CN110041522B - 一种聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物及其作为药物载体的应用 - Google Patents

一种聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物及其作为药物载体的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种聚乙二醇‑聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物，本发明还提供了上述键合物的制备方法，包括：(1)通过开环聚合制备得到聚乙二醇‑聚赖氨酸嵌段聚合物，或缩合反应制备得到聚乙二醇‑树枝状聚赖氨酸；(2)将上述步骤(1)制备得到的聚乙二醇‑聚赖氨酸与异硫氰酸酯类化合物反应，制备得到聚乙二醇‑聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物。本发明制备的键合物生物相容性好、生物安全性高、亲疏水性可调控，可以作为具有氢键相互作用的药物输送载体，该载体可形成分布均匀且包覆紧密的纳米胶束，载药率高、粒径小、体内稳定、系统毒性小且循环时间长。

Description

一种聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物及其作为药物载 体的应用
技术领域
本发明属于抗肿瘤纳米药物技术领域，具体涉及一种聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物及其作为药物载体的应用。
背景技术
临床上抗肿瘤化疗药物如紫杉醇、长春新碱、阿霉素及喜树碱等存在着水溶性差、毒副作用大及无靶向性等问题。纳米给药系统可解决上述问题，能够延长药物在血液循环系统中的半衰期、提高药物靶向性并降低药物毒副作用等。常用纳米药物体系有聚合物胶束、聚合物-药物键合物、脂质体纳米颗粒、蛋白类纳米颗粒等，目前已有多种纳米药物被批准上市或进行临床研究。
紫杉醇类抗肿瘤药物可抑制微管蛋白解聚，从而抑制细胞有丝分裂，已被用在乳腺癌、卵巢癌及非小细胞肺癌等癌症的治疗中。但其水溶性差，临床上使用的泰素(Taxol)是紫杉醇溶解在聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇1：1的混合溶剂中，生理盐水或5％葡萄糖注射液稀释，给药剂量135mg/m2，静脉滴注3h。但聚氧乙烯蓖麻油体内代谢释放组胺，会导致过敏反应、肾毒性和神经毒性，而且在体内循环中会阻碍紫杉醇进入肿瘤组织，降低药效，呈现非线性药代动力学关系。
目前以安全靶向为目的的紫杉醇新型制剂已有大量报道，其中一些已经被批准上市。白蛋白溶剂型纳米紫杉醇(Abraxane)由美国生命科学公司(American Bioscience)生产，于2005年被FDA批准上市，用于转移性乳腺癌的治疗，2008年在中国上市，商品名凯素。该药以人血白蛋白为载体，用高压均化法形成130纳米大小的紫杉醇颗粒，临床研究表明，Abraxane每三星期注射一次，最大耐受剂量300mg/m2，推荐给药剂量260mg/m2，静脉滴注0.5h，不需预给药，但其药代动力学与Taxol几乎相同。
用于药物递送的两亲性共聚物具有稳定性好、载药量高和易于多功能化等优点。含有亲水性链段和疏水性链段的聚合物在浓度高于临界胶束浓度(CMC)时，会形成以疏水段为核亲水段为壳的聚合物胶束结构。疏水性药物通过疏水、静电及氢键等作用装载于聚合物胶束疏水内核，形成载药纳米颗粒。胶束的粒径和表面性质会影响药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄规律。用于药物递送的两亲性共聚物常以甲氧基聚乙二醇(MePEG)为亲水段，聚酯或聚氨基酸衍生物等作为疏水部分，如聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚谷氨酸(PGlu)和聚赖氨酸(PLL)衍生物等；如文献(Kato K,Chin K,Yoshikawa T,et al.Phase IIstudy of NK105,a paclitaxel-incorporating micellar nanoparticle,forpreviously treated advanced or recurrent gastric cancer[J].InvestigationalNew Drugs.2012,30(4):1621-1627.)报道了紫杉醇纳米胶束NK105，以聚乙二醇为亲水端、4-苯基-1-丁醇修饰的聚天冬氨酸为疏水端，胶束粒径约85nm，载药量为23％，推荐给药剂量150mg/kg，每三星期注射一次，不需预给药。药物曲线下面积是Taxol的90倍且可以实现肿瘤的富集，在结肠癌和非小细胞肺癌动物模型上显示良好的抑瘤效果，目前正在日本进行Ⅲ期临床试验。
文献(Kim S C,Kim D W,Shim Y H,et al.In vivo evaluation of polymericmicellar paclitaxel formulation:toxicity and efficacy[J].J ControlRelease.2001,72(1-3):191-202.)报道了一种甲氧基聚乙二醇-聚乳酸嵌段聚合物(PEG-PLA)作为载体、通过物理作用将紫杉醇包埋在内核所形成的小于50nm的紫杉醇纳米胶束Genexol-PM。由韩国Samyang公司研制并于2007年在韩国上市，主要用于乳腺癌及非小细胞肺癌的一线治疗，在美国正进行Ⅲ期临床实验；动物模型试验显示，Genexol-PM的最大耐受剂量是Taxol的40倍，是一种高效安全的高剂量给药途径。但药代动力学评价显示该Genexol-PM胶束存在着体内半衰期短的问题，这是由于胶束在体内稳定性不佳、在体内循环过程中，各种蛋白作用使胶束解离，导致负载的药物被释放到血液里而被清除。
因此，如何制备体内稳定、系统毒性小且循环时间长、疗效更高的纳米胶束，是抗肿瘤药物的函待解决的重要问题。
发明内容
本发明提供了一种聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物，为聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物的嵌段聚合物或聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物，其为下式I所示化合物或式Ⅱ所示化合物中的任一种：
Figure GDA0001621021060000031
其中，R为烷基、烯基、芳香基或它们的酰基；x、y为结构单元数，x＝8～500，y＝1～200；
Figure GDA0001621021060000032
Figure GDA0001621021060000041
其中，R的定义与式I相同，n为结构单元数，n＝8～500。
作为优选，R为乙基、己基、环己基乙基、己酰基、环己酰基、烯丙基、苯甲基、苯乙基、苯丙基、苯甲酰基、苯乙酰基、苄氧基苯基、甲基硫代苯基或萘基。
进一步优选，R为苯乙基。
本发明还提供了上述聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物的制备方法，操作简单、易行，包括：
(1)通过常规方法制备聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸聚合物：
通过甲氧基聚乙二醇氨基(PEG-NH2)和N,N'-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸五氟苯酚酯(Boc-Lys(Boc)-OPFP)的缩合反应制备得到聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸，具体包括以下步骤：
(a)N,N'-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸(Boc-Lys(Boc)-OH)、2,3,4,5,6-五氟苯酚(PFP)和N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)溶解在有机溶剂中，0～30℃搅拌6～48h后，重结晶得到产物N,N'-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸五氟苯酚酯(Boc-Lys(Boc)-OPFP)；
所述的重结晶用不良溶剂为异丙醚、乙醚、正己烷、乙酸乙酯和氯仿中的一种或多种。
(b)惰性气体保护下，将PEG-NH2、N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)和上述步骤(a)制得的Boc-Lys(Boc)-OPFP溶解于干燥有机溶剂中，0～30℃下搅拌6～48h进行缩合反应，待反应结束后，用沉淀剂沉淀，得到叔丁氧羰基保护的聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸；产物经三氟乙酸/二氯甲烷脱保护反应后，再用沉淀剂沉淀，得到第一代聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸聚合物；继续通过缩合反应和脱保护反应制备得到高代数聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸聚合物；
所述的Boc-Lys(Boc)-OH、PFP和DCC的摩尔比为1：0.5～5：0.5～5；
所述的PEG-NH2、Boc-Lys(Boc)-OPFP和DIPEA的摩尔比为1：0.5～10：0.5～10；
(2)通过常规方法制备聚乙二醇-聚赖氨酸嵌段聚合物：
以PEG-NH2为大分子引发剂，通过与N-ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸酐(Lys-(Z)-NCA)开环聚合制备得到聚乙二醇-聚赖氨酸嵌段聚合物，具体包括以下步骤：
(a′)N-ε-苄氧羰基-L-赖氨酸(L-Lys(Cbz)-OH)溶于有机溶剂，加热回流后逐滴加入溶有三光气(Triphosgene)的有机溶剂，4～60℃搅拌至反应液澄清，通入氮气以除去光气和HCl气体，将反应液浓缩后用沉淀剂沉淀，后处理得到产物N-ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸酐(Lys-(Z)-NCA)；
所述的后处理包括重结晶和真空干燥。
(b′)惰性气体保护下，Lys-(Z)-NCA溶于有机溶剂，加入大分子引发剂PEG-NH2，4～45℃搅拌6～48h进行开环聚合反应，待反应结束后，沉淀剂沉淀，得到苄氧羰基保护的聚乙二醇-聚赖氨酸(PEG-PLL-Cbz)；将其溶于三氟乙酸，再加氢溴酸/醋酸进行脱保护反应，然后用沉淀剂沉淀，加入去离子水静置分层，分离水相，调节pH至8～10，透析12～48h，冻干得到聚乙二醇-聚赖氨酸嵌段聚合物；
所述的L-Lys(Cbz)-OH和Triphosgene的摩尔比为1：0.5～5；
所述的PEG-NH2和Lys-(Z)-NCA的摩尔比为1：1～200；
所述的透析所用的溶剂为甲醇、水和二甲基亚砜中的一种或多种；
所述透析截留分子量为1000～5000。
(3)将上述步骤(1)制备得到的聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸或步骤(2)制备得到的聚乙二醇-聚赖氨酸嵌段聚合物溶于有机溶剂中，加入异硫氰酸酯类化合物和有机碱，4～45℃搅拌6～48h后，透析12～48h，再用沉淀剂沉淀，得到聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物；
所述的聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸或聚乙二醇-聚赖氨酸嵌段聚合物和异硫氰酸酯的摩尔比1：1～200；
所述的有机碱为三乙胺、吡啶、N,N-二异丙基乙胺或二乙胺等；
所述的透析所用的溶剂为甲醇、水和二甲基亚砜中的一种或多种；
所述透析截留分子量为1000～10000。
步骤(1)～(3)中，所述的有机溶剂为二氧六环、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲醇、乙酸乙酯或二氯甲烷等。
步骤(1)～(3)中，所述的沉淀剂为异丙醚、乙醚或正己烷等。
步骤(3)中，所述的异硫氰酸酯类化合物为苯甲基异硫氰酸酯、苯乙基异硫氰酸酯、苯甲酰基异硫氰酸酯、苄氧基苯基异硫氰酸酯、己基异硫氰酸酯、异硫氰酸烯丙酯、环己基乙基异硫氰酸酯、苯基丙基异硫氰酸酯、甲基硫代苯基异硫氰酸酯和萘异硫氰酸酯等中的一种。
异硫氰酸酯类化合物优选为苯乙基异硫氰酸酯，这是因为苯乙基异硫氰酸酯(Phenethyl isothiocyanate，PEITC)抗肿瘤活性高、生物安全性好，其抗肿瘤机制包括抑制Ⅰ相酶活性，激活Ⅱ相脱毒/抗氧化酶和caspase酶家族，清除谷胱甘肽(GSH)并抑制GSH过氧化物酶(GPX)而引发细胞凋亡等。此外，苯乙基异硫氰酸酯具有苯环结构，且与氨基反应生成硫脲基团，苯环和硫脲基团与紫杉醇间存在π-π作用和氢键相互作用，从而提高载药能力，并且增强聚合物胶束的稳定性。
本发明制备得到的两亲性聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物，生物相容性好、生物安全性高、亲疏水性可调控；聚合物侧链氨基与异硫氰酸酯反应生成的硫脲基团，是一种良好的氢键受体，通过其自身及与药物分子的相互作用，有利于负载药物、增加纳米给药胶束的稳定性。尤其重要的是，研究表明，一些硫脲基团具有潜在的抑瘤作用，可以与携带的抗肿瘤药物进行协同作用，增强抗肿瘤效果。
本发明通过常规纳米给药胶束的制备方法——薄膜水化法或透析法包载疏水性药物，制备包载有疏水性药物的聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物纳米胶束，具体制备工艺如下：
采用薄膜水化法：将聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物和疏水性药物溶于有机溶剂A中形成载体溶液，其中疏水性药物浓度为1～10g/L；30～70℃减压旋转蒸发成膜，一边搅拌一边缓慢滴加水，即形成纳米胶束。有机溶剂A与水的体积比为1：1～10。
或采用透析法：将聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物和疏水性药物溶于有机溶剂B中形成载体溶液，其中疏水性药物浓度为1～10g/L；一边搅拌一边逐滴滴入水中，即形成胶束，透析12～48h除去有机溶剂。有机溶剂B与水的体积比为1：10～50。
所述的有机溶剂A为乙腈、三氯甲烷、二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮和四氢呋喃中的一种或多种。
所述的有机溶剂B为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、乙腈、三氯甲烷、二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮和四氢呋喃中的一种或多种。
所述的疏水性药物选自紫杉醇、多西他赛、长春新碱、阿霉素或喜树碱等。
本发明制备的包载有疏水性药物的聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物纳米胶束的粒径为5～1000nm。
作为优选，所述的纳米胶束平均粒径小于0.2微米，这是因为：由于肿瘤组织内皮细胞的不连续性，粒径小于0.2微米的粒子可以通过血管壁进入肿瘤间隙，有利于药物在肿瘤部位的富集，从而较少毒副作用，提高治疗效果。
本发明制备得到的纳米胶束载药率高、粒径小、体内稳定、系统毒性小且循环时间长；包载抗肿瘤药物后的聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物纳米胶束可溶于注射用水、葡萄糖或生理盐水，制成pH在5.0～7.0的注射液。
本发明以聚乙二醇-聚赖氨酸与异硫氰酸酯反应制备两亲性聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物，作为安全高效的疏水性药物的递送载体，其特点是：(1)聚赖氨酸单体采用天然L-赖氨酸，具有生物相容性好、体内可被降解的特点；(2)异硫氰酸酯类化合物广泛存在于花椰菜、橄榄、圆白菜等十字花科蔬菜中，生物安全性高，且研究表明有些异硫氰酸酯类化合物本身具有抗肿瘤活性；(3)异硫氰酸酯与氨基反应生成的硫脲基团，作为一种氢键受体，通过其自身及与药物分子的相互作用，有利于负载药物、增加胶束的稳定性。尤其重要的是，研究表明，一些硫脲基团具有潜在的抑瘤作用，可以与携带的抗肿瘤药物进行协同作用。(4)异硫氰酸酯基团很活泼，易于与赖氨酸残基的氨基反应，因而可容易地将不同的异硫氰酸酯基团引入到聚赖氨酸，调控其亲疏水性、药物/载体相互作用、药物的载药量、纳米颗粒的稳定性及药物释放行为等。
作为实例，本发明制备得到的第三代聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/苯乙基异硫氰酸酯键合物包载紫杉醇的纳米胶束(PEG-G3-PEITC/PTX)，其粒径分布为0.130，电势为-6.69mV，平均尺寸为31.03nm。PEG-G3-PEITC/PTX的消除相半衰期(T1/2beta)为16.849±4.291h，血浆药物浓度-时间曲线下面积(AUC)为445.828±178.080μg/mL*h。与作为对照的聚乙二醇-聚乳酸包载紫杉醇(PEG-PLA/PTX)相比，PEG-G3-PEITC/PTX的T1/2beta延长了1.7倍，AUC增加了2倍。抑瘤实验表明，PEG-G3-PEITC/PTX的治疗效果优于PEG-PLA/PTX。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明制备得到的两亲性聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物，生物相容性好、生物安全性高、亲疏水性可调控；可通过将不同的异硫氰酸酯基团引入到聚赖氨酸，调控其亲疏水性，进而调控其与所负载药物的相互作用、载药量、纳米颗粒的稳定性及药物释放行为等。
(2)本发明制备得到的包载疏水性药物胶束载药效率高，粒径小且分布良好，通过载体与所负载药物的相互作用增强胶束稳定性。
(3)本发明制备的胶束，血液循环时间长、体内稳定、系统毒性小且疗效更高。
附图说明
图1为本发明实施例2制备的聚乙二醇-聚赖氨酸/苯乙基异硫氰酸酯键合物的1HNMR图；其中，图1(a)为第三代聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/苯乙基异硫氰酸酯键合物PEG-G3-PEITC的1H NMR图；图1(b)为第四代聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/苯乙基异硫氰酸酯键合物PEG-G4-PEITC的1H NMR图；图1(c)为聚乙二醇-聚赖氨酸/苯乙基异硫氰酸酯键合物的嵌段聚合物PEG-PLL20-PEITC的1H NMR谱图；图1(d)为聚乙二醇-聚赖氨酸/苯乙基异硫氰酸酯键合物的嵌段聚合物PEG-PLL16-PEITC的1H NMR谱图。
图2为本发明实施例3制备的第三代聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/苯乙基异硫氰酸酯键合物包载紫杉醇(PEG-G3-PEITC/PTX)后及对比例1中作为对照的聚乙二醇-聚乳酸包载紫杉醇(PEG-PLA/PTX)在水中的动态光散射图(PTX的含量1mg/mL)；其中图2(a)为实施例3制备的第三代聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/苯乙基异硫氰酸酯键合物包载紫杉醇(PEG-G3-PEITC/PTX)后在水中的动态光散射图；图2(b)为作为对照的聚乙二醇-聚乳酸包载紫杉醇(PEG-PLA/PTX)在水中的动态光散射图。
图3为本发明实施例3制备的PEG-G3-PEITC/PTX纳米胶束及对比例1制备的PEG-PLA/PTX纳米胶束的透射电子显微镜(TEM)图；其中图3(左)为实施例3制备的PEG-G3-PEITC/PTX纳米胶束的透射电子显微镜(TEM)图；图3(右)为对比例1制备的PEG-PLA/PTX纳米胶束的透射电子显微镜(TEM)图。
图4为本发明性能测试3中纳米胶束PEG-G3-PEITC/PTX和纳米胶束PEG-PLA/PTX的体外释放曲线。
图5为本发明应用例1中PEG-G3、PEG-G3-PEITC和PEG-PLA的体外抗人宫颈癌HeLa细胞增殖曲线图。
图6为本发明应用例1中PEG-G3-PEITC/PTX、PEG-PLA/PTX和紫杉醇PTX的体外抗人宫颈癌HeLa细胞增殖曲线图。
图7为本发明应用例1中PEG-G3、PEG-G3-PEITC和PEG-PLA的体外抗人乳腺癌MCF-7细胞增殖曲线图。
图8为本发明应用例1中PEG-G3-PEITC/PTX、PEG-PLA/PTX和紫杉醇PTX的体外抗人乳腺癌MCF-7细胞增殖曲线图。
图9为本发明应用例2中纳米胶束PEG-G3-PEITC/PTX和纳米胶束PEG-PLA/PTX的血浆清除曲线。
图10为本发明应用例3中PEG-G3-PEITC/PTX、PEG-PLA/PTX和磷酸盐缓冲液(PBS)三组制剂在MCF-7荷瘤裸鼠抑瘤实验中所获得的相对肿瘤体积-时间曲线图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物及其作为药物载体的应用进行具体描述，但本发明并不限于这些实施例。该领域熟练技术人员根据本发明核心思想指导下所做的非本质改变，仍然属于本发明的保护范围。
实施例1：聚乙二醇-聚赖氨酸聚合物的合成
聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸聚合物的合成方法如下：
N,N'-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸(Boc-Lys(Boc)-OH，25g，72.2mmol)和2,3,4,5,6-五氟苯酚(PFP，15.9g，86.6mmol)溶解在二氧六环中，在0℃下加入N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC，17.8g，86.6mmol)，反应液逐渐升值至室温，搅拌过夜，异丙醚中重结晶，得到白色固体N,N'-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸五氟苯酚酯(Boc-Lys(Boc)-OPFP，28.6g)；
甲氧基聚乙二醇氨基(PEG5k-NH2，1g，0.2mmol)、Boc-Lys(Boc)-OPFP(0.31g，0.6mmol)和N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA，0.2mL，0.6mmol)溶解在20mL干燥的二氯甲烷中，室温氮气保护下搅拌过夜，将反应液浓缩，冰乙醚中沉淀，得到叔丁氧羰基保护的第一代聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸；将产物加入到10mL三氟乙酸/二氯甲烷(1：1)混合溶剂中进行脱保护反应，反应3h后，将反应液浓缩，冰乙醚中沉淀，得到第一代聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸聚合物PEG-G1；继续通过缩合反应和脱保护反应制备得到高代数聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸聚合物(PEG-G2，PEG-G3，PEG-G4)。
聚乙二醇-聚赖氨酸嵌段聚合物的合成方法如下：
N-ε-苄氧羰基-L-赖氨酸(L-Lys(Cbz)-OH，10g，35.6mmol)，溶于200mL乙酸乙酯，加热回流后逐滴加入三光气(Triphosgene，7g，23.6mmol)的乙酸乙酯溶液(50mL)，50℃条件下反应，待反应液变成澄清后，通入氮气以除去光气和HCl气体，将反应液浓缩，滴加到正己烷中沉淀产物，乙酸乙酯-正己烷(1∶1)重结晶，真空干燥，得到产物N-ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸酐(Lys-(Z)-NCA)；
PEG5k-NH2(1g，0.2mmol)和Lys-(Z)-NCA(1.2g，4mmol)溶于10mL的二甲基甲酰胺中，40℃氮气保护下反应48h，冰乙醚中沉淀，抽滤，通过开环聚合制备得苄氧羰基保护的聚乙二醇-聚赖氨酸(PEG-PLL-Cbz)。将产物PEG-PLL-Cbz溶于2mL三氟乙酸，再加入10mL氢溴酸/醋酸(1∶2)进行脱保护反应，室温下反应2h，冰乙醚沉淀，加入去离子水静置分层，分离水相，调节pH至8-10，在水中透析(截留分子量3500)48h，冻干，得所述的聚乙二醇-聚赖氨酸嵌段聚合物，记为PEG-PLL。
实施例2：聚乙二醇-聚赖氨酸/苯乙基异硫氰酸酯键合物的制备
以第三代聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/苯乙基异硫氰酸酯键合物(PEG-G3-PEITC)的制备为例，以PEG-G3的氨基摩尔数与苯乙基异硫氰酸酯摩尔数比例为1：1投料：PEG-G3(500mg，0.073mmol)和苯乙基异硫氰酸酯(PEITC，100mg，0.613mmol)溶于4mL二甲基亚砜中，加入三乙胺(Triethylamine，TEA，Mw＝101.19)120μL，45℃反应12h。将反应液装入透析袋(截留分子量3500)中，甲醇透析24h，减压旋蒸除去甲醇，乙醚中沉淀，得到白色粉末，记为PEG-G3-PEITC。以氘带二甲基亚砜为溶剂，通过核磁表征键合物结构，1H NMR谱图如图1(a)所示。
同法制备聚乙二醇-第四代树枝状聚赖氨酸/苯乙基异硫氰酸酯键合物，记为PEG-G4-PEITC。以氘带二甲基亚砜为溶剂，通过核磁表征键合物结构。1H NMR谱图如图1(b)所示。
聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/苯乙基异硫氰酸酯键合物的合成路线为：
Figure GDA0001621021060000121
同法制备聚乙二醇-聚赖氨酸/苯乙基异硫氰酸酯键合物的嵌段聚合物，分别记为PEG-PLL20-PEITC和PEG-PLL16-PEITC，其中，数字为赖氨酸的结构单元数。以氘带二甲基亚砜为溶剂，通过核磁表征聚合物结构。PEG-PLL20-PEITC的1H NMR谱图如图1(c)所示；PEG-PLL16-PEITC的1H NMR谱图如图1(d)所示。
聚乙二醇-聚赖氨酸/苯乙基异硫氰酸酯键合物的嵌段聚合物的合成路线为：
Figure GDA0001621021060000122
实施例3：聚乙二醇-聚赖氨酸/苯乙基异硫氰酸酯键合物包载紫杉醇
采用薄膜水化法包载抗肿瘤药物：
将PEG-G3-PEITC(7.5mg)和紫杉醇(2.5mg)溶于1mL乙腈中，40℃减压旋转蒸发成膜。然后一边搅拌一边缓慢滴加等温的去离子水(2.5mL)，即形成纳米胶束，记为PEG-G3-PEITC/PTX，其在水中的动态光散射图(PTX的含量1mg/mL)如图2(a)所示，由图可知，纳米胶束粒径分布为0.130，电势为-6.69mV，平均尺寸为31.03nm。同法制备PEG-G4-PEITC包载紫杉醇胶束。
透射电子显微镜(TEM)观察PEG-G3-PEITC/PTX胶束的形态，其TEM图如图3(左)所示，由图可以看到直径约30nm的球形颗粒。
采用透析法包载抗肿瘤药物：
PEG-PLL20-PEITC或PEG-PLL16-PEITC(9mg)和紫杉醇(1mg)溶于0.2mL二甲基亚砜中，逐滴滴入2mL去离子水中，透析12h，得到包载紫杉醇的纳米胶束。利用动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)测定纳米胶束的粒径、分布及电势。结果汇总于表1。
对比例1：聚乙二醇-聚乳酸包载紫杉醇
采用薄膜水化法包载抗肿瘤药物：
将聚乙二醇-聚乳酸(PEG2k-PLA2k，7.5mg)和紫杉醇(2.5mg)溶于1mL乙腈中，40℃减压旋转蒸发成膜，一边搅拌一边缓慢滴加等温的去离子水(2.5mL)，即形成纳米胶束，记为PEG-PLA/PTX，其在水中的动态光散射图如图2(b)所示，由图可知，纳米胶束粒径分布为0.232，电势为-4.85mV，平均尺寸为38.87nm。
透射电子显微镜(TEM)观察PEG-PLA/PTX胶束的形态，其TEM图如图3(右)所示，由图可以看到分散良好，直径约40nm的球形颗粒。
性能测试1：纳米胶束临界胶束浓度(CMC)测定
尼罗红作为一种疏水性染料，在疏水环境中会发射荧光，而在水环境中不产生荧光。按照实验设计浓度梯度制备胶束水溶液，配置10-4M的尼罗红二氯甲烷溶液，取30μL上述溶液于菌种瓶中，无盖避光条件下使其挥发，分别加入3mL不同浓度空白胶束水溶液，尼罗红终浓度10-6M，避光搅拌24h，激发波长579nm，用酶标仪检测620nm发射波长的荧光强度。以胶束浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，拟合得到两条直线，交点即为聚合物的CMC。
上述制备得到的聚乙二醇-聚赖氨酸/苯乙基异硫氰酸酯聚合物的亲疏水段比例和CMC及包载紫杉醇形成纳米胶束的粒径、分布、包封率和载药量汇总如下：
表1：
Figure GDA0001621021060000141
从表1中可以看出，PEG-G3-PEITC包载紫杉醇可形成粒径为31.03nm的胶束，粒径分布为0.130，包封率为98.3％，载药率为23.7％。PEG-G3-PEITC作为载体对紫杉醇的负载效果好，制备工艺简单，可制备得到包封率高、载药率高、粒径小、分布均匀且包覆紧密的纳米胶束。
性能测试2：纳米胶束冻干稳定性研究
测定实施例3中制备的第三代聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/苯乙基异硫氰酸酯键合物包载紫杉醇(PEG-G3-PEITC/PTX)纳米胶束的冻干稳定性，具体工艺如下：
220nm过滤器过滤，粒径为31.03nm，加入2％甘露醇，真空冷冻干燥，得到疏松白色粉末。用去离子水复溶，放置于室温，8h内纳米胶束的平均粒径稳定，见表2。
表2
时间(h) 0 1 2 5 8
粒径(nm) 34.21 33.52 33.14 37.72 33.45
粒径分布 0.308 0.354 0.373 0.401 0.401
从表2可以看出，该纳米胶束冻干复溶后粒径稳定，分布良好。
性能测试3：纳米胶束的体外释放
测定实施例3中制备的第三代聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/苯乙基异硫氰酸酯键合物包载紫杉醇(PEG-G3-PEITC/PTX)纳米胶束和对比例1制备的聚乙二醇-聚乳酸包载紫杉醇(PEG-PLA/PTX)纳米胶束的体外释放曲线。配置含有0.5％吐温-80的PBS缓冲液(0.01M，pH 7.4和pH 5.4)，将0.5mL纳米胶束溶液置于截留分子量3500的透析袋内，PTX当量浓度为1mg/mL，释放介质体积为50mL。置于37℃，120rpm的恒温摇床中孵育，在实验设定时间内取样100μL，同时补加等体积释放介质，样品加入300μL乙腈混匀，经0.22μm过滤后采用HPLC法测定其在227nm下的峰面积，定量分析紫杉醇的释放量，计算药物释放百分率，绘制体外释放曲线。实验结果如图4所示。
从图4中可以看出，在pH 7.4条件下孵育48h，PEG-G3-PEITC/PTX和PEG-PLA/PTX分别释放了50％和70％。可能由于PEG-G3-PEITC/PTX的内核具有更好的稳定性，PEG-G3-PEITC/PTX的释放速率较慢。而在pH5.4条件下，48h后PEG-G3-PEITC/PTX和PEG-PLA/PTX分别释放了70％和80％，二者的释放速率相近。
应用例1：体外抗癌细胞增殖实验
以实施例1-3制备的PEG-G3、PEG-G3-PEITC、PEG-PLA、PEG-G3-PEITC/PTX和对比例1制备的PEG-PLA/PTX为样品，分别用人乳腺癌MCF-7细胞和人宫颈癌HeLa细胞进行48小时抗癌细胞增殖效果的实验，并给出小分子紫杉醇在人乳腺癌MCF-7细胞和人宫颈癌HeLa细胞的细胞毒性实验结果进行对比。实验结果如图5-8所示。
从图5-8中可以看出，本发明中制备的聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/苯乙基异硫氰酸酯键合物对于细胞的增殖在一定的浓度范围下几乎没有影响。包载紫杉醇的胶束PEG-G3-PEITC/PTX和PEG-PLA/PTX的细胞毒性呈现浓度依赖性，与小分子紫杉醇显示一致的细胞毒性。
应用例2：纳米胶束的药物代谢动力学研究
考察实施例3中制备的第三代聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/苯乙基异硫氰酸酯键合物包载紫杉醇(PEG-G3-PEITC/PTX)纳米胶束和对比例1制备的聚乙二醇-聚乳酸包载紫杉醇(PEG-PLA/PTX)纳米胶束的药物代谢动力学参数。研究是以ICR小白鼠(6-8周，体重约20g)为动物模型，每组设三只动物做平行实验。通过尾静脉给药，等效紫杉醇剂量为10mg/kg，分别在给药后3min和0.5、1、2、6、12、24、36h通过眼眶取血于肝素润洗过的离心管里，立即5000rpm，4℃条件下离心10分钟，取50μL血浆，加入三倍血浆体积的乙腈(150μL)沉淀蛋白，振荡后5000rpm，4℃条件下离心5分钟，然后取上清液过0.22μm有机相滤膜，用于HPLC进样检测紫杉醇浓度，绘制紫杉醇浓度随时间变化曲线，即血浆清除曲线，如图9所示；从图9中可以看出，与PEG-PLA/PTX相比，PEG-G3-PEITC/PTX的体内清除较慢。
采用二室模型计算药代动力学参数，汇总于表3：
表3
参数 单位 PEG-PLA/PTX PEG-G3-PEITC/PTX
T<sub>1/2</sub>alpha h 0.125±0.040 0.712±0.174
T<sub>1/2</sub>beta h 10.419±1.586 16.849±4.291
AUC<sub>0-t</sub> μg/mL*h 220.917±34.860 445.828±178.080
MRT h 14.285±1.897 22.488±6.361
V<sub>ss</sub> mg/kg/(μg/mL) 0.591±0.032 0.399±0.143
T1/2alpha：分布相半衰期；T1/2beta：消除相半衰期；AUC0-t：血浆药物浓度-时间曲线下面积；MRT：平均滞留时间；Vss：表观分布容积
表3中的药代动力学参数显示，PEG-G3-PEITC/PTX的消除相半衰期(T1/2beta)为16.849±4.291h，血浆药物浓度-时间曲线下面积(AUC)为445.828±178.080μg/mL*h。与PEG-PLA/PTX相比，PEG-G3-PEITC/PTX的T1/2beta延长了1.7倍，AUC增加了2倍。PEG-G3-PEITC/PTX的药物平均滞留时间(MRT)长，表明PEG-G3-PEITC/PTX的体内清除速率较慢。更小的表观分布容积(Vss)，表明PEG-G3-PEITC/PTX的非靶向组织分布更少。较小的粒径和较长的循环时间有助于肿瘤部位的蓄积，达到更好的治疗效果，因此，PEG-G3-PEITC/PTX具有优于PEG-PLA/PTX的药物代谢动力学特征。
应用例3：抗肿瘤活性试验
考察三组不同制剂对接种MCF-7乳腺癌细胞的裸鼠的肿瘤生长抑制作用。具体为：在BALB/c-nu/nu裸鼠腋下移植7×106个MCF-7细胞，待肿瘤体积约100mm3时分组开始给药，每两天进行尾静脉注射，共给药五次。
组Ⅰ：采用实施例3制备的第三代聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/苯乙基异硫氰酸酯键合物作为载体包载紫杉醇的纳米胶束(PEG-G3-PEITC/PTX，等效PTX剂量为10mg/kg裸鼠)。
组Ⅱ：采用对比例1制备的聚乙二醇-聚乳酸作为载体包载紫杉醇的纳米胶束(PEG-PLA/PTX，等效PTX剂量为10mg/kg裸鼠)。
组Ⅲ：磷酸盐缓冲液阴性对照组(PBS)。
第一次给药时记为第0天，每两天记录肿瘤的长短径和裸鼠体重，计算肿瘤体积V(V＝[Length×(Width)2]/2)，相对肿瘤体积＝肿瘤体积V/初始肿瘤体积×100％，绘制相对肿瘤体积-时间曲线。停药后继续观察肿瘤的生长情况和裸鼠状态，于开始给药后的第40天处死老鼠。实验结果如图10所示。
从图10中可以看出，给药期内，PEG-G3-PEITC/PTX组和PEG-PLA/PTX组的裸鼠肿瘤的生长受到一定程度的抑制，抑瘤效果无明显差异。停药后，PEG-G3-PEITC/PTX组无明显反弹，但PEG-PLA/PTX组裸鼠肿瘤在18天时开始反弹。PEG-G3-PEITC/PTX组与PBS对照组的肿瘤有显著性差异(p<0.0005)，同剂量给药条件下，与PEG-PLA/PTX组有显著性差异(p＝0.0438)。结果表明，PEG-G3-PEITC/PTX的治疗效果优于PEG-PLA/PTX。PBS组在第16天处死，所有组别的小鼠在实验过程中体重均没有下降。

Claims (10)

1.一种聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物，其特征在于，其结构为式I或式Ⅱ(2)～Ⅱ(15)所示化合物中的任一种：
Figure FDA0002427249910000011
其中，x、y为结构单元数，x＝8～500,y＝1～200且不为1；R为烷基、烯基、芳香基或它们的酰基；
Figure FDA0002427249910000012
Figure FDA0002427249910000021
其中，n为结构单元数，n＝8～500；R的定义与式I相同。
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物，其特征在于，R为乙基、己基、环己基乙基、己酰基、环己酰基、烯丙基、苯甲基、苯乙基、苯丙基、苯甲酰基、苯乙酰基或萘基。
3.一种根据权利要求1或2所述的聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸聚合物和聚乙二醇-聚赖氨酸嵌段聚合物；
(2)将上述步骤(1)制备得到的聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸或聚乙二醇-聚赖氨酸嵌段聚合物溶于有机溶剂中，加入异硫氰酸酯类化合物和有机碱，4～45℃搅拌6～48h后，透析12～48h，再用沉淀剂沉淀，得到聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物。
4.根据权利要求3所述的聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物的制备方法，其特征在于，所述的异硫氰酸酯类化合物为苯甲基异硫氰酸酯、苯乙基异硫氰酸酯、苯甲酰基异硫氰酸酯、己基异硫氰酸酯、异硫氰酸烯丙酯、环己基乙基异硫氰酸酯、苯基丙基异硫氰酸酯和萘异硫氰酸酯中的一种。
5.根据权利要求3所述的聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物的制备方法，其特征在于，所述的聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸或聚乙二醇-聚赖氨酸嵌段聚合物和异硫氰酸酯的摩尔比1：1～200。
6.根据权利要求3所述的聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物的制备方法，其特征在于，所述的有机碱为三乙胺、吡啶、N,N-二异丙基乙胺或二乙胺。
7.根据权利要求3所述的聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物的制备方法，其特征在于，所述透析截留分子量为1000～10000。
8.一种根据权利要求1或2所述的聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物包载有疏水性药物的纳米胶束的制备方法，其特征在于，包括：
先将聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物和疏水性药物溶于有机溶剂形成载体溶液，再通过薄膜水化法或透析法包载疏水性药物，后处理得到包载有疏水性药物的聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物纳米胶束。
9.根据权利要求8所述的包载有疏水性药物的聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述的疏水性药物选自紫杉醇、多西他赛、长春新碱、阿霉素或喜树碱中的一种。
10.根据权利要求1所述的聚乙二醇-聚赖氨酸/异硫氰酸酯键合物在制备药物输送载体中的应用。
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