CN105153428A

CN105153428A - 一种用于粘液渗透的pH响应性高分子胶束及其制备方法

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Publication number: CN105153428A
Application number: CN201510382500.0A
Authority: CN
Inventors: 常津; 房蕾; 宫晓群; 张健; 杨文涛
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2015-07-02
Filing date: 2015-07-02
Publication date: 2015-12-16
Anticipated expiration: 2035-07-02
Also published as: CN105153428B

Abstract

本发明涉及一种用于粘液渗透的pH响应性高分子胶束及其制备方法；通过pH响应性腙键将PLGA与PEG相结合形成一种双亲性高分子结合体，后组装形成pH响应性高分子胶束。肼基化的PLGA、醛基化的PEG溶于二甲基亚砜在氮气下反应；反应液在N,N-二甲基甲酰胺中透析12～24小时后用冰乙醚沉淀，取离心后的沉淀干燥得到pH响应性腙键连接的双亲性结合体。所制得的自组装药物载体保持了均匀较小粒径同时，生物相容性更好，具有pH响应性，可在粘液微环境pH值较低的环境下腙键断裂脱去PEG的保护，裸露出正电基团，与负电的细胞膜静电作用，增加胶束的细胞内吞作用，使得更多载体进入细胞进行缓控释药物，发挥载体作用。

Description

一种用于粘液渗透的pH响应性高分子胶束及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于粘液渗透的刺激响应性双亲性高分子胶束及其制备方法，属于药物载体材料制备技术领域。

背景技术

粘液是一种粘弹性和粘附性的凝胶物质，覆盖于身体皮肤未覆盖的表面，例如肺呼吸道、肠胃、眼鼻咽、女性阴道等，保护着这些部位不受病原体、微粒等侵害和感染。其中部分粘液偏酸性。当这些部位发生病变需要给予药物治疗时，粘附性保护机制将变为阻隔药物直达病灶组织及细胞进行有效治疗的障碍，无论是小分子药物还是负载药物的传统纳米载体都会被粘附在表层粘液被快速清除掉。因此，深入穿透粘液屏障而不影响其防护性能将改进某些疾病的治疗效果，如囊性纤维化，性传播感染，退行性眼睛疾病，肺癌，肠易激疾病等。

JustinHanes等(WangYY.AddressingthePEGmucoadhesivityparadoxtoengineernanoparticlesthat"slip"throughthehumanmucusbarrier.[J].AngewChemIntEdEngl,2008,47(50):9872–9875)研究发现，纳米粒子表面修饰一层低分子量高密度的聚乙二醇(PEG)，利于纳米粒子快速渗透穿过粘液层，达到粘液层底部上皮细胞表面，延长了这类粘液渗透纳米粒子在粘液底层的停留时间，与传统纳米粒子相比具有更好的药物缓控释功能和更佳的治疗效果，这类纳米粒子被称为粘液渗透纳米粒子(Mucus-penetratingparticles,MPPs)。但是聚乙二醇的包覆在提高了粘液渗透效率的同时阻碍了纳米粒子与细胞的相互作用，降低了纳米粒子的进胞效率，因此降低了药物更多在细胞内释放提高治疗效果，限制了其应用。

发明内容

鉴于目前粘液渗透纳米粒子存在的缺陷，为了使粘液渗透纳米粒子更好的应用于粘液方面的药物载体，本发明提供一种包含pH响应性腙键，细胞毒性小，粒径更均匀的高分子胶束及其制备方法。

聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是一种由羟基乙酸和乳酸随机聚合形成的疏水性功能高分子，已经通过美国FDA认证，具有良好的生物相容性和生物可降解性。修饰后的PLGA纳米载体具有可控的粒径且分散度很小，可以实现药物的长时间缓控释，降低了用药频率，减少了患者的痛苦。

聚乙二醇(PEG)是一种由环氧乙烷聚合形成的亲水性高分子，同样已经通过美国FDA认证，无毒且具有良好的生物相容性和生物可降解性。PEG修饰的纳米粒子在体内有更长的体内循环和代谢半衰期，更好的溶解性，较小的毒性和免疫原性，且增强了纳米粒子对肿瘤的被动靶向作用。

通过pH响应性腙键将PLGA与PEG相结合形成一种双亲性高分子结合体，后组装形成pH响应性胶束，这种胶束制备方法简单，适应性强，成本低，而且粒径分布更为均匀，体系稳定，由于PEG的包覆使得胶束表面显中性，细胞毒性低，且在粘液层中可渗透到底部细胞层，在偏酸性的粘液中，pH响应性的腙键断裂，脱去PEG的保护，裸露出正电基团，与负电的细胞膜静电作用，增加胶束的细胞内吞作用，使得更多载体进入细胞进行缓控释药物，达到更加的治疗效果。

本发明制备了一种用于粘液渗透的pH响应性高分子胶束，选用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚乙二醇(PEG)，将PLGA肼基化，将PEG醛基化，利用肼基化的PLGA与醛基化的PEG相互反应，键合形成pH响应性的腙键(-NH-N＝CH-)。并形成pH响应性双亲性高分子结合体。该结合体自组装形成pH响应性高分子胶束作为纳米载体。

本发明的技术方案如下：

一种用于粘液渗透的pH响应性高分子胶束；其特征是通过pH响应性腙键将PLGA与PEG相结合形成一种双亲性高分子结合体，后组装形成pH响应性高分子胶束。其中双亲性高分子结合体；其特征是结构式如下：

PLGA分子量为10～50kDa，PEG分子量为1～5kDa。本发明的pH响应性双亲性高分子结合体组装形成球形纳米载体。

本发明的pH响应性双亲性高分子结合体的制备方法，步骤如下：

将肼基化的PLGA、醛基化的PEG按摩尔比1:2～5溶于二甲基亚砜中，在氩气保护下70～100℃下回流24～72h，反应结束后，将反应体系迅速冷却至室温，通入空气，终止聚合反应；反应液在N,N-二甲基甲酰胺中透析12～24小时后用冰乙醚沉淀，8000～11000转离心5～10分钟，取离心后的沉淀干燥得到pH响应性腙键连接的双亲性结合体。

肼基化的PLGA的制备方法，步骤如下：

将聚乳酸-羟基乙酸共聚物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、己二酸二酰肼按摩尔比1:(1.2～5):(1.2～5):(3～10)溶于二甲基亚砜中，室温搅拌反应24～36h，纯水透析24～48h后冻干得到肼基化的PLGA高分子固体粉末。

醛基化的PEG的制备方法，步骤如下：

将聚乙二醇、对醛基苯甲酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶按摩尔比1:(1.2～5):(1.2～5):(3～10)溶于N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应24～36h，用冰乙醚沉淀过滤，真空干燥得醛基化的PEG固体粉末。

所述的肼基化的PLGA溶于二甲基亚砜浓度为0.05～0.2g/ml。

所述的PLGA溶于二甲基亚砜浓度优选为0.05～0.2g/ml。

所述的PEG溶于N,N-二甲基甲酰胺浓度优选为0.05～0.25g/ml。

本发明的pH响应性高分子胶束的组装方法，步骤如下：

取pH响应性双亲性高分子结合体溶解在去离子水中，将溶液置于冰浴中；在超声波发生器作用下，滴入二氯甲烷或三氯甲烷，超声结束，将得到的乳液在25～30℃下通过旋转蒸发仪进行旋蒸10～15分钟，除去有机相，得到pH响应性双亲性高分子结合体的组装体溶液。

所述的双亲性高分子结合体溶于去离子水浓度优选为为1～5g/L。

所述的有机溶剂：离子水体积比优选为为1:1～20。

组成的pH响应性双亲性高分子结合体的自组装纳米载体，制剂粒径在60到100纳米之间，在pH降低时，Zeta电位值由中性转为正电。粒径均匀，分散性好。

有益效果

本发明涉及的用于粘液渗透的pH响应性高分子胶束有益效果包括：制备的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚乙二醇(PEG)结合体生物相容性好，毒性低。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)具有很好的疏水性，聚乙二醇(PEG)具有很好的亲水性，使得结合体具有双亲性和腙键pH响应性，且可进行自组装和负载药物。本发明中制备双亲性胶束可实现良好的粘液渗透性能和pH响应断键性能，且有效粒径在60～100nm，粒径更均匀；在pH值由7下降5时Zeta电位由中性变为正电，具有良好pH响应性；稳定性好，可在水溶液中保存至少两个月；制备产率高，适合大批量生产。

本发明的目的是设计并制备一种用于粘液渗透的pH响应性高分子胶束。与现有技术相比，本制备方法可以实现良好的粘液渗透性能，所制得的自组装药物载体保持了均匀较小粒径同时，生物相容性更好，且具有pH响应性，可在粘液微环境pH值较低的环境下腙键断裂脱去PEG的保护，裸露出正电基团，与负电的细胞膜静电作用，增加胶束的细胞内吞作用，使得更多载体进入细胞进行缓控释药物，达到更加的治疗效果，更高效发挥载体作用。

附图说明

图1：pH响应性双亲性高分子结合体即结合体核磁共振氢谱图。

图2：pH响应性双亲性高分子胶束即胶束粒度分析图。

图3：pH响应性双亲性高分子胶束即胶束在pH＝7.4时的电位分析图。

图4：pH响应性双亲性高分子胶束即胶束在pH＝5时的电位分析图。

图5：pH响应性双亲性高分子胶束即胶束透射照片。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。

pH响应性双亲性高分子结合体的制备方法，步骤如下：

1)将聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、己二酸二酰肼按摩尔比1:(1.2～5):(1.2～5):(3～10)分别溶于二甲基亚砜中，室温搅拌反应24～36h，纯水透析24～48h后冻干得到肼基化的PLGA高分子。

2)将聚乙二醇(PEG)、对醛基苯甲酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶按摩尔比1:(1.2～5):(1.2～5):(3～10)分别溶于N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应24～36h，用冰乙醚沉淀过滤，真空干燥得醛基化的PEG。

3)将肼基化的PLGA、醛基化的PEG按摩尔比1:2～5分别溶于二甲基亚砜中，在氩气保护下70～100℃下回流24～72h，后处理得到pH响应性腙键连接的双亲性高分子结合体。

步骤1)中所述的PLGA溶于二甲基亚砜浓度优选为0.05～0.2g/ml。

步骤2)中所述的PEG溶于N,N-二甲基甲酰胺浓度优选为0.05～0.25g/ml。

步骤3)中所述的肼基化PLGA溶于二甲基亚砜浓度优选为0.05～0.2g/ml。

步骤3)中所述的后处理具体步骤为反应结束后，将反应体系迅速冷却至室温，通入空气，终止聚合反应；反应液在N,N-二甲基甲酰胺中透析12～24小时后用冰乙醚沉淀，8000～11000转离心5～10分钟，取离心后的沉淀干燥得到双亲性高分子结合体。

pH响应性双亲性高分子胶束的组装方法，步骤如下：

pH响应性双亲性高分子胶束通过乳化-溶剂蒸发法组装制备。

所述的有机溶剂：离子水体积比优选为为1:1～20。

实施例1：

pH响应性双亲性高分子结合体的合成。

1)去聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)1g，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐100mg、N-羟基琥珀酰亚胺60mg，己二酸二酰肼75mg，分别溶于二甲基亚砜10ml中，室温搅拌反应24h，纯水透析24h后冻干得到肼基化的PLGA高分子。

2)将聚乙二醇(PEG)2g、对醛基苯甲酸200mg、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐192mg、4-二甲氨基吡啶100mg，分别溶于N,N-二甲基甲酰胺8ml中，室温搅拌反应24h，用冰乙醚沉淀过滤，真空干燥得醛基化的PEG。

3)将肼基化的PLGA500mg、醛基化的PEG640mg分别溶于二甲基亚砜10ml中，在氩气保护下70℃下回流72h，反应结束后，将反应体系迅速冷却至室温，通入空气，终止聚合反应；反应液在N,N-二甲基甲酰胺中透析12小时后用冰乙醚沉淀，8000转离心10分钟，取离心后的沉淀干燥得到双亲性高分子结合体。

如图1核磁共振氢谱图所示，PLGA与PEG的特征峰均能得到，证明双亲性高分子结合体合成成功。

实施例2：

pH响应性双亲性高分子结合体的合成。

1)去聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)0.4g，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐70mg、N-羟基琥珀酰亚胺45mg，己二酸二酰肼55mg，分别溶于二甲基亚砜8ml中，室温搅拌反应28h，纯水透析26h后冻干得到肼基化的PLGA高分子。

2)将聚乙二醇(PEG)0.3g、对醛基苯甲酸60mg、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐80mg、4-二甲氨基吡啶30mg，分别溶于N,N-二甲基甲酰胺6ml中，室温搅拌反应28h，用冰乙醚沉淀过滤，真空干燥得醛基化的PEG。

3)将肼基化的PLGA420mg、醛基化的PEG650mg分别溶于二甲基亚砜8ml中，在氩气保护下75℃下回流64h，反应结束后，将反应体系迅速冷却至室温，通入空气，终止聚合反应；反应液在N,N-二甲基甲酰胺中透析14小时后用冰乙醚沉淀，9000转离心8分钟，取离心后的沉淀干燥得到双亲性高分子结合体。

实施例3：

pH响应性双亲性高分子结合体的合成。

1)去聚乳酸-羟基乙酸共聚物(，PLGA)4g，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐200mg、N-羟基琥珀酰亚胺150mg，己二酸二酰肼300mg，分别溶于二甲基亚砜20ml中，室温搅拌反应30h，纯水透析32h后冻干得到肼基化的PLGA高分子。

2)将聚乙二醇(PEG)3g、对醛基苯甲酸600mg、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐600mg、4-二甲氨基吡啶100mg，分别溶于N,N-二甲基甲酰胺16ml中，室温搅拌反应30h，用冰乙醚沉淀过滤，真空干燥得醛基化的PEG。

3)将肼基化的PLGA360mg、醛基化的PEG250mg分别溶于二甲基亚砜6ml中，在氩气保护下80℃下回流55h，反应结束后，将反应体系迅速冷却至室温，通入空气，终止聚合反应；反应液在N,N-二甲基甲酰胺中透析16小时后用冰乙醚沉淀，10000转离心7分钟，取离心后的沉淀干燥得到双亲性高分子结合体。

实施例4：

pH响应性双亲性高分子结合体的合成。

1)去聚乳酸-羟基乙酸共聚物(，PLGA)1.5g，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐180mg、N-羟基琥珀酰亚胺130mg，己二酸二酰肼150mg，分别溶于二甲基亚砜12ml中，室温搅拌反应32h，纯水透析40h后冻干得到肼基化的PLGA高分子。

2)将聚乙二醇(PEG)1g、对醛基苯甲酸300mg、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐250mg、4-二甲氨基吡啶80mg，分别溶于N,N-二甲基甲酰胺7ml中，室温搅拌反应32h，用冰乙醚沉淀过滤，真空干燥得醛基化的PEG。

3)将肼基化的PLGA200mg、醛基化的PEG340mg分别溶于二甲基亚砜8ml中，在氩气保护下90℃下回流48h，反应结束后，将反应体系迅速冷却至室温，通入空气，终止聚合反应；反应液在N,N-二甲基甲酰胺中透析20小时后用冰乙醚沉淀，10000转离心6分钟，取离心后的沉淀干燥得到双亲性高分子结合体。

实施例5：

pH响应性双亲性高分子结合体的合成。

1)去聚乳酸-羟基乙酸共聚物(，PLGA)0.8g，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐120mg、N-羟基琥珀酰亚胺80mg，己二酸二酰肼100mg，分别溶于二甲基亚砜12ml中，室温搅拌反应36h，纯水透析48h后冻干得到肼基化的PLGA高分子。

2)将聚乙二醇(PEG)0.5g、对醛基苯甲酸100mg、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐120mg、4-二甲氨基吡啶50mg，分别溶于N,N-二甲基甲酰胺6ml中，室温搅拌反应36h，用冰乙醚沉淀过滤，真空干燥得醛基化的PEG。

3)将肼基化的PLGA400mg、醛基化的PEG540mg分别溶于二甲基亚砜10ml中，在氩气保护下100℃下回流24h，反应结束后，将反应体系迅速冷却至室温，通入空气，终止聚合反应；反应液在N,N-二甲基甲酰胺中透析24小时后用冰乙醚沉淀，11000转离心5分钟，取离心后的沉淀干燥得到双亲性高分子结合体。

实施例6：

乳化-溶剂蒸发法。采用乳化-溶剂蒸发法制备双亲性高分子胶束的过程如下：

精确称取20mg结合体溶解在4ml去离子水中，将溶液置于冰浴中。在探头式超声波发生器作用下，用注射器匀速注入1ml二氯甲烷，超声时间为10分钟，超声功率为150W。超声结束，将得到的乳液在30℃下通过旋转蒸发仪进行旋蒸13分钟，除去有机相，转速为80转/分钟。待二氯甲烷完全挥发，得到pH响应性双亲性高分子结合体的组装体溶液。

如图2粒度分析测试结果所示，所制备的自组装体有效粒径为80nm；如图3、图4体外模拟粘液酸性环境，pH变化前后电位分析测试结果所示，所制备的自组装体在pH降低时，Zeta电位值由中性转为正电，即pH响应性腙键在较低pH值时断裂，使得自组装体具有优越的pH响应性；如图5透射照片所示，所制备的自组装体粒径均匀，分散性好。

实施例7：

精确称取12mg结合体溶解在4ml去离子水中，将溶液置于冰浴中。在探头式超声波发生器作用下，用注射器匀速注入0.8ml三氯甲烷，超声时间为8分钟，超声功率为145W。超声结束，将得到的乳液在25℃下通过旋转蒸发仪进行旋蒸15分钟，除去有机相，转速为85转/分钟。待三氯甲烷完全挥发，得到pH响应性双亲性高分子结合体的组装体溶液。所制备的的组装体有效粒径为72nm。

实施例8：

精确称取8mg结合体溶解在4ml去离子水中，将溶液置于冰浴中。在探头式超声波发生器作用下，用注射器匀速注入0.5ml二氯甲烷，超声时间为9分钟，超声功率为130W。超声结束，将得到的乳液在27℃下通过旋转蒸发仪进行旋蒸14分钟，除去有机相，转速为90转/分钟。待二氯甲烷完全挥发，得到pH响应性双亲性高分子结合体的组装体溶液。所制备的的组装体有效粒径为98nm。

实施例9：

精确称取6mg结合体溶解在4ml去离子水中，将溶液置于冰浴中。在探头式超声波发生器作用下，用注射器匀速注入0.4ml三氯甲烷，超声时间为10分钟，超声功率为135W。超声结束，将得到的乳液在26℃下通过旋转蒸发仪进行旋蒸11分钟，除去有机相，转速为85转/分钟。待三氯甲烷完全挥发，得到pH响应性双亲性高分子结合体的组装体溶液。所制备的的组装体有效粒径为91nm。

实施例10：

精确称取4mg结合体溶解在4ml去离子水中，将溶液置于冰浴中。在探头式超声波发生器作用下，用注射器匀速注入0.2ml二氯甲烷，超声时间为8分钟，超声功率为150W。超声结束，将得到的乳液在29℃下通过旋转蒸发仪进行旋蒸12分钟，除去有机相，转速为88转/分钟。待二氯甲烷完全挥发，得到pH响应性双亲性高分子结合体的组装体溶液。所制备的的组装体有效粒径为75nm。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于粘液渗透的pH响应性高分子胶束；其特征是通过pH响应性腙键将聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)与聚乙二醇(PEG)相结合形成一种双亲性高分子结合体，后组装形成pH响应性高分子胶束。

2.权利要求1的高分子胶束，其特征是所述的双亲性高分子结合体结构式如下：

PLGA分子量为10～50kDa，PEG分子量为1～5kDa。

3.权利要求2的高分子胶束，其特征是双亲性高分子结合体的制备方法如下：将肼基化的PLGA、醛基化的PEG按摩尔比1:2～5溶于二甲基亚砜中，在氩气保护下70～100℃下回流24～72h，反应结束后，将反应体系迅速冷却至室温，通入空气，终止聚合反应；反应液在N,N-二甲基甲酰胺中透析12～24小时后用冰乙醚沉淀，8000～11000转离心5～10分钟，取离心后的沉淀干燥得到pH响应性腙键连接的双亲性结合体。

4.如权利要求3所述的方法，其特征是所述的肼基化的PLGA的制备方法为：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、己二酸二酰肼按摩尔比1:(1.2～5):(1.2～5):(3～10)溶于二甲基亚砜中，室温搅拌反应24～36h，纯水透析24～48h后冻干得到肼基化的PLGA高分子固体粉末。

5.如权利要求3所述的方法，其特征是所述的醛基化的PEG的制备方法为：将聚乙二醇、对醛基苯甲酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶按摩尔比1:(1.2～5):(1.2～5):(3～10)溶于N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应24～36h，用冰乙醚沉淀过滤，真空干燥得醛基化的PEG固体粉末。

6.如权利要求3所述的方法，其特征是所述的肼基化的PLGA溶于二甲基亚砜浓度为0.05～0.2g/ml。

7.如权利要求4所述的方法，其特征是所述的PLGA溶于二甲基亚砜浓度为0.05～0.2g/ml。

8.如权利要求5所述的方法，其特征是所述的PEG溶于N,N-二甲基甲酰胺浓度为0.05～0.25g/ml。

9.如权利要求1所述的pH响应性高分子胶束的组装方法，其特征是取pH响应性双亲性高分子结合体溶解在去离子水中，将溶液置于冰浴中；在超声波发生器作用下，滴入二氯甲烷或三氯甲烷，超声结束，将得到的乳液在25～30℃下通过旋转蒸发仪进行旋蒸10～15分钟，除去有机相，得到pH响应性双亲性高分子结合体的组装体溶液。

10.如权利要求9所述的方法，其特征是所述的双亲性高分子结合体溶于去离子水浓度为1～5g/L；所述的有机溶剂：离子水体积比为1:1～20。