CN105213307B

CN105213307B - 用于粘液渗透的还原响应性靶向高分子胶束及其制备方法

Info

Publication number: CN105213307B
Application number: CN201510639401.6A
Authority: CN
Inventors: 常津; 房蕾; 宫晓群; 王生; 杨文涛
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2015-09-30
Filing date: 2015-09-30
Publication date: 2018-02-13
Anticipated expiration: 2035-09-30
Also published as: CN105213307A

Abstract

本发明涉及一种用于粘液渗透的还原响应性靶向高分子胶束及其制备方法。通过还原响应性二硫键将PLGA与PEG相结合形成一种双亲性高分子结合体，后组装形成还原响应性胶束，实现良好的粘液渗透性能、还原响应断键性能和靶向细胞介导内吞的性能，且有效粒径在70～110nm，粒径更均匀；由于PEG的包覆使得胶束表面显中性，细胞毒性低，在粘液层中可渗透到底部细胞层，到达底层细胞后注射谷胱甘肽溶液，还原响应性的二硫键断裂，脱去PEG保护，裸露出包覆的靶向叶酸，与病灶细胞的细胞膜表面过表达的叶酸受体特异性结合，并由叶酸受体介导内吞作用，提高纳米载体的进胞效率，使得更多载体进入细胞进行缓控释药物，达到更加的治疗效果。

Description

用于粘液渗透的还原响应性靶向高分子胶束及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于粘液渗透的还原响应性靶向高分子胶束及其制备方法，属于药物载体材料制备技术领域。

背景技术

粘液提供了肺呼吸道、肠胃、眼、鼻咽、阴道等部位暴露的表面的第一道防线，其高的粘附性和粘弹性使外来病原体、毒素、微粒等被粘附在粘液中，并迅速清除掉，即为正常的粘液清除机制。而通过研究者大量的实验证明，粘液还会强烈的固定清除传统的纳米粒子，这也成为了粘膜表面局部给药和基因传递的一大障碍。研究者利用粘液的粘附性能，设计了两类粘附型纳米粒子。一种是能与粘液中带负电的黏蛋白静电吸附的带正电荷的纳米粒子，一种是能与粘液中巯基反应形成二硫键的带巯基的纳米粒子，两者都能与粘液形成较强的相互作用从而延长纳米载体在粘液中的停留时间，进而释放负载的药物达到治疗效果。但另一方面，粘附型纳米粒子在粘液层中停留的同时，依旧会被快速清除掉。因此，提高纳米载体的生物利用度就必须使纳米载体可以迅速渗透过粘液而避免粘附与清除。

Hanes J课题组首次提出一种“粘液渗透粒子”的概念，即通过在粒子表面修饰低分子量的聚乙二醇(PEG)获得可以在粘液中快速渗透的纳米粒子。PEG的修饰同时赋予了纳米粒子更高的稳定性，尤其是纳米粒子必须渗透通过厚厚的粘液层以达到底层细胞，稳定的负载药物到达病灶细胞并缓控释药物，减小病人痛苦且提高了治疗效果。然而聚乙二醇的修饰虽然使纳米粒子获得以上性能，但由于阻碍了纳米粒子与病灶细胞的相互作用，降低了纳米粒子的内吞效果，由此降低了胞内药物的缓控释，影响了应有的治疗效果。

发明内容

鉴于目前粘液渗透纳米粒子存在的缺陷，为了使粘液渗透纳米粒子更好的应用于粘液方面的药物载体，本发明提供一种包含还原响应性二硫键(-S-S-)，叶酸靶向，细胞毒性小，粒径更均匀的高分子胶束及其制备方法。

聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是由两种单体--羟基乙酸和乳酸随机聚合形成的，可降解的疏水性功能高分子，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，在美国已经通过FDA认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典，被广泛应用于药物载体和医用工程材料等领域。改性后的PLGA纳米载体具有可控的粒径且分散度很小，可以实现药物长时间的缓控释，降低了患者用药频率，减少了患者的痛苦。

聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是一种由环氧乙烷聚合而成的亲水性高分子，与疏水性高分子结合后的产物即双亲性高分子可组装用作药物或基因载体。同样在美国已经通过FDA认证，无毒且具有良好的生物相容性和生物可降解性。聚乙二醇可以用于修饰纳米粒子，以保护纳米粒子延长体内循环和代谢半衰期，更好的溶解性，较小的毒性和免疫原性，且增强了纳米粒子对肿瘤的被动靶向作用。

叶酸(FA)是人体不能合成又必需的维生素，需要外源性摄取，其摄取途径是叶酸通过与细胞表面的叶酸受体特异性结合，介导内吞进入细胞。在细胞增殖较多、分裂很快的组织，如卵巢癌、肾癌、子宫内膜癌、睾丸癌、脑瘤、肺腺癌、乳腺癌、脑瘤、睾丸癌等大部分恶性肿瘤，因为需要大量的叶酸，叶酸受体高度表达，有时比正常组织高出几百倍。利用叶酸受体对叶酸及其类似物的运转机制和叶酸受体在肿瘤等部位的高度表达，可设计标记叶酸的纳米药物载体靶向目标部位进行治疗，较少对正常组织的损害，增强治疗效果。

通过还原响应性二硫键将PLGA与PEG相结合形成一种双亲性高分子结合体，后组装形成还原响应性胶束，这种胶束制备方法简单，适应性强，成本低，而且粒径分布更为均匀，体系稳定，由于PEG的包覆使得胶束表面显中性，细胞毒性低，且在粘液层中可渗透到底部细胞层，到达底层细胞后注射谷胱甘肽(GSH)溶液，还原响应性的二硫键断裂，脱去PEG的保护，裸露出包覆的靶向叶酸，与病灶细胞的细胞膜表面过表达的叶酸受体特异性结合，并由叶酸受体介导内吞作用，提高纳米载体的进胞效率，使得更多载体进入细胞进行缓控释药物，达到更加的治疗效果。

本发明制备了一种用于粘液渗透的还原响应性靶向高分子胶束，选用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)和聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)，将PLGA和PEG用3,3’-二硫代二丙酸键合连接，形成含还原响应性的二硫键(-S-S-)的双亲性高分子结合体，该结合体与连接了叶酸的PLGA共同自组装形成还原响应性靶向高分子胶束作为纳米载体。

本发明的技术方案如下：

一种用于粘液渗透的还原响应性双亲性高分子结合体，其特征是结构式如下：

PLGA分子量为10～50kDa，PEG分子量为1～5kDa。本发明的还原响应性双亲性高分子结合体与叶酸修饰的PLGA共自组装形成还原响应性靶向球形纳米载体。

本发明的还原响应性双亲性高分子结合体的制备方法，步骤如下：

将聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、3,3’-二硫代二丙酸按摩尔比1:(1.2～5):(0.6～2):(3～10)溶于N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应24～48h后在上述溶液中按摩尔比聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)：聚乙二醇(PEG)＝1:4溶入聚乙二醇(PEG)，室温搅拌反应24～48h，后处理得到还原响应性双亲性高分子结合体。

所述的PLGA溶于N,N-二甲基甲酰胺浓度优选为0.05～0.25g/ml。

所述的后处理具体步骤为，将反应液在N,N-二甲基甲酰胺中透析12～24小时后，在纯水中透析24～48h，冻干的得到还原响应性双亲性高分子结合体。

本发明的还原响应性靶向高分子胶束的组装方法，步骤如下：

取还原响应性双亲性高分子结合体分散在离子水中，将溶液置于冰浴中；在超声波发生器作用下，滴入溶有叶酸修饰的PLGA的二氯甲烷或三氯甲烷；将得到的乳液在25～30℃下通过旋转蒸发仪进行旋蒸10～15分钟，除去有机相，得到还原响应性双亲性高分子结合体与靶向基团的共组装体溶液。

所述的双亲性高分子结合体溶于去离子水浓度优选为为1～5g/L。

所述的叶酸修饰的PLGA溶于二氯甲烷或三氯甲烷浓度优选为为0.2～1g/L。

所述的二氯甲烷或三氯甲烷：离子水体积比优选为为1:1～20。

组成的还原响应性双亲性高分子结合体与靶向基团的共组装纳米载体，制剂粒径在70到110纳米之间，在谷胱甘肽(GSH)10mM/L环境下，二硫键断裂，脱去PEG的保护，裸露出包覆的靶向叶酸。粒径均匀，分散性好。

有益效果

本发明涉及的用于粘液渗透的还原响应性靶向高分子胶束有益效果包括：制备的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚乙二醇(PEG)结合体生物相容性好，毒性低。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)具有很好的疏水性，聚乙二醇(PEG)具有很好的亲水性，使得结合体具有双亲性。连接PLGA和PEG的3,3’-二硫代二丙酸使双亲性高分子具有还原响应性，且可进行自组装和负载药物。本发明中制备双亲性胶束可实现良好的粘液渗透性能、还原响应断键性能和靶向细胞介导内吞的性能，且有效粒径在70～110nm，粒径更均匀；在谷胱甘肽(GSH)10mM/L环境下，还原响应性的二硫键断裂，脱去PEG的保护，裸露出包覆的靶向叶酸，与病灶细胞的细胞膜表面过表达的叶酸受体特异性结合，并由叶酸受体介导内吞作用，提高纳米载体的进胞效率，具有良好的还原靶向响应性；稳定性好，可在水溶液中保存至少两个月；制备产率高，适合大批量生产。

本发明的目的是设计并制备一种用于粘液渗透的还原响应性靶向高分子胶束。与现有技术相比，本制备方法可以实现良好的粘液渗透性能，所制得的自组装药物载体保持了均匀较小粒径同时，生物相容性更好，且具有还原靶向响应性，可在谷胱甘肽(GSH)10mM/L环境下，还原响应性的二硫键断裂，脱去PEG的保护，裸露出包覆的靶向叶酸，与病灶细胞的细胞膜表面过表达的叶酸受体特异性结合，并由叶酸受体介导内吞作用，提高纳米载体的进胞效率，使得更多载体进入细胞进行缓控释药物，达到更加的治疗效果，更高效发挥载体作用。

附图说明

图1：还原响应性双亲性高分子结合体即结合体核磁共振氢谱图。

图2：还原响应性靶向高分子胶束即胶束粒度分析图。

图3：还原响应性靶向高分子胶束即胶束在谷胱甘肽(10mM/L)环境下的粒度变化图。

图4：还原响应性靶向高分子胶束即胶束透射照片。

图5：还原响应性靶向高分子胶束即胶束在粘液中渗透后靶向和停留效果照片。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。

还原响应性双亲性高分子结合体的制备方法，步骤如下：

所述的PLGA溶于N,N-二甲基甲酰胺浓度优选为0.05～0.25g/ml。

还原响应性靶向高分子胶束的组装方法，步骤如下：

还原响应性靶向高分子胶束通过乳化-溶剂蒸发法组装制备。

取还原响应性双亲性高分子结合体分散在离子水中，将溶液置于冰浴中；在超声波发生器作用下，滴入溶有叶酸修饰的PLGA的二氯甲烷或三氯甲烷，超声结束，将得到的乳液在25～30℃下通过旋转蒸发仪进行旋蒸10～15分钟，除去有机相，得到还原响应性双亲性高分子结合体与靶向基团的共组装体溶液。

所述的双亲性高分子结合体溶于去离子水浓度优选为1～5g/L。

所述的叶酸修饰的PLGA溶于二氯甲烷或三氯甲烷浓度优选为0.2～1g/L。

所述的二氯甲烷或三氯甲烷：离子水体积比优选为1:1～20。

实施例1：

还原响应性双亲性高分子结合体的合成。

取聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA，分子量为10kDa)1g，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐100mg、4-二甲氨基吡啶30mg，3,3’-二硫代二丙酸85mg，溶于N,N-二甲基甲酰胺12ml中，室温搅拌反应24h后，在上述溶液中加入聚乙二醇(PEG，分子量为1kDa)90mg，室温搅拌反应24h后，将反应液在N,N-二甲基甲酰胺中透析12h后，在纯水中透析24h，冻干的得到还原响应性双亲性高分子结合体。

如图1核磁共振氢谱图所示，PLGA与PEG的特征峰均能得到，证明双亲性高分子结合体合成成功。

实施例2：

还原响应性双亲性高分子结合体的合成。

取聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA，分子量为21kDa)0.4g，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐70mg、4-二甲氨基吡啶23mg，3,3’-二硫代二丙酸65mg，溶于N,N-二甲基甲酰胺10ml中，室温搅拌反应28h后，在上述溶液中加入聚乙二醇(PEG，，分子量为2.5kDa)25mg，室温搅拌反应28h后，将反应液在N,N-二甲基甲酰胺中透析14h后，在纯水中透析26h，冻干的得到还原响应性双亲性高分子结合体。

实施例3：

还原响应性双亲性高分子结合体的合成。

取聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA，分子量为32kDa)4g，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐200mg、4-二甲氨基吡啶60mg，3,3’-二硫代二丙酸300mg，溶于N,N-二甲基甲酰胺20ml中，室温搅拌反应30h后，在上述溶液中加入聚乙二醇(PEG，分子量为3.4kDa)1g，室温搅拌反应30h后，将反应液在N,N-二甲基甲酰胺中透析20h后，在纯水中透析32h，冻干的得到还原响应性双亲性高分子结合体。

实施例4：

还原响应性双亲性高分子结合体的合成。

取聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA，分子量为40kDa)1.5g，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐180mg、4-二甲氨基吡啶65mg，3,3’-二硫代二丙酸160mg，溶于N,N-二甲基甲酰胺14ml中，室温搅拌反应32h后，在上述溶液中加入聚乙二醇(PEG，分子量为4kDa)280mg，室温搅拌反应32h后，将反应液在N,N-二甲基甲酰胺中透析22h后，在纯水中透析40h，冻干的得到还原响应性双亲性高分子结合体。

实施例5：

还原响应性双亲性高分子结合体的合成。

取聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA，分子量为50kDa)0.8g，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐120mg、4-二甲氨基吡啶40mg，3,3’-二硫代二丙酸110mg，溶于N,N-二甲基甲酰胺15ml中，室温搅拌反应48h后，在上述溶液中加入聚乙二醇(PEG，分子量为5kDa)100mg，室温搅拌反应48h后，将反应液在N,N-二甲基甲酰胺中透析24h后，在纯水中透析48h，冻干的得到还原响应性双亲性高分子结合体。

实施例6：

乳化-溶剂蒸发法。采用乳化-溶剂蒸发法制备双亲性高分子胶束的过程如下：

精确称取20mg结合体溶解在4ml去离子水中，将溶液置于冰浴中。在探头式超声波发生器作用下，用注射器匀速注入1ml溶有2mg叶酸修饰的PLGA的二氯甲烷溶液，超声时间为10分钟，超声功率为150W。超声结束，将得到的乳液在30℃下通过旋转蒸发仪进行旋蒸13分钟，除去有机相，转速为80转/分钟。待二氯甲烷完全挥发，得到还原响应性双亲性高分子结合体与靶向基团的共组装体溶液。

如图2粒度分析测试结果所示，所制备的自组装体有效粒径为89nm；如图3体外模拟粘液还原性环境，通过粒径分析测试结果所示，当谷胱甘肽(GSH)浓度达到10mM/L时，所制备的自组装体在还原性环境下，粒径逐步变大，最后分成疏水性小粒径部分，及二硫键断裂脱落的亲水性PEG大粒径部分，即还原响应性二硫键在较高浓度的谷胱甘肽(GSH)环境中断裂，使得自组装体具有优越的还原响应性；如图4透射照片所示，所制备的自组装体粒径均匀，分散性好。如图5照片所示，还原响应性靶向高分子胶束在粘液中渗透后，有很好的靶向和停留效果。

实施例7：

精确称取12mg结合体溶解在4ml去离子水中，将溶液置于冰浴中。在探头式超声波发生器作用下，用注射器匀速注入0.8ml溶有1mg叶酸修饰的PLGA的三氯甲烷溶液，超声时间为8分钟，超声功率为145W。超声结束，将得到的乳液在25℃下通过旋转蒸发仪进行旋蒸15分钟，除去有机相，转速为85转/分钟。待三氯甲烷完全挥发，得到还原响应性双亲性高分子结合体与靶向基团的共组装体溶液。所制备的的组装体有效粒径为72nm。

实施例8：

精确称取8mg结合体溶解在4ml去离子水中，将溶液置于冰浴中。在探头式超声波发生器作用下，用注射器匀速注入0.5ml溶有0.5mg叶酸修饰的PLGA的二氯甲烷溶液，超声时间为9分钟，超声功率为130W。超声结束，将得到的乳液在27℃下通过旋转蒸发仪进行旋蒸14分钟，除去有机相，转速为90转/分钟。待二氯甲烷完全挥发，得到还原响应性双亲性高分子结合体与靶向基团的共组装体溶液。所制备的的组装体有效粒径为98nm。

实施例9：

精确称取6mg结合体溶解在4ml去离子水中，将溶液置于冰浴中。在探头式超声波发生器作用下，用注射器匀速注入0.4ml溶有0.2mg叶酸修饰的PLGA的三氯甲烷溶液，超声时间为10分钟，超声功率为135W。超声结束，将得到的乳液在26℃下通过旋转蒸发仪进行旋蒸11分钟，除去有机相，转速为85转/分钟。待三氯甲烷完全挥发，得到还原响应性双亲性高分子结合体与靶向基团的共组装体溶液。所制备的的组装体有效粒径为108nm。

实施例10：

精确称取4mg结合体溶解在4ml去离子水中，将溶液置于冰浴中。在探头式超声波发生器作用下，用注射器匀速注入0.2ml溶有0.1mg叶酸修饰的PLGA的二氯甲烷溶液，超声时间为8分钟，超声功率为150W。超声结束，将得到的乳液在29℃下通过旋转蒸发仪进行旋蒸12分钟，除去有机相，转速为88转/分钟。待二氯甲烷完全挥发，得到还原响应性双亲性高分子结合体与靶向基团的共组装体溶液。所制备的的组装体有效粒径为75nm。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于粘液渗透的还原响应性靶向高分子胶束；其特征是通过含有还原响应性二硫键(-S-S-)的3,3’-二硫代二丙酸将聚乳酸‐羟基乙酸共聚物(PLGA)与聚乙二醇(PEG)连接形成一种双亲性高分子结合体，然后结合体与连接了叶酸的PLGA共同经过乳化溶剂蒸发法自组装形成还原响应性靶向高分子胶束，所述的双亲性高分子结合体结构式如下：

PLGA分子量为10～50kDa，PEG分子量为1～5kDa；将聚乳酸‐羟基乙酸共聚物(PLGA)、1‐(3‐二甲氨基丙基)‐3‐乙基碳二亚胺盐酸盐、4‐二甲氨基吡啶、3,3’-二硫代二丙酸按摩尔比1:(1.2～5):(0.6～2):(3～10)溶于N,N‐二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应24～48h后，在上述溶液中按摩尔比聚乳酸‐羟基乙酸共聚物(PLGA)：聚乙二醇＝1:4溶入聚乙二醇，室温搅拌反应24～48h，后处理得到还原响应性双亲性高分子结合体。

2.如权利要求1所述的高分子胶束的制备方法，其特征是所述的PLGA溶于N,N‐二甲基甲酰胺浓度为0.05～0.25g/ml。

3.如权利要求1所述的高分子胶束的制备方法，其特征是所述的后处理具体步骤为，将反应液在N,N‐二甲基甲酰胺中透析12～24小时后，在纯水中透析24～48h，冻干的得到还原响应性双亲性高分子结合体。

4.权利要求1的高分子胶束的组装方法，其特征是取还原响应性双亲性高分子结合体分散在离子水中，将溶液置于冰浴中；在超声波发生器作用下，滴入溶有叶酸修饰的PLGA的二氯甲烷或三氯甲烷；将得到的乳液在25～30℃下通过旋转蒸发仪进行旋蒸10～15分钟，除去有机相，得到还原响应性双亲性高分子结合体与靶向基团的共组装体溶液。

5.如权利要求4所述的高分子胶束的组装方法，其特征是所述的双亲性高分子结合体溶于去离子水浓度为1～5g/L。

6.如权利要求4所述的高分子胶束的组装方法，其特征是所述的叶酸修饰的PLGA溶于二氯甲烷或三氯甲烷浓度为0.2～1g/L。

7.如权利要求4所述的高分子胶束的组装方法，其特征是所述的二氯甲烷或三氯甲烷：离子水体积比为1:1～20。