CN103796671A

CN103796671A - 促进β-β交联的制备含热稳定的氧载体的组合物的方法

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Publication number: CN103796671A
Application number: CN201280038971.4A
Authority: CN
Inventors: 黄炳镠; 郭瑞仪; 毕国珠
Original assignee: Billion King International Ltd
Current assignee: Billion King International Ltd
Priority date: 2011-08-31
Filing date: 2012-08-23
Publication date: 2014-05-14
Also published as: TW201313736A; DK2750700T3; NZ620913A; TW201341396A; AP2014007545A0; IL231198A0; MY163300A; EP2750700A4; ZA201401518B; US20130052232A1; BR112014003480A2; KR101794932B1; CA2844510A1; ES2664589T3; AP3848A; WO2013032828A3; AU2012300475B2; US8106011B1; MX352941B; TWI526218B

Abstract

本发明提供有利于β-β交联的制备含热稳定的基于血红蛋白的氧载体的药物组合物的方法。使用本发明的方法，可控制得到的分子的氧亲和力，从而使得可产生经调整用于特定应用的基于血红蛋白的氧载体。较低氧亲和力的交联血红蛋白可用于需要快速组织氧合的应用(例如出血性休克)，而较高氧亲和力的交联血红蛋白可用于需要较慢氧合速率的应用(例如癌症辅助疗法)。产生了高度纯化的和热稳定的交联非聚合的四聚血红蛋白，所述四聚血红蛋白具有大于40-60％的β-β交联并且适用于哺乳动物而不会引起肾损伤和血管收缩。进行高温和短时间(HTST)热加工步骤以有效地去除任何不需要的二聚血红蛋白、未交联的四聚血红蛋白和血浆蛋白质杂质。

Description

促进β-β交联的制备含热稳定的氧载体的组合物的方法

著作权声明/许可

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相关申请的交叉参考

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技术领域

本发明涉及有利于β-β交联的制备含热稳定的氧载体的药物组合物的方法。使用本发明的方法，可控制得到的分子的氧亲和力，从而使得可产生经调整用于特定应用的基于血红蛋白的氧载体。较低氧亲和力的交联血红蛋白可用于需要快速组织氧合的应用(例如出血性休克)，而较高氧亲和力的交联血红蛋白可用于需要较慢氧合速率的应用(例如癌症辅助疗法)。

背景技术

血红蛋白在大多数脊椎动物中对于血管系统与组织之间的气体交换发挥重要作用。其负责通过血液循环将氧从呼吸系统运送到体细胞，并且还将代谢废物二氧化碳从体细胞运离到呼吸系统，在此处呼出二氧化碳。由于血红蛋白具有此氧运输特征，因此如果其可以在离体状态下被稳定化并且在体内使用，则可将其用作有效的氧供体。

天然存在的血红蛋白是在红细胞内存在时通常稳定的四聚体。然而，当天然存在的血红蛋白从红细胞中去除时，其在血浆中变得不稳定并且分裂成两个α-β二聚体。这些二聚体中的每一个的分子量约为32kDa。这些二聚体在经肾脏过滤并排泄时可导致实质性肾损伤。四聚体键的断裂也会负面地影响循环中的功能性血红蛋白的持续性。

为了解决所述问题，最近在血红蛋白加工方面的发展已经引入了各种交联技术来产生四聚体内的分子内键以及四聚体之间的分子间键，从而形成聚合血红蛋白。现有技术教导聚合血红蛋白是增加血红蛋白的循环半衰期的优选形式。然而，本发明人确定，聚合血红蛋白在血液循环中更容易转化成高铁血红蛋白。高铁血红蛋白不能结合氧，并且因此不能氧合组织。因此，现有技术所教导的导致形成聚合血红蛋白的交联是有问题的。在本领域中需要允许分子内交联从而产生稳定的四聚体而不同时形成聚合血红蛋白的技术。

现有技术为稳定血红蛋白而进行的尝试所存在的其它问题包括产生包含不可接受的高百分比的二聚体单元的四聚血红蛋白(或如果给予患者则会快速解离成二聚血红蛋白的未交联的四聚血红蛋白)；二聚体的存在使血红蛋白组合物不能令人满意地给予哺乳动物。二聚形式的血红蛋白可导致哺乳动物机体的严重肾损伤；此肾损伤可严重到足以导致死亡。因此，在本领域中需要在终产物中产生具有检测不到的二聚形式的稳定的四聚血红蛋白。

现有技术血红蛋白产物的另一问题是在给予后血压突然升高。过去，已经从较早一代的基于血红蛋白的氧载体记录到血管收缩事件。因此，在本领域中需要制备在向哺乳动物施用时不会引起血管收缩和高血压的血红蛋白的方法。

现有技术为产生稳定血红蛋白而进行的尝试所存在的其它问题包括存在可导致哺乳动物的过敏效应的蛋白质杂质，例如免疫球蛋白G。因此，在本领域中需要可产生无蛋白质杂质的稳定四聚血红蛋白的方法。

除上述问题以外，在本领域中还需要无二聚体、无磷脂并且能够以工业规模产生的稳定化的四聚血红蛋白。

基于血红蛋白的氧载体可用于众多种医学应用；根据医学应用，需要不同水平的氧亲和力。例如，具有低氧亲和力的血红蛋白分子可比具有较高氧亲和力的血红蛋白分子更容易将氧转移到靶组织。因此将需要控制交联四聚血红蛋白的氧亲和力。因此，在本领域中需要控制交联类型和交联条件以产生具有精确氧结合水平的交联四聚血红蛋白。

发明内容

本发明提供了加工非聚合的、热稳定的、纯化的交联四聚血红蛋白的方法，所述交联四聚血红蛋白适用于哺乳动物而不会导致严重的肾损伤、血管有害作用和包括死亡在内的严重不良事件。本发明去除了二聚形式的血红蛋白、未交联的四聚血红蛋白、磷脂和蛋白质杂质。本发明还提供通过控制四聚体中的交联类型(例如，四聚体中的β-β交联、α-α交联、α-β交联的量)、四聚体的四级结构和交联条件来控制得到的交联四聚体的氧亲和力的技术。较低氧亲和力的交联血红蛋白可用于需要快速组织氧合的应用(例如出血性休克)，而较高氧亲和力的交联血红蛋白可用于需要较慢氧合速率的应用(例如癌症辅助疗法)。另外，本发明使用(1)快速细胞裂解装置用于精确的和受控的低渗裂解；(2)流通柱色谱(flowthrough columnchromatography)；(3)高温短时间(HTST)装置用于在纯化过程中热加工血红蛋白溶液以去除不需要的不稳定的血红蛋白二聚体并去除蛋白质杂质，例如免疫球蛋白-G，使得可避免肾损伤、血管有害作用和其它毒性反应；和(4)气密的输液袋包装以避免氧侵入到终产物中。

所述方法包括哺乳动物全血的起始材料，所述全血至少包含红细胞和血浆。将哺乳动物全血中的红细胞与血浆分离，随后过滤以获得滤过的红细胞级分。洗涤滤过的红细胞级分以去除血浆蛋白质杂质。在快速细胞裂解装置中通过受控低渗裂解，持续足以裂解红细胞而不裂解白细胞的时间，来破裂洗涤过的红细胞。进行过滤以从裂解产物中去除至少一部分废滞留物。从所述裂解产物中提取第一血红蛋白溶液。

对所述血红蛋白溶液进行一个或多个纯化过程，例如超滤和/或色谱。

通过富马酸双-3，5-二溴水杨酸酯(DBSF)使纯化的血红蛋白交联以形成热稳定的交联血红蛋白而不形成聚合血红蛋白，使得得到的非聚合的交联四聚血红蛋白的分子量为60-70kDa。如本文中所使用，表达“非聚合的”是指不与其它血红蛋白分子或任何其它非血红蛋白分子(例如PEG)发生分子间交联的四聚血红蛋白。根据血红蛋白源、血红蛋白的四级结构和交联条件，可产生具有高百分比β-β交联的四聚产物。此外，可控制得到的分子的氧亲和力从而使得可产生经调配用于特定应用的基于血红蛋白的氧载体。

依照此程序，对交联血红蛋白进行热处理以去除任何残留的未交联的四聚血红蛋白和任何未稳定化的血红蛋白(例如二聚形式的血红蛋白)和任何其它蛋白质杂质。在热处理前，将约0.2％的浓度的N-乙酰基半胱氨酸任选地添加到交联四聚血红蛋白以防止形成高铁血红蛋白。在热处理和冷却后立即任选地添加约0.025％到0.4％的浓度的N-乙酰基半胱氨酸以进一步防止形成高铁血红蛋白。热处理优选地是在约70℃到95℃进行30秒到3小时的高温短时间处理，随后冷却到25℃。通过离心或过滤去除在热处理期间形成的任何沉淀。

然后将无二聚体、无磷脂、无蛋白质杂质的热稳定的非聚合的交联四聚血红蛋白添加到药物上可接受的载体。

此后，将热稳定的交联四聚血红蛋白调配并包装在定制的气密的聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯和乙烯-乙烯醇(PE、EVA、EVOH)输液袋中。所述包装防止导致形成无活性高铁血红蛋白的氧污染。

附图说明

图1是描绘本发明的方法概述的流程图。

图2示意性地描绘本发明的方法中使用的快速细胞裂解装置。

图3描绘对于(a)未经热处理的交联四聚血红蛋白和(b)已经在90℃经历45秒到2分钟的热处理或在80℃经历30分钟的热处理的热稳定的交联四聚血红蛋白的高效液相色谱分析。

图4是流通柱色谱的洗脱曲线；血红蛋白溶液处于流过级分中。

图5示意性地描绘用于工业规模操作的具有超滤作用的流通CM柱色谱系统。

图6是用于HTST热加工步骤的装置的示意图。

图7证明HTST加工装置中的温度曲线，和在所述系统中在本发明的85℃和90℃下去除不稳定的四聚体(二聚体)所用的时间。

图8是用于本发明的热稳定的交联四聚血红蛋白的输液袋的示意图。

图9描绘在脱氧环境下与DBSF反应之前(虚线)和之后(实线)牛血红蛋白的α和β球蛋白链的反相HPLC色谱图。

图10描绘(A)天然牛血红蛋白和(B)在脱氧条件下与DBSF交联的血红蛋白的15％SDS-PAGE分析。

图11描绘通过MALDI-TOF分析所生成的来自二聚蛋白质带(B6)的胰蛋白酶消化的肽的肽质量指纹谱(peptide mass fingerprint)。

具体实施方式

血红蛋白是哺乳动物和其它动物的血液的红细胞中含铁的氧运输蛋白质。血红蛋白展现蛋白质的三级结构和四级结构两者的特性。血红蛋白中的大多数氨基酸形成由短的非螺旋区段连接的α螺旋。氢键稳定血红蛋白内部的螺旋部分，产生分子内向其的吸引力，将每个多肽链折叠成特定的形状。血红蛋白分子由四个球状蛋白质亚单位组装而成。每个亚单位由一条多肽链构成，所述多肽链排列成一组α-螺旋结构的区段，以“肌红蛋白折叠”排列与包埋的血红素基团连接。

血红素基团由固定在称为卟啉的杂环中的铁原子组成。铁原子与环中心中位于一个平面中的所有4个氮原子同等地结合。然后氧能够结合到与卟啉环的平面垂直的铁中心。因此，单个血红蛋白分子具有与4个氧分子结合的能力。

在哺乳动物中，最常见类型的血红蛋白是四聚体；在人中，其称为血红蛋白A并且由指定为α2β2的非共价结合的两个α亚单位和两个β亚单位组成，每个亚单位分别由141个和146个氨基酸残基构成。α和β亚单位的大小和结构彼此非常类似。对于约65kDa的四聚体的总分子量，每个亚单位的分子量为约16kDa。四条多肽链通过盐桥、氢键和疏水相互作用彼此结合。牛血红蛋白的结构与人血红蛋白类似(α链中的同一性为90.14％；β链中的同一性为84.35％)。不同之处在于牛血红蛋白中位于βCys93处的两个巯基，而人血红蛋白中的巯基分别位于αCys104、βCys93和βCys112处。当比较氨基酸序列时，人血红蛋白与牛、犬、猪和马血红蛋白具有高度的相似性。

在红细胞内部的天然存在的血红蛋白中，α链与其相应的β链的缔合非常强并且在生理条件下不会离解。然而，在红细胞外，一个αβ二聚体与另一αβ二聚体的缔合相当弱。所述键具有分裂成两个αβ二聚体的倾向，每个二聚体为约32kDa。这些不需要的二聚体足够小从而能够被肾脏过滤并排泄，结果造成潜在的肾损伤以及显著减少的在血管内的存留时间。

因此，从功效和安全性两方面来看，有必要稳定在红细胞外使用的任何血红蛋白。下面概述了产生稳定化的血红蛋白的方法；本发明的方法的概述呈现在图1的流程图中。

首先，选择全血来源作为来自红细胞的血红蛋白的来源。选择哺乳动物全血，包括但不限于人、牛、猪、马和犬全血。将红细胞与血浆分离，过滤并洗涤以去除血浆蛋白质杂质。

为了从红细胞释放血红蛋白，将细胞膜裂解。尽管可使用各种技术来裂解红细胞，但本发明利用可以以适合于工业规模生产的体积以精确受控的方式在低渗条件下的裂解。为此，使用如图2中所见的快速细胞裂解装置来裂解红细胞。低渗裂解产生包含血红蛋白和废滞留物的裂解产物溶液。为了能够进行工业规模生产，小心地控制裂解以使得仅红细胞被裂解而不裂解白细胞或其它细胞。在一个实施方案中，选择快速细胞裂解装置的大小以使得红细胞在2到30秒内或足以裂解红细胞的时间内和优选30秒内穿过所述装置。快速细胞裂解装置包括静态混合器。使用去离子水和蒸馏水作为低渗溶液。当然应当理解，使用具有不同的盐浓度的其它低渗溶液将导致用于红细胞裂解的时间段不同。由于受控的裂解程序仅裂解红细胞，而不破坏白细胞或细胞性物质，因此其使毒性蛋白质、磷脂或DNA从白细胞和其它细胞性物质的释放最小化。在30秒后，即在含有红细胞的溶液已经穿过快速细胞裂解装置的静态混合器部分后，立即添加高渗溶液。得到的血红蛋白与使用其它裂解技术得到的血红蛋白相比具有更高的纯度和更低水平的污染物，例如不需要的DNA和磷脂。分别通过聚合酶链式反应(检测限＝64pg)和高效液相色谱(HPLC，检测限＝1μg/ml)方法没有在所述血红蛋白溶液中检测到来自白细胞的不期望的核酸和磷脂杂质。

在所述方法中的此阶段，对血红蛋白溶液进行纯化以去除各种蛋白质和其它杂质。此纯化可为基于超滤的过程、基于色谱的过程或一个或多个超滤和/或色谱过程的组合。在示例性实施方案中，进行两个超滤过程：一个过程在流通柱色谱前去除分子量比血红蛋白大的杂质，另一过程在流通柱色谱后去除分子量比血红蛋白小的杂质。后一超滤过程浓缩血红蛋白。在一些实施方案中，使用100kDa过滤器进行第一超滤过程，而使用30kDa过滤器进行第二超滤过程。

使用流通柱色谱来去除纯化的血红蛋白溶液中的蛋白质杂质，例如免疫球蛋白-G、白蛋白和碳酸酐酶。在一些实施方案中，通过使用一种市售离子交换柱或其组合来实施柱色谱，所述离子交换柱例如DEAE柱、CM柱、羟磷灰石柱等。用于柱色谱的pH通常为6到8.5。在一个实施方案中，使用流通CM柱色谱步骤在pH8.0下去除蛋白质杂质。进行酶联免疫吸附测定(ELISA)和HPLC方法以检测从柱色谱洗脱后样品中残留的蛋白质杂质和磷脂。此独特的流通柱色谱分离使得能够实现用于工业规模生产的连续分离方案。ELISA结果显示在洗脱的血红蛋白中这些杂质的量非常低(免疫球蛋白-G：44.3ng/ml；白蛋白：20.37ng/ml；碳酸酐酶：81.2μg/ml)。使用不同种类的柱利用不同的pH值去除蛋白质杂质的结果示于下表1中。

表1

在柱色谱过程后，通过DBSF使血红蛋白交联。所选条件使得有利于在β-β亚单位之间发生交联并且得到的产物具有大于50％的β-β交联。对于在脱氧条件下的交联来说，得到的血红蛋白相比于在基本上类似的条件下测量的相同物种的天然血红蛋白具有低氧亲和力和较高的p50值。例如，对于牛血红蛋白来说，天然牛血红蛋白具有约23-29mm Hg的p50值。在本发明中在脱氧条件下形成的交联牛血红蛋白具有约38-50mm Hg的p50值。较低氧亲和力意味着所述四聚体可比具有较高氧亲和力的材料更容易地将氧“卸载”到靶标。对于在氧合条件下牛血红蛋白的交联来说，与具有约23-29mm Hg的p50值的天然牛血红蛋白相比，形成了具有较高氧亲和力的材料，所述材料具有小于约23mm Hg的较低p50值。当需要快速氧合时，如在由大量失血所致的组织缺氧(例如，出血性休克)的情况下，使用较低氧亲和力的组合物。较高氧亲和力的组合物可用于在癌症治疗中的氧合辅助疗法，其中需要较缓慢的氧递送速率。

对于人血红蛋白来说，在脱氧条件下的交联通常产生大多数的具有较低氧亲和力的α-α交联血红蛋白，也就是说，氧亲和力从天然人血红蛋白以大约至少2倍降低。与相同条件下的天然人血红蛋白(p50值为约23-30mm Hg)相比，在氧合条件下的交联往往有利于产生具有较高氧亲和力(也就是说，小于约23mm Hg的较低p50)的β-β交联血红蛋白。

对于优选小于0.1ppm溶解氧水平的脱氧交联条件来说，在3到16小时的时段内、在环境温度(15-25℃)下、在约8-10的pH，优选约pH8.6-9.2下、以1∶2.5到1∶4.0的血红蛋白与DBSF的摩尔比维持所述条件。得到的交联血红蛋白是分子量为60-70kDa的四聚血红蛋白，表明不存在聚合血红蛋白。DBSF反应的产率高，＞99％，并且终产物中的二聚体浓度低。任选地，本发明方法无需如各种现有技术方法中那样在交联前使用巯基处理试剂(例如碘乙酰胺)与血红蛋白反应。对于氧合条件下的交联来说，使用氧合环境(例如空气，pO₂为约149mmHg；或纯O₂，pO₂接近760mmHg)，而上述剩余条件基本上相同。

对于牛血红蛋白来说，对于脱氧条件(小于0.1ppm溶解氧水平)下的交联来说，β-β交联大于50％，且优选地大于60％。对于氧合条件下交联的牛血红蛋白来说，也有利于β-β交联，β-β交联水平通常大于40％。

对于人血红蛋白来说，氧合条件下的交联有利于β-β交联。

在交联后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(一种生理缓冲液)交换交联溶液并且通过切向流动过滤去除任何残留的化学品。

在交联后，本发明提供用于交联四聚血红蛋白溶液的热加工步骤(高温短时间，HTST)。在脱氧环境中进行热处理。在热处理之前，任选地添加N-乙酰基半胱氨酸以防止形成高铁血红蛋白(无活性的血红蛋白)。在热加工步骤后，将溶液冷却并且任选地添加N-乙酰基半胱氨酸以维持低水平的高铁血红蛋白。如果N-乙酰基半胱氨酸在热处理之前和之后添加，则在热处理之前添加的量为约0.2％，而在热处理之后添加的量为约0.025％到0.4％。然而，如果N-乙酰基半胱氨酸仅在热处理之后添加，则添加的量为0.025％-0.4％。在一个实施方案中，在热处理之后添加的N-乙酰基半胱氨酸的量为0.2％-0.4％。在另一实施方案中，在热处理之后添加的N-乙酰基半胱氨酸的量为0.025％-0.2％。

在一些实施方案中，将交联四聚血红蛋白溶液在脱氧环境（小于0.1ppm溶解氧水平)中在50℃到95℃的温度范围内加热持续0.5分钟到10小时。在一些实施方案中，将交联四聚血红蛋白溶液在70℃到95℃范围的温度下加热持续30秒到3小时。在一些优选的实施方案中，将交联四聚血红蛋白溶液在80℃加热30分钟。并且还在其它优选的实施方案中，将交联血红蛋白溶液加热至90℃持续30秒到3分钟，然后在约15到30秒内快速冷却到约25℃，并且如上所述任选地添加N-乙酰基半胱氨酸。

为了分析HTST热加工步骤的结果，使用HPLC分析方法来检测在此热加工步骤后二聚体的量。用于HPLC分析的流动相含有氯化镁(0.75M)，所述氯化镁可分离二聚体(未稳定化的四聚体)与热稳定的交联四聚血红蛋白。对于促进血红蛋白解离成二聚体，在相同的离子强度下氯化镁的有效性为氯化钠的约30倍。热加工步骤也充当变性步骤，从而显著地去除交联四聚血红蛋白中不需要的蛋白质杂质(检测不到免疫球蛋白-G；白蛋白减少96.15％；碳酸酐酶减少99.99％)。进行酶联免疫吸附测定(ELISA)以检测样品中的蛋白质杂质。因此，纯化的、热稳定的交联四聚血红蛋白溶液具有检测不到的水平的二聚体(低于检测限：0.043％)和免疫球蛋白-G以及极低量的白蛋白(0.02μg/ml)和碳酸酐酶(0.014μg/ml)。图3显示在HPLC系统中检测不到二聚形式的血红蛋白。表2显示关于通过HTST热加工步骤的有关蛋白质杂质和二聚体去除的实验结果。此HTST热加工步骤使得能够选择性地将热稳定的交联四聚体与不稳定的四聚体(例如，未交联的四聚体)和二聚体分离。

表2

在脱氧条件下交联血红蛋白的热加工步骤后，热稳定的交联四聚血红蛋白准备用于药物调配和包装。本发明描述了热稳定的交联四聚血红蛋白溶液在脱氧环境中的气密包装步骤。本发明中热稳定的交联四聚血红蛋白在脱氧条件下维持时稳定超过两年。

在本发明中，含氧载体的药物组合物主要打算用于静脉注射应用。传统上，现有产品使用具有高透氧性的常规的PVC血袋或Stericon血袋，这会最终缩短产品的寿命，因为产品在氧合条件下快速地(在几天内)转变成无活性的高铁血红蛋白。

本发明中使用的包装使得热稳定的交联四聚体血红蛋白稳定超过两年。使用EVA/EVOH材料的多层包装来使透气性最小化并且避免形成无活性的高铁血红蛋白。设计与本发明的纯化的和热稳定的交联四聚血红蛋白一起使用的100ml输液袋由厚度为0.4mm的5层EVA/EVOH层压材料制成，所述材料透氧性为在室温下0.006-0.132cm³/100平方英寸/24小时/大气压。此材料是VI类塑料(如USP<88>中所定义)，其满足体内生物学反应测试和物理化学测试(the in-vivo Biological Reactivity Tests and thePhysico-Chemical Test)并且适合于制作用于静脉注射目的的输液袋。此初级袋可特别地用于保护热稳定的交联四聚体血红蛋白溶液免于长期氧暴露，长期氧暴露导致其不稳定并且最终影响其治疗性质。

对于血液产品的二级保护，已知使用铝外包装来防止潜在的漏气并且将产品保持在脱氧状态。然而，在铝外包装中有存在针孔的可能性，使其气密性受损并且使产品不稳定。因此本发明使用铝外包装袋作为二级包装，所述铝外包装袋防止氧合并且还防止暴露于光。所述外包装袋的组成包括0.012mm聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、0.007mm铝(Al)、0.015mm尼龙(nylon)(NY)和0.1mm聚乙烯(PE)。该外包装薄膜的厚度为0.14mm且其氧透过速率为在室温下0.006cm³/100平方英寸/24小时/大气压。此二级包装延长了血红蛋白的稳定时间，从而延长了产品的保存期限。

本发明中的方法适用于热稳定的交联四聚血红蛋白的大规模工业生产。另外，热稳定的交联四聚血红蛋白与药物载体(例如，水、生理缓冲液、以胶囊形式)的组合适合于哺乳动物应用。

本发明的含氧载体的药物组合物可用于改善组织氧合、癌症治疗、治疗缺氧病症(例如出血性休克)和在低氧含量环境下的心脏保存(例如心脏移植)。在示例性实施方案中，剂量选择为具有约0.2-1.3g/kg范围的浓度，输注速率小于10ml/小时/kg体重。

对于在治疗缺氧病症和心脏保存中的应用，本发明的具有较低氧亲和力的含氧载体的药物组合物作为向靶器官提供氧的血液代替品起作用。较低氧亲和力的交联血红蛋白可用于需要快速组织氧合的应用(例如出血性休克和离体器官保存)。

对于在癌症治疗中的应用，本发明的具有较高氧亲和力的含氧载体的药物组合物作为组织氧合剂起作用以改善肿瘤组织中的氧合，从而增强化学敏感性和放射敏感性。较高氧亲和力的血红蛋白可用于需要较慢氧合速率的应用(例如癌症辅助疗法)。

实施例

以描述本发明的具体实施方案的方式提供以下实施例，但不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

方法概述

本发明的方法的示意性流程图图示于图1中。将牛全血采集于封闭的无菌容器/袋中，所述容器/袋含有作为抗凝剂的3.8％(w/v)柠檬酸钠溶液。然后立即将血液与柠檬酸钠溶液充分混合以抑制血液凝固。通过单采机制(apheresis mechanism)将红细胞(RBC)与血浆和其他较小的血细胞分离并采集。将“细胞洗涤器”与γ灭菌的一次性离心机转筒(centrifuge bowl)一起用于此程序。用等体积的0.9％(w/v氯化钠)盐水洗涤RBC。

通过对RBC细胞膜施加低渗冲击，裂解洗涤的RBC，以释放血红蛋白内含物。对于此目的，使用描绘于图2中的用于RBC裂解器件的专门的快速细胞裂解装置。在RBC裂解后，使用100kDa膜通过切向流超滤将血红蛋白分子与其它蛋白质分离。收集滤液中的血红蛋白用于流通柱色谱，并且通过30kDa膜进一步浓缩到12-14g/dL。实施柱色谱以去除蛋白质杂质。

首先使浓缩的血红蛋白溶液与DBSF反应以形成热稳定的交联四聚血红蛋白分子。然后在脱氧条件下在90℃下进行热处理步骤30秒至3分钟，随后进行最终的配制和包装。

实施例2

时间&受控的低渗裂解和过滤

采集新鲜牛全血并在冷却条件(2-10℃)下运输。经由细胞洗涤器并且随后用0.65μm过滤将红细胞与血浆分离。在用0.9％盐水洗涤红细胞(RBC)滤液后，通过低渗裂解破裂滤液。通过使用图2中描绘的快速细胞裂解装置来进行低渗裂解。所述快速细胞裂解装置包括静态混合器以辅助细胞裂解。将具有受控的血红蛋白浓度(12-14g/dL)的RBC悬浮液与4体积的纯化水混合从而对RBC细胞膜产生低渗冲击。控制低渗冲击的时间以避免不希望的对白细胞和血小板的裂解。低渗溶液经过快速细胞裂解装置的静态混合器部分持续2到30秒或否则足以裂解红细胞的时间，且优选30秒。在30秒后当裂解产物离开静态混合器时通过将裂解产物与1/10体积的高渗缓冲液混合而终止冲击。所用高渗溶液为0.1M磷酸盐缓冲液，7.4％NaCl，pH7.4。图2的快速细胞裂解装置可连续地处理50到1000升裂解产物/小时，且优选地至少300升/小时。

在RBC裂解后，通过0.22μm过滤器将红细胞的裂解产物过滤以获得血红蛋白溶液。分别通过聚合酶链式反应(检测限＝64pg)和HPLC法(检测限＝1μg/mL)在所述血红蛋白溶液中均未检测到来自白细胞的核酸和磷脂杂质。进行第一次100kDa超滤以去除分子量高于血红蛋白的杂质。接着进行流通柱色谱以进一步纯化所述血红蛋白溶液。然后进行第二次30kDa超滤以去除分子量低于血红蛋白的杂质，并用于浓缩。

实施例3

对无基质血红蛋白溶液的病毒清除研究

为了证明本发明产品的安全性，通过病毒验证研究来证明(1)0.65μm渗滤步骤和(2)100kDa超滤步骤的病毒清除能力。这是通过向这两种方法的按比例缩小的形式中有意掺加不同的模型病毒(脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus)、伪狂犬病病毒(pseudorabies virus)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhoea virus)和牛细小病毒(bovine parvovirus))来进行。在此研究中，使用了四种类型的病毒(参见表3)。这些病毒的生物物理学和结构特征不同，并且它们在对物理和化学药剂或处理的抗性方面显示出差异。

表3

验证方案简要地示于下表4中。

表4

下表5总结了在(1)0.65μm渗滤和(2)100kDa超滤中4种病毒的对数(log)减少的结果。通过0.65μm渗滤和100kDa超滤有效地去除了所有4种病毒，BVDV、BPV、EMCV和PRV。

表5

注释：

≥没有测定到残留的感染性

实施例4

流通柱色谱

使用CM柱(购自GE healthcare)来进一步去除任何蛋白质杂质。起始缓冲液为20mM乙酸钠(pH8.0)，且洗脱缓冲液为20mM乙酸钠、2M NaCl(pH8.0)。在用起始缓冲液平衡CM柱后，将蛋白质样品加载到柱中。用至少5柱体积的起始缓冲液洗涤未结合的蛋白质杂质。使用8柱体积的25％洗脱缓冲液(0-0.5M NaCl)进行洗脱。洗脱曲线示于图4中；血红蛋白溶液处于流过级分中。通过ELISA分析流过级分的纯度。结果示于下表6中。

表6

由于血红蛋白溶液在pH8下处于来自CM柱色谱的流过级分中(不在洗脱液中)，因此这是一种用于连续的工业规模操作的好方法。第一超滤装置直接连接到流通CM柱色谱系统，并且流通管道可以连接到用于工业规模操作的第二超滤装置。示意性的工业工艺配置显示在图5中。

实施例5

热稳定的交联四聚血红蛋白的制备

(5a)在脱氧条件下与DBSF的交联反应

在脱氧条件(也就是说，小于0.1ppm溶解氧水平)下实施交联反应。将DBSF添加到血红蛋白溶液以形成交联四聚血红蛋白，而不形成聚合血红蛋白。DBSF稳定化程序稳定四聚形式的血红蛋白(65kDa)并且防止解离成二聚体(32kDa)，所述二聚体通过肾脏排泄。在此实施方案中，使用的血红蛋白与DBSF的摩尔比为1∶2.5，并且pH为8.6。此过程在环境温度(15-25℃)下在惰性氮气氛中实施3-16个小时的时间以防止血红蛋白氧化形成在生理学上无活性的高铁血红蛋白(溶解氧水平保持在小于0.1ppm)。通过使用HPLC测量残留DBSF来监测DBSF反应的完成度。DBSF反应的产率高，＞99％。β-β交联的产量为至少约40％。

(5b)HTST热加工步骤

高温短时间(HTST)加工装置示于图6中。使用HTST加工装置对交联四聚血红蛋白进行热加工步骤。在此实施例中，热处理的条件为90℃持续30秒到3分钟，且优选45秒到60秒，但可以如上所讨论的那样选择其他条件并相应地对装置进行改良。将含有交联的血红蛋白且任选地向其中添加有0.2％N-乙酰基半胱氨酸的溶液以1.0升/分钟的流速泵送到HTST加工装置(HTST热交换器的第一区段被预加热并且维持在90℃)中，所述设置的第一区段的保留时间为45秒到60秒，然后使所述溶液以相同的流速流过进入所述热交换器的保持在25℃的另一区段中。冷却所需的时间在15秒到30秒之间。在冷却到25℃后，立即以0.2％到0.4％的浓度添加N-乙酰基半胱氨酸。容易地控制热加工装置的配置以进行工业操作。二聚体含量的温度曲线示于图7中。如果血红蛋白没有交联，则其对热不稳定并且在热加工步骤后形成沉淀。此后通过离心或过滤去除该沉淀以在之后形成澄清溶液。

下表7显示蛋白质杂质(例如免疫球蛋白-G、白蛋白、碳酸酐酶)和不需要的未稳定化的四聚体或二聚体在热加工步骤后被去除。使用ELISA法测量免疫球蛋白-G、白蛋白和碳酸酐酶的量，而通过HPLC法测定二聚体的量。在HTST热加工步骤后热稳定的交联四聚血红蛋白的纯度极高，在98.0％到100％的范围内。

表7

(5c)通过添加0.025-0.2％NAC防止高铁血红蛋白形成

在热处理和冷却后，立即以约0.025-0.2％的浓度将N-乙酰基半胱氨酸(NAC)添加到交联四聚血红蛋白中以防止高铁血红蛋白形成。在不同时间间隔，通过一氧化碳血氧定量法(Co-oximetry method)测量高铁血红蛋白的百分比。表8显示在添加NAC后5个月内交联四聚血红蛋白中高铁血红蛋白的百分比。如表8中所示，在添加NAC后，热处理的交联四聚血红蛋白中的高铁血红蛋白水平保持稳定并且非常低，在1.8-5.1％的范围内。

表8

实施例6

包装

因为本发明的产品在脱氧条件下是稳定的，因此用于所述产品的包装使透气性最小化是重要的。对于静脉应用，定制设计的100ml输液袋由厚度为0.4mm的5层EVA/EVOH层压材料制成，其透氧性为在室温下0.006-0.132cm³/100平方英寸/24小时/大气压。此特殊材料是VI类塑料(如USP<88>中所定义)，其满足体内生物学反应测试和物理化学测试并且适合于制作用于静脉注射目的的容器(应注意根据所需的应用由此材料还可以制成其它形式的包装)。还将二级包装铝外包装袋应用于初级包装输液袋，所述铝外包装袋提供额外的屏障以使光暴露和氧扩散最小化。所述袋的各层包含：0.012mm聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、0.007mm铝(Al)、0.015mm尼龙(NY)和0.1mm聚乙烯(PE)。该外包装薄膜的厚度为0.14mm且其氧透过速率为在室温下0.006cm³/100平方英寸/24小时/大气压。输液袋的示意图绘示于图8中。根据本发明的每个输液袋的总透氧性为在室温下0.0025cm³/24小时/大气压。

实施例7

交联牛Hb的表征(脱氧交联条件)

(7a)通过反相高效液相色谱(HPLC)分离球蛋白链

使用稍微修改的Shelton等人(1984)研发的梯度在VYDAC C4柱上来解析(resolve)天然牛血红蛋白的球蛋白链和DBSF交联牛血红蛋白的交联球蛋白链。

(7b)DBSF交联牛血红蛋白的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析

通过与还原性样品缓冲液(62mM Tris-HCl(pH6.8)、10％(v/v)甘油、5％(v/v)巯基乙醇和2.3％(w/v)SDS)混合来制备天然牛血红蛋白溶液和DBSF交联牛血红蛋白溶液，并且在95℃加热10min。使用具有4％积层凝胶的15％丙烯酰胺平板凝胶解析样品混合物。以60mA的恒定电流运行电泳。电泳后，用0.1％(w/v)考马斯蓝(Coomassie Blue)R350、20％(v/v)甲醇和10％(v/v)乙酸将SDS-PAGE凝胶染色。为了估计DBSF交联牛血红蛋白中不同类型的交联的百分比，使用Lumi-Analyst3.1软件来定量黑光单元(Black Light Unit)(BLU)中显示的被解析的蛋白质条带的强度。

(7c)还原的球蛋白链的胰蛋白酶消化

将对应于主要交联球蛋白链的蛋白质条带从SDS-PAGE凝胶切离，切割成立方体(1×1mm)，并且用10％甲醇/10％乙酸脱色。将脱色的凝胶立方体用25mM NH₄CO₃中的10mM DTT还原并且在黑暗中用25mMNH₄CO₃中的55mM碘乙酰胺烷基化45min，且然后在37℃用25mMNH₄CO₃中的20ng/μl经修饰的胰蛋白酶在凝胶内消化过夜。在胰蛋白酶消化后，通过扩散到50％(v/v)乙腈(ACN)和1％(v/v)三氟乙酸(TFA)中来提取经胰蛋白酶消化的肽。

(7d)基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱(MS)分析

将从蛋白质条带提取的经胰蛋白酶消化的肽点样到用1μl基质溶液(2mg/ml氰基-4-羟基肉桂酸，在50％ACN/0.1％TFA中饱和)预点样的Anchorchip板上，并且风干。干燥后，用10mM单磷酸盐缓冲液洗涤样品斑点并且使用乙醇∶丙酮∶0.1％TFA(6∶3∶1比率)的溶液使其再结晶。利用在800-3500Da的m/z范围内以反射模式操作的Bruker Autoflex III(Bruker Daltonic GmbH，Bremen，Germany)进行MALDI-TOF MS分析并且将参数设定如下：用于肽质量指纹谱(PMF)的离子源为25kV，且用于PMF的反射器为26.3kV。使用Bruker肽混合校准标准品(Mix CalibrationStandard)进行外部校准。通过Flex-Analysis(Bruker Daltonic GmbH，Bremen，Germany)自动标记S/N比超过4的峰。通过MASCOT2.2.04和Biotools2.1软件(Bruker Daltonic GmbH，Bremen，Germany)进一步分析MS数据，并且在NCBI非冗余(NCBInr)数据库中针对哺乳动物蛋白对这些数据进行搜索。下列的参数用于数据库搜索：单同位素质量准确度(monoisotopic massaccuracy)＜250ppm，母体电荷(parent charge)为+1，漏切位点(missedcleavage)为1，半胱氨酸的脲甲基化(carbamidomethylation)为固定修饰，蛋氨酸的氧化为可变修饰。

(7e)液相色谱-电喷雾电离(LC-ESI)串联质谱(MS/MS)分析

使用直接耦合到HCT Ultra ESI-离子阱质谱仪(Bruker Daltonic GmbH，Bremen，Germany)的毛细管HPLC对来自蛋白质条带的经胰蛋白酶消化的肽进行纳升级LC MS/MS(Nano-LC MS/MS)分析。在柱注射之前将肽消化物溶解于0.1％甲酸/2％ACN中。使用4-90％的梯度(0.001％甲酸和80％ACN中的0.001％甲酸)利用C18柱(15cm×75nm，LC PACKINGS)进行肽分离。流速在25℃为250ng/min。将来自C18柱的洗脱液输入以线性模式操作用于在线分析的HCT Ultra ESI-离子阱质谱仪中。用喷雾电压为137V且加热的毛细管温度为160℃的纳米源优化离子阱质谱仪。将离子阱中肽离子的累积时间设定为200ms，并且选择用于MS/MS分析的质荷比为100Da到1800Da且电荷态为1-3。

采用在220nm的波长下监测的VYDAC C4柱上的反相HPLC来分离发生在DBSF交联牛血红蛋白中的α与β链之间的不同类型的交联。使用与DBSF交联之前和之后的牛血红蛋白获得的色谱图示于图9中。在图9中，天然牛血红蛋白的α链的移动性高于β链(如用虚线所示)。其特性通过MALDI-TOF分析被确认。在与DBSF反应后，使β链交联，而绝大部分α链却未交联(如用实线所示)。由于与DBSF交联，形成6个疏水性大于天然β链的主要的球蛋白峰。DBSF交联牛血红蛋白中的交联球蛋白链也通过15％SDS-PAGE解析，如图10中所示。对主要交联球蛋白链(图10中的B6)进行胰蛋白酶消化和后续的MALDI-TOF分析，并且基于其肽质量指纹谱将其鉴定为仅β球蛋白链，如图11中所示。

尽管已就多个实施方案描述了本发明，但这些实施方案并非限制性的。本领域普通技术人员将理解大量的变动和更改。这样的变动和更改被认为包括在下列权利要求的范围内。

Claims

1.一种制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，该含氧载体的药物组合物包含血红蛋白，所述血红蛋白基本上由具有高于40％的β-β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白组成，所述方法包括：

a)提供至少包含红细胞和血浆的哺乳动物全血；

b)将所述哺乳动物全血中的所述红细胞与所述血浆分离；

c)过滤与所述血浆分离的所述红细胞以获得滤过的红细胞级分；

d)洗涤所述滤过的红细胞级分以去除血浆蛋白质杂质，得到洗涤过的红细胞；

e)破裂所述洗涤过的红细胞以产生包含破裂的红细胞的裂解产物的溶液；

f)进行过滤以从所述裂解产物中去除至少一部分废滞留物；

g)从所述裂解产物中提取第一血红蛋白溶液；

h)进行至少一个纯化过程以去除病毒、废滞留物或蛋白质杂质中的一种或多种；

i)在氧合环境中通过富马酸双-3，5-二溴水杨酸酯使所述第一血红蛋白溶液交联以形成交联血红蛋白，其中所述交联血红蛋白是具有至少40％β-β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白；

j)去除任何残留的化学品；

k)在脱氧环境中热处理所述交联血红蛋白以使任何残留的未稳定化的/未交联的血红蛋白、任何二聚血红蛋白和任何其它蛋白质杂质变性并沉淀，从而使得得到的热稳定的交联四聚血红蛋白具有检测不到浓度的二聚体并且基本上由非聚合的交联四聚血红蛋白组成，所述非聚合的交联四聚血红蛋白具有至少40％的β-β交联且其氧亲和力大于在基本上类似的条件下测量的相同物种的天然血红蛋白的氧亲和力；

l)通过离心或过滤去除沉淀以形成澄清溶液；和

m)将纯化的和热稳定的交联四聚血红蛋白添加到药物上可接受的载体。

2.根据权利要求1所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中热加工步骤是在约70℃到95℃进行30秒到3小时的高温短时间(HTST)过程，随后立即冷却且在所述冷却后立即添加0.2％到0.4％的量的N-乙酰基半胱氨酸。

3.根据权利要求1所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中所述全血是牛全血且所述β-β交联高于50％并且p50值小于约23mm Hg。

4.根据权利要求1所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中所述全血是牛全血且所述β-β交联高于60％并且p50值小于约23mm Hg。

5.根据权利要求1所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中所述纯化是使用色谱进行的，所述色谱包括使用一个或多个阳离子交换柱或阴离子交换柱。

6.根据权利要求5所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中所述色谱柱是一个或多个DEAE、CM和/或羟磷灰石柱。

7.根据权利要求1所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中所述全血是人血。

8.根据权利要求1所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中所述全血是猪血、马血或犬血。

9.根据权利要求1所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其进一步包括在低透氧性包装中包装所述血红蛋白溶液以使得血红蛋白溶液具有约两年的保存期限。

10.一种包含血红蛋白的含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物，其中所述血红蛋白基本上由通过权利要求1所述的方法形成的具有高于40％的β-β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白组成。

11.一种包含血红蛋白的含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物，其中所述血红蛋白基本上由通过权利要求4所述的方法形成的具有高于60％的β-β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白组成。

12.根据权利要求10所述的组合物，其用于氧合组织，其中所述组合物被体内或离体施用。

13.根据权利要求11所述的组合物，其用于氧合组织，其中所述组合物被体内或离体施用。

14.一种制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，该含氧载体的药物组合物包含血红蛋白，所述血红蛋白基本上由具有高于50％的β-β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白组成，所述方法包括：

a)提供至少包含红细胞和血浆的哺乳动物全血；

b)将所述哺乳动物全血中的所述红细胞与所述血浆分离；

f)进行过滤以从所述裂解产物中去除至少一部分废滞留物；

g)从所述裂解产物中提取第一血红蛋白溶液；

i)在脱氧环境中通过富马酸双-3，5-二溴水杨酸酯使所述第一血红蛋白溶液交联以形成交联血红蛋白，其中所述交联血红蛋白是具有至少50％β-β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白；

j)去除任何残留的化学品；

k)在脱氧环境中热处理所述交联血红蛋白以使任何残留的未稳定化的/未交联的血红蛋白、任何二聚血红蛋白和任何其它蛋白质杂质变性并沉淀，从而使得得到的热稳定的交联四聚血红蛋白具有检测不到浓度的二聚体并且基本上由非聚合的交联四聚血红蛋白组成，所述非聚合的交联四聚血红蛋白具有至少50％的β-β交联且其氧亲和力小于在基本上类似的条件下测量的相同物种的天然血红蛋白的氧亲和力；

l)通过离心或过滤去除沉淀以形成澄清溶液；和

15.根据权利要求14所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中所述全血是牛全血且所述交联四聚牛血红蛋白的氧亲和力具有约38mm Hg到50mm Hg的p50值。

16.根据权利要求14所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其进一步包括在低透氧性包装中包装所述血红蛋白溶液以使得血红蛋白溶液具有约两年的保存期限。

17.一种包含血红蛋白的含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物，其中所述血红蛋白基本上由通过权利要求14所述的方法形成的β-β交联大于50％的非聚合的交联四聚血红蛋白组成。

18.一种包含血红蛋白的含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物，其中所述血红蛋白基本上由通过权利要求15所述的方法形成的β-β交联大于60％的非聚合的交联四聚血红蛋白组成。

19.根据权利要求17所述的组合物，其用于氧合组织，其中所述组合物被体内或离体施用。

20.根据权利要求18所述的组合物，其用于氧合组织，其中所述组合物被体内或离体施用。

21.根据权利要求1所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中热加工步骤是在约70℃到95℃进行30秒到3小时的高温短时间(HTST)过程，随后立即冷却且在所述冷却后立即添加0.025％到0.4％的量的N-乙酰基半胱氨酸。

22.根据权利要求1所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中所述热加工步骤是在约70℃到95℃进行30秒到3小时的高温短时间(HTST)过程，随后立即冷却且在所述冷却后立即添加0.025％到0.2％的量的N-乙酰基半胱氨酸。

23.一种制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，该含氧载体的药物组合物包含血红蛋白，所述血红蛋白基本上由具有高于40％的β-β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白组成，所述方法包括：

a)提供至少包含红细胞和血浆的哺乳动物全血；

b)将所述哺乳动物全血中的所述红细胞与所述血浆分离；

f)进行过滤以从所述裂解产物中去除至少一部分废滞留物；

g)从所述裂解产物中提取第一血红蛋白溶液；

j)去除任何残留的化学品；

l)冷却得到的热稳定的交联血红蛋白；

m)添加0.025％-0.4％的N-乙酰基半胱氨酸；

n)通过离心或过滤去除沉淀以形成澄清溶液；和

o)将纯化的和热稳定的交联四聚血红蛋白添加到药物上可接受的载体。

24.根据权利要求14所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中热加工步骤是在约70℃到95℃进行30秒到3小时的高温短时间(HTST)过程，随后立即冷却且在所述冷却后立即添加0.025％到0.4％的量的N-乙酰基半胱氨酸。

25.根据权利要求14所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中热加工步骤是在约70℃到95℃进行30秒到3小时的高温短时间(HTST)过程，随后立即冷却且在所述冷却后立即添加0.025％到0.2％的量的N-乙酰基半胱氨酸。

26.根据权利要求14所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中热加工步骤是在约70℃到95℃进行30秒到3小时的高温短时间(HTST)过程，随后立即冷却且在所述冷却后立即添加0.2％到0.4％的量的N-乙酰基半胱氨酸。

27.一种制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，该含氧载体的药物组合物包含血红蛋白，所述血红蛋白基本上由具有高于50％的β-β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白组成，所述方法包括：

a)提供至少包含红细胞和血浆的哺乳动物全血；

b)将所述哺乳动物全血中的所述红细胞与所述血浆分离；

f)进行过滤以从所述裂解产物中去除至少一部分废滞留物；

g)从所述裂解产物中提取第一血红蛋白溶液；

j)去除任何残留的化学品；

l)冷却得到的热稳定的交联四聚血红蛋白；

m)添加0.025％-0.4％的N-乙酰基半胱氨酸；

n)通过离心或过滤去除沉淀以形成澄清溶液；和