CN106029059A - 用于药品递送的自组装刷状嵌段共聚物-纳米颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了两性液晶刷状嵌段共聚物，其在水性溶液中可以容易地自组装成纳米颗粒，并且还允许疏水性药学活性分子的囊封。

Description

用于药品递送的自组装刷状嵌段共聚物-纳米颗粒
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年10月7日提交的美国临时专利申请系列No.61/887,781的优先权，该申请的公开内容以引用方式全文并入本文。
技术领域
本发明提供两性液晶刷状嵌段共聚物，其在水性溶液中可以容易地自组装成纳米颗粒，并且还允许进行疏水性药学活性分子的囊封。
背景技术
抗癌药品的临床应用因其疏水性和非特异性毒性而受到限制，因为大部分临床使用的抗癌药品为低分子化合物，其在健康和疾病组织中快速扩散通过肌体，导致严重的副作用。越来越需要研发用于抗癌药品的安全有效的递送系统。自组装纳米颗粒结构允许抗癌药品囊封于核心中，同时疏水性外壳使得水溶性和稳定性增加。具有合适尺寸和表面性质的纳米颗粒可以通过增强的渗透性和停留(EPR)效应而具有在肿瘤位点中聚集的机会，其中所述增强的渗透性和停留效应是由肿瘤血液和淋巴管系统异常所导致的。
已经研发出用于抗癌药品递送的多种自组装纳米颗粒。不幸的是，大部分的这种颗粒在临床试验中均未显示有利的效果。用于药品递送的聚合物系统的主要障碍是聚合物胶束在高度稀释和低药品加载水平下缺乏稳定性。此外，许多合成的可生物降解的共聚物在侵蚀时在体内会产生与周围组织不利地相互作用的低聚物和单体。
具有胆固醇末端基团的共聚物也在多种生物医学应用中产生了关注，包括用作用于细胞附着和增殖的膜、形成聚合支架的基础以及作为具有改善的血液相容性的材料。但是，所报告的包含胆固醇的两性聚合物结构体系为仅具有一个或几个胆固醇分子的缀合物或线性共聚物。这导致低的稳定性、有限的药品加载能力(达到20％(w/w))以及低的囊封效率和这些包含胆固醇的共聚物药品的快速释放。
发明概述
设计具有合适结构的嵌段共聚物，以及增加药品加载能力的同时降低聚合物载体及其降解产物的毒性的组合物，仍提出挑战。包含胆固醇分子的液晶聚合物(LCP)已经用于多个领域中，例如生物活性材料和生物技术，但是仅少数的研究者使用LCP用于药品递送系统。本发明提供了新型液晶刷状嵌段共聚物(“LC刷状BCP”或“嵌段共聚物”)。本发明公开的嵌段共聚物在水相溶液中容易形成自组装纳米颗粒。这些纳米颗粒允许简单地通过自组装来加载疏水性药品，而无需超声处理或匀浆处理过程。本发明公开的纳米颗粒还显示出高含量甾类化合物疏水核心的优异稳定性，并展现出囊封疏水性药品的高能力，同时在表面上的刷状亲水性分子使得纳米颗粒在水性介质中稳定。亲水性表面在体内还防止被网状内皮系统(RES)吸收，并促进长循环。本发明公开的自组装的纳米颗粒具有良好的生物相容性、高的药品加载能力、在循环中的长期停留、多峰性潜力，并且可以容易地大规模制造，这使得它们适用于药品递送。
囊封疏水性抗癌药品的本发明公开的纳米结构显示比游离的抗癌药品具有高的肿瘤聚集和抗肿瘤效力以及明显降低的毒性。这些性质使得本发明公开的纳米颗粒特别适用于抗癌药品递送。
最终，本发明公开的嵌段共聚物可以官能化(例如使用巯基、磷酸基、羧酸基等)，并且此类共聚物还可以在水性介质中自组装，从而形成良好定义的纳米颗粒。例如巯基官能化的纳米颗粒可以用作用于疏水性抗癌药品(通过物理诱陷)和金纳米颗粒(Au NP)(通过与巯基形成共价结合)的双重囊封的多官能载体。高的药品加载和高的囊封效率以及均匀的尺寸分布和良好的稳定性允许官能化的纳米颗粒在例如光热癌症治疗和生物传感中用于抗癌药品和金属纳米颗粒的递送。
因此，在广泛的方面中，本发明公开提供了包括以下的嵌段共聚物：第一嵌段，其为下式：
以及
第二嵌段，其为下式：
其中：
m和n独立地为大约3至大约500的整数；
A独立地选自聚降冰片烯(polynorbonene)、聚环戊烯、聚环辛烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯和聚硅氧烷；
R1为可任选地包含连接体的甾类化合物部分；以及
R2为聚氧化烯部分。
在另一个方面中，本发明公开提供了核心/外壳纳米颗粒形式的本发明公开的嵌段共聚物。在一个实施方案中，核心/外壳纳米颗粒形式为其中本发明公开的嵌段共聚物在水相溶液中自组装。
在一个方面中，本发明公开提供了包含本发明公开的嵌段共聚物和疏水性药学活性分子的纳米颗粒。另一个方面提供了包含这种纳米颗粒的治疗递送系统。另一个方面提供了递送药学活性分子的方法，其包括将这种纳米颗粒给予受试对象。另一个方面提供了治疗疾病或紊乱的方法，其包括将这种纳米颗粒给予受试对象。例如如果疏水性药学活性分子为抗癌药品，则所述疾病或紊乱为癌症。
最终，本发明公开还提供了用于制备本发明公开的纳米颗粒的工艺：其包括(a)将本发明公开的嵌段共聚物溶解于有机溶剂中，从而得到共聚物溶液；以及(b)在水性溶液中混合所述共聚物溶液，从而形成纳米颗粒。
附图简述
图1示出Au NP和DOX-双重囊封的P(PEOASH-b-C5A)的水性介质中的自组装，而图2示出P(NBCh9-b-NBPEG)共聚物在水性介质中的自组装。
图3示出浓度为1mg/mL的自组装且双重囊封的刷状-chol-BCP纳米颗粒。双重囊封的纳米颗粒的红色比Au NP-囊封的P(PEOA-b-PC5MA)-SH纳米颗粒更深，表明存在DOX。1：在水中的空白NP；2：在DMP中的AuNP-模板化的刷状-chol-BCP；3：在水中的AuNP-囊封的NP；4：在水中的DOX-囊封的NP；以及5：在水中的双重囊封剂NP。
图4A显示自组装且双重囊封的刷状-chol-BCP(P(PEOA-b-PC5A)-SH)的透射电子显微镜(TEM)图像：(a)空白刷状-chol-BCP纳米颗粒；(b)在DMF中的AuNP-模板化的刷状-chol-BCP；(c)Au NP-囊封的刷状-chol-BCP；(d)在水中的DOX-囊封的NP；以及(d)Au NP+DOX-双重囊封的刷状-chol-BCP；比例尺为100nm。TEM图像显示刷状-chol-BCP纳米颗粒的形状为球形，并具有均匀的尺寸分布。图4B示出在AuNP-模板化的刷状-chol-BCP和双重-囊封的NP中AuNP的能量色散X射线(EDX)光谱。
图5示出在25℃下通过动态光散射(DLS)测量在双重-囊封之前(a,c)和双重-囊封之后(b,d)，刷状-chol-BCP纳米颗粒的尺寸分布。
图6A示出在储存在4℃下的PBS/FBS(1:1)中，双重-囊封的P(PEOASH-b-PC5A36)和P(PEOASH-b-C5A13)纳米颗粒的稳定性。图6B示出在PBS(pH 7.4)中，DOX加载的P(PEOASH-b-PC5A)纳米颗粒的释放概况。图6C示出在储存在4℃的PBS/FBS(1:1)中，双重-囊封的P(PEO-b-PC5MA)-SH纳米颗粒的稳定性。图6D示出在PBS(pH 7.4)中，DOX加载的和双重加载的P(PEOA-b-PC5MA)-SH纳米颗粒的释放概况。
图7示出400kDa-50(a)、600kDa-75(b)、600kDa-180(c)、400kDa-50-DOX(d)、600kDa-75-DOX(e)和600kDa-180-DOX(f)的TEM图像。在(a)、(b)、(d)、(e)和(f)图像中的纳米颗粒是使用1％磷钨酸负染色的。
图8A提供了在储存在4℃的PBS/FBS(1:1)中，DOX-加载的400kDa-50、600kDa-75和600kDa-180纳米颗粒的稳定性。图8B示出了在100rpm和37℃下，在包含0.1％Tween 80的PBS(pH 7.4)中，DOX-加载的400kDa-50、600kDa-75和600kDa-180纳米颗粒的释放概况。
图9A示出与不同浓度的空白400kDa-50、600kDa-75和600kDa-180纳米颗粒温育48h的HeLa细胞的活力。图9B示出与游离DOX、DOX-加载的400kDa-50、600kDa-75和600kDa-180纳米颗粒(在不同浓度的DOX下)温育24h的HeLa细胞的活力。图9C示出与不同浓度的游离Dox、Dox-加载的P(PEOASH-b-PC5A)NP和Au+DOX-加载的(PEOASH-b-PC5A)NP(在不同浓度的DOX下)温育24h的HeLa细胞的活力。
图10示出通过FACS测定的与游离DOX以及DOX-加载的400kDa-50、600kDa-75和600kDa-180纳米颗粒(在25μg/mL DOX当量下)温育2h的HeLa细胞的平均荧光。*P<0.05。
图11A提供了游离DOX和DOX-NP的体内循环时间，图11B示出在注射24h后，在携带肿瘤的SCID小鼠中，DOX和DOX-NP的组织分布。数据以平均值±SD(n＝5)示出，*P<0.05,**P<0.01。
图12A提供了在注射后1h、5h、24h时，在携带肿瘤的SCID小鼠中DiR加载的纳米颗粒的体内荧光图像，图12B示出在注射后24h时，在SCID小鼠中器官和肿瘤的离体荧光图像。
图13示出在携带肿瘤的SCID小鼠中DOX-NP的抗肿瘤效力：(A)肿瘤体积；(B)在研究(a)对照、(b)使用DOX-NP处理的小鼠的结束时肿瘤组织的照片；(C)体重改变；以及(D)存活率。数据以平均值±SD(n＝5)示出，**P<0.01。
发明详述
在描述本公开的方法和材料之前，应该理解的是本文所述的方面不限于具体的实施方案、方法、机构或构造，如此当然可以改变。还应该理解的是本文使用的术语是仅为了描述特定的方面，除非本文中明确定义，否则无意于进行限定。
就本发明公开而言，本领域的普通技术人员可以构造本文所述的方法以满足所需的需要。例如在某些方面中，本发明公开的共聚物包含含有甾类化合物的嵌段和含有聚氧化烯的嵌段。此类共聚物在水性溶液中容易自组装成纳米颗粒，而无需超声处理或匀浆处理，并且具有良好的生物相容性、高药品加载能力、在循环中的长期停留、多峰性潜力，并且可以容易地大规模制造。在另一个实例中，本发明公开的纳米结构可以用于囊封疏水性治疗活性分子，例如抗癌药品。囊封抗癌药品的纳米颗粒与游离抗癌药品相比显示出高的肿瘤聚集和抗肿瘤效力，以及明显降低的毒性。在另一个实例中，本发明公开的嵌段共聚物可以官能化(例如使用巯基)，并且此类共聚物在水性介质也能够自组装，从而形成良好定义的具有官能团的纳米颗粒。巯基官能化的纳米颗粒用作用于疏水性抗癌药品(通过物理诱陷)和金纳米颗粒(Au NP)(通过与巯基的共价键合)的双重囊封的多官能载体。这些双重纳米颗粒展示高的药品加载、高的囊封效率、均匀的尺寸分布和良好的稳定性。
本发明公开的嵌段共聚物需要第一嵌段包含甾类化合物部分，其可任选地包含连接体。本领域的普通技术人员可以领会的是，可以选择合适的甾类化合物以满足所需的需要。例如适用于本发明公开的材料的甾类化合物部分包含胆固醇、胆酸、脱氧胆酸、牛黄胆酸等。在一个实施方案中，甾类化合物部分包含胆固醇。
甾类化合物部分可以通过合适的连接体与聚合物主链连接。连接体的一些实例包括但不限于：
聚内酯或硅氧烷的低聚物。在一个实施方案中，在R1处的连接体为：在另一个实施方案中，在R1处的连接体为：
包含甾类化合物的第一嵌段可以占嵌段共聚物总重量的大约1％至大约80％(即，大约1％至大约80％的重量份)。例如基于嵌段共聚物的总重量，第一嵌段的重量份可以为高于50％或低于50％，或大约5％至大约70％，或大约40％至大约70％，或大约40％至大约50％，或大约60％至大约70％，或大约2％至大约30％，或大约3％至大约30％，或大约5％至大约30％，或大约2％至大约20％，或大约3％至大约20％，或大约5％至大约20％，或大约7％至大约20％。
本发明公开的嵌段共聚物需要第二嵌段包含聚氧化烯部分。本领域的普通技术人员应该领会的是，可以选择合适的聚氧化烯以满足所需的要求。在一些实施方案中，聚氧化烯部分包括聚氧化乙烯或聚氧化乙烯硫醇酯。在另一个实施方案中，聚氧化烯部分包含聚氧化乙烯。
包含聚氧化烯的第二嵌段可以占嵌段共聚物总重量的大约20％至大约99％(即，大约20％至大约99％的重量份)。例如基于嵌段共聚物的总重量，第二嵌段的重量份可以为高于50％或低于50％，或大约30％至大约95％，或大约30％至大约60％，或大约50％至大约60％，或大约30％至大约40％，或大约70％至大约98％，或大约70％至大约97％，或大约70％至大约95％，或大约80％至大约98％，或大约8％至大约97％，或大约80％至大约95％，或大约80％至大约93％。
本发明公开的嵌段共聚物需要主链部分A。本文所述的嵌段共聚物可以包含例如聚降冰片烯、聚环戊烯、聚环辛烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯和本领域任一技术人员可以利用的聚硅氧烷主链A，并且可以根据所需的产品而改变。在一个实施方案中，本发明公开的嵌段共聚物为其中各个A独立地为聚降冰片烯或聚丙烯酸酯的那些。在另一个实施方案中，各个A独立地为降冰片烯。在另一个实施方案中，各个A独立地为聚丙烯酸酯。
在一个实施方案中，本发明公开的嵌段共聚物包含以下结构：
其中x为大约3至大约100的整数；m为大约5至大约200的整数；而n为大约5至大约100的整数。在一些实施方案中，x为大约5至50。在其他的实施方案中，x为大约8，或者x为大约44。
本领域技术人员将认识到本发明公开的嵌段共聚物可以进一步包含一种或多种额外的官能团。官能团的实例包括但不限于巯基、磷酸基、羧酸基等。本领域的任一技术人员能够基于特定的应用而选择所需的官能团。例如巯基官能化的嵌段共聚物可以用作用于疏水性抗癌药品(即通过物理诱陷)和金纳米颗粒(Au NP)(通过与巯基的共价键合)的双重囊封的多官能载体。类似地，磷酸或羧酸官能化的嵌段共聚物可以用于囊封量子点(例如CdSe等)或磁性纳米颗粒。
m和n的数值可以由本领域技术人员选择，并且可以根据所需的产品而改变。例如m可以为大约10至大约100；和/或n可以为大约15至大约85。本发明公开的嵌段共聚物的分子量可以为大约10000至大约1000000Da。在一个实施方案中，本发明公开的嵌段共聚物为大约40000至大约750000Da，或大约60000至大约700000Da，或大约60000至大约100000Da，或大约40000至大约200000Da。
本文所公开的嵌段共聚物具有多种理想的品质，例如包括相对较低的多分散性。可任选地，在本发明的实施方案中，聚合物链展现出Mw/Mn为大约1.0至大约2.5的多分散性指数。在一些实施方案中，多分散性指数为大约1.0至大约2.0，或大约1.0至大约1.9，或大约1.1至大约1.9，或大约1.0至大约1.8，或大约1.1至大约1.8，或大约1.0至大约1.5，或大约1.5至大约1.5，或大约1.0至大约1.3，或大约1.0至大约1.2，或大约1.0，或大约1.1，或大约1.2，或大约1.3，或大约1.4，或大约1.5，或大约1.6，或大约1.7，或大约1.8，或大约1.9，或者甚至大约2.0。在某些实施方案中，聚合物展现出Mw/Mn为大约1.0至大约1.5的多分散性指数。在一些其他的实施方案中，聚合物展现出Mw/Mn为大约1.0至大约1.2的多分散性指数。
在另一个方面中，本发明公开提供了核心/外壳纳米颗粒形式的本发明公开的嵌段共聚物。在一个实施方案中，所述的核心/外壳纳米颗粒形式为其中本发明公开的嵌段共聚物在水性溶液中自组装。在一个方面中，本发明公开提供了包含本发明公开的嵌段共聚物以及疏水性药学活性分子的纳米颗粒。可以根据所需的治疗效果，使用任何合适的疏水性药学活性分子。合适的实例包括但不限于阿霉素、道诺霉素、新长春碱、紫杉醇紫杉醇、多西他奇、顺铂、喜树碱、依立替康、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤,或地塞米松。
本发明公开的纳米颗粒可以进一步包含一种或多种金属纳米颗粒，例如金纳米颗粒和/或磁性纳米颗粒和/或量子点(例如CdSe等)。
本文所公开的嵌段共聚物具有多种理想的品质，例如包括良好定义的且均匀的尺寸分布。本发明公开的纳米颗粒的尺寸在任何情况下可以为大约5至大约500nm。例如纳米颗粒可以为大约10至大约200nm，或大约50至大约150nm，或大约100至大约250nm，或大约100至大约200nm，或大约120至大约150nm，或大约110至大约150nm，或大约120至大约180nm，或大约150至大约250nm，或大约150至大约200nm。
定义
在整个说明书中，除非内容另外要求，否则词语“comprise”和“include”以及变体(例如“comprises”,“comprising”,“includes”,“including”)将被理解为包含所述的成分、特征、元素或步骤，或者一组成分、特征、元素或步骤，但是不排除任何其他的整数或步骤，或者一组整数或步骤。
如本说明书和所附的权利要求书所用，除非内容中另外明确地陈述，否则单数形式“a”、“an”和“the”包括复数参照物。
范围在本文中可以表示为由“大约”一个特定的数值，和/或至“大约”另一个特定的数值。当表示此类范围时，另一个方面包括由一个特定的数值和/或至其他的特定的数值。类似地，当数值通过先行词“大约”以近似值表示时，应该理解为所述特定数值形成另一个方面。应该进一步理解的是，各个范围的端点与其他端点关联时和独立于其他端点时均是有效的。
如本文所用，术语“结合”包括将一种或多种项目加入至反应混合物中。
如本文所用，术语“分散性”、“多分散性”、“多分散性指数”、“PDI”、和“Mw/Mn”可以交换使用，并且是指就分子质量的分布而言聚合物均匀性的量度。可以通过重量平均分子量(Mw)除以数量平均分子量(Mn)来计算分散性(即Mw/Mn)。在某些实施方案中，可以根据聚合度来计算分散性，其中分散性等于Xw/Xn，其中Xw为重量平均聚合度，Xn为数量平均聚合度。
除非另外说明，否则所有的百分数、比率和比例以重量计。除非明确作出相反的说明，否则成分的重量百分数(重量％，也称为wt％)基于包含所述成分的组合物的总重量(例如基于反应混合物的总量)。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明公开的材料和方法，其不应该被视为将本发明公开的范围或精神限定于具体的过程及其中所述的材料。
材料和方法
所有的玻璃器具均在120℃下的干燥箱中储存几个小时。盐酸阿霉素(DOX.HCl)和盐酸伊达比星购自BiotangInc(Waltham,MA,USA)。嵌二萘购自the Sigma-AldrichChemical Co.(St.Louis,MO,USA)。三乙胺(TEA)和二甲基甲酰胺(DMF)购自FisherScientific(Boston,MA,USA)。青霉素-链霉素、0.25％(w/v)胰蛋白酶-0.03％(w/v)EDTA溶液、RPMI 1640和DMEM培养基购自American Type Culture Collection(Rockville,MD,USA)。人类子宫颈癌细胞(Hela)和人类肺癌细胞系(A549)购自the National CancerInstitute(Frederick,MD,USA)。胎牛血清(FBS)购自Atlanta Biologicals(Norcross,GA,USA)。Draq5,1,1′-双十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚二碳菁高氯酸碘化物(DiR)和体外毒理学测试试剂盒(基于MTT)得自Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)。Spectra/Pro膜购自Spectrum Laboratories,Inc.(Rancho Dominguez,CA,USA)。2,2’-偶氮-双(异丁腈)(AIBN)、硫代乙醇酸(98％)、对甲苯磺酸一水合物(PTSA)、D,L-二硫苏糖醇(DTT)、氯金酸(HAuCl4.3H2O)、柠檬酸钠、胆固醇(96％)、1,5-戊二醇(>97％)购自Aldrich,USA。三乙胺(TEA)和二甲基甲酰胺(DMF)购自Fisher Scientific(Boston,MA,USA)。聚乙二醇(MW＝1500)、1,4-二氧六环(99.8％,极干的)、二氯甲烷(DCM)(99.9％,极干的)、丙烯酰氯(>97％)购自AcrosOrganics USA。根据公开的过程制备5-胆固醇基氧基无机丙烯酸酯(C5A)。根据公开的过程合成RAFT试剂S-1-十二烷基-S’-(α,α’-二甲基-α”-乙酸)三碳酸酯(CTA)。80(polysorbate 80)为得自Croda(Columbus Circle Edison,NJ)的赠品。所有化学品均为分析级，并且未经纯化而使用。
数据表示为平均值±标准偏差。使用student’s t-检验测定试验组和对照组之间的差异的统计学意义。认为可能性(p)低于0.05为具有统计学意义。
实施例1：P(PEOASH-b-C5A)的合成和纯化
方案1
使用受控的自由基聚合来合成所有的嵌段共聚物，例如在C.T.Nguyen,et al.(Polymer Chemistry 2014,5(8),2774-2783)中所述的可逆加成断裂转移(RAFT)。简言之，将聚乙二醇(MW＝1500Da)(1mmol)和PTSA(0.1mmol)加入至圆底烧瓶中，并加入甲苯(10ml)。向该反应混合物中缓慢加入硫代乙醇酸(0.5mmol)，并在氮气环境下将该混合物过夜回流。在使反应混合物冷却后，通过蒸发除去溶剂，并使用DCM/水分隔残余物，在硫酸镁上干燥。收集有机层，在低压下浓缩。为了减少二硫官能团，通过加入DTT(1mmol)并在室温下搅拌3h，使收集的化合物溶解于甲醇中。然后，将所得的溶液在二乙醚中沉淀，从而除去DTT，并得到硫醇化的PEO(PEOSH)产物的白色固体。1H NMR(CDCl3,δppm):4.27(t,2H,-COOCH2-，在PEO末端基团中)，3.79-3.44(m,-CH2CH2O-,PEO的重复单元)，3.35(s,2H)，1.55(s,-SH)，13C NMR(CDCl3,δppm):170.9(-COO)，70.3和64.8(-CH2,在PEO的重复单元中)，27.7(-CH2-S)。
首先，将PEOSH以10wt％的浓度溶解于DCM中。接着，将丙烯酰氯和TEA加入至所述溶液中，并在氮气环境下过夜搅拌。PEOSH、丙烯酰氯和TEA的摩尔比为1:2:2。在反应结束后，滤出不溶性的盐(TEA.HCl)，并收集溶液。将聚乙烯氧化物硫醇丙烯酸酯(polyethyleneoxide thiolate acrylate,PEOASH)在超冷的二乙醚中沉淀，并收集到浅黄色的固体。1HNMR(CDCl3,δppm):4.27(t,2H,-COOCH2-,在PEO末端基团中),3.79-3.44(m,-CH2CH2O-,PEO的重复单元)，6.42,6.09,5.54(m,3H,CH2-CH＝COO。13C NMR(CDCl3,δppm):170.9(-COO)，133,126.6(-CH2,在乙烯基基团中的CH)，70.3和64.8(在PEO中的-CH2重复单元),27.7(-CH2-S)。
利用RAFT聚合作用来合成P(PEOASH)大分子链转移剂。将单体PEOASH(0.5g,0.93mmol)溶解于装配有搅拌棒的Schlenk管中的3mL甲苯中，然后加入RAFT试剂CTA(18.3mg,0.05mmol)和引发剂AIBN(0.82mg,0.005mmol)。通过3个冷冻-排空-解冻循环使Schlenk管脱气，然后放置于70℃的油浴中。使反应进行20h。浓缩反应混合物并在二乙醚中沉淀。收集带有聚丙烯酸酯的PEOSH(P(PEOASH))聚合物，并在真空下过夜干燥。1H NMR(CDCl3,δppm):4.27(t,2H,-COOCH2-，在PEO末端基团中)，3.79-3.44(m,-CH2CH2O-，PEO的重复单元)，3.15(t,2H,CH3C10H20CH2-S-)，1.60-1.75(m,6H,-S-C(CH3)2COO-)，1.25(m,20H,CH3C10H20CH2S-)，0.87(t,3H,CH3C10H20CH2S-)。GPC(40℃，THF流动相，聚苯乙烯标准品)：Mn＝8540g/mol,PDI＝1.18。
在一个代表性过程中，将P(PEOASH)大分子链转移剂(1.2g,0.2mmol)、C5A(3.8g,28.0mmol)和AIBN(6mg,0.04mmol)的混合物溶解于1,4-二氧六环(3mL)中，并通过3次冷冻-排空-解冻循环进行脱气。密封反应混合物，然后将其在75℃下在预热的油浴中放置20h。浓缩所得的混合物，并在二乙醚中沉淀。收集产物并在真空下干燥。1H NMR(CDCl3,δppm):5.33(d,1H,-C＝CH-，胆固醇基部分中的烯烃基团)，3.9(m,2H,-COOCH2CH2)，3.64(m,-CH2CH2O-PEO的重复单元)，3.45(m,2H,-CH2OCH-)，3.12(m,1H,-CH2OCH-)，2.50-0.55(m,54H,-CH3,-CH2-,-CH-,-CH-(CH3)-，在胆固醇基中，-CH2-C(CH3)COO-,-CH2CH2-CH2CH2CH2-，在间隔基团中)。GPC(40℃，THF流动相，聚苯乙烯标准品)：Mn＝15270g/mol,PDI＝1.21。
1H-NMR允许对所得的LCP嵌段共聚物的摩尔组成(n:m)和摩尔重量进行测定。在5.3、3.9和2.5-0.55ppm的信号归因于胆固醇的质子。此外，在刷状-chol-BCP中缺乏在6.42、6.09和5.54ppm处的单体烯烃峰，表明单体转化成聚合物。分别在3.6ppm和4.25ppm处观察到对应于PEO重复单元和PEO末端CH2基团的PEO嵌段的信号。通过比较在5.33ppm(在胆固醇基部分的烯烃基团)和3.64ppm(PEO重复单元)处1H-NMR光谱峰的完整性，测定2个不同嵌段的重量份。凝胶渗透色谱(GPC)用于测量刷状-chol-BCP的数量平均分子量(Mn)和多分散性指数(PDI)。刷状-chol-BCP急剧地迁移至较高的分子量区域，并具有窄的分子量分布。结果显示单峰对称分布，表明良好控制的聚合过程。使用固定的分子量为9000g mol-1的P(PEOASH)大分子链转移剂得到具有不同重量份(或MW)的胆固醇嵌段的2种不同的刷状-chol-BCP，同时通过调节胆固醇比率将PC5A嵌段的分子量控制为7000gmol-1至18000gmol-1。
表1.合成的刷状-chol-BCP聚合物的分子特征
[a]在40℃下通过使用THF作为流动相并使用聚苯乙烯标准品校准的GPC来测定。[b]5.33ppm(在胆固醇基部分中的烯烃基团)和3.64ppm(PEO重复单元)处1H-NMR光谱峰的积分比值用于计算刷状-chol-BCP的重量份。
实施例2：P(PEO-b-C5MA)-SH的合成和纯化
方案2
甲基丙烯酸接枝聚氧化乙烯(MA-g-PEO)：为了合成大分子单体MA-g-PEO，将聚氧化乙烯甲基醚(MW:2000Da,4g,2mmol)溶解于DCM中，然后加入甲基丙烯酰氯和三乙胺(TEA)，并在氮气下过夜搅拌。PEO、甲基丙烯酰氯和TEA的摩尔比为1:2:2。在12h后，滤除不溶性的盐(TEA.HCl)，并收集溶液。使大分子单体产物在超冷的二乙醚中沉淀，并收集到浅黄色固体。1H NMR(CDCl3,δppm):6.15,5.54(m,2H,CH2-CH＝COO-)，4.27(t,2H,-COOCH2-，在PEO末端基团中)，3.79-3.44(m,-CH2CH2O-，PEO的重复单元)，3.36(s,-OCH3)。13C NMR(CDCl3,δppm):170.9(-COO)，133,126.6(-CH2,乙烯基中的CH)，70.3和64.8(PEO中的-CH2重复单元)。
PEO大分子引发剂(PMA-g-PEO-硫酯)：利用RAFT聚合作用来合成PMA-g-PEO-硫酯大分子链转移剂。在装配有搅拌棒的Schlenk管中，将大分子单体(MA-g-PEO，0.5g，0.93mmol)溶解于1,4-二氧六环(3mL)中，然后加入RAFT试剂(CTA，18.3mg，0.05mmol)和引发剂(AIBN，0.82mg，0.005mmol)。然后通过3次冷冻-排空-解冻循环将Schlenk管脱气，并将其置于保持在80℃的油浴中。使反应进行24h。浓缩反应混合物，并在二乙醚中沉淀。收集产物，并在真空下过夜干燥。1H NMR(CDCl3,δppm):4.27(t,2H,-COOCH2-，在PEO末端基团中)，3.79-3.44(m,-CH2CH2O-，PEO的重复单元)，3.36(s,-OCH3)，3.2(t,2H,CH3C10H20CH2-S-)，1.60-1.75(m,6H,-S-C(CH3)2COO-)，1.25(m,20H,CH3C10H20CH2S-)，0.87(t,3H,CH3C10H20CH2S-)。13C NMR(CDCl3,δppm):170.9(-COO)，133,126.6(-CH2，在乙烯基基团中的CH)，74.5(-COOCH-)，70.3和64.8(在PEO中的-CH2重复单元)，51.3-11.2(-CH2-C(CH3)COO-)。GPC(40℃，THF流动相，聚苯乙烯标准品):Mn＝8950g/mol，PDI＝1.27。
P(PEO-b-C5MA)-硫酯(刷状-chol-BCP-硫酯；或者(PMA-g-PEO)-b-PC5MA-硫酯)：在一个代表性过程中，将PMA-g-PEO大分子链转移剂(1.2g，0.2mmol)、C5MA(3.8g，28.0mmol)和AIBN(6mg，0.04mmol)的混合物溶解于1,4-二氧六环(3mL)中，并通过实施3次冷冻-排空-解冻循环进行脱气。密封反应混合物，然后将其在保持在90℃下的油浴中放置20h。浓缩所得混合物，并在大量过量的甲醇中沉淀。收集产物粗品，使用甲醇过夜Soxhlet萃取，从而除去未反应的单体，然后使用THF萃取，并在甲醇中再次沉淀。收集产物刷状-chol-BCP-硫酯，并在真空下干燥。通过UV-可见光谱测量，在310nm处出现硫酯的峰。1H NMR(CDCl3,δppm):5.33(d,1H,-C＝CH-,在胆固醇基部分中的烯烃基团)，4.5(m,1H,-CH2-COO-CH)，3.9(m,2H,-COOCH2CH2)，3.64(m,-CH2CH2O-PEO的重复单元)，3.45(m,2H,-CH2OCH-)，3.36(s,-OCH3)，3.2(t,2H,CH3C10H20CH2-S-)，2.50-0.55(m,56H,-CH3,-CH2-,-CH-,-CH-(CH3)-，在胆固醇基部分中；-CH2-C(CH3)COO-,-CH2CH2-CH2CH2CH2-，在间隔基团中)。13C NMR(CDCl3,δppm):170.9(-COO)，140.9(-C＝CH-,胆固醇中的烯烃基团)，121.9(-C＝CH-,胆固醇中的烯烃基团)，133,126.6(-CH2,乙烯基团中的CH)，74.5(-COOCH-)，70.3和64.8(PEO中的-CH2重复单元)，51.3-11.2(-CH2-C(CH3)COO-,-胆固醇)。GPC(40℃，THF流动相，聚苯乙烯标准品):Mn＝18320g/mol，PDI＝1.16。
P(PEO-b-C5MA)-硫醇((PMA-g-PEO)-b-PC5MA-硫醇；或刷状-chol-BCP-硫醇)：为了获得刷状-chol-BCP-硫醇，在THF中通过正丁基胺使刷状-chol-BCP-硫酯过原。在一个代表性过程中，在氮气笼罩下将刷状-chol-BCP-硫酯(0.35g，0.02mmol)和正丁基胺(80mg，1.1mmol)溶解于THF中，搅拌2h，直至溶液的颜色由浅黄色变为无色。然后在过量的甲醇中沉淀聚合物。收集产物粗品，使用甲醇过夜Soxhlet萃取，从而除去未反应的单体，然后使用THF萃取，最后在甲醇中再次沉淀。收集产物，并在真空下干燥。为了建立反应动力学，将刷状-chol-BCP-硫酯在THF(1mg/mL)中形成的溶液放置于在UV可见光谱的样品分隔区中拟合的石英比色皿中。加入THF中的适量正丁基胺溶液，并且以时间为函数测量310nm处溶液的吸光率。通过1H NMR和13C NMR证明所述的结构。
通过FT-IR证明刷状-chol-BCP-硫醇的形成，在2450cm-1处显示硫醇峰。此外，1HNMR光谱显示缺少3.2ppm处的峰，其对应于刷状-chol-BCP-硫醇的硫酯基团的质子，表明硫酯基团成功地被硫醇基团取代。在UV可见光谱中，初始刷状-chol-BCP-硫酯展现出集中于310nm处的强烈的吸光率，该吸收峰属于硫酯基团，而在还原后，在该光谱区域中未检测到吸光率。该结果证明在刷状-chol-BCP-硫醇中形成硫醇基团。此外，UV可见光谱还通过测量将正丁基胺注入刷状-chol-BCP-硫酯溶液中时310nm处吸收时间的减少来提供还原步骤的动力学。吸收强度在加入正丁基胺时在2h内快速降低，并且达到较低的恒定的值，表明还原反应的完成效率>96％。表2概括了刷状嵌段共聚物的分子特征。
表2.合成的刷状-chol-BCP聚合物的分子特征
[a]在40℃下通过使用THF作为流动相并使用聚苯乙烯标准品校准的GPC来测定。[b]5.33ppm(在胆固醇基部分中的烯烃基团)和3.64ppm(PEO重复单元)处1H-NMR光谱峰的积分比值用于计算刷状-chol-BCP的重量份。[c]使用1H-NMR分析来测定单体向聚合物的转化。[d]使用UV-可见光谱来测定还原的转化。
实施例3：具有P(PEOASH-b-C5A)或使用P(PEOA-b-C5MA)-SH的自组装纳米颗粒和DOX-NP的制备和表征
通过纳米沉淀方法制备基于P(PEOASH-b-C5A)的自组装纳米颗粒。简言之，将P(PEOASH-b-C5A)(10mg)溶解于THF(2mL)中，然后在匀浆下以20000rpm滴注至包含80(1％,w/v)的蒸馏水(10mL)中。然后在环境温度下在氮气流中使THF蒸发。通过在50000rpm下超离心60min来收集纳米颗粒，从而除去80，然后分散至蒸馏水中。相同的过程用于制备P(PEOA-b-C5A)-SH纳米颗粒。
使用嵌二萘作为疏水性探针，通过荧光技术来测定临界聚集浓度(CAC)。将丙酮中的嵌二萘溶液(3x10-4M)加入至检测管中，然后通过蒸发除去有机溶剂。接着，将在蒸馏水(10mL)中的各种浓度的共聚物溶液加入至检测管中，并在60℃下超声处理3h，从而平衡嵌二萘和纳米颗粒。样品溶液的浓度由0.005mg/mL改变为0.5mg/mL。嵌二萘的最终浓度为6.0x10-7M。记录使用荧光分光光度计(Perkin Elmer LS-55B,USA)，在336nm的激发波长下350-450nm处嵌二萘的发射光谱。为了测量在嵌二萘发射光谱中第一(374.5nm)和第三最高能量带(386nm)的强度比，将激发和发射光谱的狭缝开放(slit opening)设定为2.5nm。
随着LCP浓度的升高观察到线性降低。基于这种方案，P(PEOASH-b-C5A13)共聚物的CAC值低于P(PEOASH-b-PC5A36)共聚物的CAC值，分别显示为9.4和15.8的数值(表3)，表明具有较高胆固醇含量的P(PEOASH-b-PC5A36)纳米颗粒的内部核心中强烈的疏水性相互作用。硫醇官能化的共聚物P(PEOA-b-C5A)-SH的CMC值为15.2(表3)。刷状-chol-BCP的这些较低的CAC值表明刷状-chol-BCP理想地对于系统性药品递送是理想的，并且可以在延长的时间内作为体内的自组装纳米颗粒而循环。
表3.自组装刷状-chol-BCP和双重囊封的纳米颗粒的表征
CAC：通过探针荧光技术测量的临界聚集浓度
DLC：药品加载含量＝(纳米颗粒中DOX的量/DOX-加载的纳米颗粒的量)x100
EE：囊封效率＝(纳米颗粒中DOX的量/用于纳米颗粒制备的DOX的量)x100
实施例4：具有P(PEOASH-b-C5A)或P(PEOA-b-C5MA)-SH的双重加载纳米颗粒的制备和表征
为了制备Au NP-囊封的P(PEOASH-b-C5A)，在装配冷凝器的50mL圆底烧瓶中，在强力搅拌下首先将DI水中的10mL 0.01wt％HAuCl4加热至沸腾。然后快速加入DI水中的0.2mL1wt％柠檬酸钠，得到由蓝至紫红色的颜色改变。在相同温度下进一步搅拌10min后，将所得溶液冷却至温室，并持续搅拌，从而产生柠檬酸封端的(citrate-capped)Au NP。在15min内将P(PEOASH-b-C5A)溶液(10mg，2mL THF中)以滴加方式注射至包含80(1％,w/v)的Au NP溶液中。然后在室温下将溶液搅拌2h，使得柠檬酸盐分子与PEO的巯基基团完全交换。将所得的溶液在3000rpm下离心10min，从而除去沉淀的Au NP。相同的过程用于制备双重加载的P(PEOA-b-C5MA)-SH纳米颗粒。
为了制备双重囊封的纳米颗粒，首先将DOX.HCl溶解于包含2当量TEA的DMF中，并在黑暗下过夜搅拌，从而形成疏水性DOX。通过真空干燥器除去有机溶剂，从而得到干燥的疏水性DOX。将疏水性DOX溶解于THF中，并在匀浆下以20000rpm的将所得溶液滴注至Au NP-囊封的刷状-chol-BCP溶液中。在3000rpm下将所得溶液离心10min，然后过滤通过0.45μm注射器，从而除去任何沉淀的游离DOX。在超离心和冷冻干燥后得到最终产物。使用动态光散色(DLS)仪器(Malvern)测量双重囊封的纳米颗粒(1mg/mL)的平均粒径和尺寸分布。通过Tecnai Biotwin G2透射电子显微镜(TEM)，在加速电压80KV下使双重囊封的纳米颗粒的形态成像。通过将纳米颗粒溶液滴加到具有Formvar薄膜的铜网格涂层上，然后进行空气干燥，从而制备样本。
通过比色法来测定双重囊封的纳米颗粒中DOX的量。将冷冻干燥的双重囊封的纳米颗粒(0.5mg)溶解于THF(2mL)中，从而获得澄清的溶液。使用UV-VIS分光光度计来检测在480nm下的吸光率。制备多种浓度的DOX标准品溶液，并测量在480nm下的吸光率，从而生成用于计算药品加载含量的校正曲线。通过以下等式计算药品加载含量(DLC)和囊封效率(EE)：
通过静脉内途径给予的纳米载体会遭受与血清蛋白质的相互作用，其中所述血清蛋白质是可以改变载体稳定性和组织分布的血液成分中的主要物质。因此，当纳米载体遭遇血清蛋白质时，如果纳米载体保持其整体性，则可以预计向目标组织的高效的药品递送。对于稳定性检测而言，将冷冻干燥的双重囊封的纳米颗粒以1mg/mL的浓度悬浮于磷酸盐缓冲的盐水(PBS)/胎牛血清(FBS)(1:1)中，然后超声处理大约10min，并过滤通过0.45μm注射器过滤膜。使用Zetasizer(Malvern)在4℃下储存条件中监测纳米颗粒的粒径。
结果
不被特定的理论所束缚，据信纳米颗粒可能具有核心/外壳结构，其带有疏水性胆固醇的内部核心，该内部核心起到疏水性药品的储存器的作用，以及包含硫醇基团的亲水性PEO外壳。据信，在溶液相中产生的Au NP由于A与硫醇基团之间的相互作用而沉积在刷状-chol-BCP表面上。Au NP成功地被囊封在刷状-chol-BCP中，这可通过TEM证明(参见图3和4)。Au NP-加载的刷状-chol-BCP在TEM图像下显示为比不具有Au NP的纳米颗粒更深的球形纳米颗粒，这是由于金属纳米颗粒的较高的密度。此外，在2.1keV下具有峰的能量分散X-射线(EDX)光谱表明在自组装的刷状-chol-BCP内存在Au(数据未示出)。
此外，疏水性DOX分子通过DOX和胆固醇部分的疏水性相互作用而成功地被囊封至Au NP-囊封的刷状-chol-BCP中。在DOX进料比为25％(w/w)下，使用得到P(PEOASH-b-PC5A36)纳米颗粒中23.8％(w/w)的高的药品加载含量(DLC)，并具有95.2％的高的囊封效率(EE)。通过刷状-chol-BCP的分子量可以影响药品的加载，例如具有较低的疏水性嵌段的P(PEOASH-b-PC5A13)会产生19.3％(w/w)较低的药品加载水平和较大的粒径(～200nm)。不被特定的理论所束缚，据信上述情况可归因于自组装的纳米颗粒中亲水性和疏水性链段之间的平衡的改变，并且这转而影响疏水性核心与DOX的相互作用。由于胆固醇侧链的分子内相互作用和缠结性质(entanglement property)，刷状-chol-BCP内的疏水性相互作用可以增强稳定性，这将有利于纳米颗粒的系统性药品递送。此外，在这些聚合物中的分子间和分子内疏水性相互作用对药品的囊封具有积极的影响，从而得到改善的药品加载能力和效率。由于优异的胆固醇-DOX相容性，通过胆固醇部分的存在还可以显著地影响药品的加载能力。
刷状-chol-BCP纳米颗粒的平均粒径范围为128至175nm，并具有窄的尺寸分布(PDI小于0.1)(表3)。纳米级的尺寸和窄的单峰PDI表明刷状-chol-BCP组装的纳米颗粒具有作为用于囊封Au NP和DOX的纳米载体的良好的物理属性。由于更紧实的疏水性内部核心的形成，纳米颗粒的平均尺寸会随着胆固醇含量的增加而降低。TEM图像显示纳米颗粒(刷状-chol-BCP自组装的纳米颗粒)的性质为球形，并且空白的纳米颗粒的尺寸为100-170nm，而且Au NP囊封的纳米颗粒具有更大的尺寸，为150-200nm(图4)，这比通过DLS测量的尺寸稍微小一些。DOX的物理囊封增加了颗粒的尺寸，和纳米颗粒的多分散性，显示双重囊封的P(PEOASH-b-PC5A13)和P(PEOASH-b-PC5A36)的尺寸分别为230.2nm和183.8nm(图5)。具有双重囊封的Au NP+DOX的纳米颗粒的形状为球形，并且尺寸为182-230nm，如TEM图像所示(图4)。粒径是体内应用中需要考虑的重要因素，因为其会影响纳米颗粒的生物分布。直径小于200nm的纳米颗粒会优选地聚集，并通过增强的渗透性和停留(EPR)效应而停留在肿瘤实质中，而具有较大直径的药品载体则容易被网状内皮系统(RES)清除。
为了研究双重囊封纳米颗粒的物理稳定性，使用DLS来监测磷酸盐缓冲的盐水(PBS)/胎牛血清(FBS)溶液中纳米颗粒的尺寸的改变。双重囊封的纳米颗粒在50％FBS中在4℃下储存1周后，其平均粒径不会显著改变(图6A和6C)，并且未观察到沉淀聚集，表明通过胆固醇分子之间和/或胆固醇,Au NP和DOX之间的疏水性相互作用而取得优异的稳定性。该发现表明双重囊封的刷状-chol-BCP纳米颗粒是稳定的，并且在水性介质中保持它们的形式和结构，而且适用于体内应用。
实施例5：P(NBCh9-b-NBPEG)的合成和纯化
方案3
之前报告了降冰片烯官能化的单体(5-{9-(胆固醇基氧基羰基)-壬基氧基羰基}-双环[2.2.1]庚-2-烯(NBCh9))和甲氧基聚乙二醇(MPEG)官能化的降冰片烯(NBPEG)(Mn＝2Kg/mol)的合成。使用在Deshmukh,P.,et al.(Macromolecules 2013,46,8245-8252)中所述的开环异位聚合作用(ROMP)合成所有的嵌段共聚物，其中所述的文献以引用方式并入本文。表4概括了刷状嵌段共聚物的分子特征。
表4.P(NBCh9)x-b-(NBPEG)y的分子特征
下标中的[a]编号代表理论聚合度，400kDa-50包含～8％w/w胆固醇含量，而600kDa-75和600kDa-180分别包含～6％和18％w/w of胆固醇；[b]使用GPC测定的分子量，注意：由于刷子结构体系，所观察的分子量低于理论计算的；[c]单体的重量份百分率是通过分别针对胆固醇和PEG侧链的峰的1H-NMR积分来测定的。
根据上述方法制备其他的刷状嵌段共聚物，并且结果概括于表4A中。这些嵌段共聚物还能够形成纳米结构。
表4A.P(NBCh9)x-b-(NBPEG)y的分子特征
[a]PNBCh9和PNBMPEG分别代表了由之前的出版物所报告的NBCh9和NBMPEG(大分子)单体的均聚物。[b]下标代表了基于单体与催化剂的比例而计算的聚合度。[c]通过分析测定。[d]理论分子量是通过分别针对胆固醇和PEG侧链的峰的1H-NMR积分来测定的。[e]使用RI检测器通过GPC测定，其中THF用作洗脱剂，聚苯乙烯标准品用于构建传统的校正。
实施例6：自组装的纳米颗粒和DOX-NP的制备和特征
通过透析方法制备孔板的自组装纳米颗粒。简言之，借助于超声处理，将P(NBCh9-b-NBPEG)溶解于DMF中。然后，将溶液转移至透析袋(MWCO:10,000Da)中，并针对蒸馏水透析48h。为了制备DOX加载的P(NBCh9-b-NBPEG)纳米颗粒(DOX-NP)，首先将DOX.HCl溶解于包含2当量的TEA的DMF中，并在黑暗下过夜搅拌，从而形成疏水性DOX和TEA.HCl。加入各种共聚物，然后在黑暗中将溶液再搅拌1小时。接着，将溶液针对蒸馏水透析48h，从而除去游离的DOX和溶剂。通过在8000rpm下离心10min，从而除去沉淀的DOX，然后过滤通过0.45μm注射器。在冷冻干燥后收集最终的产物。
如实施例4中所述，使用动态光散射(DLS)测量DOX-NP(1mg/mL)的平均粒径、尺寸分布和电动电位。如实施例3中所述，使用嵌二萘作为疏水性探针，通过荧光测量来测定P(NBCh9-b-NBPEG)共聚物的临界聚集浓度(CAC)。用于激发和发射光谱的狭缝开放设定为5nm。如实施例4所述，通过比色法来测定加载至纳米颗粒中的DOX的量。
结果
MW为400kDa(400kDa-50)和600kDa(600kDa-75和600kDa-180)的3种亲水性P(NBCh9-b-NBPEG)刷状共聚物由于胆固醇部分之间的疏水性相互作用而容易在水性溶液中自组装，从而形成纳米颗粒。作为自聚集形成的阈值浓度的CAC是通过嵌二萘的2个荧光发射峰(I374/I385)的强度比来测定的。随着P(NBCh9-b-NBPEG)浓度的升高，观察到线性降低。400kDa-50共聚物的CAC值低于包含胆固醇的600kDa共聚物(表4)的CAC值，表明400kDa-50共聚物更稳定。在相同的分子量下，具有更高胆固醇含量的600kDa共聚物(600kDa-180)比具有较低的胆固醇含量的600kDa共聚物(600kDa-75)的更高的CAC，表明在具有更高胆固醇含量的P(NBCh9-b-NBPEG)纳米颗粒的内部核心中强烈的疏水性相互作用。这些CAC值处于PEG基嵌段共聚物的典型范围内，表明P(NBCh9-b-NBPEG)共聚物可以作为自组装的纳米颗粒在体内循环延长的时间。不被特定的理论所束缚，据信纳米颗粒可能具有带有疏水性胆固醇内部核心的核心/外壳结构域，其中所述的疏水性胆固醇内部核心起到疏水性药品的储存器的作用。
使用透析方法将疏水性DOX成功地囊封至P(NBCh9-b-NBPEG)自组装纳米颗粒中。在DOX进料比为25％(w/w)的情况下，400kDa-50纳米颗粒中的DLC为大约22.1％，并且EE为88.4％。药品加载受到共聚物的分子量的影响。尽管600kDa-180共聚物比400kDa-50共聚物具有更高的胆固醇含量，但是600kDa-180共聚物具有较低的DLC和EE(表5)。这归因于600kDa-180的亲水性链段和疏水性链段之间的平衡的改变，导致纳米颗粒的不同的自组装行为。具有更高胆固醇含量的600kDa-180共聚物比600kDa-75具有稍微更高的DLC和EE值。
表5.P(NBCh9-b-NBMPEG)和DOX-NP的特征
DLC：药品加载含量
EE：囊封效率
分别通过DLS和TEM测量空白P(NBCh9-b-NBMPEG)纳米颗粒和DOX-NP的粒径和形态。空白P(NBCh9-b-NBMPEG)纳米颗粒的平均粒径范围为124至179nm，并且具有窄的尺寸分布(PDI小于0.1)(表5)。随着分子尺寸由400kDa升高至600kDa，纳米颗粒的平均尺寸增大。在600kDa的相同的MW下，由于更紧实的疏水性内部核心形成，纳米颗粒的尺寸将随着胆固醇含量的升高而降低。DOX的物理囊封增加了纳米颗粒的粒径和多分散性(表5)。TEM图像显示具有DOX和不具有DOX加载的纳米颗粒的形状为球形，并且对于孔板纳米颗粒而言，直径为100-160nm，而对于DOX-NP而言，直径为120-170(图7)。通过TEM测定的粒径比通过DLS测量的尺寸稍微更小。粒径是体内应用中需要考虑的重要因素，因为其会影响纳米颗粒的生物分布，并且自组装纳米颗粒通过EPR作用在肿瘤组织中聚集的理想尺寸为小于200nm。因此，DOX-NP的纳米级粒径(≤200nm)对于通过EPR作用的被动肿瘤靶向是有利的。由于胆固醇衍生物的悬垂羰基羟基基团，所以400kDa-50,600kDa-75和600kDa-180纳米颗粒在它们的表面上是带负电荷的，这可以通过400kDa-50,600kDa-75,和600kDa-180的电动电位值分别为-18.8,-14.9,和-6.9mV所反映(表5)。为了高效地将药品递送至目标肿瘤位点，纳米颗粒必须具有在血流中保持相当长的时间的能力，而不会被单核吞噬细胞系统(MPS)删除。这种能力取决于它们的尺寸和表面特征。公知的是具有亲水性表面的纳米颗粒可以逃脱巨噬细胞的捕获，并且报告直径为大约200nm的负电荷的脂质体显示比天然脂质体具有增加的肝脏吸收速率。负电荷由-40mV降低至-15mV导致肝脏吸收速率显著降低和延长的血液循环。因此，具有亲水性表面和中性表面电荷的DOX-NP适用于阻碍血浆蛋白质吸附及被MPS清除。
实施例7：由纳米颗粒得到DOX的稳定性和体外释放
将冷冻干燥的DOX-NP(1mg/mL)悬浮于包含血清的磷酸盐缓冲的盐水(PBS)溶液(50％FBS)中，然后超声处理10min，并过滤通过0.45μm注射器过滤膜。使用MalvernZetasizer，在储存时间内监测储存在4℃下的纳米颗粒的粒径。
使用透析方法来研究由纳米颗粒得到的DOX的体外释放。简言之，将冷冻干燥的DOX-NP(6mg)悬浮液3mL PBS(0.01M,pH 7.4)中，然后超声处理10min，从而产生光学澄清的悬液。将该悬液引入至5mL透析仪(MWCO:10,000Da)中，并在37℃下在100rpm的水浴摇床中浸渍于20mL包含Tween 80的PBS(0.1％w/v)中。在所选的时间间隔下，移出溶解介质中的等分物(10mL)，并补充相等体积的新鲜介质。在480nm下通过UV立即测量DOX的浓度。基于已知DOX浓度的标准曲线来计算所释放的DOX的百分率。
考虑到P(NBCh9-b-NBPEG)纳米颗粒打算用于静脉内(i.v.)给予，则评价它们在包含介质的血清中的稳定性。使用DLS来研究DOX-NP的稳定性，从而监测纳米颗粒的尺寸的改变。DOX加载的400kDa-50,600kDa-75,和600kDa-180的平均粒径在50％FBS中在4℃下储存1周后不会显著改变(图8A)，并且未观察到沉淀或聚集。
为了进一步评估P(NBCh9-b-NBPEG)纳米颗粒作为药品载体的潜力，使用透析方法在包含0.1％Tween 80的PBS(pH 7.4,37℃)中进行DOX释放的检测。P(NBCh9-b-NBPEG)纳米颗粒以持续的释放模式释放DOX，而非初始的突然释放，并且在第一天后释放大约2％，在13天后400kDa-50-DOX纳米颗粒释放大约25％，600kDa-180-DOX纳米颗粒释放17％(图8B)。由400kDa-50纳米颗粒得到的药品释放比600kDa纳米颗粒相对更快。尽管胆固醇含量显著差异，由600kDa-75和600kDa-180得到的DOX的释放是相似的。纳米颗粒的缓慢的释放性质(并非突然释放)用于抗癌药品的递送，其中血流中是否有限量的药品，直至纳米颗粒达到肿瘤组织，其中由于所述的共聚物在酶的存在下降解，所以药品的释放在细胞内可以提高。
实施例8：DOX-NP的细胞毒性
将HeLa细胞(7500细胞/孔)接种于96孔板上，并在补充有10％FBS,1％抗生素,和1％L-谷氨酰胺的200μL DMEM中在37℃和5％CO2下培养24h。在培养后，加入溶解于不具有补充剂的DMEM中的各种浓度的空白纳米颗粒(0.2-1mg/mL),DOX-NP,和游离DOX(1-50μg/mLDOX等价物)。在与游离的DOX和DOX-NP温育24h后，并且与空白纳米颗粒温育48h后，利用3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-3,5-二苯基四氮唑溴化物染料(MTT染料,最终浓度为0.5mg/mL)吸收在微板读取器(Tecan group Ltd.,Switzerland)上在540nm下测定细胞毒性。
图9A-B示出使用空白P(NBCh9-b-NBPEG)纳米颗粒、游离的DOX以及在不同的纳米颗粒和相当的DOX浓度下的DOX-NP处理的HeLa细胞的活力。空白P(NBCh9-b-NBPEG)纳米颗粒显示甚至在1mg/mL的浓度下对HeLa细胞的可忽略的毒性，并且在处理后的48h，细胞活力≥90％(图9A)，表明P(NBCh9-b-NBPEG)纳米颗粒对细胞的较低的毒性和良好的相容性。游离的DOX和DOX-NP在温育24h后会以剂量(1-50μg/mL DOX)依赖的方式将细胞活力降低40-95％(图9B)，表明P(NBCh9-b-NBPEG)纳米颗粒会释放DOX并且被递送至其所需的细胞位置。通过将DOX浓度由1μg/mL增加至高达50μg/mL，游离的DOX会急剧地降低细胞活力，而DOX-NP会逐渐地降低细胞活力。在所有的DOX浓度下，游离的DOX显示明显高于DOX-NP的细胞毒性。为了显示明显的细胞毒性，被细胞吸收的DOX-NP必需释放游离形式的DOX。如图8B所示，在24h内，仅3％DOX被纳米颗粒释放。结果，在特定的温育时间后，由纳米颗粒释放的DOX的浓度远低于游离DOX的浓度。因此，游离DOX和DOX-NP之间的细胞毒性的差异可能是由于游离DOX和DOX-NP的吸收途径的差异，以及DOX-NP的持续释放的性质。在相似的DOX水平下，DOX加载的400kDa-50的细胞毒性明显高于DOX加载的600kDa-75的细胞毒性，表明在10μg/mLDOX下，DOX加载的400kDa-50的活力值为大约40％，而DOX加载的600kDa-75的活力值为大约70％。除了25μg/mL DOX以外，DOX加载的400kDa-50和DOX加载的600kDa-180的细胞毒性无显著性差异。
相似地，图9C显示使用游离的DOX,DOX加载的P(PEOASH-b-PC5A)NP,以及Au和DOX加载的P(PEOASH-b-PC5A)NP处理的HeLa细胞的活力。
实施例9：DOX-NP的细胞内吸收
为了观察细胞的吸收，将HeLa细胞以1.0×105细胞/孔的密度接种于Lab-Tek II腔室玻片的8孔腔室中，并在37℃和5％CO2下，预温育24h。将包含相等剂量(25μg/mL)的游离DOX和DOX-NP的无血清DMEM加入至各孔中，然后在37℃下温育2h。接着使用PBS漂洗细胞，使用10μM Draq5染色，并使用4％福尔马林溶液固定10min。然后，将盖玻片放置在载玻片上。通过共聚焦激光扫描显微镜(Leica,England)在激发波长488nm(用于DOX)和633nm(用于Draq5)下将游离DOX和DOX-NP的细胞吸收成像。
为了定量细胞的吸收，使0.5mL的HeLa细胞(5x 105细胞/孔)在CO2的潮湿气氛中在37℃下在24孔板中生长24h。将包含相等剂量(25μg/mL)的有利DOX和DOX-NP的无血清DMEM加入细胞中，该细胞随后温育2h。然后，使用PBS将细胞洗涤3次，通过胰蛋白酶化收获，并转移至荧光激活细胞分选仪(Fluorescence Activated Cell Sorter(FACS))管中。通过流式细胞仪(FACSCalibur,BD Biosciences,San Jose,CA)分析所有的样品，从而测定细胞内含作用。在FL2通道中实施细胞内DOX的荧光测量。
使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)来研究与游离的DOX相比，HeLa细胞中DOX-NP的细胞吸收行为。由于DOX本身是发荧光的，所以直接用于研究细胞的吸收而无需在纳米颗粒中额外的标志物。使用Draq-5将核染色，并通过共焦软件变成蓝色。在温育2h后，游离DOX(25μg/mL)处理的细胞在核中呈现强烈的红色，表明游离的DOX快速地转运至细胞质中，并扩散至核中(结果未示出)。在与DOX-NP温育的细胞中，DOX的细胞内分布明显不同。在温育2h后，在细胞质中，而不是细胞核中观察到强烈的DOX荧光，表明DOX-NP被HeLa细胞有效地内化。为了比较游离DOX和DOX-NP的细胞吸收，实施流式细胞仪分析。由于荧光强度与被细胞内化的DOX的量成比例，所以平均荧光强度用于细胞吸收的定量比较(图10)。尽管使用DOX加载的400kDa-50,600kDa-75和600kDa-180纳米颗粒处的细胞的荧光强度的差异是可忽略的，但是在相等的DOX浓度和温育时间下，使用游离的DOX处理的细胞显示比使用DOX-NP处理的细胞具有更强的荧光强度。之前已经报告细胞膜对于分子量大于1kDa的复合物是天然不可渗透的。尽管DOX的分子量为543.52Da，但是P(NBCh9-b-NBMPEG)纳米颗粒的分子量超过400kDa。因此，游离的DOX分子的快速细胞吸收是由于小分子快速扩散通过细胞膜，而纳米颗粒的细胞吸收可能是通过内吞作用途径，并且它们不能渗透细胞核。由于游离DOX的快速细胞吸收，所以癌症治疗中的游离DOX的使用可以导致严重的毒性，这是因为它们可以快速扩散通过肌体的健康和疾病组织。公知的是具有离心尺寸的纳米颗粒可以通过EPR效应在肿瘤微环境中累积。但是，在肿瘤组织中的累积并非总是与治疗结果有关，这是因为抗癌药品需要细胞内化作用而在肿瘤细胞内部发挥它们的生物学功能。结果表明药学活性分子加载的NP的高效细胞吸收可以改善那些药学活性分子对抗癌症的治疗作用。
实施例10：DOX-NP的体内循环时间和组织分布
为了体内测定循环时间，将6-8周龄的内部饲养的Balb/c小鼠随机分成2组，每组5只，并且静脉内注射单剂量为5mg/kg(相等的DOX)游离的DOX和DOX-NP。在注射后的5min,15min,30min,1h,2h,4h,6h,8h,24h，通过面静脉收集血液(150μL)至肝素化的管中，用于2个时间点，然后通过心脏穿刺处死小鼠，用于下一个时间点的血液收集。各组小鼠都具有3个时间点用于血液收集。通过离心分析血浆(3000rpm,10min,4℃)，并储存在-80℃直至分析。
就组织分布研究而言，对6至8周龄的携带肿瘤的严重性联合免疫缺陷(SCID)小鼠接种0.1mL包含2x 106人类肺癌细胞(A549)的PBS(接种至右侧)。在肿瘤移植后的4周，将2.5mg/kg的游离DOX和DOX-NP(100μL)(相等的DOX)注射至鼠尾静脉中。在注射后的24小时，将小鼠处死用于血液和器官收集，包括肿瘤、肝脏、脾、肾脏、肺和心脏。然后将组织称重，并使用探针近距离声波定位器(Qsonica LLC,CT)在裂解缓冲液(0.1M Tris-HCl,2mM EDTA,0.1％Triton X-100)中均化。将各种组织的裂解物在4℃下在14000rpm下离心20min。将血液在4℃下在3000rpm下离心10min。
使用所报告的过程(具有一些修改)实施样品的提取。简言之，使用100μL去甲氧基柔红霉素(1μg/mL)作为内部标准品(IS)加料至血浆(50μL)和组织(100μL)中。在加入100μL1.0M Tris缓冲溶液后，通过加入2.5ml氯仿/甲醇(75:25,v/v)的混合物并涡旋处理5min来进行2次DOX和IS的提取。在8000rpm下离心10min后，收集有机相中的样品，并在环境温度下在氮气流中蒸发至干燥。将由血浆和组装得到的干燥的残余物溶解于100μL甲醇中，然后离心，从而除去任何沉淀物。使用装配有自动取样器和荧光检测器(Shimadzu,Kyoto,Japan)的HPLC装置来分析所得的上清液。使用0.05M乙酸钠(pH 4.0)和乙腈(73.5:26.5)的混合物作为流动相，将20-μl样品注射至C18柱(Kinetex 5μm,150x 4.6mm,Phenomenex,CA)上。流动速率为1mL/min，并通过在480/558nm的激发和发射波长(Ex/Em)下通过荧光检测来监测信号。
图11A显示在i.v注射剂量为5mg/kg的游离DOX和DOX-NP后，DOX的血浆浓度-时间概况。在注射后5min时，游离DOX的血浆浓度为75.6±5μg/mL，但是在注射后1h，急剧降低至5.3±0.3μg/mL，并且在注射后4h，降低至1.4±0.1μg/mL，表明游离DOX由循环中快速消除。相反，DOX-NP显示明显延迟的血液清除，显示在注射后的5min，DOX的血浆浓度为88.0±5.2μg/mL，在注射后的1h，血浆浓度为68.8±7.3μg/mL，在注射后的4h，血浆浓度为45.4±7.1μg/mL。值得注意的是，在给予DOX-NP后24小时，DOX血浆浓度仍为12.6±1.9μg/mL，而此时间点时，游离的DOX是几乎不可察觉的。游离DOX快速清除的结果是，认为血清中发现的药品被囊封于纳米颗粒中。这种增加的循环时间可以归因于DOX分子在P(NBCh9-b-NBPEG)纳米颗粒的核心中是稳定的，从而防止它们被肾脏清除以及被肝脏中的酶代谢。由P(NBCh9-b-NBPEG)纳米颗粒和亲水性PEG外壳诱导的P(NBCh9-b-NBPEG)纳米颗粒的这种行为可以降低单核吞噬细胞系统(MPS)的吸收，并降低血浆蛋白质的吸收。药品成功地被动地靶向肿瘤组织是基于纳米颗粒在血流中的长的循环时间从而利用EPR效应，以及药品囊封于纳米核心中的稳定性。因此，具有稳定性和长的循环时间的药学活性分子加载的NP可以优选地在肿瘤组织中累积。
如图11B所示，在给予游离DOX后的DOX的浓度在肝脏中最高，并且在肿瘤中最低。相反，在给予DOX-NP后的DOX的浓度在血液中最高，并且肿瘤浓度明显高于给予游离DOX后观察到的浓度。结果表明尽管游离的DOX广泛地分布于肌体中，但是其主要在宿主防御和代谢器官(例如肝脏、脾、肺和肾脏)中被捕获，并且被这些器官代谢或快速排泄，从而导致肿瘤中的药品浓度低。值得注意的是，与游离的DOX相比，在给予DOX-NP后的24h，在肝脏中取得低6.5倍的浓度，而在DOX的肿瘤中取得高2.3倍的浓度。在给予DOX-NP后的DOX血浆水平比给予相同剂量的游离DOX后的水平高11倍。血浆中这种高的药品浓度可以归因于DOX-NP在肿瘤组织中的进一步积累，以及纳米颗粒的血液循环时间增加。此外，与游离药品相比，DOX-NP将心脏中的药品浓度降低3.9倍。因此，P(NBCh9-b-NBPEG)纳米可以可以显著地降低DOX的心脏毒性，这是因为心脏病是游离DOX的剂量限定的副作用。同时，与游离DOX相比，纳米颗粒还将肺内的DOX水平降低10倍，其可以降低对肺的损伤并增加其生物安全性。结果证明具有PEG屏蔽效应和优异的稳定性的DOX-NP比游离的药品展现出更长的血液循环、更低的MPS吸收以及更高的肿瘤累积。
实施例11：P(NBCh9-b-NBPEG)纳米颗粒的体内成像
通过体内近红外(NIR)成像来评估P(NBCh9-b-NBPEG)自组装纳米颗粒的生物分布。如部分2.5中所述，通过透析方法将NIR荧光团(DiR)加载至纳米颗粒中。简言之，将P(NBCh9-b-NBPEG)(10mg)和DiR(0.6mg)溶解于DMF(3mL)中。将所得的溶液针对蒸馏水透析48h，然后过滤通过0.45μm膜，在进行冷冻干燥。在波长750nm下分光光度法测定DiR的加载含量。
通过将A549细胞(2×106个细胞，处于100μL PBS中)皮下注射至雄性SCID小鼠的一侧中来建立肿瘤模型。当肿瘤达到可接受的尺寸时，使用DiR加载的自组装纳米颗粒(5μg/kg相等的DiR)通过鼠尾静脉注射来处理小鼠。使用Maestro体内成像系统(CambridgeResearch&Instrumentation,Inc.,Woburn,MA)，在注射后1、5和24h得到全身图像。在注射后24h，在处死小鼠后还获得各个器官(包括心脏、肾脏、肝脏、脾、肺、和肿瘤)的图像。
在注射后1h时，在整个动物中检测荧光，并且在肝脏中可见强烈的荧光信号，表明纳米颗粒主要在肝脏中累积(图12A)。在注射后5h时持续观察到强烈的全身荧光，表明DiR加载的P(NBCh9-b-NBPEG)纳米颗粒的长的循环时间。此外，与动物的周围组织相比，在肿瘤中DiR信号的对比在注射P(NBCh9-b-NBPEG)纳米颗粒后的5h早已是明显的。在24h后，在肿瘤组织中观察到强烈的红色信号，并且在肝脏中仅观察到低的信号。在注射后的24h时，处死小鼠，并分离主要的器官，从而分析DiR加载的纳米颗粒的组装分布。如图12B中所示，在肿瘤组织中观察到最高的NIRF强度，而其他组织的信号强度较低，并且在心脏中具有特别低的荧光信号。结果表明P(NBCh9-b-NBPEG)纳米颗粒在肿瘤组织中有效地累积。不被特定的理论所束缚，据信P(NBCh9-b-NBPEG)纳米颗粒的这种可察觉的肿瘤特异性递送可以得自由纳米颗粒的稳定性所得到的延长的循环时间，以及由于它们小的尺寸而在肿瘤组织中产生的EPR效应。
实施例12：抗肿瘤活性的评价
在SCID小鼠中评价DOX和DOX-NP的抗肿瘤效力，其中所述的小鼠的右侧皮下接种包含2×106A549细胞的0.1mL PBS。当肿瘤生长至大约20-30mm3(在肿瘤移植后的9天)时，将小鼠随机分成3组(n＝5-6)，并且将这一天指定为第0天。通过鼠尾静脉向小鼠每周2次静脉注射盐水(对照)、游离DOX和DOX-NP(100μL)(具有2.5mg/kg相等的DOX)。根据肿瘤体积来评价抗肿瘤活性，其是使用以下等式计算的：肿瘤体积(mm3)＝宽度2×长度/2。同时测量体重作为系统毒性的指示。
图13显示使用游离DOX和DOX-NP(2.5mg/kg DOX)处理的小鼠的肿瘤体积、体重和生存率改变。对照组(盐水)和使用DOX-NP处理的组中的肿瘤体积在24天内分别增加至大约230.7±98.2mm3和176.6±44.0mm3(图13A)。尽管肿瘤的生长会受到游离DOX处理的抑制，但是该组动物的体重与对照组和DOX-NP处理组相比，会急剧降低(图13C)，表明在给定剂量下游离的DOX会诱导严重的毒性。最终，DOX组中所有的动物在第11天由于人道主义的原因而不得不被终结。在24天后，对照组的肿瘤体积快速增加，并且在第52天时达到883.4±165.7mm3。相反，使用DOX-NP处理的组的肿瘤体积稍微增加至224.8±84.7mm3，并且在注射38天后开始降低，并且在第52天时进一步降低至130±102.0mm3，表明处理组比对照组具有明显较低的平均肿瘤体积(p<0.01)。此外，与初始肿瘤体积(大约30mm3)相比，在DOX-NP处理的小鼠中，肿瘤体积几乎不增加，表明DOX-NP有效地抑制肿瘤的生长。处死所有小鼠，并且在处理52天后切除肿瘤。图13B显示在试验结束时各组的代表性照片。对照组的肿瘤尺寸大于处理组的肿瘤尺寸，这与肿瘤体积的相关测量结果一致。增强的体内效力可以通过以下情况解释：由于DOX有效地保持在核心内而使得DOX-NP在肿瘤位点处的累积增强，由此防止它们在延长的血液循环过程中渗漏至血流中。此外，一旦DOX-NP在肿瘤组织中累积，DOX由纳米颗粒中的持续释放会增加DOX暴露于肿瘤细胞的时间，从而使得肿瘤的生长被抑制。
体重改变是携带肿瘤的动物中药品相关毒性的重要指示。如图13C-D所示，使用2.5mg/kg的游离DOX处理携带肿瘤的SCID小鼠使得体重快速下降(28.1±1.2％)，并且在第3次注射后，在11天内所有的小鼠死亡，证明游离的药品在携带肿瘤的SCID小鼠中是有毒的。使用DOX-NP进行处理似乎是良好耐受的，并且与对照组相比，体重几乎未降低，并且生存率未改变。这些结果证明当DOX被引入至P(NBCh9-b-NBPEG)纳米颗粒中时，增强的DOX抗肿瘤活性和极大降低的DOX毒性。
应该理解的是本文所述的实施例和实施方案仅是为了说明的目的，并且根据这些实施例和实施方案的多种修改或改变对于本领域的技术人员而言是显而易见的，并且涵盖在本申请的精神和界限内，以及所附权利要求书的范围内。就所有目的而言，本文所引用的所有公开、专利和专利申请均以引用方式并入本文。

Claims (29)

1.一种嵌段共聚物，其包含：
第一嵌段，其具有下式：
以及
第二嵌段，其具有下式：
其中：
m和n独立地为大约3至大约500的整数；
A独立地选自聚降冰片烯、聚环戊烯、聚环辛烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯和聚硅氧烷；
R1为甾类化合物部分，其可任选地包含连接体；以及
R2为聚氧化烯部分。
2.权利要求1所述的嵌段共聚物，其中所述甾类化合物部分包含胆固醇、胆酸、脱氧胆酸或牛黄胆酸。
3.权利要求2所述的嵌段共聚物，其中所述甾类化合物部分包含胆固醇。
4.权利要求1-3的任意一项所述的嵌段共聚物，其中R1处所述连接体为
聚内酯或硅氧烷的低聚物。
5.权利要求1-4的任意一项所述的嵌段共聚物，其中所述聚氧化烯部分包含聚氧化乙烯或聚氧化乙烯硫醇酯。
6.权利要求1-5的任意一项所述的嵌段共聚物，其中各个A独立地为聚降冰片烯。
7.权利要求1-5的任意一项所述的嵌段共聚物，其中各个A独立地为聚丙烯酸酯。
8.权利要求1所述的嵌段共聚物，其包含以下结构：
其中：
x为大约3至大约100的整数；
m为大约5至大约200的整数；以及
n为大约5至大约100的整数。
9.权利要求8所述的嵌段共聚物，其中所述x为大约5至50。
10.权利要求9所述的嵌段共聚物，其中所述x为大约8，或者所述x为大约44。
11.权利要求8-10的任意一项所述的嵌段共聚物，其中所述m为大约10至大约100。
12.权利要求8-11的任意一项所述的嵌段共聚物，其中所述n为大约15至大约85。
13.权利要求1-12的任意一项所述的嵌段共聚物，其中所述嵌段共聚物的分子量为大约10000至大约1000000Da。
14.权利要求13所述的嵌段共聚物，其中所述嵌段共聚物的分子量为大约40000至大约750000Da。
15.权利要求14所述的嵌段共聚物，其中所述嵌段共聚物的分子量为大约60000至大约700000Da。
16.权利要求1-15的任意一项所述的嵌段共聚物，其中所述嵌段共聚物为核心/外壳纳米颗粒形式。
17.一种包含权利要求16所述的嵌段共聚物和疏水性药学活性分子的纳米颗粒。
18.权利要求17所述的纳米颗粒，其中所述疏水性分子为阿霉素、道诺霉素、新长春碱、紫杉醇、多西他奇、顺铂、喜树碱、依立替康、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤或地塞米松。
19.权利要求16-18的任意一项所述的纳米颗粒，其进一步包含一种或多种金属纳米颗粒。
20.权利要求19所述的纳米颗粒，其中所述金属纳米颗粒为金纳米颗粒。
21.权利要求19所述的纳米颗粒，其中所述金属纳米颗粒为磁性纳米颗粒或量子点。
22.权利要求16-21的任意一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的直径为大约5nm至大约500nm。
23.权利要求22所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的直径为大约10nm至大约200nm。
24.权利要求23所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的直径为大约50nm至大约150nm。
25.一种递送递送药学活性分子的方法，其包括将根据权利要求17-24的任意一项所述的纳米颗粒给予受试对象。
26.一种治疗疾病或紊乱的方法，其包括将有效治疗疾病或紊乱的量的、根据权利要求17-24的任意一项所述的纳米颗粒给予有需要的受试对象。
27.一种用于制备根据权利要求16-24的任意一项所述的纳米颗粒的方法，其包括：(a)将权利要求1-15的任意一项所述的嵌段共聚物溶解于有机溶剂中，从而获得共聚物溶液；以及(b)在水性溶液中混合所述共聚物溶液，从而形成纳米颗粒。
28.权利要求27所述的方法，其中所述有机溶剂为二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二恶烷、四氢呋喃或其任意组合。
29.权利要求27或28所述的方法，其中所述混合所述共聚物溶液是通过在水性溶液中透析来实施的。
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