CN106750343B - Y型两亲嵌段共聚物及其制备方法和以该共聚物为载体靶向胞内释药的载药胶束 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种Y型两亲嵌段共聚物及其制备方法和以该共聚物为载体靶向胞内释药的载药胶束，属于高分子聚合物及载药胶束技术领域。本发明的技术方案要点为：Y型两亲嵌段共聚物，其结构式为
Figure 269268DEST_PATH_IMAGE002
。本发明还公开了该Y型两亲嵌段共聚物的制备方法及以该Y型两亲嵌段共聚物为载体靶向胞内释药的载药胶束及其制备方法。本发明采用stereocomplex的方法制备了一系列Y型两亲共聚物载药体系，通过比较、优化、选择合适的药物载体构筑药物输送体系，降低药物的毒副作用，改变药物的药代动力学从而提高疗效，操作简单，对设备要求低，采用现有设备即可进行生产。

Description

Y型两亲嵌段共聚物及其制备方法和以该共聚物为载体靶向 胞内释药的载药胶束
技术领域
本发明属于高分子材料聚合物及载药胶束技术领域，具体涉及一种Y型两亲嵌段共聚物及其制备方法和以该共聚物为载体靶向胞内释药的载药胶束。
背景技术
聚乳酸(Polylactic acid，PLA)又称聚丙交酯，是由来源丰富的乳酸分子通过化学方法得到的，是20世纪90年代迅速发展起来的新一代可完全降解的高分子材料。聚乳酸在体内的降解产物是乳酸(人和所有高级动物体内的正常代谢产物)，最终会分解为无毒的水和二氧化碳。正因为聚乳酸具有生物相容性和可降解性使其成为药物输送体系的热点，并且已被美国FDA批准应用于临床。
两亲聚合物胶束作为抗肿瘤药物载体具有广阔的应用前景，它可以有效增强药物稳定性，提高药物的选择性并能够根据病灶部位与正常组织的环境差异控制释放药物，使药物有效地富集于肿瘤组织处，进而提高治疗效果和病人的生命质量。基于聚乳酸、聚甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯这两种具有良好生物相容性的材料，设计并合成了稳定性增强的载药胶束，期望将其用于抗肿瘤药物的输送体系中。
两亲性聚合物既含有亲水性链段又含有疏水性链段，它们之间通过共价键结合在一起。在选择性溶剂中，聚合物可以自组装形成不同形态的胶束，包括球形、囊泡、棒状、管状和叶瓣形等。根据自组装形成胶束原理的不同，聚合物胶束可分为嵌段共聚物胶束、聚电解质共聚物胶束、接枝共聚物胶束和非共价键胶束等。
聚合物胶束是在多种驱动力协同作用下形成的，胶束内分子间是以非共价键缔合的，因而其在溶液中不稳定，容易受外界因素如温度、pH值、溶剂、稀释和剪切力等影响，导致胶束结构的解体。理想状况下，载药胶束在药物输送过程中要具有很好的稳定性才能将药物有效地输送到病灶部位从而达到较好的疗效。因此作为载药材料，设计并合成稳定的胶束就变得十分重要。
阿霉素(Doxorubicin)是一种常见的抗肿瘤模型药物，广泛应用于癌症的治疗中，其作用机理主要通过插入DNA中并与之相互作用抑制核酸的合成，从而抑制癌细胞的生长。本发明通过包载和释放阿霉素用来研究所合成聚合物的体外释放能力。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种Y型两亲嵌段共聚物，以该共聚物为载体靶向胞内释药的载药胶束，以及它们的制备方法，该方法设计制备了一系列Y型两亲共聚物载药体系，通过选择合适的药物载体构筑药物输送体系可以降低药物的毒副作用，改变药物的药代动力学从而提高疗效。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，Y型两亲嵌段共聚物，其特征在于该Y型两亲嵌段共聚物的结构式为：
Figure BDA0001191166620000021
本发明所述的Y型两亲嵌段共聚物的制备方法，其特征在于具体步骤为：
(1)双羟基引发剂的合成
向圆底烧瓶中加入三羟甲基乙烷，再加入干燥丙酮搅拌10min，然后用注射器吸取三乙胺加入到圆底烧瓶中，搅拌30min后将圆底烧瓶置于冰浴中，用恒压滴定漏斗将2-溴代异丁酰溴溶液以8-10s/滴的速率滴加到圆底烧瓶中，待2-溴代异丁酰溴溶液滴加完全后，撤去冰浴，在室温条件下反应24h，待反应完全后抽滤反应产物，收集滤液，向滤液中加入无水Na2CO3，在室温条件下搅拌5h，然后抽滤，得到的淡黄色滤液过硅胶柱纯化，收集目标产物，旋蒸浓缩后于35℃真空干燥得到白色固体双羟基引发剂；
(2)Y型疏水嵌段PLA的合成
将反应瓶放入加热套中，抽真空，通氮气反复三次，待反应瓶温度降至室温后，在氮气条件下向反应瓶内加入单体丙交酯，抽真空/充氮气30min，然后在氮气条件下向反应瓶中加入步骤(1)得到的双羟基引发剂，抽真空/充氮气30min，将反应瓶置于130℃的油浴中，待其完全溶解后，用注射器吸取辛酸亚锡加入至反应瓶中，关闭氮气搅拌反应24h，反应结束后，取出反应瓶，降至室温后向反应瓶中加入二氯甲烷溶解反应产物，待其全部溶解后，将此溶液逐滴加入到乙醚中沉淀，重复溶解-沉淀-抽滤三次，收集沉淀物，置于35℃的真空干燥箱中干燥得到白色固体Y型疏水嵌段PLA；
(3)Y型两亲嵌段共聚物PLA-b-PDMAEMA的合成
将反应瓶放入加热套中，抽真空，通氮气反复三次，待反应瓶温度降到室温后，在氮气条件下向反应瓶中加入步骤(2)得到的Y型疏水嵌段PLA大分子引发剂和无水四氢呋喃，鼓泡30min，然用注射器吸取聚甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯PMDETA加入到反应瓶中，继续鼓泡30min，在氮气条件下向反应瓶中加入CuBr，将反应瓶密封后置于60℃的油浴中反应24h，反应结束后，取出反应瓶，降至室温后向反应瓶中加入三氯甲烷溶解反应产物，将溶液通过碱性氧化铝柱子以三氯甲烷为流动性将铜离子除去，收集溶液，旋蒸浓缩，然后将其沉淀在乙醚中，重复溶解-沉淀-抽滤两次，收集沉淀物，置于35℃的真空干燥箱中干燥得到白色固体Y型两亲嵌段共聚物PLA-b-PDMAEMA。
进一步优选，步骤(1)中所述的三羟基甲基乙烷、三乙胺与2-溴代异丁酰溴的投料摩尔比为1.12:1.07:1，过硅胶柱纯化采用干法上样，以体积比为2:3的乙酸乙酯与石油醚混合溶液为流动相。
进一步优选，步骤(2)中所述的单体丙交酯与双羟基引发剂的投料摩尔比为27.78:1，单体丙交酯为L-丙交酯或D-丙交酯中的一种或多种。
本发明所述的以Y型两亲嵌段共聚物为载体靶向胞内释药的载药胶束，其特征在于该载药胶束由上述Y型两亲嵌段共聚物和疏水性药物组成，其中疏水性药物包裹在Y型两亲嵌段共聚物疏水嵌段形成的疏水核中。
进一步优选，所述的载药胶束的粒径为40-200nm。
进一步优选，所述的疏水性药物为阿霉素。
进一步优选，所述的Y型两亲嵌段共聚物为共聚物PDLA-b-PDMAEMA、共聚物PLLA-b-PDMAEMA或由共聚物PDLA-b-PDMAEMA和共聚物PLLA-b-PDMAEMA组成的立构复合物sc-PLA-b-PDMAEMA。
本发明所述的以Y型两亲嵌段共聚物为载体靶向胞内释药的载药胶束的制备方法，其特征在于具体步骤为：将上述得到的Y型两亲嵌段共聚物PLA-b-PDMAEMA和疏水性药物溶解于共溶剂中，其中共溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或三乙胺，再向上述溶液中滴加二次蒸馏水直至载药胶束溶液的浓度为0.5mg/mL，然后透析除去共溶剂，过滤，冷冻干燥得到以Y型两亲嵌段共聚物为载体靶向胞内释药的载药胶束。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
1、所合成的Y型两亲性聚合物PLA-b-PDMAEMA既含有亲水性链段又含有疏水性链段，将疏水性的抗肿瘤药物包载在核中，显著地增加了药物的溶解度，有效地提高了药物的生物利用度，同时也避免了药物降解活性，增加了药物的稳定性，大大减少了毒副作用；
2、基于聚乳酸、聚甲基丙烯酸-N，N-二甲氨基乙酯(PDMAEMA)设计的材料具有良好的生物利用度；
3、聚乳酸具有生物相容性和可降解性，在体内可以自行降解成乳酸，最终会分解成无毒的水和二氧化碳；
4、聚甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯的单体分子结构赋予其多重环境响应性，在生物医药、药物控制释放及功能吸附材料上有广泛的应用。
基于两亲嵌段聚合物胶束的基本特征，它主要用作抗肿瘤药物载体。与其他载药材料相比，两亲嵌段聚合物胶束载体具有很多优势：胶束外壳的亲水作用和纳米级的粒径(一般为20-100nm)使其不易被网状内皮系统吞噬，并且可阻止细胞和蛋白质的吸附，因而可以在血液中长时间地循环并保持稳定，增大了它们到达肿瘤部位并利用肿瘤细胞的“增强渗透与滞留效应”达到被动靶向效果几率。另外，纳米级的粒径也使它们在肿瘤部位展现出更好的生物膜穿透能力。可以通过对修饰聚合物胶束外壳如接入配体或者抗体等实现主动靶向，同时也可以通过设计加入pH敏感、温度敏感、氧化还原敏感等基团实现多重环境响应的聚合物胶束。
聚甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯在水中的pH/温度敏感行为研究，当溶液pH值小于聚合物离解常数(pKa约为7.0-7.3)时，聚合物链呈舒展构状态，没有相变；当pH值大于pKa时，聚合物发生去质子化作用，析出部分聚合物，且对应的低临界溶解温度值(lowercritical solution tenperature，LCST)随pH的升高而降低。体外药物释放试验表明，与pH＝7相比，pH＝5时载药胶束较快释放姜黄素。另外，体内药物代谢研究表明，与单独的阿霉素溶液相比，载药胶束在血液中的保留时间变长并且胶束中的阿霉素也会被延迟清除。这些结果说明，这种pH响应型的聚合物非常有潜质作为疏水性抗癌药物的载体。
本发明制备了一系列Y型两亲共聚物载药体系，通过选择合适的药物载体构筑药物输送体系可以降低药物的毒副作用，改变药物的药代动力学从而提高疗效，操作简单，对设备要求低，采用现有设备即可进行生产。
附图说明
图1中(a)、(b)、(c)分别为制备的双羟基引发剂、Y型疏水嵌段PLA、Y型两亲嵌段共聚物PLA-b-PDMAEMA的核磁图谱；
图2为制备的Y型两亲嵌段共聚物PLA-b-PDMAEMA的凝胶渗透色谱图；
图3中(a)、(b)、(c)分别为制备的共聚物PDLA-b-PDMAEMA、共聚物PLLA-b-PDMAEMA和立构复合物sc-PLA-b-PDMAEMA以芘为探针得到的荧光光谱的I1/I3随浓度的变化曲线；
图4中(a)、(b)、(c)分别为制备的共聚物PDLA-b-PDMAEMA、共聚物PLLA-b-PDMAEMA和立构复合物sc-PLA-b-PDMAEMA胶束溶液的动态光散射图；
图5中(A)、(B)、(C)为别为制备的共聚物PDLA-b-PDMAEMA、共聚物PLLA-b-PDMAEMA和立构复合物sc-PLA-b-PDMAEMA胶束溶液的透射电镜图；
图6是共聚物PDLA-b-PDMAEMA、共聚物PLLA-b-PDMAEMA和立构复合物sc-PLA-b-PDMAEMA胶束溶液的Zeta电位图片；
图7是载药胶束的细胞外液模拟液中的药物释放曲线；
图8是共聚物PDLA-b-PDMAEMA、共聚物PLLA-b-PDMAEMA和立构复合物sc-PLA-b-PDMAEMA胶束溶液的DSC(差示扫描量热法)曲线；
图9是采用MTT法测定的不同浓度的Y型两亲嵌段共聚物对于小鼠L929细胞的影响；
图10是细胞毒性荧光图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
Figure BDA0001191166620000051
结构式中的m、n、p分别代表聚合度。
(1)双羟基引发剂的合成
Figure BDA0001191166620000052
向圆底烧瓶中加入三羟甲基乙烷，再向其中加入新蒸干燥丙酮搅拌10min，然后用注射器吸取三乙胺加入到圆底烧瓶中，搅拌30min，将圆底烧瓶置于冰浴中，用恒压滴定漏斗将2-溴代异丁酰溴溶液(先向恒压滴定漏斗中加入适量新蒸干燥丙酮，然后向其中加入2-溴代异丁酰溴)以8-10s/滴的速率加入到圆底烧瓶中。待2-溴代异丁酰溴溶液加入完全后，撤去冰浴。在室温条件下反应24h。待反应完全后，发现溶液变黄，并且有大量的白色固体。抽滤反应产物，收集滤液，向滤液中加入无水Na2CO3，在室温条件搅拌5h。然后抽滤，得到的淡黄色滤液过硅胶柱纯化。收集目标产物，旋蒸浓缩，于35℃真空干燥，得到白色固体。
所述的三羟甲基乙烷、三乙胺与2-溴代异丁酰溴的投料摩尔比为1.12:1.07:1，过硅胶柱纯化采用干法上样，以体积比为2:3的乙酸乙酯与石油醚混合溶液为流动相。
图1(a)为双羟基引发剂在氘代二甲基亚砜溶液中的核磁氢谱图。与原料三羟甲基乙烷的核磁谱图1HNMR(DMSO)图相比发现，此核磁氢谱图在化学位移为δ＝1.89ppm和δ＝3.97ppm处出现两个新的单峰，其它峰的化学位移几乎没有变化。将图中d(甲基)的积分面积设置为3，分别对图谱中峰面积进行积分。结果发现化学位移为δ＝1.89ppm峰的积分值为6，它们是2-溴代异丁酰溴的两个甲基的氢原子；化学位移为δ＝3.27-3.29ppm峰的积分值为4，它们和原料三羟甲基乙烷的亚甲基的化学位移几乎一致，所以它们是产物中的两个羟甲基结构中的亚甲基；化学位移为δ＝3.97ppm峰的积分值为2，它是与酯基相连的亚甲基上的氢原子；同时发现，在化学位移为δ＝4.53-4.56ppm处峰的积分值为2，化学位移与原料三羟甲基乙烷中的羟基几乎一致，可断定其为两个羟基。由此可知通过三乙胺作为缚酸剂我们成功合成了带有溴原子的双羟基引发剂。
(2)Y型疏水嵌段PLA的合成
Figure BDA0001191166620000061
以辛酸亚锡为催化剂，双羟基引发剂引发丙交酯开环聚合形成Y型聚乳酸(PLLA/PDLA)。具体过程如下：烤一只史莱克瓶子(将瓶子放入加热套中，抽真空，通氮气反复三次)，待瓶子温度降至室温后，在开大氮气的条件下，向反应瓶内加入单体丙交酯(L-LA或/和D-LA)，抽真空/充氮气30min；然后在开大氮气的条件下，向反应瓶中加入双羟基引发剂，抽真空/充氮气30min，将史莱克瓶子置于130℃的油浴中，待其完全溶解之后，用注射器吸取辛酸亚锡加入至反应瓶(开大氮气)，关闭氮气搅拌反应24h。反应结束后，取出反应瓶，降至室温后，向反应瓶中加入二氯甲烷(CH2Cl2)溶解反应产物，待其全部溶解后，将此溶液逐滴地加入到乙醚中沉淀(4-5h)，重复溶解-沉淀-抽滤三次。收集沉淀物，置于35℃的真空干燥箱中干燥，得白色固体。
所述的丙交酯与双羟基引发剂的投料摩尔比为27.78:1，引发开环聚合的催化剂为辛酸亚锡，无水无氧操作的关键在于抽真空、通氮气反复进行三次。
图1(b)是端溴原子的Y型疏水嵌段聚乳酸(PDLA)在氘带氯仿中的核磁共振氢谱图，以此谱图为例，证明不同手性分子量接近的端溴原子PLA的成功合成。与图1(a)相比，图1(b)明显多出新的多重峰。在化学位移为δ＝1.58-1.60ppm处的双重峰和δ＝5.14-5.19ppm处的四重峰分别是聚乳酸重复单元中的甲基和次甲基的特征峰，并且δ＝1.58-1.60ppm处峰的积分面积正好是δ＝5.14-5.19ppm处峰的积分面积的3倍，这说明引发剂成功引发丙交酯的开环聚合反应。化学位移δ＝1.07ppm即d是引发剂中的甲基，将其设置为3，求出e处的积分面积即可求得所合成的聚合物的分子量。
(3)Y型两亲嵌段共聚物PLA-b-PDMAEMA的合成
Figure BDA0001191166620000071
烤一只史莱克瓶子(将瓶子放入加热套中，抽真空，通氮气反复三次)，待瓶子温度降到室温后，开大氮气，向反应瓶中加入Y型疏水嵌段PLA大分子引发剂和无水四氢呋喃，鼓泡30min。然用注射器吸取PMDETA加入到反应瓶中，继续鼓泡30min，在开大氮气的条件下向反应瓶中加入CuBr，将反应瓶密封后置于60℃的油浴中反应24h。反应结束后，取出反应瓶，降至室温后向反应瓶中加入三氯甲烷(CHCl3)溶解反应产物，将溶液通过碱性氧化铝柱子以三氯甲烷为流动性将铜离子除去，收集溶液，旋蒸浓缩，然后将其沉淀在适量体积的乙醚中(4-5h)，重复溶解-沉淀-抽滤两次。收集沉淀物，置于35℃的真空干燥箱中干燥，得白色固体。
所述的溶剂四氢呋喃必须是新回流的无水试剂，除去铜离子所用的为碱性氧化铝的柱子，以三氯甲烷为流动相。
图1(c)为Y型两亲嵌段共聚物PDLA-b-PDMAEMA在氘代氯仿中的核磁共振氢谱。以此图谱为例，说明不同手性两亲共聚物的成功合成。与图1(b)相比，该核磁图谱显得更为复杂，有多个新峰出现在图谱里。如图1所示，c和d分别是PDMAEMA与氧原子和氮原子相连两个亚甲基，它们各自峰的积分面积与化学位移在δ＝2.29ppm(与氮原子相连的两个甲基)处的积分面积接近为1:3，这与它们在单体中的比例是基本一致；同时，它们与化学位移在δ＝2.57ppm(亚甲基)的积分面积比为1:1；与δ＝0.89-1.14ppm(甲基)处峰的面积积分比为2:3，这些都说明PDMAEMA的成功聚合。通过将化学位移在δ＝4.33-4.39ppm(聚乳酸链端的次甲基的特征峰)处峰的积分面积设置为2，得到h和c处峰的积分面积，即可求出聚合度进而求出Y型两亲共聚物的分子量。
凝胶渗透色谱(GPC)
样品的分子量及其分子量分布使用waters公司的waters 1515仪器进行测试。仪器配置为：三根LP柱串联，柱形：Styragel凝胶色谱柱(孔的尺寸为102,103和
Figure BDA0001191166620000081
)。流动相DMF，流速1mL/min，柱温45℃，PEO标样校正。
样品配制方法：取10mg样品，溶于1mL色谱纯DMF，并用孔径为0.22μm的有机膜过滤。
测试方法：首先开机走基线，待基线走平后，取20μL的样品注入仪器，开始检测。制备共聚物PDLA-b-PDMAEMA和共聚物PLLA-b-PDMAEMA胶束溶液
准确称取100mg共聚物PDLA-b-PDMAEMA和共聚物PLLA-b-PDMAEMA，将其分别放入干净的100mL单口圆底烧瓶中并向其中加入6mL新蒸的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌使其溶解。待其完全溶解之后，使用精密型恒压滴液漏斗以30s/滴的速率向两个反应瓶中各滴加20mL二次蒸馏水。待二次蒸馏水滴加完毕后，继续搅拌2.5h，然后将其转移至2000Da的透析袋中并将透析袋置于盛有二次蒸馏水的烧杯中进行透析4天。待透析袋中的DMF被完全置换出来，将透析袋中的溶液转移至200mL的容量瓶中，用二次蒸馏水定容至刻度线得到浓度为0.5mg/mL的共聚物PDLA-b-PDMAEMA胶束溶液(母液)和共聚物PLLA-b-PDMAEMA胶束溶液(母液)，静置，备用。
制备PDLA/PLLA-b-PDMAEMA(sc-PLA-b-PDMAEMA)的立构复合胶束溶液
分别准确称取50mg共聚物PDLA-b-PDMAEMA和共聚物PLLA-b-PDMAEMA于一个干燥干净的100mL单口圆底烧瓶中，用6mL新蒸DMF搅拌溶解，待其完全溶解后继续搅拌6h。然后用精密恒压滴液漏斗以30s/滴的速率向瓶子中滴加25mL二次蒸馏水。待二次蒸馏水滴加完毕后，继续搅拌4h，然后将其转移至2000Da的透析袋中并将透析袋置于盛有二次蒸馏水的烧杯中进行透析4天。待透析袋中的DMF被完全置换出来，将透析袋中的溶液转移至200mL的容量瓶中，用二次蒸馏水定容至刻度线得到浓度为0.5mg/mL的聚合物胶束溶液(母液)，静置，备用。
荧光光谱(FL)的测定
样品配置方法：首先将10uL芘的丙酮溶液(c＝6×10-4mol/L)加至10mL容量瓶中，待丙酮完全挥发后向其中加入不同体积的胶束溶液然后将其定容，配置成一系列浓度梯度的含有芘的胶束溶液。超声3次(2min/次)，静置6h进行测试。
采用美国Perkin Elmer公司的LS-45/55/荧光/磷光/发光分光光度计行测试。将扫描模式设置为发射，扫描范围为350-450nm，激发波长设置为336nm。将配置好样品倒入石英比色皿中(溶液约占比色皿体积的2/3)，换样时用母液润洗，然后放入仪器中进行测试。测试按照浓度从小到大的顺序。
动态光散射(DLS)
采用英国马尔文Zs-90纳米激光粒度仪进行测试。首先将聚合物胶束溶液用孔径为0.45μm的水系滤膜过滤，静置过夜。然后取适量的样品(高度为1.5cm)于聚苯乙烯树脂比色皿中，将样品室温度设置为25℃，平行测试3次。
透射电镜(TEM)
使用日本JEOL公司的JEM 2010透射电镜进行测试。
样品制备方法：将聚合物胶束溶液用0.45μm的水膜过滤，滤液静置一天；然后取一滴静置后的滤液滴于镀有碳膜的铜网上，待其自然晾干后，在透射电镜中观察胶束形貌。
差示扫描量热仪(DSC)
使用德国Netzsch公司的Photo-DSC 204F1 Phoenix仪器进行差示扫描量热的测试。样品测试在氮气气氛中进行。首先称取一定量的样品于小铝锅中，在专用压盖机上将盖子压紧，放入仪器中。然后选择仪器自带的校正方法进行温度和灵敏度校正，设置参数(吹扫气40mL/min；保护气60mL/min；起始温度20℃；终止温度300℃；升温速度10℃/min)进行测试。每组实验结束后用液氮冷却。
紫外可见光光谱(UV-vis)
采用美国Agilent公司的cary 100型紫外分光光度计进行测试。将样品倒入石英比色皿中(溶液约占比色皿体积的2/3)，换样时用母液润洗，然后放入仪器中进行测试，测试按照浓度从小到大的顺序。
制备共聚物PLLA-b-PDMAEMA载药胶束
准确称取6mg盐酸阿霉素和适量的三乙胺(其中三乙胺与盐酸阿霉素的投料摩尔比为3:1)于一个干净干燥的100mL圆底烧瓶瓶中，然后向其中加入6mL共溶剂N,N-二甲基甲酰胺(DMF)搅拌2h后向其中加入60mg共聚物PLLA-b-PDMAEMA，待其完全溶解后将其转移至3500Da的透析袋中，并将其置于盛有二次蒸馏水的烧杯中，每4h换一次水，透析24h。接着将透析袋中的溶液进行冷冻干燥，称重并将其放置于-20℃的环境中待用。
制备立构复合物sc-PLA-b-PDMAEMA载药胶束
准确称取6mg盐酸阿霉素和适量的三乙胺(其中三乙胺与盐酸阿霉素的投料摩尔比为3:1)于一个干净干燥的100mL圆底烧瓶瓶中，然后向其中加入3mL共溶剂N,N-二甲基甲酰胺(DMF)搅拌2h后向其中加入立构复合物(其中共聚物PDLA-b-PDMAEMA和共聚物PLLA-b-PDMAEAM分别为30mg)，继续搅拌2h后将其转移至3500Da的透析袋中，并将其置于盛有二次蒸馏水的烧杯中，每4h换一次水，透析24h。接着将透析袋中的溶液进行冷冻干燥，称重并将其放置于-20℃的环境中待用。
聚合物胶束的载药量和包封率以及体外释放均通过紫外–可见光光谱进行测试，
MTT法检测两亲嵌段共聚物的细胞毒性
我们采用小鼠L929纤维母细胞进行研究：96孔板内，L929细胞以每孔1×104个这样的密度种入DMEM培养基中，于37℃、体积分数为5％的CO2的条件下培育24h。除去培养基，加入不同浓度(0.005mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL)的聚合物培养基溶液，并且用不加任何聚合物的培养基作为控制对照组。培养72h，然后用MTT法检测细胞的存活率。
图9为不同浓度的聚合物对于小鼠L929细胞的影响。从图中可以分析，当浓度高达0.5mg/mL时经过72h培养，小鼠细胞仍旧保持着较高的存活率，这说明合成的聚合物具有良好的生物相容性。
通过在体外对细胞蛋白进行染色来进一步研究聚合物的生物相容性。
小鼠L929纤维母细胞，24孔板内，L929细胞以每孔2×104个这样的密度种入DMEM(含有0.005mg/mL和0.5mg/mL聚合物)培养基中，以不加聚合物的培养基为控制对照组，于37℃、体积分数为5％的CO2的条件下培育48h后对细胞进行荧光染色。除去培养基，在室温下将细胞放入2.5wt％的聚甲醛溶液中进行固定15min，然后进行冲洗并将其放在2wt％BSA溶液中进行培养。接着在室温条件下，将这些细胞用FITC-鬼笔环肽培养1h，然后用PBS冲洗接着在室温条件下用DAPI进行染核培养。用荧光显微镜观察细胞的形貌
图10为细胞毒性荧光图。在本实验中，用FITC-鬼笔环肽(绿色荧光)DAPI(蓝色)对细胞进行了染色。从图中我们发现，细胞在含有不同浓度聚合物培养基中进行48h培养后，其形貌于控制对照组相比，并没有显著的变化。这进一步说明所合成的聚合物具有良好的生物相容性。
综上所述，荧光、透射电镜和动态光散射分析结果表明，相比于聚合物胶束，立构复合物胶束具有更低的临界胶束浓度值和更小的粒径。细胞毒性实验表明，聚合物及立构复合物均具有良好的生物相容性。通过包载和释放阿霉素研究了聚合物胶束的体外释放药物能力，结果表明，与聚合物载药胶束相比，立构复合物载药胶束表现出较缓慢的体外释放速度，这是立构复合作用增强了胶束的稳定性导致的。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

Claims (9)

1.Y型两亲嵌段共聚物，其特征在于该Y型两亲嵌段共聚物的结构式为：
Figure FDA0002363598810000011
结构式中的m、n、p分别代表聚合度，其中m＝n＝27，p为任意大于零的整数。
2.一种权利要求1所述的Y型两亲嵌段共聚物的制备方法，其特征在于具体步骤为：
(1)双羟基引发剂的合成
向圆底烧瓶中加入三羟甲基乙烷，再加入干燥丙酮搅拌10min，然后用注射器吸取三乙胺加入到圆底烧瓶中，搅拌30min后将圆底烧瓶置于冰浴中，用恒压滴定漏斗将2-溴代异丁酰溴溶液以8-10s/滴的速率滴加到圆底烧瓶中，待2-溴代异丁酰溴溶液滴加完全后，撤去冰浴，在室温条件下反应24h，待反应完全后抽滤反应产物，收集滤液，向滤液中加入无水Na2CO3，在室温条件下搅拌5h，然后抽滤，得到的淡黄色滤液过硅胶柱纯化，收集目标产物，旋蒸浓缩后于35℃真空干燥得到白色固体双羟基引发剂；
(2)Y型疏水嵌段PLA的合成
将反应瓶放入加热套中，抽真空，通氮气反复三次，待反应瓶温度降至室温后，在氮气条件下向反应瓶内加入单体丙交酯，抽真空/充氮气30min，然后在氮气条件下向反应瓶中加入步骤(1)得到的双羟基引发剂，抽真空/充氮气30min，将反应瓶置于130℃的油浴中，待其完全溶解后，用注射器吸取辛酸亚锡加入至反应瓶中，关闭氮气搅拌反应24h，反应结束后，取出反应瓶，降至室温后向反应瓶中加入二氯甲烷溶解反应产物，待其全部溶解后，将此溶液逐滴加入到乙醚中沉淀，重复溶解-沉淀-抽滤三次，收集沉淀物，置于35℃的真空干燥箱中干燥得到白色固体Y型疏水嵌段PLA；
(3)Y型两亲嵌段共聚物PLA-b-PDMAEMA的合成
将反应瓶放入加热套中，抽真空，通氮气反复三次，待反应瓶温度降到室温后，在氮气条件下向反应瓶中加入步骤(2)得到的Y型疏水嵌段PLA大分子引发剂和无水四氢呋喃，鼓泡30min，然用注射器吸取聚甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯PMDETA加入到反应瓶中，继续鼓泡30min，在氮气条件下向反应瓶中加入CuBr，将反应瓶密封后置于60℃的油浴中反应24h，反应结束后，取出反应瓶，降至室温后向反应瓶中加入三氯甲烷溶解反应产物，将溶液通过碱性氧化铝柱子以三氯甲烷为流动性将铜离子除去，收集溶液，旋蒸浓缩，然后将其沉淀在乙醚中，重复溶解-沉淀-抽滤两次，收集沉淀物，置于35℃的真空干燥箱中干燥得到白色固体Y型两亲嵌段共聚物PLA-b-PDMAEMA。
3.根据权利要求2所述的Y型两亲嵌段共聚物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的三羟基甲基乙烷、三乙胺与2-溴代异丁酰溴的投料摩尔比为1.12:1.07:1，过硅胶柱纯化采用干法上样，以体积比为2:3的乙酸乙酯与石油醚混合溶液为流动相。
4.根据权利要求2所述的Y型两亲嵌段共聚物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的单体丙交酯与双羟基引发剂的投料摩尔比为27.78:1，单体丙交酯为L-丙交酯或D-丙交酯中的一种或多种。
5.一种以Y型两亲嵌段共聚物为载体靶向胞内释药的载药胶束，其特征在于该载药胶束由权利要求1所述的Y型两亲嵌段共聚物和疏水性药物组成，其中疏水性药物包裹在Y型两亲嵌段共聚物疏水嵌段形成的疏水核中。
6.根据权利要求5所述的以Y型两亲嵌段共聚物为载体靶向胞内释药的载药胶束，其特征在于：所述的载药胶束的粒径为40-200nm。
7.根据权利要求5所述的以Y型两亲嵌段共聚物为载体靶向胞内释药的载药胶束，其特征在于：所述的疏水性药物为阿霉素。
8.根据权利要求5所述的以Y型两亲嵌段共聚物为载体靶向胞内释药的载药胶束，其特征在于：所述的Y型两亲嵌段共聚物为共聚物PDLA-b-PDMAEMA、共聚物PLLA-b-PDMAEMA或由共聚物PDLA-b-PDMAEMA和共聚物PLLA-b-PDMAEMA组成的立构复合物sc-PLA-b-PDMAEMA。
9.一种权利要求5所述的以Y型两亲嵌段共聚物为载体靶向胞内释药的载药胶束的制备方法，其特征在于具体步骤为：将上述得到的Y型两亲嵌段共聚物PLA-b-PDMAEMA和疏水性药物溶解于共溶剂中，其中共溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或三乙胺，再向上述溶液中滴加二次蒸馏水直至载药胶束溶液的浓度为0.5mg/mL，然后透析除去共溶剂，过滤，冷冻干燥得到以Y型两亲嵌段共聚物为载体靶向胞内释药的载药胶束。
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