺激”聚合物胶束的粒径和对细胞因子负载率的变化来考察其稳定性。
如图4所示，负载了细胞因子的“协同刺激”聚合物胶束形态规则，呈圆球状，分散均匀。经测量统计，SEM电镜图中纯聚合物胶束粒径约137nm，“协同刺激”聚合物胶束的粒径约243nm。
如图5所示，粒径分布图显示，纯聚合物胶束的粒径约98.7nm，而负载细胞因子后的聚合物胶束的粒径约164.3nm。从SEM和DLS结果均可以看出“协同刺激”聚合物胶束的粒径显著大于纯聚合物胶束的粒径，表示成功得到了负载细胞因子的聚合物胶束。同时因扫描电镜在制样时进行了喷金操作，因此电镜尺寸比DLS尺寸略大。“协同刺激”聚合物胶束粒径大小集中在160nm左右，PDI为0.14，说明胶束大小整体比较均匀。理论上，该尺寸的粒径在体内可以降低肾小球的滤过率。
三、考察体外水平下不同浓度IL-15和IL-2对NK细胞杀伤活性的刺激效果
本实验以人白血病K562细胞为靶细胞，采用常规NK细胞杀伤活性测定方法，考察体外水平下不同浓度IL-15和IL-2(100U/ml、250U/ml、500U/ml、1000U/ml)对NK细胞杀伤活性的刺激效果。结果如图12所示，在设置的浓度范围内，IL-15和IL-2均可显著增强NK细胞对靶细胞的杀伤活性，且呈浓度依赖性。
四、本发明的NK细胞协同刺激聚合物胶束体内抑制肿瘤活性研究
1、MDA-MB-231乳腺癌裸鼠模型的建立
从液氮罐中取出MDA-MB-231细胞株复苏，用DMEM完全培养基(Hyclon，北京全式金生物技术有限公司)培养；经过一次传代，待细胞生长状态良好、活力旺盛时，用胰蛋白酶消化细胞，待细胞充分消化，加入完全培养基终止消化，用巴氏吸管轻轻吹打，制成单细胞悬液，1000r/min离心5min，用完全培养基重悬，吹匀后取适量细胞悬液加入0.4％的台盼蓝(北京索来宝科技有限公司)染色，用血球计数板计数，用完全培养基将细胞浓度调整为1x107个/ml，用于下步实验；
取20只balb/c雌性裸鼠，4-5周龄，在无特定病原体级层流架内饲养，饲养中所用到的垫料笼具等均经高压蒸汽灭菌，垫料每隔一日更换一次，更换时需保证在无菌条件下进行；对小鼠右腋下消毒处理，将浓度为1x107个/ml的人乳腺癌MDA-MB-231细胞悬液，在小鼠右侧腋窝的皮下接种0.1ml；接种后，每日观察小鼠的进食进水情况及精神状态，用游标卡尺测量移植瘤直径，计算肿瘤体积并详细记录。公式1为肿瘤体积(tumor volume,TV)的计算方法：
TV＝1/2×a×b2 (1)
其中：
TV——肿瘤体积(cm3)；
a——肿瘤瘤体长度(cm)；
b——肿瘤瘤体宽度(cm)。
肿瘤生长至50mm3时将动物随机分组，同时，各组裸鼠开始尾静脉注射给药，给药方案与组别见表1，观察给药过程中小鼠的精神状态；实验结束后，随即处死裸鼠，手术剥取瘤块称重并测量其长度及宽度。依据测量结果计算得出相对肿瘤体积(relative tumorvolume，RTV)(公式见2)和相对肿瘤增殖率T/C(％)(公式见3)；
RTV＝Vt/V0 (公式2)
其中：
V0——d0测得的肿瘤体积(cm3)，
Vt——每次测量时测得的肿瘤体积(cm3)。
T/C(％)＝TRTV/CRTV×100 (公式3)
其中：
T/C(％)——相对肿瘤增殖率，
TRTV——治疗组相对肿瘤体积(cm3)，
CRTV——模型组相对肿瘤体积(cm3)。
表1小鼠体内实验组别设置
Figure BDA0003060889760000151
2、体重及血清生理生化指标检测
实验过程中隔天称量小鼠重量并详细记录。给药结束后，眼球取血法采取实验小鼠血液，每只大约取1ml全血；具体取血操作：左手固定小鼠；将小鼠眼眶周围的毛及胡须剪掉，以防止溶血；用弯头镊子挤压小鼠眼球，充血后摘下，将血液收集于抗凝管中，送至西北工业大学校医院检测血常规。
3、组织切片制备与观察
①脏器及肿瘤组织切片的制备与染色
用提前准备好的固定液固定新鲜组织，将目的部位的组织修平整后放于贴好标签的脱水盒内。如下依次进行梯度酒精脱水及浸蜡：先用浓度为75％、85％、90％、95％的酒精分别处理4h、2h、2h、1h；然后用无水乙醇I II分别处理30min，醇苯处理5-10min，二甲苯I、II分别处理5-10min；接着依次浸入65℃融化的石蜡I、II、III各1h；组织浸好蜡后，未等其凝固即将组织取出，按照包埋面的要求放入提前贴好标签纸的包埋框中，使组织在-20℃冻台中冷却至蜡凝固，将表面修理平整，使用石蜡切片机切成4μm厚的切片；用40℃温水浸泡切片使得组织展平后粘贴于载玻片上，60℃烘箱内至水分烤干、蜡烤化后取出常温放置。随后用二甲苯浸泡以脱掉石蜡，再用梯度浓度的乙醇脱掉二甲苯。待石蜡脱除干净后进行HE染色，先用PBS溶液充分浸泡清洗组织切片，随后在每个组织切片上滴加100μl预先配制的苏木素染色液充分染色10min；待结束染色，使用蒸馏水冲洗掉多余的染色液，随后用1％的盐酸乙醇进行分化以除去细胞中多余的苏木素染液。待分化完成，使用超纯水冲洗组织切片。为使得有更好的染色效果，在组织切片中加入呈弱碱性的促蓝液，将细胞核染成蓝；待返蓝结束，分别使用清水和超纯水清洗干净，后滴加伊红染液，充分染色3min；染色结束，使用梯度的乙醇溶液将组织切片脱水后，用二甲苯浸泡两次，每次约4min，随后将切片晾干并用中性树胶封片；最后使用二甲苯处理3min，以实现透明处理，然后使用显微镜进行图像采集。
②肿瘤组织切片的荧光tunel染色
按照①中步骤进行切片脱蜡，甩干后用组化笔在组织周围画圈，避免液体流走，然后在圈中组织上滴加可以没过组织的蛋白酶K工作液，置于保温箱内37℃温育25min，随后用PBS溶液浸泡清洗切片3次；清洗完成后甩干切片，在圈中组织上滴加可以没过组织的破膜工作液，常温孵育20min，随后用PBS溶液浸泡清洗切片3次；取tunel试剂盒中TdT、dUTP，按照1:9比例混合配制工作液并滴加于圈内组织，切片平放在湿盒中置于恒温箱，37℃孵育2h；孵育结束后将切片浸泡于PBS溶液内洗涤3次，甩干PBS后，在圈内滴加适量DAPI染色液，室温下避光孵育10min，充分染色后，用PBS将多余的染色液冲洗干净，晾干切片，滴加少量抗荧光淬灭剂以封片，然后使用荧光显微镜进行图像采集。
4、协同刺激聚合物胶束对IL-15和IL-2体内半衰期的影响
①实验采用5-6周健康的balb/c小鼠，雌雄不拘，实验前使小白鼠适应实验室环境一周，随后将小鼠随机分成4组(control组、PEG-PTMC组、IL-2+IL-15组、PEG-PTMC-IL-2/IL-15组)，所用PEG-PTMC-IL-2/IL-15为实施例2制备；
②按照表1用药量采用尾静脉注射给药；
③分别在处理5min、15min、30min、1h和2h后利用面颊取血针进行面颊取血，收集于干净的EP管中；
④3000r/min离心10min，分离血清；
⑤采用无菌水将血清稀释5倍，混匀；
⑥利用人IL-2和IL-15ELISA检测试剂盒分别测定小鼠血清中IL-2和IL-15的浓度；
⑦半衰期计算：通过静脉注射的药物，在特定剂量范围内，大部分的药物消除速率为一级，因此可以使用消除速率常数K来计算
Figure BDA0003060889760000171
即
Figure BDA0003060889760000172
而
Figure BDA0003060889760000173
因此，在获得原始数据后，将浓度c进行自然对数变换转为lnc，此时K就等价于lnc-t曲线斜率的绝对值，再利用最小二乘法进行一元线性回归拟合lnc-t，即可得较为精确得K值(相比任意取两个点所得的K值)，根据公式4求出游离IL-2、IL-15以及聚合物胶束的小鼠体内半衰期：
Figure BDA0003060889760000181
注：K为消除速率常数。
5、本发明的NK细胞协同刺激聚合物胶束体内抑制肿瘤活性研究结果：
(1)“协同刺激”聚合物胶束抗肿瘤活性检测
将MDA-MB-231乳腺癌细胞接种到雌性balb/c裸鼠体内，待瘤体生长至约50mm3，给药治疗，每日测量计算肿瘤大小，并绘制生长曲线，待处死小鼠后称量瘤体的重量并计算肿瘤抑制率。
结果如图6所示，初始给药时，四组实验小鼠的肿瘤体积较为一致，表明造模成功，在实验处理时间范围内，IL-2+IL-15组和PEG-PTMC-IL-2/IL-15(实施例2制备)组均可以有效抑制肿瘤生长，且相较于其他处理组，“协同刺激”聚合物胶束组能够更为显著的抑制瘤体的生长，减小瘤体体积；同时，根据各处理组的瘤重，可得PEG-PTMC组的肿瘤抑制率为8.13±5.3％，IL-2+IL-15组的肿瘤抑制率显著提高达到31.71±5.3％(P<0.001)；并且，PEG-PTMC-IL-2/IL-15组的肿瘤抑制率为65.85±4.5％(P<0.001)，显著高于IL-2+IL-15组；这些结果说明利用聚合物胶束负载的手段可显著提高游离细胞因子对乳腺癌异植瘤的抑制效果。
为了进一步考察“协同刺激”聚合物胶束的抗肿瘤活性，发明人进行了肿瘤组织的HE染色及tunel染色，结果显示，control组与PEG-PTMC组的肿瘤细胞排列较为致密，细胞核较大且被染料深染，并且各细胞核形状不一致，核分裂象增多。当采用游离的IL-2+IL-15或者PEG-PTMC-IL-2/15处理后，肿瘤组织出现了不同程度坏死，肿瘤细胞数减少，细胞核皱缩变圆，细胞排列松散、出现了大面积的细胞凋亡(如图7的a所示)，且相较于游离的IL-2+IL-15组，PEG-PTMC-IL-2/15组的肿瘤细胞凋亡程度更深。同时，发明人也采用了Tunel染色，观察所得与HE相同的结果；如图7的b所示，阳性细胞核(凋亡细胞)呈现出绿色，而蓝色则为DAPI复染后的细胞核，两种荧光重叠部分即是真实凋亡的细胞，呈淡蓝色，在control组与PEG-PTMC组，淡蓝色区域极少，而采用游离的IL-2+IL-15或者PEG-PTMC-IL-2/15处理后，两处理组均不同程度地显示出细胞凋亡作用，且PEG-PTMC-IL-2/15组得淡蓝色区域更为明显，经过分析荧光面积占比(图7的c)，发现IL-2+IL-15组及PEG-PTMC-IL-2/15组肿瘤细胞凋亡率更高，且PEG-PTMC-IL-2/15组显著高于IL-2+IL-15组，与前述实验结果一致，说明PEG-PTMC-IL-2/15可显著提高细胞因子对乳腺癌异植瘤的抑制效果。
(2)“协同刺激”聚合物胶束体内安全性评估
在为期14天的荷瘤小鼠实验结束后，所有小鼠均存活，而且实验期间未观察到任何临床毒性症状。实验过程中定期称量小鼠重量并详细记录，考察聚合物胶束对小鼠体重的影响；
如图8所示，与对照组相比，“协同刺激”聚合物胶束对小鼠的体重无显著影响。给药结束后，通过血常规中血细胞组成分析，检测聚合物胶束对机体炎症反应的影响；
如图9所示，各处理组血细胞组成包括白细胞数(WBC)、淋巴细胞百分比(LYMPH％)、单核细胞百分比(MONO％)和中性粒细胞百分比(NEUT％)均未见显著变化(p>0.05)，说明PEG-PTMC负载并未引起炎症反应。总之，这些结果初步表明该负载体系的生物安全性。
为了进一步分析“协同刺激”聚合物胶束的生物安全性，发明人又进行了组织切片染色以考察其对小鼠脏器的影响。
结果如图10显示，与对照组相比，各处理组小鼠组织的结构正常，细胞排列有序，细胞核细胞质清晰可见，没有呈现坏死现象。
上述结果表明，PEG-PTMC、游离的IL-2与IL-15以及PEG-PTMC-IL-2/15均不会对小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏造成损伤，进一步表明了该载药体系的生物安全性。
(3)半衰期检测
如图11结果显示，对于IL-2+IL-15组，IL-15的半衰期为12.46±1.2min，IL-2的半衰期为14.74±1.77min；而对于PEG-PTMC-IL-2/IL-15组，IL-15的半衰期为67.28±2.3min，IL-2的半衰期为48.46±2.96min；
相比游离细胞因子组，IL-2和IL-15在小鼠体内的半衰期提高了约4倍(p<0.001)，这应该是由于游离IL-2和IL-15的粒径一般小于1nm，而负载IL-2和IL-15的聚合物胶束的粒径在185.7nm左右，因此相比游离的IL-2和IL-15，负载IL-2和IL-15的聚合物胶束粒径较大，能有效降低肾小球滤过等过程，进而显著提高药物在小鼠体内的半衰期。
鉴于上述研究，还可利用NK细胞协同刺激聚合物胶束在制备治疗肿瘤药物的应用，将其作为活性组分，制备治疗肿瘤的药物。

Claims (10)

1.一种NK细胞协同刺激聚合物胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)向IL-2和IL-15的混合水溶液中加入催化量的TCEP，室温下进行反应，得到反应液；
2)向步骤1)得到的反应液中加入DBM-PEG-PTMC，室温下进行反应，得到反应物；
3)将步骤2)得到的反应物依次经透析、离心收集上清、浓缩后得NK细胞协同刺激聚合物胶束。
2.根据权利要求1所述NK细胞协同刺激聚合物胶束的制备方法，其特征在于：
IL-2和IL-15的质量之和与DBM-PEG-PTMC的质量之比为1∶5～20。
3.根据权利要求1或2所述NK细胞协同刺激聚合物胶束的制备方法，其特征在于：
步骤1)中，室温下搅拌反应30～40min；
步骤2)中，室温下搅拌反应0.5～2h。
4.根据权利要求3所述NK细胞协同刺激聚合物胶束的制备方法，其特征在于，步骤3)的具体步骤为：
3.1)将步骤2)得到的反应物置于3000～3500Da透析袋中透析1～2天，除去催化剂以及杂质，期间每4±0.5h换一次透析水；
3.2)透析结束后收集样品，1000～2000rpm/min离心5～20min，弃去下层絮状沉淀，收集上清液；
3.3)对步骤3.2)得到的上清液进行超滤浓缩除去未反应的IL-2和IL-15，得到NK细胞协同刺激聚合物胶束。
5.根据权利要求1所述NK细胞协同刺激聚合物胶束的制备方法，其特征在于：
步骤2)中，所述DBM-PEG-PTMC采用以下方法获得：
S1.制备N3-PEG-PTMC和alkynyl-DBM：
在氮气氛围和催化剂TBD存在的条件下，N3-PEG-OH和TMC的DMF溶液在室温下反应制备N3-PEG-PTMC；
向碳酸钾和2,3-二溴马来酰亚胺的丙酮溶液中滴加入溴丙炔，室温反应制备alkynyl-DBM；
S2.DBM-PEG-PTMC的合成：
将步骤S1制备的N3-PEG-PTMC和alkynyl-DBM与dNbpy的DMF溶液通过多次冷冻-抽气-解冻循环除去反应管中的气体，并在最后一次循环中加入溴化亚铜；随后将反应体系处于氮气氛围下继续反应制备DBM-PEG-PTMC。
6.根据权利要求5所述NK细胞协同刺激聚合物胶束的制备方法，其特征在于：
制备N3-PEG-PTMC时，N3-PEG-OH、TBD、TMC的摩尔比为1∶0.1～1∶30～80，反应时间为12h～36h；
制备alkynyl-DBM时，2,3-二溴马来酰亚胺、碳酸钾、溴丙炔的摩尔比为1∶1～1.5∶1～1.5，反应时间为12h～36h；
合成DBM-PEG-PTMC时，N3-PEG-PTMC、dNbpy、溴化亚铜、alkynyl-DBM的摩尔比为1∶0.1～1∶0.1～0.5∶1～1.5，反应时间为12h～36h。
7.一种NK细胞协同刺激聚合物胶束，其特征在于：采用权利要求1～6任一制备方法制得。
8.权利要求1-6任一权利要求所述方法制备的NK细胞协同刺激聚合物胶束在制备治疗肿瘤药物的应用。
9.一种治疗肿瘤的药物，其特征在于：其活性组分包括权利要求1-6任一所述方法制备的NK细胞协同刺激聚合物胶束。
10.根据权利要求9所述治疗肿瘤的药物，其特征在于：所述NK细胞协同刺激聚合物胶束中的IL-15和IL-2的有效含量分别至少为100U/ml。
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