MX2014002327A - Metodo para la preparacion de una composicion que contiene portador de oxigeno estable al calor que facilita la reticulacion beta-beta. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos para la preparación de una composición farmacéutica que contiene portador de oxígeno a base de hemoglobina estable al calor tal que se favorece la reticulación beta-beta. Usando los métodos de la presente invención, se puede controlar la afinidad a oxígeno de la molécula resultante de modo que se producen portadores de oxígeno a base de hemoglobina adaptados para aplicaciones específicas. La hemoglobina reticulada de menor afinidad a oxígeno es útil para aplicaciones que requieren rápida oxigenación de tejido (por ejemplo, choque hemorrágico) en tanto que la hemoglobina reticulada de mayor afinidad a oxígeno es útil para aplicaciones que requieren una menor velocidad de oxigenación (por ejemplo, terapia adjunta de cáncer). Se requiere una hemoglobina tetramérica no polimérica reticulada estable al calor y altamente purificada que tiene reticulación beta-beta de más de 40-60% y adecuada para el uso en mamíferos sin producir lesión renal ni vasoconstricción. Un paso de procesamiento térmico de alta temperatura y corto tiempo (HTST) se realiza para remover efectivamente cualquier hemoglonia dimérica indeseada, hemoglobina tetramérica no reticulada e impurezas de proteína plasmática.

Description

MÉTODO PARA LA PREPARACIÓN DE UNA COMPOSICIÓN QUE CONTIENE PORTADOR DE OXÍGENO ESTABLE AL CALOR QUE FACILITA LA RETICULACIÓN BETA-BETA REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS: La presente solicitud es una Solicitud de Patente Internacional que solicita prioridad respecto de una patente provisoria E.U.A. No. 61/529,279 inscrita el 31 de Agosto de 2011 , una Continuación Parcial de Solicitud E.U.A. No. 13/225,797 inscrita el 6 de Septiembre de 20 1 y una Continuación Parcial de Solicitud E.U.A. No. 13/275,366 inscrita el 18 de Octubre de 2011 , ahora Patente US 8,106,011 , incorporada en su totalidad a modo de referencia.

CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a métodos para preparar una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno estable al calor que favorece una reticulación beta-beta. Aplicando los métodos de la presente invención, se puede controlar la afinidad de la molécula resultante con el oxígeno, a objeto de producir portadores de oxígeno en base a hemoglobina adecuados para aplicaciones específicas. La hemoglobina reticulada con baja afinidad con el oxígeno es útil para aplicaciones que requieren una rápida oxigenación de tejidos (por ej. shock hemorrágico), en tanto que la hemoglobina reticulada con alta afinidad con el oxígeno es útil para aplicaciones que requieren una oxigenación más lenta (por ej. terapia asociada a cáncer).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La hemoglobina juega un importante rol en el intercambio gaseoso entre el sistema vascular y los tejidos de la mayoría de los vertebrados. Es responsable de transportar el oxígeno desde el sistema respiratorio hacía las células del cuerpo a través de la circulación de la sangre y también de transportar el dióxido de carbono producto de los residuos metabólicos desde las células del cuerpo hacia el sistema respiratorio, en que el dióxido de carbono es exhalado. Debido a su característica de transportar oxígeno, la hemoglobina puede ser utilizada como un potente suministro de oxígeno cuando puede ser estabilizada ex vivo y utilizada in vivo.

La hemoglobina nativa es un tetrámero sustancialmente estable cuando está dentro de los glóbulos rojos. Sin embargo, cuando la hemoglobina es extraída de los glóbulos rojos, se vuelve inestable en el plasma y se separa en dos dímeros a-ß. Cada uno de estos dímeros equivale aproximadamente a 32 kDa en peso molecular. Estos dímeros pueden causar un importante daño renal cuando son filtrados a través de los ríñones y excretados. La descomposición del vínculo del tetrámero impacta también negativamente la sustentabilidad de la hemoglobina funcional en circulación.

A objeto de solucionar este problema, recientes investigaciones relacionadas con el procesamiento de la hemoglobina han incorporado diferentes técnicas de reticulación para crear enlaces intramoleculares dentro del tetrámero así como enlaces intermoleculares entre los tetrámeros para formar hemoglobina polimérica. La técnica anterior sostiene que la hemoglobina polimérica es la forma preferida para aumentar la vida media circulatoria de la hemoglobina. Sin embargo, como pudieron determinar los presentes inventores, en la circulación sanguínea la hemoglobina polimérica se convierte más rápidamente en metahemoglobina. La metahemoglobina no puede ligar oxígeno y por lo tanto no puede oxigenar tejidos. Por lo tanto, la reticulación sostenida por la técnica anterior que produce la formación de hemoglobina polimérica es un problema. Dentro de este campo, se requiere una técnica que permita la reticulación intramolecular para crear tetrámeros estables sin la simultánea formación de hemoglobina polimérica.

Otros problemas de las tentativas de la técnica anterior de estabilizar la hemoglobina incluyen la producción de hemoglobina tetrámera que comprende un inaceptable alto porcentaje de unidades dímeras (o hemoglobina tetrámera no reticulada que se disocia rápidamente en hemoglobina dimera cuando es administrada a un paciente); la presencia de dímeros hace que la composición de hemoglobina sea insatisfactoria para ser administrada a mamíferos. La forma dimera de la hemoglobina puede provocar daños renales severos en el organismo del mamífero; cuyos daños renales pueden ser suficientemente severos como para provocar la muerte. Por consiguiente, dentro de la técnica existe la necesidad de crear hemoglobina tetrámera estable con forma dimera indetectable en el producto final.

Otro de los problemas de los productos de hemoglobina de la técnica anterior es un aumento repentino de la presión sanguínea después de su administración. En el pasado se registraron eventos de vasoconstricción en portadores de oxígeno en base a hemoglobina de generaciones más antiguas. Por lo tanto, dentro de la técnica es necesario contar con un proceso para preparar hemoglobina que no cause vasoconstricción y elevada presión arterial cuando es aplicada a mamíferos.

Otros problemas ocasionados por las tentativas de la técnica anterior de crear hemoglobina estable incluye la presencia de impurezas de proteínas como inmunoglobina G, que puede provocar efectos alérgicos a los mamíferos. Por lo tanto, existe la necesidad de contar con un proceso que pueda producir hemoglobina tetrámera estable sin impurezas de proteínas.

Además de los problemas mencionados, existe la necesidad de contar con una hemoglobina tetrámera estabilizada libre de dímeros, libre de fosfolípidos y capaz de ser producida a escala industrial.

Los portadores de oxígeno en base a hemoglobina se pueden utilizar en una amplia variedad de aplicaciones médicas; dependiendo de la aplicación médica, se necesitan diferentes niveles de afinidad con el oxígeno. Por ejemplo, una molécula de hemoglobina con baja afinidad con el oxígeno puede transferir oxígeno más fácilmente a un tejido objetivo que una molécula de hemoglobina que tiene mayor afinidad con el oxígeno. Por lo tanto es deseable controlar la afinidad de la hemoglobina tetrámera reticulada con el oxígeno. En consecuencia, existe la necesidad de controlar el tipo de reticulación y las condiciones de reticulación para producir hemoglobina tetrámera reticulada con niveles precisos de enlaces de oxígeno.

LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para procesar una hemoglobina tetrámera reticulada estable al calor, no polímera, apropiada para ser utilizada en mamíferos sin causar daños renales severos, efectos vasculares dañinos y eventos adversos severos incluso la muerte. La presente invención elimina la forma dímera de la hemoglobina, la hemoglobina tetrámera no reticulada, los fosfolípidos y las impurezas de proteínas. La presente invención proporciona además una técnica para controlar la afinidad del tetrámero reticulado resultante con el oxígeno, controlando el tipo de reticulación en el tetrámero (por ej. la cantidad de reticulaciones beta-beta, de reticulaciones alfa-alfa, de reticulaciones alfa-beta en el tetrámero), la estructura cuaternaria del tetrámero, y las condiciones de la reticulación. La hemoglobina reticulada que tiene baja afinidad con el oxígeno es útil para aplicaciones que requieren una rápida oxigenación de los tejidos (por ejemplo shock hemorrágico) en tanto que la hemoglobina reticulada que tiene alta afinidad con el oxígeno es útil para aplicaciones que requieren una lenta oxigenación de los tejidos (por ej. terapia relacionada con cáncer). Adicionalmente, la presente invención utiliza (1) un aparato de citólisis instantánea para efectuar una lisis hipotónica controlada, (2) una columna cromatográfica de flujo continuo, (3) un aparato de alta temperatura por un corto tiempo (HTST) para procesar la solución de hemoglobina con calor en el proceso de purificación, a fin de remover los dímeros no estabilizados indeseados de la hemoglobina y para eliminar las impurezas de proteínas, por ejemplo inmunoglobulina-G, a fin de evitar daños renales, efectos vasculares dañinos y otras reacciones de toxicidad, y (4) una envoltura hermética de la bolsa de infusión para impedir la intrusión del oxígeno en el producto final.

El método incluye un material de partida de sangre entera de mamífero, que incluye al menos glóbulos rojos y plasma. Los glóbulos rojos se separan del plasma de la sangre entera de mamífero y a continuación se filtran para obtener una fracción filtrada de glóbulos rojos. La fracción filtrada de glóbulos rojos es lavada para retirar las impurezas de proteína del plasma. Los glóbulos rojos lavados se rompen mediante una lisis hipotónica controlada en un aparato de citólisis instantánea durante el tiempo necesario para romper los glóbulos rojos sin romper los glóbulos blancos. Se realiza una filtración para remover al menos una parte de la fracción retenida de desechos del lisado. De este lisado se extrae una primera solución de hemoglobina.

Se realiza uno o más procesos de purificación de la solución de hemoglobina, como por ejemplo ultrafiltración y/o cromatografía.

La hemoglobina purificada es reticulada con fumarato bis-3,5-dibromosalicil (DBSF), para crear hemoglobina reticulada estable al calor sin formaciones de hemoglobina polimérica, de modo que el peso molecular de la hemoglobina tetrámera no polimérica resultante sea de 60-70 kDa. La expresión "no polimérica" aquí empleada, se refiere a hemoglobina tetrámera que no está reticulada ¡ntermolecularmente con otras moléculas de hemoglobina o con cualesquier otras moléculas que no son de hemoglobina, como PEG. Dependiendo de la fuente de la hemoglobina, la estructura cuaternaria de la hemoglobina y de las condiciones de reticulación, se puede producir un producto tetrámero con un alto porcentaje de reticulación beta-beta. Además, la afinidad con el oxígeno de la molécula resultante puede ser controlada, de modo que se puede producir portadores de oxígeno en base a hemoglobina adaptados para aplicaciones específicas.

Continuando con este procedimiento, la hemoglobina reticulada es sometida a un tratamiento con calor para remover cualquier hemoglobina tetrámera no reticulada residual y cualquier hemoglobina no estabilizada, por ejemplo la forma dímera de la hemoglobina, y cualesquier otras impurezas de proteínas. Antes de someterla al tratamiento con calor, a la hemoglobina tetrámera reticulada se le agrega opcionalmente N-acetil cisteína en una concentración de aproximadamente 0.2%, a fin de evitar la formación de metahemoglobina. Inmediatamente después del tratamiento con calor y del enfriamiento, se le agrega opcionalmente N-acetil cisteína en una concentración de aproximadamente 0.025% a 0.4% para evitar la formación de metahemoglobina. El tratamiento con calor se realiza preferiblemente a una temperatura elevada de aproximadamente 70°C a 95°C durante corto tiempo, 30 segundos a 3 horas, seguida por un enfriamiento hasta 25°C. Los precipitados que se pudieran formar durante el tratamiento con calor son eliminados por centrifugación o filtración.

La hemoglobina tetrámera reticulada no polimérica libre de dímeros, libre de fosfolípidos, libre de impurezas de proteína, estable al calor es agregada entonces a un portador farmacéuticamente aceptable.

A continuación, la hemoglobina tetrámera reticulada estable al calor es formulada y envasada en una bolsa de infusión hermética de polietileno, etileno-vinil-acetato y etileno-vinil-alcohol (PE, EVA, EVOH) de forma especial. El envase evita la contaminación con el oxígeno que produce la formación de metahemoglobina inactiva.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIG. 1 es un diagrama de circulación de la vista general de un proceso de la presente invención.

La FIG. 2 es una vista esquemática de un aparato de citólisis instantánea utilizado en el proceso de la presente invención.

Las FIGS. 3(a) y 3(b) muestran un análisis cromatográfico líquido de alta eficacia para la hemoglobina tetrámera reticulada no tratada con calor FIG. 3(a), y hemoglobina tetramera reticulada estable al calor sometida a un tratamiento con calor a 90°C durante 45 segundos hasta 2 minutos o a 80°C durante 30 minutos FIG. 3(b).

La FIG. 4 es un perfil de elución de una columna cromatográfica de flujo continuo; en que la solución de hemoglobina se encuentra en la fracción de flujo continuo.

La FIG. 5 es una vista esquemática de un sistema de columna cromatográfica CM de flujo continuo con ultrafiltración para una operación industrial a gran escala.

La FIG. 6 es una vista esquemática del aparato utilizado en el paso de tratamiento con calor HTST.

La FIG. 7 muestra el perfil de temperaturas del aparato HTST y el tiempo que demora eliminar los tetrámeros no estabilizados (dímeros) del sistema a 85°C y 90°C de acuerdo a la presente invención.

La FIG. 8 es una vista esquemática de una bolsa de infusión para la hemoglobina tetrámera reticulada estable al calor de acuerdo a la presente invención.

La FIG. 9 muestra el cromotograma HPLC de fase inversa de las cadenas globinas a y ß de hemoglobina bovina antes (línea de rayas) y después (línea continua) de la reacción con DBSF en un ambiente desoxigenado.

Las FIGS. 10(A) y 10(B) muestran un análisis de 15% SDS-PAGE de hemoglobina bovina nativa FIG. 10(A) y hemoglobina reticulada con DBSF en condición desoxigenada FIG. 10(B).

La FIG. 11 nuestra la huella de la masa peptídica de los péptidos digeridos por la tripsina de la banda de proteína dímera (B6) generada por el análisis MALDI-TOF.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La hemoglobina es una proteína transportadora de oxígeno que contiene hierro y está contenida en los glóbulos rojos de los mamíferos y otros animales. La hemoglobina tiene las características de las estructuras terciarias y cuaternarias de las proteínas. La mayoría de los aminoácidos de la hemoglobina forman hélices alfa conectadas por segmentos cortos no helicoidales. Los enlaces de hidrógeno estabilizan las secciones helicoidales al interior de la hemoglobina, debido a lo cual las atracciones dentro de la molécula pliegan cada cadena de polipéptidos en una forma específica. Una molécula de hemoglobina está formada por cuatro subunidades de proteína globular. Cada subunidad está compuesta por una cadena de polipéptidos dispuestos en un conjunto de segmentos estructurales con hélices a conectadas en una disposición de "pliegue de mioglobina" que incorpora un grupo heme.

El grupo heme consiste en un átomo de hierro sostenido en un anillo heterocíclico, conocido como porfirina. El átomo de hierro se enlaza idénticamente con los cuatro átomos de nitrógeno en el centro del anillo que yace en un plano, con lo cual el oxígeno se puede enlazar con el centro del hierro perpendicular al plano del anillo de porfirina. De esta forma una sola molécula de hemoglobina tiene la capacidad de combinarse con cuatro moléculas de oxígeno.

En los mamíferos, el tipo más común de hemoglobina es el tetrámero; en los humanos se denomina hemoglobina A y consiste de dos subunidades a y dos ß en un enlace no covalente denominado a2ß2, cada una de las cuales tiene 141 y 146 residuos aminoácidos respectivamente. El tamaño y la estructura de las subunidades y ß son muy similares entre sí. Cada subunidad tiene un peso molecular de aproximadamente 16 kDa para un peso molecular total del tetrámero de aproximadamente 65 kDa. Las cuatro cadenas de polipéptidos están enlazadas entre sí por medio de puentes salinos, enlaces de hidrógeno e interacción hidrófoba. La estructura de la hemoglobina bovina es similar a la de la hemoglobina humana (90.14% de igualdad en la cadena a; 84.35% de igualdad en la cadena ß). La diferencia son los dos grupos sulfhidrilo de la hemoglobina bovina posicionados en ß Cys 93, en tanto que los sulfhidrilos de la hemoglobina humana están posicionados en a Cys 104, ß Cys 93 y ß Cys 112 respectivamente. Si se comparan sus secuencias aminoácidas, la hemoglobina humana que se produce en forma nativa al interior de los glóbulos rojos comparte grandes similitudes con la hemoglobina bovina, canina, porcina y equina. La asociación de una cadena a con la correspondiente cadena ß es muy intensa y no se disocia bajo condiciones fisiológicas. Sin embargo, la asociación de un dímero aß con otro dímero aß es bastante débil al exterior de los glóbulos rojos. El enlace presenta una tendencia a separarse en dímeros aß cada uno de aproximadamente 32 kDa. Estos dímeros indeseados son suficientemente pequeños para ser filtrados por los ríñones y ser excretados, lo que produce un potencial daño renal y una sustancial disminución del tiempo de retención intravascular.

Debido a esto, es necesario estabilizar la eficacia y seguridad de cualquier hemoglobina utilizada fuera de los glóbulos rojos. El proceso para producir la hemoglobina estabilizada se especifica más adelante; una visión general del proceso de la presente invención es presentada en el diagrama de circulación de la FIG. 1.

Inicialmente se selecciona una fuente de sangre entera como fuente de hemoglobina a partir de glóbulos rojos. Se selecciona sangre entera de mamíferos incluyendo, sin limitar, sangre entera humana, bovina, porcina, equina y canina. Los glóbulos rojos son separados del plasma, filtrados y lavados para eliminar las impurezas de las proteínas del plasma.

A objeto de separar la hemoglobina de los glóbulos rojos, la membrana celular es lisada. Aunque para lisar la membrana los glóbulos rojos se pueden utilizar diferentes técnicas, la presente invención utiliza una lisis bajo condiciones hipotónicas, en una forma que puede ser controlada con precisión en volúmenes adecuados para una producción a escala industrial. Con este fin, para lisar los glóbulos rojos se utiliza el aparato de citólisis instantánea mostrado en la FIG. 2. La lisis hipotónica crea una solución de lisado que incluye hemoglobina y un retenido desechable. Para lograr una producción a escala industrial, la lisis se controla cuidadosamente de modo que se lisen solamente glóbulos rojos y no se lisen glóbulos blancos u otras células. De acuerdo con una aplicación, el tamaño del aparato para citólisis instantánea es seleccionado de modo que los glóbulos rojos atraviesen el aparato en 2 a 30 segundos o el tiempo que sea necesario para lisar los glóbulos rojos, preferiblemente 30 segundos. El aparato de citólisis instantánea incluye una mezcladora estática. Como solución hipotónica se utiliza agua desionizada y destilada. Queda entendido que si se utilizan otras soluciones hipotónicas con diferentes concentraciones salinas se requieren períodos de tiempo diferentes para lisar los glóbulos rojos. Debido a que el procedimiento de lisis controlada lisa solamente los glóbulos rojos y no los glóbulos blancos ni el material celular, minimiza la liberación de proteínas tóxicas, fosfolípidos o ADN de los glóbulos blancos y otros materiales celulares.

De inmediato, después de 30 segundos, se agrega una solución hipertónica, es decir, después que la solución que contiene los glóbulos rojos atraviesa la sección de la mezcladora estática del aparato de citólisis instantánea. La hemoglobina resultante tiene una mayor pureza y un menor nivel de contaminantes, por ej. ADN indeseado y fosfolípidos que la hemoglobina resultante del uso de otras técnicas de lisis. No se detectan ácidos nucleicos indeseados de los glóbulos blancos o impurezas de fosfolípidos en la solución de hemoglobina por reacción de la cadena de polimerasa (límite de detección = 64 P9) Y Por e' rnétodo de cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC, límite de detección = 1 g/ml) respectivamente.

En esta etapa del proceso, la solución de hemoglobina es purificada para eliminar diversas proteínas y otras impurezas. Esta purificación puede ser a base de ultrafiltración, a base de cromatografía o con una combinación de uno o más procesos de ultrafiltración y/o cromatogragía. De acuerdo con un ejemplo de aplicación se realizan dos procesos: uno que elimina las impurezas con pesos moleculares superiores a la hemoglobina antes de la cromatografía en la columna de flujo continuo, y otro que elimina las impurezas con pesos moleculares inferiores a la hemoglobina después de la cromatografía en la columna de flujo continuo. Este último proceso de ultrafiltración concentra la hemoglobina. De acuerdo con algunas aplicaciones, se utiliza un filtro de 100 kDa para la primera ultrafiltración, en tanto que para la segunda ultrafiltración se utiliza un filtro de 30 kDa.

La cromatografía en columna de flujo continuo se utiliza para eliminar las impurezas de proteínas en la solución de hemoglobina purificada, por ej. inmunoglobulina-G, albúmina y anhidrasa carbónica. En algunas aplicaciones, la cromatografía de columna se efectúa utilizando una columna o una combinación de columnas de intercambio de iones de tipo comercial, por ejemplo la columna DEAE, la columna CM, la columna hidroxiapatita, etc. El pH para la cromatografía de columna es normalmente entre 6 y 8.5. En una aplicación se utiliza un paso con una columna cromatográfica CM de flujo continuo para eliminar impurezas de proteínas con un pH 8.0. Se realiza un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y un método HPLC para detectar las impurezas de las proteínas y fosfolípidos que permanecen en la muestra después de la elución de la cromatografía de columna. Esta exclusiva separación por columna cromatográfica de flujo continuo permite aplicar un programa de separación continua para producción a escala industrial. El resultado del ensayo ELISA demuestra que la cantidad de impurezas es sustancialmente baja en la hemoglobina eluida (inmunoglobulina-G: 44.3 ng/ml; albúmina: 20.37 ng/ml; anhidrasa carbónica: 81.2 pg/ml). Los resultados de la eliminación de impurezas de proteína realizada utilizando diferentes tipos de columnas con diferentes valores pH se muestra en la Tabla 1 siguiente.

Tabla 1 Porcentaje de eliminación (%) Columna (condición pH) Anhidrasa carbónica Albúmina Inmunoglobulina-G DEAE (con pH 7.5) — 68 29.8 DEAE (con pH 7.8) — 60 50.9 CM (con pH 6.2) — 32 21.8 CM (con pH 8.0) 5.6 53.2 66.4 Hidroxiapatita (con pH 7.5) 4.5 23.5 22.8 Continuando con el proceso de cromatografía de columna, la hemoglobina es sometida a reticulación por DBSF. Las condiciones se seleccionan de modo que se favorezca la reticulación que ocurre entre las unidades beta-beta y que el producto resultante tenga una reticulación beta-beta superior a 50%. En reticulaciones bajo condiciones desoxigenadas, la hemoglobina resultante tiene baja afinidad con el oxígeno en un valor p50 más alto comparado con la hemoglobina nativa de la misma especie medida en condiciones sustancialmente similares. Por ejemplo, en el caso de hemoglobina bovina, la hemoglobina bovina nativa tiene un valor p50 del orden de 23-29 mm Hg. La hemoglobina bovina reticulada formada bajo condiciones desoxigenadas de la presente invención tiene un valor p50 del orden de 38-50 mm Hg. Una menor afinidad con el oxígeno significa que el tetrámero puede "descargar" oxígeno en un objetivo con mayor facilidad que un material que tiene mayor afinidad con el oxígeno. Para efectuar la reticulación de hemoglobina bovina bajo condiciones oxigenadas, se forma un material que tiene mayor afinidad con el oxígeno con un menor valor p50, menos de aproximadamente 23 mm Hg, comparado con la hemoglobina bovina nativa que tiene un valor p50 del orden de 23-29 mm Hg. Cuando se desea una rápida oxigenación se utilizan composiciones que tienen menor afinidad con el oxígeno, como en los casos de hipoxia de tejidos como resultado de una gran pérdida de sangre (por ej. shock hemorrágico).Las composiciones que tienen mayor afinidad con el oxígeno se utilizan en terapias de oxigenación accesoria en tratamientos de cáncer, cuando es deseable que la administración de oxígeno sea más lenta.

En la hemoglobina humana, la reticulación bajo condiciones desoxigenadas produce normalmente mayor cantidad de hemoglobina reticulada alfa-alfa con baja afinidad con el oxígeno, es decir, una afinidad con el oxígeno que disminuye en el orden de al menos el doble de la hemoglobina humana nativa. La reticulación bajo condiciones oxigenadas tiende a favorecer la producción de hemoglobina reticulada beta-beta que tiene mayor afinidad con el oxígeno (es decir, un p50 más bajo, menos de aproximadamente 23 mm Hg), comparada con la hemoglobina humana nativa bajo la misma condición (un valor p50 del orden de aproximadamente 23-30 mm Hg).

Para una condición de reticulación desoxigenada, preferiblemente con un nivel de oxígeno disuelto inferior a 0.1 ppm, se mantiene una relación molar de hemoglobina a DBDF entre 1 :2.5 y 1 :4.0 durante un período de 3 a 16 horas a temperatura ambiente (15 - 25°C), con un pH de aproximadamente 8 - 10, preferiblemente alrededor de pH 8.6 - 9.2. La hemoglobina reticulada resultante es hemoglobina tetrámera con un peso molecular de 60-70 kDa, lo que demuestra que no hay presencia de hemoglobina polimérica. El rendimiento de la reacción DBSF es elevado, 99% y la concentración de dímeros en el producto final es baja. Opcionalmente, el presente proceso no requiere reactivos de tratamiento sulfhidrilo, como yodoacetamida, para que reaccione con la hemoglobina antes de efectuar la reticulación, como sucede en varios procesos de la técnica anterior. Para efectuar la reticulación en condiciones oxigenadas, se utiliza un ambiente oxigenado (por ej. aire, pÜ2 con alrededor de 149 mm Hg; o 02 puro, el p02 tiene aproximadamente 760 mm Hg), en tanto que las demás condiciones antes indicadas permanecen sustancialmente iguales.

En la hemoglobina bovina, la reticulación beta-beta es superior a 50% y preferiblemente superior a 60% para reticular bajo condiciones desoxigenadas (nivel de oxígeno disuelto inferior a 0.1 ppm). En la hemoglobina bovina reticulada bajo condiciones oxigenadas, también se favorece la reticulación beta-beta, una reticulación beta-beta a un nivel generalmente superior de 40%.

En la hemoglobina humana, la reticulación bajo condiciones oxigenadas favorece la reticulación beta-beta.

A continuación de la reticulación, se efectúa el intercambio de la solución salina tamponada con fosfato (PBS) que es un tampón fisiológico, por la solución de reticulación y se elimina cualquier residuo químico por medio de filtración por flujo tangencial.

Después de la reticulación, la presente invención contempla el paso del tratamiento de la solución de hemoglobina tetrámera reticulada con calor (Alta Temperatura por Corto Tiempo, HTST). El tratamiento con calor tiene lugar en un ambiente desoxigenado. Antes del tratamiento con calor se le agrega opcionalmente N-acetil cisteína para evitar la formación de metahemoglobina (hemoglobina inactiva). A continuación del paso del tratamiento con calor, la solución es enfriada y opcionalmente se le agrega N-acetil cisteína para mantener un bajo nivel de metahemoglobina. Si se agrega N-acetil cisteína antes y después del tratamiento con calor, la cantidad agregada antes del tratamiento es aproximadamente 0.2%, en tanto que la cantidad agregada después del tratamiento es aproximadamente 0.025% hasta 0.4%. Sin embargo, si solamente se agrega N-acetil cisteína después del tratamiento con calor, la cantidad agregada deberá ser desde 0.025% hasta 0.4%. En una aplicación, la cantidad de N-acetil cisteína agregada después del tratamiento con calor es 0.2%-0.4%. En otra aplicación, la cantidad de N-acetil cisteína agregada después del tratamiento con calor es 0.025%-0.2%.

En algunas aplicaciones, la solución de hemoglobina tetrámera reticulada es calentada en un ambiente desoxigenado (con un nivel de oxígeno disuelto inferior a 0.1 ppm) dentro de un margen de temperaturas entre 50°C y 95°C y durante periodos de tiempo entre 0.5 minutos y 10 horas. En algunas aplicaciones la solución de hemoglobina tetrámera reticulada es calentada dentro de un margen de temperaturas entre 70°C y 95°C durante 30 segundos a 3 horas. En algunas aplicaciones preferidas, la solución de hemoglobina tetrámera reticulada es calentada a 80°C durante 30 minutos. De acuerdo con otra aplicación preferida, la solución de hemoglobina reticulada es calentada a 90°C durante 30 segundos hasta 3 minutos, a continuación es enfriada rápidamente hasta aproximadamente 25°C en aproximadamente 15 a 30 segundos, y opcionalmente se le agrega N-acetil cisteína en la forma antes descrita.

A objeto de analizar el resultado del paso del calentamiento HTST, se utiliza un método analítico HPLC para detectar la cantidad de dímeros después del paso de tratamiento con calor. La fase móvil para efectuar el análisis HPLC contiene cloruro de magnesio (0.75M) que puede separar dímeros (tetrámeros no estabilizados) y hemoglobina tetrámera reticulada estable al calor. Para promover la disociación de la hemoglobina en dímeros, el cloruro de magnesio es aproximadamente 30 veces más efectivo que el cloruro de sodio con la misma fuerza iónica. El paso del tratamiento con calor actúa además como paso de desnaturalización a fin de eliminar drásticamente las impurezas de las proteínas de la hemoglobina tetrámera reticulada (no detectables en la inmunoglobulina-G; 96.15% disminución de albúmina; 99.99% disminución de anhidrasa carbónica). Se efectúa el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) para detectar las impurezas de proteínas contenidas en la muestra. De esta forma, la solución de hemoglobina purificada, reticulada, tetrámera, estable al calor contiene un nivel indetectable de dimeros (bajo el límite de detección: 0.043%), e inmunoglobulina-G, y una muy baja cantidad de albúmina (0.02 pg/ml) y anhidrasa carbónica (0.014 pg/ml). Las FIGS. 3(a) y 3(b) demuestran que la forma dímera de la hemoglobina es indetectable en el sistema HPLC. La Tabla 2 muestra los resultados experimentales relativos a la eliminación de impurezas de proteínas y dimeros por medio del paso del tratamiento con calor HTST. Este paso de tratamiento con calor HTST permite efectuar una separación selectiva de los tetrámeros reticulados estables al calor de los tetrámeros inestables (por ej. tetrámeros no reticulados) y dimeros.

Tabla 2 Inmuno- Albúmina Anhidrasa Tetrámero Dímero globuiina-G (µ?/?t??) carbónica (%) (%) (pg/ml) ( g ml) Sin tratamiento 0.36 0.57 355.41 90.1 5.4 con calor 80°C por 10 min No detectable 0.33 0.032 92.7 3.4 80°C por 15 min No detectable 0.14 0.022 93.3 2.9 80°C por 30 min No detectable 0.03 0.014 96.6 No detectable Sin tratamiento 0.29 0.52 261.80 91.8 5.3 con calor 90°C por 1.0 min No detectable 0.21 >0.063 93.4 2.0 90°C por 1.5 min No detectable 0.04 0.022 94.9 0.6 90°C por 2.0 min No detectable 0.02 0.016 96.1 No detectable A continuación del paso del tratamiento de la hemoglobina reticulada con calor bajo una condición desoxigenada, la hemoglobina tetrámera reticulada estable al calor está lista para ser utilizada en formulaciones farmacéuticas y para ser envasada. La presente invención describe un paso de envasado hermético de la solución de hemoglobina tetrámera reticulada estable al calor en un ambiente desoxigenado. La hemoglobina tetrámera reticulada estable al calor de acuerdo a la presente invención es estable cuando se mantiene en una condición desoxigenada durante más de dos años.

De acuerdo con esta invención, el portador de oxígeno que contiene una composición farmacéutica es aplicado principalmente en inyecciones intravenosas. Tradicionalmente, los productos de acuerdo a la técnica anterior utilizan bolsas para sangre de PVC o Stericon, que tienen una alta permeabilidad al oxígeno, lo que acorta la vida útil del producto puesto que lo transforman rápidamente en metahemoglobina inactiva (dentro de pocos días) bajo condiciones oxigenadas.

El envase utilizado en la presente invención permite que la hemoglobina tetrámera reticulada estable al calor permanezca estable durante más de dos años. Se utiliza un envase multicapas de material EVA/EVOH para minimizar la permeabilidad del gas y para evitar la formación de metahemoglobina inactiva. Una bolsa de infusión de 100 mi diseñada para ser utilizada con la hemoglobina tetrámera reticulada estable al calor de la presente invención se fabrica con cinco capas de material EVA/EVOH laminado con un espesor de 0.4 mm, que tiene una permeabilidad al oxígeno de 0.006-0.132 cm3 por 100 pulgadas cuadradas (645.16 cm2) durante 24 horas en una atmósfera a temperatura ambiente. Este material es un plástico Clase VI (según definición en USP<88>), cumple con los Ensayos de Reactividad Biológica in vivo y con el Test Físico-Químico y es apropiado para fabricar una bolsa de infusión para inyecciones intravenosas. Esta primera bolsa es especialmente útil para proteger la solución de hemoglobina tetrámera reticulada estable al calor contra exposiciones prolongadas al oxígeno que causan su inestabilidad y finalmente afectan sus propiedades terapéuticas.

Para la protección secundaria de los productos de sangre, se han utilizado envolturas de aluminio para proteger contra posibles filtraciones de aire y para mantener el producto en un estado desoxigenado. Sin embargo existe la posibilidad que el aluminio sufra pinchaduras que comprometan su hermeticidad y provoquen la inestabilidad del producto. Por lo tanto, la presente invención utiliza como envase secundario una bolsa de aluminio que impide la oxigenación y evita la exposición a la luz. La composición de esta bolsa para cubrir incluye 0.012mm de tereftalato de polietileno (PET), 0.007mm de aluminio (Al), 0.015mm of nilón (NY) y 0.1 mm of polietileno (PE). La película envolvente tiene un espesor de 0.14mm y una velocidad de transmisión de oxígeno de 0.006 cm3 por 100 pulgadas cuadradas (645.16 cm2) durante 24 horas en una atmósfera a temperatura ambiente. Este segundo envase aumenta el período de estabilidad de la hemoglobina, prolongando la vida útil del producto.

El proceso de esta invención es aplicable a una producción industrial en gran escala de hemoglobina tetrámera reticulada estable al calor. Además, la hemoglobina tetrámera reticulada estable al calor en combinación con un portador farmacéutico (por ej. agua, tampón fisiológico, en forma de cápsulas) es apropiado para el uso en mamíferos.

El portador de oxígeno que contiene la composición farmacéutica de la presente invención es útil para mejorar la oxigenación de los tejidos, en el tratamiento del cáncer, en el tratamiento de desórdenes causados por privación de oxígeno, por ejemplo shocks hemorrágicos, y en la conservación del corazón en un ambiente de bajo contenido de oxígeno (por ej. trasplante de corazón). En los ejemplos de aplicaciones, las dosificaciones se seleccionan de modo que tengan una concentración de aproximadamente 0.2-1.3 g/kg con una velocidad de infusión inferior a 10 ml/hora/peso corporal.

Cuando se utiliza en el tratamiento de desórdenes por privación de oxígeno y para la conservación del corazón, el portador de oxígeno que contiene la composición farmacéutica con menor afinidad con el oxígeno de la presente invención, se utiliza como sustituto de la sangre para proporcionar oxígeno a un órgano objetivo. La hemoglobina reticulada con menor afinidad con el oxígeno se utiliza para aplicaciones que requieren una rápida oxigenación del tejido (por ej. shock hemorrágico y conservación de órganos ex vivo).

En aplicaciones de tratamientos de cáncer, el portador de oxígeno que contiene la composición farmacéutica con mayor afinidad con el oxígeno de la presente invención se utiliza como agente de oxigenación de tejidos tumorales, incrementando de esta forma la sensibilidad a la quimioterapia y a la radiación. Una hemoglobina con mayor afinidad con el oxígeno es útil para aplicaciones que requieren menor velocidad de oxigenación (por ej. terapias relacionadas con cáncer).

Ejemplos Los siguientes ejemplos tienen por objeto describir aplicaciones específicas de esta invención, y su intención no es limitar el alcance de esta invención en forma alguna.

Ejemplo 1 Visión general del proceso En la FIG. 1 se muestra un diagrama de flujo esquemático del proceso de la presente invención. Se coloca sangre bovina entera en un recipiente/bolsa cerrada esterilizada que contiene 3.8% (peso/volumen) de solución de citrato de sodio como anticoagulante. De inmediato se mezclan muy bien la sangre y la solución de citrato para impedir la formación de coágulos. Se aislan los glóbulos rojos (RBC) y se recolectan desde el plasma y otros glóbulos de sangre más pequeños por medio de un mecanismo de aféresis. Para este procedimiento se utiliza una "lavadora de glóbulos" en un contenedor centrífugo desechable esterilizado con rayos gama. Los RBC son lavados con un volumen equivalente de 0.9% de sustancia salina (cloruro de sodio p/v).

Los glóbulos rojos lavados son lisados para liberar el contenido de hemoglobina aplicando un choque hipotónico a las membranas de los glóbulos rojos. Para este propósito se utiliza un aparato especializado de citólisis instantánea para lisis de los glóbulos rojos mostrado en la FIG. 2. A continuación de la lisis de los glóbulos rojos, las moléculas de hemoglobina son aisladas de otras proteínas por infiltración con flujo tangencial utilizando una membrana de 100 kDa. Se recolecta la hemoglobina del filtrado para efectuar la cromatografía en la columna de flujo directo y a continuación se concentra hasta 12-14 f/dL por medio de una membrana de 30 kDa. La cromatografía de columna tiene por objeto eliminar las impurezas de las proteínas.

La solución concentrada de hemoglobina se hace reaccionar primeramente con DBSF para formar moléculas de hemoglobina tetrámera reticulada estable al calor. Luego se realiza el paso de tratamiento con calor en condición desoxigenada a 90°C durante 30 segundos hasta 3 minutos antes de efectuar la formulación y el envasado final.

Ejemplo 2 Tiempo y lisis hipotónica y filtración controlada Se recolecta sangre bovina fresca entera y se transporta en condición de frío (2 a 10°C). Los glóbulos rojos son separados del plasma por medio de una lavadora de glóbulos y posteriormente con una filtración de 0.65 pm. Después de lavar el filtrado de glóbulos rojos con 0.9% de sustancia salina, este es sometido a la ruptura celular por medio de lisis hipotónica. La lisis hipotónica se realiza con el aparato de citólisis instantánea que se muestra en la FIG. 2. El aparato de citólisis instantánea incluye una mezcladora estática que contribuye a la lisis de las células. La suspensión de glóbulos rojos con una concentración de hemoglobina controlada (12-14g/dl) es mezclada con 4 volúmenes de agua purificada para generar un choque hipotónico a las membranas de los glóbulos rojos. El período del choque hipotónico es controlado para evitar una lisis indeseada de glóbulos blancos o plaquetas. La solución hipotónica pasa a través de la mezcladora estática del aparato de citólisis instantánea durante 2 a 30 segundos, o el tiempo suficiente para producir la lisis de los glóbulos rojos, preferiblemente, 30 segundos. El choque finaliza después de 30 segundos y el lisado se mezcla con 1/10 del volumen de tampón hipotónico de lisis cuando sale de la mezcladora estática. La solución hipotónica utilizada es 0.1M tampón de fosfato, 7.4% NaCI, pH 7.4. El aparato de citólisis instantánea de la FIG. 2 puede procesar 50 a 1000 litros de lisado por hora y, preferiblemente al menos 300 litros por hora en forma continuada.

Después de efectuar la lisis de los glóbulos rojos, el lisado de células de glóbulos rojos es filtrado en un filtro de 0.22 pm para obtener una solución de hemoglobina. No se detectan ácidos nucleicos de glóbulos blancos ni impurezas de fosfolípidos en la solución de hemoglobina con los métodos de reacción de cadena de polimerasa (límite de detección = 64 pg) y HPLC (límite de detección = 1 pg/ml), respectivamente. Se realiza una primera ultrafiltración de 100 kDa para eliminar las impurezas que tienen un peso molecular más alto que la hemoglobina. A continuación se realiza una cromatografía en una columna de flujo directo para purificar aún más la solución de hemoglobina. Se realiza una segunda ultrafiltración con 30 kDa para eliminar las impurezas que tienen un peso molecular más bajo que la hemoglobina y para concentrarla.

Ejemplo 3 Estudio de eliminación de virus en solución de hemoglobina libre de estromas A objeto de demostrar la seguridad del producto de la invención, se efectuó un estudio de inactividad viral que demuestra la capacidad de eliminación de los virus con (1) un paso de diafiltración con 0.65 µ?? y un paso de ultrafiltración con 100 kDa. Esto se realiza inoculando deliberadamente una versión a menor escala de estos dos procesos con diferentes modelos de virus (virus de encefalomiocarditis, virus de seudohidrofobia, virus de diarrea bovina viral y parvovirus bovino). En este estudio se utilizan cuatro tipos de virus (ver Tabla 3). Estos virus tienen diferentes características biofísicas y estructurales y presentan diferentes resistencias a los agentes o tratamientos físicos y químicos.

Tabla 3 El esquema de validación se muestra en forma concisa siguiente Tabla 4.

Tabla 4 Diafiltración Ultrafiltración Lavado de glóbulos Inoculación de glóbulos i i Inoculación de glóbulos Ultrafiltración i i Diafiltración Test de virus i Tests de virus El resumen de los resultados de la reducción logarítmica de los 4 virus en la (1) diafiltración de 0.65 µ?? y en la (2) ultrafiltración de 100 kDa se muestra en la siguiente Tabla 5. Los cuatro virus, BVDV, BPV, EMCV y PRV son efectivamente eliminados por la diafiltración de 0.65 µ?? y la ultrafiltración 100 kDa.

Tabla 5 Observación: > no se determinó la capacidad de infección residual.

Ejemplo 4 Cromatografía por columna de flujo continuo Se utiliza una columna CM (distribuida por GE Healthcare) para eliminar cualquier impureza de proteínas. El tampón inicial es 20mM de acetato de sodio (pH 8.0) y el tampón de elución es 20mM acetato de sodio, 2M NaCI (pH 8.8). Después de equilibrar la columna CM con el tampón inicial, se coloca la muestra de proteína en la columna. Las impurezas de proteína no enlazadas son lavadas con al menos 5 veces el volumen de la columna de tampón inicial. La elución se realiza utilizando 25% de tampón de elución (0-05M NaCI) en 8 veces el volumen de la columna. El perfil de la elución se muestra en la FIG. 4; la solución de hemoglobina se encuentra en la fracción no retenida. La pureza de la fracción no retenida es analizada por medio de ELISA. Los resultados se indican en la siguiente Tabla 6.

Tabla 6 Impurezas de Proteínas Anhidrasa Imunoglobulina-G Albúmina carbónica Antes de columna 1320 ng/ml 860.3 pg/ml 435.2 ng/ml CM Flujo continuo 44.3 ng/ml 81.2 pg/ml 20.4 ng/ml (con hemoglobina) Debido a que la solución de hemoglobina se encuentra en el flujo continuo de la cromatografía de columna CM con un pH 8 (no en el efluente), constituye un método adecuado para una operación a escala industrial. La primera instalación de ultrafiltración está conectada directamente con el flujo continuo del sistema de cromatografía de columna CM, y las tuberías de flujo continuo pueden ser conectadas con la segunda instalación de ultrafiltración para operaciones a escala industrial. La configuración esquemática del proceso industrial se muestra en al FIG. 5.

Ejemplo 5 Preparación de la hemoglobina tetrámera reticulada estable al calor (5a) Reacción de reticulación con DBSF bajo condición desoxigenada La reacción de reticulación se realiza en condición desoxigenada, es decir, con un nivel inferior a 0.1 ppm de oxígeno disuelto. Se agrega DBSF a la solución de hemoglobina para obtener hemoglobina tetrámera reticulada sin formación de hemoglobina polimérica. El procedimiento e3 estabilización con DBSF estabiliza la forma tetrámera de la hemoglobina (65 kDa) que es excretada a través de los ríñones. De acuerdo con esta aplicación, se utiliza una relación molar de hemoglobina a DBSF de 1 :2.5 y el pH es 8.6. El proceso se realiza durante 3-16 horas a temperatura ambiente (15-25°C) en una atmósfera inerte de nitrógeno para evitar la oxidación de la hemoglobina y formación metahemoglobina férrica que es fisiológicamente inactiva (el nivel de oxígeno disuelto se mantiene en menos de 0.1 ppm). La terminación de la reacción de DBSF es monitoreada midiendo el DBSF residual con el uso de HPLC. El rendimiento de la reacción de DBSF es elevado, >99%. La producción de reticulaciones beta-beta es del orden de al menos alrededor de 40%. (5b) Paso de tratamiento de HTST con calor En la FIG. 6 se muestra un aparato de tratamiento con Alta Temperatura por Poco Tiempo (HTST). La hemoglobina tetrámera reticulada es sometida al paso de tratamiento con calor utilizando el aparato HTST. En este ejemplo, la condición para el tratamiento con calor es 90°C durante 30 segundos hasta 3 minutos, y preferiblemente 45 a 60 segundos, a pesar que se pueden elegir otras condiciones como se señala anteriormente, modificando el aparato en la forma correspondiente. Una solución que contiene hemoglobina reticulada con el agregado opcional de 0.2% N-acetil cisteína, es bombeada dentro del aparato de tratamiento HTST (la primera sección del intercambiador de calor HTST es precalentado y mantenido a 90°C) a una velocidad de circulación de 1.0 litros por minuto, el tiempo de residencia en la primera sección del aparato es entre 45 y 60 segundos, luego se hace pasar la solución a la misma velocidad de circulación hacia otra sección del intercambiador de calor que es mantenido a 25°C. El tiempo requerido para enfriar es entre 15 y 30 segundos. Después de enfriar hasta 25°C, se agrega de inmediato N-acetil sisteína en una concentración de 0.2% a 0.4%. La instalación del aaprato de tratamiento con calor es fácilmente controlada para una operación industrial. Un perfil de temperatura con contenido de dímeros se muestra en la FIG. 7. Si la hemoglobina no es reticulada, no es estable al calor y forma un precipitado después del paso de tratamiento con calor. El precipitado debe ser eliminado por centrifugación o filtración para obtener una solución clara.

La siguiente Tabla 7 muestra cómo se eliminan las impurezas indeseables de proteína, tales como inmunoglobulina-G, albúmina, anhidrasa carbónica y tetrámeros o dimeros no estabilizados después del paso de tratamiento con calor. La cantidad de inmunoglobulina-G, albúmina y anhiderasa carbónica se mide utilizando un método ELISA, en tanto que la cantidad de dimeros es determinada con un método HPLC. La pureza de la hemoglobina tetrámera reticulada estable al calor es extremadamente elevada después del paso HTST der tratamiento con calor, en el orden de 98.0 hasta 100%.

Tabla 7 Impurezas de las proteínas (con ELISA) Con HPLC Condición de la Imunoglobulina-G Albúmina Anhidrasa Tetrámeros Dimeros muestra (Mg ml) (M9/ml) carbónica (%) (%) ( Q/ml) Sin tratamiento con 0.29 0.52 261.80 91.8 5.3 calor 90°C por 2min No detectable 0.02 0.016 96.1 No detectable (%) eliminación 100.0 96.15 99.99 100.0 Segunda parte (5c) Prevención de formación de metahemoglobina con la adición de 0.025-0.2% NAC A continuación del tratamiento con calor y Al enfriamiento, se agrega de inmediato N-acetil cisteína (NAC) a la hemoglobina tetrámera reticulada en una concentración de aproximadamente 0.025-0.2% para impedir la formación de meta hemoglobina. A diferentes intervalos de tiempo, se mide el porcentaje de metahemoglobina con un método de co-oximetría. La Table 8 muestra el porcentaje de metahemoglobina en la hemoglobina tetrámera reticulada después de agregar NAC en un período de 5 meses. Como se muestra en la Tabla 8, el nivel de metahemoglobina en la hemoglobina tetrámera reticulada se mantiene constante y muy baja después de la adición de NAC, dentro de 1.8 - 5.1%.

Tabla 8 Ejemplo 6 Envasado Debido a que el producto de la presente invención es estable bajo condiciones desoxigenadas, el envasado del producto es importante para minimizar la permeabilidad del gas. Para aplicaciones intravenosas, se utiliza una bolsa de infusión de 100 mi diseñada especialmente con cinco capas de material laminado EVA/EVOH de 0.4 mm de espesor, cuya permeabilidad al oxígeno es 0.006 hasta 0.132 cm3 por 100 pulgadas cuadradas (645.16 cm2) durante 24 horas en una atmósfera a temperatura ambiente. Este material especificado es un plástico Clase VI (según se define en USP<88), que cumple con las pruebas de reactividad biológica in vivo y las pruebas físico-químicas y es apropiado para fabricar contenedores para inyecciones intravenosas (también se pueden fabricar otras formas de envase con este material, dependiendo de la aplicación deseada). Además, la bolsa de infusión primaria se cubre con una funda secundaria de aluminio que proporciona una barrera adicional, minimizando la exposición a la luz y la difusión del oxígeno. Las capas de la funda comprenden: 0.012mm de tereftalato de polietileno (PET), 0.007mm de aluminio (Al), 0.015mm of nilón (NY) y 0.1 mm de polietileno (PE). La película de la funda tiene 0.1 mm de espesor y una velocidad de transmisión del oxígeno de 0.006 cm3 por 100 pulgadas cuadradas (645.16 cm2) durante 24 horas por atmósfera a temperatura ambiente. En la FIG. 8 se muestra una vista esquemática de la bolsa de infusión. La impermeabilidad general del oxígeno de cada bolsa de infusión de acuerdo con la presente invención es 0.0025 cm3 por 24 horas por atmósfera a temperatura ambiente.

Ejemplo 7 Caracterización de Hb reticulada bovina (condición reticulada desoxigenada) (7a) Separación de cadenas de globina por Cromatografía Líquida de Alta Eficacia de Fase Invertida (HPLC) Las cadenas de globina de la hemoglobina bovina nativa y las cadenas de globina reticulada de hemoglobina bovina reticulada DBSF se resuelven en una columna VYDAC C4 utilizando las gradientes desarrolladas por Shelton et al., 1984, con modificaciones menores. (7b) Análisis de hemoglobina bovina reticulada DBSF en electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) Se prepara hemoglobina bovina nativa y una solución de hemoglobina bovina reticulada DBSF mezclándolas con tampón reductor de muestra (62 mM Tris-HCI (pH 6.8), 10% (v/v) glicerol, 5% (v/v) mercaptoetanol y 2.3% (p/v) SDS), y se calienta hasta 95°C durante 10 min. La mezcla de muestra se resuelve utilizando 15% de gel plano de acrilamida con 4% de gel de apilamiento. La electroforesis se efectúa con una corriente constante de 60 mA. Después de la electroforesis, el gel SDS-PAGE es teñido con 0.1 % (p/v) Coomassie Blue R350, 20% (v/v) metanol y 10% (v/v) de ácido acético. Para estimar el porcentaje de los diferentes tipos de reticulación de la hemoglobina bovina reticulada en al hemoglobina bovina reticulada, se cuantifican las intensidades de las bandas de proteínas resueltas expresadas en Unidad de Luz Negra (BLU) utilizando software Lumi-Analyst 3.1. (7c) Digestión de tripsina en cadena de globina reducida.

La banda de proteína correspondiente a la principal cadena de globina reticulada es extraída del gel SDS-PAGE, es cortada en cubos (1 x 1 mm), y desteñida con 10% de metanol/ 10% de ácido acético. Los cubos de gel desteñidos son reducidos con 10 mM DTT en 25 mM NH4CO3 y alquilados con 55 mM idoacetamida en 25 mM NH4CO3 durante 45 min a obscuras, y a continuación son digeridos en gel con 20 ng/µ? de tripsina modificada en 25 mM NH4CO3 a 37°C durante la noche. Después de la digestión con tripsina, los péptidos digeridos con tripsina son extraídos por difusión en 50% (v/v) acetonitrilo (ACN) y 1 % (v/v) ácido trifluoroacético (TFA). (7d) Análisis de espectometría de masas (MS) con desorción por láser asistida por matriz/Ionización en Tiempo de Vuelo (MALDI-TOF) Los péptidos digeridos con tripsina extraídos de la banda de proteína son colocados sobre una placa Anchorchip, previamente cubierta con 1 µ? de solución matriz (2 mg/ml ácido ciano-4-hidroxicinamico, saturado en 50% ACN/ 0.1 % TFA, y secado al aire. Una vez seca, la muestra es lavada con 10 mM de tampón monofosfato y recristalizada utilizando una solución de etanol: acetona: 0.1% TFA (relación 6:3:1). Se realiza un análisis MALDI-TOF MS con un Bruker Autoflex III (Bruker Daltonic GmbH, Bremen, Alemania) operado en el modo reflectrón a lo largo del margen m/z de 800-3500 Da, fijando los siguientes parámetros: fuente de iones 25 kV para la huella peptídica (PMF), y reflector 26.3 kV para PMF. La calibración externa se realiza utilizando una Norma de Calibración Bruker Peptide Mix. Los puntos máximos que tienen una relación S/N sobre 4 son automáticamente etiquetados por el Flex-Analysis (Bruker Daltonic GmbH, Bremen, Alemania). Los datos MS fueron analizados nuevamente por medio de MASCOT 2.2.04 y software Biotools 2.1 (Bruker Daltonic GmbH, Bremen, Alemania), y estos datos fueron analizados comparándolos con proteínas de mamíferos en la base de datos no redundante NCBI (NCBInr). Para las investigaciones en la base de datos se utilizan los siguientes parámetros: exactitud de la masa monoisotópica <250 ppm, carga parental +1 , segmentaciones perdidas 1 , carbamidometilación de cisteína como modificación fija, oxidación de metionina como modificación variable. (7e) Análisis de Cromatografía líquida - ionización por electrospray (LC- ESI) espectometría de masa en tándem (MS/MS) Se realiza un análisis Nano-LC MS/MS de los péptidos digeridos con tripsina de la banda de proteína empleando un HPLC capilar acoplado directamente con la trampa de iones HCT Ultra ESI del espectómetro de masas (Bruker Daltonic GmbH, Bremen, Alemania). Las digestiones de péptidos se disuelven en 0.1 % ácido fórmico/2% ACN antes de inyectarlos en la columna. Se utiliza una gradiente desde 4-90% (0.001 % ácido fórmico y 0.001% ácido fórmico en 80% ACN) para la separación de péptidos utilizando una columna C18 ( 5 cm X 75 nm, LC PACKINGS). La velocidad de flujo es 250 ng/min a 25°C. Los eluidos de una columna C18 son introducidos en la trampa de iones HCT Ultra ESI del espectómetro de masas, operado en modo lineal para un análisis en línea. El espectómetro de masas con trampa de iones es optimizado con la nanofuente que tiene un voltaje de spray de 137V y una temperatura capilar de 160°C. El tiempo de acumulación de los iones de péptidos en la trampa de iones es fijada en 200 ms, y la relación masa a carga seleccionada para el análisis MS/MS es entre 100 y 1800 Dka con un estado de carga 1-3.

Para separar diferentes tipos de reticulaciones que tienen lugar entre las cadenas a y ß de la hemoglobina bovina reticulada DBSF se utiliza el HPLC de inversión de fases sobre una columna VYDAC C4, monitoreado con una longitud de onda de 220nm. Los modelos cromatográficos obtenidos con el uso de hemoglobina bovina antes y después de la reticulación con DBSF se muestran en la FIG. 9. En la FIG. 9, las cadenas a son más móviles que las cadenas ß de hemoglobina bovina nativa (como se muestra con la línea de trazos). Sus identidades son confirmadas por medio del análisis MALDI-TOF. Después de la reacción con DBSF, las cadenas ß son reticuladas, en tanto que una gran mayoría de las cadenas a se dejan solas (como se muestra con la línea continua). Como consecuencia de la reticulación con DBSF, se forman 6 valores máximos de globina con mayor hidrofobicidad que las cadenas ß nativas. Las cadenas de globina reticulada de la hemoglobina bovina reticulada con DBSF son resueltas además con 15% de SDS-PAGE, como se muestra en las FIGS. 10(A) y 10(B). La principal cadena de globina reticulada (B6 en la FIG. 10(B) es sometida a la digestión de la tripsina y a continuación al análisis MALDI-TOF, y se identifica solamente como cadena beta globina, en base a su huella péptida, como se muestra en la FIG. 11.

Aunque la anterior invención ha sido descrita con respecto a diferentes aplicaciones, dichas aplicaciones no son limitantes. Numerosas variaciones y modificaciones resultarán evidentes para los técnicos en la materia. Dichas variaciones y modificaciones se consideran incluidas en el alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (27)

REIVINDICACIONES

1. Un método para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno altamente purificado y estable al calor, cuya composición farmacéutica contiene un portador de oxígeno que incluye hemoglobina, en que la hemoglobina consiste esencialmente de hemoglobina reticulada no polimérica con una reticulación beta-beta superior a 40%, CARACTERIZADO porque dicho método comprende los pasos de: a). proporcionar sangre entera de un mamífero que incluye al menos glóbulos rojos y plasma; b). separar los glóbulos rojos del plasma de la sangre entera de mamífero; c) . filtrar los glóbulos rojos separados del plasma para obtener una fracción de glóbulos rojos filtrados; d) . lavar la fracción de glóbulos rojos filtrados para eliminar las impurezas de la proteína del plasma que se encuentran en los glóbulos rojos lavados; e) . provocar la ruptura celular de los glóbulos rojos lavados para crear una solución que comprende un lisado de glóbulos rojos; f) . efectuar una filtración para eliminar al menos una parte del material de desecho retenido en el lisado; g) . extraer una primera solución de hemoglobina desde el lisado; h) . realizar al menos un proceso de purificación para eliminar uno o más virus, desechos retenidos, o impurezas de proteínas; i). reticular la primera solución de hemoglobina en fumarato bis- 3,5-dibromosalicilo para formar hemoglobina reticulada en un ambiente oxigenado, cuya hemoglobina reticulada es hemoglobina tetrámera reticulada no polimérica con al menos 40% de reticulación beta-beta; j). eliminar cualquier producto químico residual; k). tratamiento de la hemoglobina reticulada con calor en un ambiente desoxigenado para desnaturalizar y precipitar cualquier contenido de hemoglobina residual no estabilizada/no reticulada, cualquier hemoglobina dímera y cualesquier otras impurezas de proteínas, de modo que la hemoglobina tetrámera reticulada estable al calor resultante tenga una concentración no detectable de dímeros y consista esencialmente de hemoglobina tetrámera reticulada no polimérica con una reticulación beta-beta de al menos 40% y una afinidad con el oxígeno superior a la afinidad con el oxígeno de la hemoglobina nativa de la misma especie medida bajo condiciones sustancialmente similares; I). eliminar precipitados por medio de una centrifugación o una filtración para obtener una solución clara; y m). agregar la hemoglobina tetrámera reticulada estable al calor a un portador farmacéuticamente aceptable.

2. El método para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno altamente purificado y estable al calor de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el paso del tratamiento con calor es un proceso con alta temperatura durante corto tiempo (HTST) realizado con aproximadamente 70°C a 95°C durante 30 segundos hasta 3 horas seguido de inmediato por un enfriamiento y agregado de N-acetil cisteína en cantidades de 0.2 a 0.4% inmediatamente después del enfriamiento.

3. El método para la preparación de un portador de oxígeno altamente purificado y estable al calor que contiene una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la sangre entera es sangre entera bovina y la reticulación beta-beta es superior a 50% y el valor p50 es inferior a aproximadamente 23 mm Hg.

4. El método para la preparación de un portador de oxígeno altamente purificado y estable al calor que contiene una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sangre entera es sangre entera bovina y la reticulación beta-beta es superior a 60% y el valor p50 es inferior a aproximadamente 23 mm Hg.

5. El método para la preparación de un portador de oxígeno altamente purificado y estable al calor que contiene una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la purificación se realiza utilizando cromatografía, cuya cromatografía incluye el uso de una o más columnas de intercambio de cationes o columnas de intercambio de aniones.

6. El método para la preparación de un portador de oxígeno altamente purificado y estable al calor que contiene una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la columna cromatográfica es una o más columnas DEAE, CM y/o con h id roxoa patita.

7. El método para la preparación de un portador de oxígeno altamente purificado y estable al calor que contiene una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la sangre entera es sangre humana.

8. El método para la preparación de un portador de oxígeno altamente purificado y estable al calor que contiene una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la sangre entera es sangre porcina, sangre equina, o sangre canina.

9. Un método para la preparación de un portador de oxígeno altamente purificado y estable al calor que contiene una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque además comprende el paso de envasar la solución de hemoglobina en un envase de baja permeabilidad al oxígeno, a objeto que la solución de hemoglobina tenga una vida útil del orden de dos años.

10. Una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno altamente purificado y estable al calor, caracterizada porque comprende hemoglobina, en que la hemoglobina consiste esencialmente de hemoglobina tetrámetra reticulada no polimérica con una reticulación beta-beta superior a 40% elaborada con el proceso de la reivindicación 1.

11. Una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno altamente purificado y estable al calor, caracterizada porque comprende hemoglobina, en que la hemoglobina consiste esencialmente de hemoglobina tetrámetra reticulada no polimérica con una reticulación beta-beta superior a 60% elaborada con el proceso de la reivindicación 4.

12. La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada para oxigenar tejidos, cuya composición es administrada ya sea in vivo o ex vivo.

13. La composición de conformidad con la reivindicación 11 caracterizada para oxigenar tejidos, dicha composición es administrada ya sea ¡n vivo o ex vivo.

14. Un método para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno altamente purificado y estable al calor, caracterizado porque la composición farmacéutica contiene un portador de oxígeno incluye hemoglobina, cuya hemoglobina consiste esencialmente de hemoglobina tetrámera reticulada no polimérica con una reticulación beta-beta superior a 50%, en donde el método comprende las etapas de: a) . proporcionar sangre entera de mamífero que incluye al menos glóbulos rojos y plasma; b) . separar los glóbulos rojos del plasma de la sangre entera de mamífero; c) . filtrar los glóbulos rojos separados del plasma para obtener una fracción de glóbulos rojos filtrados; d) . lavar la fracción de glóbulos rojos filtrados para eliminar las impurezas de la proteína del plasma y obtener glóbulos rojos lavados; e). provocar la ruptura de los glóbulos rojos lavados para crear una solución que comprende un lisado de glóbulos rojos; f) . efectuar una filtración para eliminar al menos una parte del material de desecho retenido en el lisado; g) . extraer una primera solución de hemoglobina desde el lisado; h). realizar al menos un proceso de purificación para eliminar uno o más virus, desechos retenidos, o impurezas de proteínas; i). reticular la primera solución de hemoglobina en fumarato bis-3,5-dibromosalicilo para obtener hemoglobina reticulada en un ambiente desoxigenado, cuya hemoglobina reticulada es hemoglobina tetrámera reticulada no polimérica con al menos 50% de reticulación beta-beta; j). eliminar cualquier producto químico residual; k). tratar la hemoglobina reticulada con calor en un ambiente desoxigenado para desnaturalizar y precipitar cualquier hemoglobina residual no estabilizada/no reticulada, cualquier hemoglobina dímera y cualesquier otras impurezas de proteínas, de modo que la hemoglobina tetrámera reticulada estable al calor resultante tenga una concentración no detectable de dímeros y consista esencialmente de hemoglobina tetrámera reticulada no polimérica con una reticulación beta-beta de al menos 50% y una afinidad con el oxígeno inferior a la afinidad con el oxígeno de la hemoglobina nativa de la misma especie medida bajo condiciones sustancialmente similares; I). eliminar los precipitados por medio de una centrifugación o una filtración para obtener una solución clara; y m). agregar la hemoglobina tetrámera reticulada estable al calor a un portador farmacéuticamente aceptable.

15. El método para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno altamente purificado y estable al calor de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la sangre entera es sangre entera de bovino y en que la afinidad con el oxígeno de la hemoglobina bovina tetrámera reticulada tiene un valor p50 del orden de aproximadamente 38 a 50 mm Hg.

16. Un método para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno altamente purificado y estable al calor de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque además comprende el paso de envasar la solución de hemoglobina en un envase poco permeable al oxígeno de modo que la vida útil la solución de hemoglobina sea del orden de dos años.

17. Una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno altamente purificado y estable al calor, caracterizada porque comprende hemoglobina, en que la hemoglobina consiste esencialmente en hemoglobina tetrámera reticulada no polimérica con una reticulación beta-beta superior a 50% elaborada con el proceso de la reivindicación 14.

18. Una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno altamente purificado y estable al calor, caracterizada porque comprende hemoglobina, en que la hemoglobina consiste esencialmente en hemoglobina tetrámera reticulada no polimérica con una reticulación beta-beta superior a 60% elaborada con el proceso de la reivindicación 15.

19. La composición de la reivindicación 17, caracterizada para oxigenar tejidos, dicha composición es administrada in vivo o ex vivo.

20. La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada para oxigenar tejidos, dicha composición es administrada in vivo o ex vivo.

21. El método para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno altamente purificado y estable al calor de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el paso de tratamiento con calor es un proceso de alta temperatura en corto tiempo (HTST) realizado con aproximadamente 70°C a 95°C durante 30 segundos hasta 3 horas, seguido inmediatamente por enfriamiento y agregado de N-acetil cisteína en una cantidad de 0.025% a 0.4% inmediatamente después del enfriamiento.

22. El método para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno altamente purificado y estable al calor de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de tratamiento con calor es un proceso con alta temperatura en corto tiempo (HTST) realizado con aproximadamente 70°C a 95°C durante 30 segundos hasta 3 horas, seguido inmediatamente por enfriamiento y agregado de N-acetil cisteína en una cantidad de 0.025% a 0.4% inmediatamente después del enfriamiento.

23. Un método para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno altamente purificado y estable al calor, caracterizado porque la composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno incluye hemoglobina, cuya hemoglobina consiste esencialmente en hemoglobina tetrámera reticulada no polimérica con una reticulación beta-beta superior a 40%, en donde el método comprende los pasos de: a). proporcionar sangre entera de mamífero que incluye al menos glóbulos rojos y plasma; b). separar los glóbulos rojos del plasma de la sangre entera de mamífero; c) . filtrar los glóbulos rojos separados del plasma para obtener una fracción de glóbulos rojos filtrados; d) . lavar la fracción de glóbulos rojos filtrados para eliminar las impurezas de la proteína del plasma y obtener glóbulos rojos lavados; e) . provocar la ruptura de los glóbulos rojos lavados para crear una solución que comprende un lisado de glóbulos rojos; f) . efectuar una filtración para eliminar al menos una parte del material de desecho retenido en el lisado; g). extraer una primera solución de hemoglobina desde el lisado; h) . realizar al menos un proceso de purificación para eliminar uno o más virus, desechos retenidos, o impurezas de proteínas; i) . reticular la primera solución de hemoglobina en fumarato bis-3,5-dibromosalicilo para obtener hemoglobina reticulada en un ambiente oxigenado, en que la hemoglobina reticulada es hemoglobina tetrámera reticulada no polimérica con al menos 40% de reticulación beta-beta; j). eliminar cualquier producto químico residual; k). tratar la hemoglobina reticulada con calor en un ambiente desoxigenado para desnaturalizar y precipitar cualquier hemoglobina residual no estabilizada/no reticulada, cualquier hemoglobina dímera y cualesquier otras impurezas de proteínas, de modo que la hemoglobina tetrámera reticulada estable al calor resultante tenga una concentración no detectable de dimeros y consista esencialmente de hemoglobina tetrámera reticulada no polimérica con una reticulación beta-beta de al menos 40% y una afinidad con el oxígeno superior a la afinidad con el oxígeno de la hemoglobina nativa de la misma especie medida bajo condiciones sustancialmente similares; I). enfriar la hemoglobina reticulada estable al calor resultante; m). agregar 0.025%-0.4% de N-acetil cisteína; n). eliminar el precipitado por medio de una centrifugación o una filtración para obtener una solución clara; y o). agregar la hemoglobina tetrámera reticulada estable al calor purificada a un portador farmacéuticamente aceptable.

24. El método para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno altamente purificado y estable al calor de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el paso del tratamiento con calor es un proceso de alta temperatura por un corto tiempo (HTST) realizado con aproximadamente 70°C a 95°C durante 30 segundos hasta 3 horas, seguido de inmediato por enfriamiento y agregado de N-acetil cisteína en una cantidad de 0.025% a 0.4% inmediatamente después del enfriamiento.

25. El método para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno altamente purificado y estable al calor de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el paso del tratamiento con calor es un proceso de alta temperatura durante corto tiempo (HTST) realizado con aproximadamente 70°C a 95°C durante 30 segundos hasta 3 horas, seguido de inmediato por enfriamiento y agregado de N-acetil cisteína en una cantidad de 0.025% a 0.2% inmediatamente después del enfriamiento.

26. El método para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno altamente purificado y estable al calor de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el paso del tratamiento con calor es un proceso con alta temperatura durante corto tiempo (HTST) realizado con aproximadamente 70°C a 95°C durante 30 segundos hasta 3 horas, seguido de inmediato por enfriamiento y agregado de N-acetil cisteína en una cantidad de 0.2% a 0.4% inmediatamente después del enfriamiento.

27. Un método para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno altamente purificado y estable al calor, caracterizado porque la composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno incluye hemoglobina, en que la hemoglobina consiste esencialmente de hemoglobina tetrámera reticulada no polimérica con una reticulación beta-beta superior a 50%, en donde el método comprende los pasos de: a). proporcionar sangre entera de mamífero que incluye al menos glóbulos rojos y plasma; b). separar los glóbulos rojos del plasma de la sangre entera de mamífero; c) . filtrar los glóbulos rojos separados del plasma para obtener una fracción de glóbulos rojos filtrados; d) . lavar la fracción de glóbulos rojos filtrados para eliminar las impurezas de la proteína del plasma y obtener glóbulos rojos lavados; e) . provocar la ruptura de los glóbulos rojos lavados para crear una solución que comprende un lisado de glóbulos rojos; f) . efectuar una filtración para eliminar al menos una parte del material de desecho retenido en el lisado; g). extraer una primera solución de hemoglobina desde el lisado; h) . realizar al menos un proceso de purificación para eliminar uno o más virus, desechos retenidos, o impurezas de proteínas; i) . reticular la primera solución de hemoglobina en fumarato bis-3,5-dibromosalicilo para obtener hemoglobina reticulada en un ambiente desoxigenado, en que la hemoglobina reticulada es hemoglobina tetrámera reticulada no polimérica con al menos 50% de reticulación beta-beta; j). eliminar cualquier producto químico residual; k). tratar la hemoglobina reticulada con calor en un ambiente desoxigenado para desnaturalizar y precipitar cualquier hemoglobina residual no estabilizada/no reticulada, cualquier hemoglobina dímera y cualesquier otras impurezas de proteínas, de modo que la hemoglobina tetrámera reticulada estable al calor resultante tenga una concentración no detectable de dimeros y consista esencialmente de hemoglobina tetrámera reticulada no polimérica con una reticulación beta-beta de al menos 50% y una afinidad con el oxígeno inferior a la afinidad con el oxígeno de la hemoglobina nativa de la misma especie medida bajo condiciones sustancialmente similares; I). enfriar la hemoglobina tetrámera reticulada estable al calor resultante; m). agregar 0.025%-0.4% de N-acetil cisteína; n). eliminar el precipitado por medio de una centrifugación o una filtración para obtener una solución clara; y o). agregar la hemoglobina tetrámera reticulada estable al calor y purificada a un portador farmacéuticamente aceptable.