EA027238B1 - Способ получения композиции, содержащей термостойкий переносчик кислорода на основе гемоглобина - Google Patents
Способ получения композиции, содержащей термостойкий переносчик кислорода на основе гемоглобина Download PDFInfo
- Publication number
- EA027238B1 EA027238B1 EA201400169A EA201400169A EA027238B1 EA 027238 B1 EA027238 B1 EA 027238B1 EA 201400169 A EA201400169 A EA 201400169A EA 201400169 A EA201400169 A EA 201400169A EA 027238 B1 EA027238 B1 EA 027238B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- hemoglobin
- cross
- linked
- blood cells
- red blood
- Prior art date
Links
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 title claims abstract description 258
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 title claims abstract description 258
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 96
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 title claims abstract description 96
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 96
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 56
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 5
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims abstract description 56
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 41
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 24
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 14
- 101000856264 Anadara inaequivalvis Globin-1 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 65
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 43
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 43
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 32
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 30
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 30
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 24
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 24
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 22
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 21
- 229960004308 acetylcysteine Drugs 0.000 claims description 19
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 19
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 18
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 18
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 11
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 11
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 10
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 4
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 claims description 3
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims 4
- 240000005578 Rivina humilis Species 0.000 claims 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 7
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 abstract description 7
- 208000032456 Hemorrhagic Shock Diseases 0.000 abstract description 6
- 206010049771 Shock haemorrhagic Diseases 0.000 abstract description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 6
- 230000000287 tissue oxygenation Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 abstract description 4
- 206010061481 Renal injury Diseases 0.000 abstract 1
- 206010047139 Vasoconstriction Diseases 0.000 abstract 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract 1
- 230000025033 vasoconstriction Effects 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 34
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 28
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 25
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 19
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108010061951 Methemoglobin Proteins 0.000 description 14
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 9
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 9
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 8
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 8
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 8
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 7
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 7
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 6
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 6
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 5
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 5
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 5
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 5
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 239000000815 hypotonic solution Substances 0.000 description 4
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 4
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 4
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 4
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 4
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 4
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 3
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000012785 packaging film Substances 0.000 description 3
- 229920006280 packaging film Polymers 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 3
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 2
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010047163 Vasospasm Diseases 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000007705 chemical test Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 2
- 150000003278 haem Chemical group 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000001698 laser desorption ionisation Methods 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 150000004032 porphyrins Chemical class 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 238000009517 secondary packaging Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 2
- VQYLPBZKTJXVAA-WUCPZUCCSA-N (2r)-2-amino-4-oxo-3-sulfanylpentanoic acid Chemical compound CC(=O)C(S)[C@H](N)C(O)=O VQYLPBZKTJXVAA-WUCPZUCCSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000511341 Cardita Species 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100284769 Drosophila melanogaster hemo gene Proteins 0.000 description 1
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 1
- 229920000219 Ethylene vinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- 108010085682 Hemoglobin A Proteins 0.000 description 1
- 102000007513 Hemoglobin A Human genes 0.000 description 1
- 241000175212 Herpesvirales Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000702617 Human parvovirus B19 Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102100030856 Myoglobin Human genes 0.000 description 1
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 1
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 206010051511 Viral diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 208000012998 acute renal failure Diseases 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 239000003633 blood substitute Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004850 capillary HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004715 ethylene vinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- RZXDTJIXPSCHCI-UHFFFAOYSA-N hexa-1,5-diene-2,5-diol Chemical compound OC(=C)CCC(O)=C RZXDTJIXPSCHCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000819 hypertonic solution Substances 0.000 description 1
- 229940021223 hypertonic solution Drugs 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 150000004712 monophosphates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000002496 oximetry Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000009516 primary packaging Methods 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 238000010223 real-time analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000009120 supportive therapy Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000006442 vascular tone Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N α-cyano-4-hydroxycinnamic acid Chemical compound OC(=O)C(C#N)=CC1=CC=C(O)C=C1 AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/41—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- A61K38/42—Haemoglobins; Myoglobins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/08—Solutions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Предлагается способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостойкий переносчик кислорода на основе гемоглобина, который, по существу, состоит из неполимерного сшитого тетрамерного гемоглобина, имеющего β-β перекрестную сшивку. Используя способы по настоящему изобретению кислородной аффинностью полученной молекулы можно управлять так, чтобы можно было получить основанные на гемоглобине переносчики кислорода, рассчитанные на конкретное применение. Низший кислород-аффинный перекрестно-сшитый гемоглобин используется в целях, требующих быстрой оксигенации ткани (к примеру, геморрагический шок), а высший кислород-аффинный перекрестно-сшитый гемоглобин используется в целях, требующих более медленной оксигенации (к примеру, вспомогательной терапии рака). Получается высокоочищенный и термостойкий перекрестно-сшитый неполимерный тетрамерный гемоглобин, имеющий β-β сшивку более 40%, пригодный для введения млекопитающим без последующей почечной недостаточности и сосудистых спазмов. Этап высокотемпературной и кратковременной (HTST) термической обработки проводится для эффективного удаления нежелательного димерного гемоглобина, неперекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина и плазменных белковых примесей.
Description
Настоящее изобретение относится к способам получения фармацевтической композиции, содержащей термостойкий переносчик кислорода, который облегчает перекрестное сшивание β-β. Используя способы по настоящему изобретению кислородной аффинностью полученной молекулы можно управлять так, чтобы можно было получить основанные на гемоглобине переносчики кислорода, рассчитанные на конкретное применение. Низший кислород-аффинный перекрестно-сшитый гемоглобин используется в целях, требующих быстрой оксигенации ткани (к примеру, геморрагический шок), а высший кислород-аффинный перекрестно-сшитый гемоглобин используется в целях, требующих более медленной оксигенации (к примеру, вспомогательной терапии рака).
Уровень техники
Гемоглобин имеет большое значение для большинства позвоночных в газообмене между сосудистой системой и тканями. Он отвечает за доставку кислорода из дыхательной системы в клетки тела посредством кровообращения, а также выводит конечный продукт обмена веществ, углекислый газ, из клеток ткани в дыхательную систему, где углекислый газ выдыхается. Поскольку гемоглобин обладает таким свойством переноса кислорода, его можно использовать как мощный поставщик кислорода, если бы его можно было стабилизировать ех νίνο и использовать ίη νίνο.
Встречающийся в природе гемоглобин - это тетрамер, которой обычно стабилен, когда находится в эритроцитах (эритроцитах). Однако если естественного происхождения гемоглобин удалить из эритроцитов, он становится нестабильным в плазме и делится на два α-β димера. Каждый из этих димеров имеет молекулярную массу приблизительно 32 кДа. Эти димеры могут привести к чувствительной почечной недостаточности, когда фильтруются в почках и выделяются. Разрыв тетрамерной связи также негативно сказывается на устойчивости функционального гемоглобина в кровотоке.
В целях решения данной проблемы последние разработки в переработке гемоглобина включали в себя различные методики перекрестного сшивания для создания внутримолекулярных связей в тетрамере, а также межмолекулярных связей между тетрамерами для формирования полимерного гемоглобина. Из существующего уровня техники известно, что полимерный гемоглобин является предпочтительной формой для того, чтобы увеличить время полураспада гемоглобина в кровотоке. Вместе с тем, как определено настоящими изобретателями, полимерный гемоглобин более склонен к преобразованию в метгемоглобин в циркуляции крови. Метгемоглобин не способен связывать кислород и поэтому не может насыщать кислородом ткани. Таким образом, перекрестное сшивание, известное на существующем уровне техники, которое приводит к формированию полимерного гемоглобина, является проблемным. В отрасли существует потребность в методике, которая реализовывала бы внутримолекулярное сшивание для получения стабильных тетрамеров без одновременного формирования полимерного гемоглобина.
Другие, связанные с проблемами попытки существующего уровня техники стабилизировать гемоглобин включают в себя получение тетрамерного гемоглобина, включающего неприемлемо высокий процент димерных звеньев (или неперекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, который быстро диссоциирует до димерного гемоглобина, если вводится пациенту); наличие димеров делает гемоглобиновый состав неприемлемым для введения млекопитающим. Димерная форма гемоглобина может привести к острой почечной недостаточности в организме млекопитающих; такая почечная недостаточность может быть настолько серьезной, что может привести к смерти. Таким образом, в отрасли существует необходимость создания стабильного тетрамерного гемоглобина с неопределяемой димерной формой в конечных продуктах.
Еще одной проблемой продуктов гемоглобина существующего уровня техники является резкое повышение артериального давления после введения. В прошлом реакции сосудистых спазмов регистрировались у старшего поколения от переносчиков кислорода, основанных на гемоглобине. Таким образом, в отрасли существует необходимость в процессе получения гемоглобина, который не приводит к сосудистым спазмам и повышению кровяного давления, когда вводится млекопитающим.
- 1 027238
Дальнейшие проблемы существующего уровня техники, связанные с получением стабильного гемоглобина, включают наличие белковых примесей, таких как иммуноглобин С, который может вызвать аллергические реакции у млекопитающих. Таким образом, в отрасли существует необходимость в процессе, который может давать стабильный тетрамерный гемоглобин без белковых примесей.
Кроме вышеуказанных проблем в отрасли существует потребность в стабилизированном тетрамерном гемоглобине, без димеров, без фосфолипидов, который можно производить в промышленных масштабах.
Основанные на гемоглобине переносчики кислорода можно использовать в самых разных областях медицины; в зависимости от медицинского применения, желательны различные уровни кислородной аффинности. К примеру, молекула гемоглобина с низкой кислород-аффинностью может переносить кислород более легко к тканям-мишеням, чем молекула гемоглобина с более высокой кислородаффинностью. Следовательно, было бы желательно контролировать кислород-аффинность перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина. Таким образом, в отрасли существует необходимость в контроле типа перекрестного сшивания и условий перекрестного сшивания для получения перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина с точными уровнями связывания кислорода.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает способ получения не полимерного, термостойкого, очищенного поперечно перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, пригодного для введения млекопитающим без последующей серьезной почечной недостаточности, отрицательных сосудистых реакций и серьезных побочных реакций, включающих в себя смерть. Настоящее изобретение устраняет димерную форму гемоглобина, неперекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин, фосфолипиды и белковые примеси. Настоящее изобретение также описывает процедуру контроля кислородной аффинности получаемого поперечно перекрестно-сшитого тетрамера путем контроля типа перекрестного сшивания в тетрамере (к примеру, количество сшиваний β-β, сшиваний α-α, сшиваний α-β в тетрамере), четвертичной структуры тетрамера и условий перекрестного сшивания. Низший кислород-аффинный перекрестно-сшитый гемоглобин используется в целях, требующих быстрой оксигенации ткани (к примеру, геморрагический шок), а высший кислород-аффинный перекрестно-сшитый гемоглобин используется в целях, требующих более медленной оксигенации (к примеру, вспомогательной терапии рака). Кроме того, в настоящем изобретении используется (1) установка мгновенного цитолиза для точного и контролируемого гипотонического лизиса, (2) проточная колоночная хроматография, (3) установка высокотемпературной кратковременной (НТБТ) термической обработки гемоглобинового раствора в процессе очистки для удаления нежелательных не стабилизированных димеров гемоглобина и для удаления белковых примесей, к примеру иммуноглобина С, для того, чтобы можно было избежать почечной недостаточности, отрицательных сосудистых реакций и других токсичных реакции, и (4) герметичный инфузионный мешок упаковки для того, чтобы избежать попадания кислорода в конечный продукт.
Способ включает использование в качестве исходного материала цельной крови млекопитающего, состоящей, по меньшей мере, из эритроцитов и и плазмы. Эритроциты отделяют от плазмы, находящейся в цельной крови млекопитающего, далее следует фильтрация для получения отфильтрованной фракции эритроцитов. Фракция отфильтрованных эритроцитов промывается для удаления плазменных белковых примесей. Промытые красные кровяные клетки разрушаются в управляемом гипотоническом лизисе в течение времени, достаточном для лизирования эритроцитов без лизирования белых кровяных клеток в установке мгновенного цитолиза. Фильтрация осуществляется для удаления по меньшей мере части концентрата отходов из лизата. Первый гемоглобиновый раствор извлекается из лизата.
Далее проводят один или несколько процессов очистки с гемоглобиновым раствором, таких как обратная ультрафильтрация и/или хроматография.
Очищенный гемоглобин сшивается бис-3,5-дибромсалицилфумаратом (ΌΒ8Ρ) для получения термостойкого перекрестно-сшитого гемоглобина без формирования полимерного гемоглобина так, что молекулярный вес получаемого неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина составляет 60-70 кДа. Выражение неполимерный в настоящем документе относится к тетрамерному гемоглобину, не имеющему межмолекулярной перекрестной сшивки с другими молекулами гемоглобина или любыми иными негемоглобиновыми молекулами, такими как ПЭГ. В зависимости от источника гемоглобина, четвертичной структуры гемоглобина и условий перекрестной сшивки можно получить тетрамерный продукт с высоким содержанием β-β поперечных сшивок. Далее кислородной аффинностью полученной молекулы можно управлять так, чтобы можно было получить основанные на гемоглобине переносчики кислорода, рассчитанные на конкретное применение.
После этой процедуры, перекрестно-сшитый гемоглобин подвергается термообработке для удаления любого остаточного неперекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина и любого нестабилизированного гемоглобина, к примеру димерной формы гемоглобина, и любых других белковых примесей. До проведения термической обработки Ν-ацетилцистеин в некоторых случаях добавляется в концентрации примерно 0,2% к сшитому тетрамерному гемоглобину для предотвращения формирования гемоглобина.
Сразу же после термической обработки и охлаждения Ν-ацетилцистеин в некоторых случаях до- 2 027238 бавляется в концентрации примерно от 0,025 до 0,4% для дальнейшего предотвращения формирования метгемоглобина. Термической обработкой является предпочтительно высокотемпературная кратковременная обработка, проводимая приблизительно от 70 до 95°С в течение от 30 с до 3 ч с последующим охлаждением до 25°С. Любой осадок, формирующийся в ходе термической обработки, удаляют центрифугированием или фильтрацией.
Затем не содержащий димеров, фосфолипидов, белковых примесей, термостойкий, неполимерный перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин добавляют к фармацевтически приемлемому носителю.
После этого термостойкий, перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин смешивается и упаковывается в специальный герметичный полиэтиленовый, этилен-винил-ацетатный и этилен-винил-спиртовой (ПЭ, ЭВА, ЭВС) инфузионный мешок. Упаковка предотвращает кислородное загрязнение, которое приводит к формированию неактивного метгемоглобина.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 иллюстрирует блок-схему обзорного процесса по настоящему изобретению;
фиг. 2 схематически иллюстрирует установку мгновенного цитолиза, используемую в процессе по настоящему изобретению;
фиг. 3 - высокоэффективный жидкостный хроматографический анализ на (а) нетермообработанный перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин и (Ь) термостойкий перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин, который прошел термообработку при 90°С в течение от 45 с до 2 мин или при 80°С в течение 30 мин;
фиг. 4 - профиль элюции проскока колоночной хроматографии; гемоглобиновый раствор находится во фракции проскока;
фиг. 5 схематически иллюстрирует проскок системы СМ колоночной хроматографии с ультрафильтрацией для работы в промышленных масштабах;
фиг. 6 иллюстрирует схематическое изображение установки, используемой на ΗΤ8Τ этапе термической обработки;
фиг. 7 - температурный профиль в установке ΗΤ8Τ обработки и время, потребовавшееся на удаление дестабилизированного тетрамера (димера) в системе при температуре от 85 до 90°С по настоящему изобретению;
фиг. 8 - схематическое изображение инфузионного мешка для термостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина по настоящему изобретению;
фиг. 9 иллюстрирует обращенно-фазовую ВЭЖХ хроматограмму α и β глобиновых цепей бычьего гемоглобина до (пунктирная линия) и после (сплошная линия) реакции с ΌΒ8Ε в бескислородной среде;
фиг. 10 иллюстрирует анализ (8Ό8-ΡΑΟΕ) электрофорезом в 15% натрий додецилсульфатеполиакриламидном геле (А) природного гемоглобина и (В) гемоглобина, перекрестно сшитого с ΌΒ8Ρ в бескислородной среде.
фиг. 11 иллюстрирует пептидную массовую карту разложенных трипсином пептидов от димерной белковой полосы (В6), получаемую в ходе анализа время-пролетной ионизации лазерной десорбцией с использованием матрицы ΜΑΣΌΣ-ΤΟΕ.
Подробное описание изобретения
Гемоглобин представляет собой железосодержащий переносящий кислород белок в эритроцитах крови млекопитающих и других животных. Гемоглобин демонстрирует характеристики как третичных, так и четвертичных структур белков. Большинство аминокислот в гемоглобине формируют α-спирали, соединённые короткими неспиральными сегментами. Водородные связи стабилизируют спиральные участки внутри гемоглобина, порождая внутренние притяжения в молекуле, изгибая каждую полипептидную цепь особым образом. Молекула гемоглобина собрана из четырех глобулярных белковых субъединиц. Каждая субъединица состоит из полипептидной цепи, являющейся набором α-спиральных структурных сегментов, соединенных в кольцевое миоглобинное образование с включенной группой гема.
Гемовая группа состоит из атома железа, удерживаемого в гетероциклическом кольце, известном как порфирин. Атом железа связан одинаково со всеми четырьмя атомами азота в центре кольца, которое располагается в одной плоскости. Кислород, таким образом, способен связываться с железом в центре перпендикулярно к плоскости порфиринового кольца. Таким образом, одна молекула гемоглобина обладает способностью присоединять четыре молекулы кислорода.
У млекопитающих наиболее распространенный тип гемоглобина представляет собой тетрамер; у людей он называется гемоглобином А и состоит из двух α и двух β не ковалентно-связанных субъединиц, обозначаемых, как α2β2, каждая - состоящая из 141 и 146 аминокислотных остатков соответственно. Размер и структура α и β субъединиц очень похожа друг на друга. Каждая субъединица имеет молекулярный вес приблизительно 16 кДа с общим молекулярным весом тетрамера приблизительно 65 кДа. Четыре полипептидных цепочки связаны друг с другом ионными мостиками, водородными связями и гидрофобным взаимодействием. Структура бычьего гемоглобина аналогична человеческому гемоглобину (90,14% совпадения в α-цепи; 84,35% совпадения в β-цепи). Разница заключается в двух сульфгидрильных группах в бычьем гемоглобине, располагающихся в β-цис 93, а сульфгидрильные группы в че- 3 027238 ловеческом гемоглобине расположены в α-цис 104, β-цис 93 и β-цис 112 соответственно. Человеческий гемоглобин обладает большим сходством с бычьим, собачьим, свиным и лошадиным гемоглобином при сравнении их аминокислотных последовательностей.
В природном гемоглобине в эритроцитах соединение α-цепи с соответствующей ей β-цепью очень прочное и не диссоциирует в физиологических условиях. Вместе с тем соединение одного αβ димера с другим αβ димером является довольно слабым вне эритроцитов. Связь имеет тенденцию к распаду на два αβ димера, каждый приблизительно по 32 кДа. Эти нежелательные димеры достаточно малы, чтобы фильтроваться почками и выводиться с возможной последующей почечной недостаточностью и существенно сниженным тонусом сосудов.
Таким образом, необходимо стабилизировать любой гемоглобин, который используется вне эритроцитов, как для эффективности, так и для безопасности. Процесс получения стабилизированного гемоглобина описан ниже; обзор процесса по настоящему изобретению представлен на блок-схеме фиг. 1.
Первоначально выбирают источник цельной крови, как источник гемоглобина из эритроцитов. Выбирается цельная кровь млекопитающих, включая, без ограничений, человеческую, бычью, свиную, лошадиную и собачью цельную кровь. Эритроциты отделяют от плазмы, фильтруют и промывают, чтобы удалить белковые примеси из плазмы.
Для того чтобы выделить гемоглобин из эритроцитов, клеточную мембрану лизируют. Хотя различные процедуры можно использовать для лизирования эритроцитов, в настоящем изобретении используют лизис в гипотонических условиях, таким образом, который можно точно контролировать в объемах, соответствующих промышленному производству. С этой целью установка мгновенного цитолиза, как показано на фиг. 2, используется для лизиса эритроцитов. Гипотонический лизис дает раствор лизата, включающий в себя гемоглобин и концентрат отходов. Для организации промышленного производства лизис тщательно контролируется так, чтобы только эритроциты лизировались без лизирования белых кровяных клеток или других клеток. В одном из вариантов осуществления изобретения размер установки мгновенного цитолиза выбирается так, что эритроциты проходят через установку в течение от 2 до 30 с или, в любом случае, за время, достаточное для лизиса эритроцитов, предпочтительно 30 с. Установка мгновенного цитолиза включает в себя статический смеситель. Деионизированная и дистиллированная вода используется в качестве гипотонического раствора. Конечно же, понятно, что использование других гипотонический растворов, имеющих иные солевые концентрации, может явиться причиной разных временных периодов на лизис эритроцитов. Так как контролируемый лизисный процесс лизирует только эритроциты, а не белые кровяные клетки или клеточное вещество, то он минимизирует выброс токсичных белков, фосфолипидов или ДНК из белых кровяных клеток и прочего клеточного вещества. Гипотонический раствор добавляется непосредственно через 30 с, то есть после того как раствор, содержащий эритроциты, прошел участок статического смесителя установки мгновенного цитолиза. Полученный гемоглобин имеет более высокую степень чистоты и более низкий уровень загрязнителей, таких как нежелательные ДНК и фосфолипиды, чем гемоглобин, полученный с помощью других процедур лизиса. Нежелательные нуклеиновые кислоты из белых кровяных клеток и фосфолипидные примеси не обнаруживаются в гемоглобиновом растворе методом полимеразной цепной реакции (предел обнаружения = 64 пг) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ, предел обнаружения = 1 мкг/мл) соответственно.
На этом этапе процесса гемоглобиновый раствор очищается для удаления различных белковых и других примесей. Эту очистку можно проводить на основе ультрафильтрации, хроматографии или сочетания одного или более ультрафильтрационных и/или хроматографических процессов. В примерном варианте осуществления изобретения используются два ультрафильтрационных процесса: первый, который удаляет примеси, имеющие молекулярный вес больше, чем у гемоглобина до проточной колоночной хроматографии, и второй, который удаляет примеси с молекулярным весом меньше, чем у гемоглобина после проточной колоночной хроматографии. Последний процесс ультрафильтрации концентрирует гемоглобин. В некоторых вариантах осуществления изобретения фильтр 100 кДа используется для первой ультрафильтрации, а фильтр 30 кДа используется для второй ультрафильтрации.
Проточная колоночная хроматография используется для удаления белковых примесей в очищенном гемоглобиновом растворе, таких как иммуноглобин С, альбумин и карбоангидраза. В некоторых вариантах осуществления изобретения колоночная хроматография проводится с помощью одной или нескольких серийных ионообменных колонок, таких как диэтиламиноэтиловая колонка, колонка СМ, гидроксиапатитовая колонка и т.д. Значение рН для колоночной хроматографии обычно составляет от 6 до 8,5. В одном варианте осуществления изобретения этап проточной колоночной хроматографии используется для удаления белковых примесей при рН 8.0. Иммуносорбентный энзимсвязанный анализ (ЕЫЗА) и ВЭЖХ используются для нахождения белковых примесей и фосфолипидов, остающихся в образце после элюции из колонки хроматографии. Такая уникальная колоночная хроматография с проскоком позволяет реализовать непрерывную схему разделения для производства в промышленных масштабах. Результаты ЕЫЗА показывают, что количество этих примесей существенно ниже в элюированном гемоглобине (иммуноглобин С: 44,3 нг/мл; альбумин: 20,37 нг/мл; карбоангидраза: 81,2 мкг/мл). Результаты удаления
- 4 027238 белковых примесей с помощью различных типов колонок при различных значениях рН приведены в табл. 1 далее.
Таблица 1
Процент удаления(%)
Колонка (условия рН)
Карбоангидраза Альбумин Иммуноглобин С
| Диэтиламиноэтил (при рН 7,5) | — | 68 | 29,8 |
| Диэтиламиноэтил (при рН 7,8) | — | 60 | 50,9 |
| СМ(при рН 6,2) | — | 32 | 21,8 |
| СМ(при рН 8,0) | 5,6 | 53,2 | 66,4 |
| Г идроксиапатит (при рН 7,5) | 4,5 | 23,5 | 22,8 |
По окончании процесса колоночной хроматографии гемоглобин подвергается ΌΒδΡ-сшивке. Условия выбираются так, чтобы поперечная сшивка, происходящая между β-β субъединицами, стимулировалась, а полученный продукт имел более 50% β-β поперечных сшивок. При поперечной сшивке в бескислородной среде получаемый гемоглобин имеет более низкую кислородную аффинность с более высоким значением р50 по сравнению с исходным гемоглобином тех же видов, с замерами в существенно сходных условиях. К примеру, для бычьего гемоглобина исходный бычий гемоглобин имеет значение р50 порядка 23-29 мм рт.ст. Перекрестно-сшитый бычий гемоглобин, сформировавшийся в бескислородной среде по настоящему изобретению, имеет значение р50 порядка 38-50 мм рт.ст. Более низкая кислородная аффинность означает, что тетрамер может отдать кислород цели более легко, чем материал с более высокой кислородной аффинностью. При поперечном сшивании бычьего гемоглобина в кислородной среде формируется материал с более высокой кислородной аффинностью с нижним значением р50 меньше чем приблизительно 23 мм рт.ст. по сравнению с исходным бычьим гемоглобином, который имеет значение р50 порядка 23-29 мм рт.ст. Препараты с более низкой кислородной аффинностью используются, когда быстрая оксигенация желательна в случаях гипоксии тканей вследствие обширной кровопотери (к примеру, геморрагический шок). Препараты с более высокой кислородной аффинностью полезны в оксигенационных вспомогательных терапиях в лечении раковых заболеваний, где более низкая скорость доставки кислорода желательна.
Для человеческого гемоглобина перекрестная поперечная сшивка в бескислородной среде обычно дает большинство α-α перекрестно-сшитого гемоглобина с более низкой кислородной аффинностью, то есть кислородной аффинностью, сниженной по меньшей мере в 2 раза по сравнению с исходным человеческим гемоглобином. Поперечная сшивка в кислородной среде, как правило, облегчает образование β-β перекрестно-сшитого гемоглобина с более высокой кислородной аффинностью (то есть с нижним р50 меньше чем приблизительно 23 мм рт.ст.) по сравнению с исходным человеческим гемоглобином при тех же условиях (значение р50 порядка приблизительно 23-30 мм рт.ст.).
Для дезоксигенированных условий перекрестной сшивки предпочтителен уровень растворенного кислорода менее 0,1 ч./млн, он поддерживается с молярным соотношением гемоглобина к ΌΒδΡ от 1:2,5 до 1:4,0 в течение периода времени от 3 до 16 ч при температуре окружающей среды (15-25°С), при рН примерно 8-10, предпочтительно рН примерно 8,6-9,2. Получаемый перекрестно-сшитый гемоглобин является тетрамерным гемоглобином, имеющим молекулярный вес 60-70 кДа, не содержащий полимерный гемоглобин. Выход ΌΒδΡ реакции значителен, >99%, а концентрация димеров в конечном продукте низка. Необязательно, данный процесс не требует сульфгидрильных обрабатывающих реактивов, таких как иодоацетамид, для реагирования с гемоглобином до перекрестной сшивки, как требуется в различных процессах существующего уровня техники. При перекрестной сшивке в кислородной среде используется кислородная среда (к примеру, воздух, рО2 составляет приблизительно 149 мм рт.ст.; или чистый О2, рО2 составляет приблизительно 760 мм рт.ст.), а остальные вышеприведенные условия существенно не меняются.
Для бычьего гемоглобина β-β поперечная сшивка превышает 50% и предпочтительно превышает 60% при сшивке в дезоксигенированной среде (уровень растворенного кислорода менее 0,1 ч./млн). Для бычьего гемоглобина, перекрестно-сшитого в кислородной среде, β-β поперечная сшивка также облегчается, обычно на уровне более 40% β-β перекрестного сшивания.
Для человеческого гемоглобина поперечная сшивка в кислородной среде облегчает β-β сшивку.
После перекрестной сшивки фосфатно-буферный солевой раствор (ФБСР), физиологический буфер, заменяется на сшиваемый раствор, а любые остаточные химические вещества удаляются тангенциальной поточной фильтрацией.
После перекрестной сшивки настоящее изобретение предполагает этап термической обработки (высокотемпературной кратковременной, ΗΤδΤ) перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобинового рас- 5 027238 твора. Термическая обработка проходит в бескислородной среде. До термической обработки Νацетилцистеин необязательно добавляется для предотвращения формирования метгемоглобина (неактивного гемоглобина). После этапа термической обработки раствор охлаждается и Ν-ацетилцистеин необязательно добавляется для поддержания низкого уровня метгемоглобина. Если Ν-ацетилцистеин добавляется перед и после термической обработки, количество, добавляемое до термической обработки, равняется примерно 0,2%, а количество, добавляемое после термической обработки, равняется примерно от 0,025 до 0,4%. Вместе с тем, если Ν-ацетилцистеин добавляется только после термической обработки, то добавляемое количество составляет 0,025-0,4%. В одном из вариантов осуществления изобретения количество Ν-ацетилцистеина, добавляемого после термической обработки, равняется 0,2-0,4%. В другом варианте осуществления изобретения количество Ν-ацетилцистеина, добавляемого после термической обработки, равняется 0,025-0,2%.
В отдельных вариантах осуществления изобретения перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобиновый раствор нагревается в бескислородной среде (уровень растворенного кислорода менее 0,1 ч./млн) в диапазоне температур от 50 до 95°С при длительности от 0,5 мин до 10 ч. В отдельных вариантах осуществления изобретения перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобиновый раствор нагревается в диапазоне температур от 70 до 95°С и при длительности от 30 с до 3 ч. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобиновый раствор нагревается при 80°С в течение 30 мин. Кроме того, в других предпочтительных вариантах осуществления изобретения перекрестно-сшитый гемоглобиновый раствор нагревается при 90°С в течение от 30 с до 3 мин, затем быстро охлаждается до 25°С в течение приблизительно от 15 до 30 с, а Ν-ацетилцистеин необязательно добавляется, как указано выше.
Для анализа результатов этапа ΗΤδΤ термической обработки аналитическая ВЭЖХ используется для определения количества димеров после этого этапа термической обработки. Мобильный этап ВЭЖХ-анализа включает в себя магний хлористый (0,75 моль), который может разделять димеры (не стабилизированные тетрамеры) и термостойкий перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин. В стимулировании диссоциации гемоглобина на димеры магний хлористый в 30 раз эффективней, чем натрия хлорид при той же ионной силе. Этап термической обработки также действует, этап денатурации для существенного удаления нежелательных белковых примесей в сшитом тетрамерном гемоглобине (не определяется иммуноглобин С; 96,15% удаления альбумина; 99,99% снижения карбоангидраза). Иммуносорбентный энзимсвязанный анализ (ЕЬ1§А) проводится для определения белковых примесей в образце. Таким образом, очищенный, термостойкий перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобиновый раствор имеет не определяемый уровень димера (ниже предела обнаружения: 0,043%), и иммуноглобина С и очень малое количество альбумина (0,02 мкг/мл) и карбоангидразы (0,014 мкг/мл). Фиг. 3 иллюстрирует, что димерная форма гемоглобина не определяется в системе ВЭЖХ. Табл. 2 демонстрирует результаты эксперимента в отношении удаления белковых примесей и димера этапом ΗΤδΤ термической обработки. Данный этап ΗΤδΤ термической обработки облегчает избирательное отделение термостойкого перекрестно-сшитого тетрамера от нестабильного тетрамера (к примеру, неперекрестно-сшитого тетрамера) и димера.
Таблица 2
Без термической обработки 80°С в течение 10 мин.
80°С в течение 15 мин.
80°С в течение 30 мин.
Без термической обработки 90°С в течение 1,0 мин. 90°С в течение 1,5 мин. 90°С в течение 2,0 мин.
| Иммуноглобин 6 (мкг/мл) | Альбумин (мкг/мл) | Карбоангидраза (мкг/мл) | Тетра мер (%) | Димер (%) |
| 0,36 | 0,57 | 355,41 | 90,1 | 5,4 |
| Не выявляем | 0,33 | 0,032 | 92,7 | 3,4 |
| Не выявляем | 0,14 | 0,022 | 93,3 | 2,9 |
| Не выявляем | 0,03 | 0,014 | 96,6 | Не выявляем |
| 0,29 | 0,52 | 261,80 | 91,8 | 5,3 |
| Невыявляем | 0,21 | >0,063 | 93,4 | 2,0 |
| Невыявляем | 0,04 | 0,022 | 94,9 | 0,6 |
| Невыявляем | 0,02 | 0,016 | 96,1 | Не выявляем |
После этапа термической обработки перекрестно-сшитого гемоглобина в бескислородной среде термостойкий перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин готов к фармацевтическому смешиванию и упаковке. Настоящее изобретение описывает этап герметичной упаковки термостойкого перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина в бескислородной среде. Термостойкий перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин по настоящему изобретению является стабильным, когда хранится в бескислородной
- 6 027238 среде сроком свыше двух лет.
В настоящем изобретении фармацевтическая композиция, содержащая переносчик кислорода, в первую очередь предназначена для внутривенных инъекций. Традиционно, ранее существовавшие продукты требовали обычных пакетов для крови из ПВХ или пакетов для крови 5>1спсоп. которые обладают высокой кислородной проницаемостью, что в конечном итоге сократит срок хранения продукта, так как он быстро превращается в неактивный метгемоглобин (в течение нескольких дней) в кислородной среде.
Упаковка, используемая в настоящем изобретении, обеспечивает стабильность термостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина свыше двух лет. Многослойный пакет из ЭВА/ЭВСматериала используется для минимизации газовой проницаемости и во избежание формирования неактивного метгемоглобина. Инфузионный мешок емкостью 100 мл, предназначенный для использования с очищенным и термостойким сшитым тетрамерным гемоглобином по настоящему изобретению, изготавливается из пяти слоев материала, покрытого ЭВА/ЭВС, толщиной до 0,4 мм, с кислородной проницаемостью 0,006-0.132 см3 на 100 кв.дюймов за сутки в атмосфере при комнатной температуре. Этот материал представляет собой пластик класса VI (как определено в Фармакопее США <88>), который отвечает требованиям испытаний ίη νίνο на биологическую активность и физико-химических испытаний и пригоден для изготовления инфузионных мешков для целей внутривенных инъекции. Такой первичный мешок особенно полезен для защиты термостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобинового раствора от долгосрочного воздействия кислорода, которое вызывает его нестабильность и, в конечном итоге, влияет на его терапевтические свойства.
Для вторичной защиты продуктов крови известно использование алюминиевой пленки для защиты от возможных утечек воздуха и для поддержания продукта в бескислородном состоянии. Вместе с тем существует вероятность наличия малых отверстий в алюминиевой пленке, что угрожает ее герметичности и делает продукт нестабильным. Поэтому в настоящем изобретение используют в качестве вторичной упаковки алюминиевый пленочный мешок, который предотвращает оксигенацию, а также исключает воздействие света. Состав пленочного мешка включает в себя 0,012 мм полиэтилентерефталата (ПЭТ), 0,007 мм алюминия (А1), 0,015 мм нейлона (ΝΥ) и 0,1 мм полиэтилена (ПЭ). Упаковочная пленка имеет толщину 0,14 мм и кислородопроницаемость 0,006 см3 на 100 кв.дюймов в сутки в атмосфере при комнатной температуре. Эта вторичная упаковка продляет время стабильности гемоглобина, увеличивая срок хранения продукта.
Процесс по настоящему изобретению применим в широкомасштабном промышленном производстве термостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина. Кроме того, термостойкий перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин в сочетании с фармацевтическим носителем (к примеру, водой, физиологическим буфером, в форме капсул) пригоден для приема млекопитающими.
Фармацевтическая композиция, включающая в себя переносчик кислорода, по настоящему изобретению применима для улучшении оксигенации тканей, лечении рака, в лечении нарушений с кислородной недостаточностью, таких как геморрагический шок, и в хранении такого органа, как сердце, в низкокислородной среде (к примеру, при пересадке сердца). В примерных вариантах осуществления изобретения дозировка выбирается для получения диапазона концентрации приблизительно 0,2-13 г/кг со скоростью введения менее 10 мл/ч/кг веса тела.
Для лечения нарушений с кислородной недостаточностью и для хранения органа, такого как сердце, используют фармацевтическую композицию, содержащую переносчик кислорода, с низкой кислородной аффинностью по настоящему изобретению в качестве заменителя крови, доставляющего кислород к целевому органу. Низкий кислород-аффинный перекрестно-сшитый гемоглобин применим в областях, требующих быстрой оксигенации ткани (к примеру, геморрагический шок и хранение органов ех νίνο).
В случае лечения рака с помощью фармацевтевтической композиции, включающей переносчик кислорода, с высокой кислородной аффинностью по настоящему изобретению она служит в качестве вещества оксигенации ткани для улучшения оксигенации опухолевых тканей, тем самым повышая химио- и радиационную чувствительность. Высокий кислород-аффинный гемоглобин применим в областях, требующих более медленной оксигенации (к примеру, вспомогательной терапии рака).
Примеры
Следующие примеры приведены в качестве описания отдельных вариантов осуществления данного изобретения, не предназначены как-либо ограничить объем данного изобретения.
Пример 1. Обзор процесса.
Схематическая функциональная диаграмма процесса по настоящему изобретению приводится на фиг. 1. Бычью цельную кровь собирают в закрытый стерильный контейнер/мешок, содержащий 3,8% (вес./об.) раствора тринатрий цитрата в качестве антикоагулянта. Кровь затем непосредственно хорошо перемешивают с раствором тринатрий цитрата для замедления свертывания крови. Эритроциты (КВС) изолируют и отделяют от плазмы и других малых кровяных клеток путем афереза. Промывка клеток используется для этой процедуры в γ-стерилизованной одноразовой чашке центрифуги. КВС промывают равным объемом 0,9% (вес./об. хлорида натрия) солевого раствора.
Промытые КВС лизируют, чтобы высвободить гемоглобиновое содержимое, применяя гипотонический шок к клеточной мембране КВС. Специализированная установка мгновенного цитолиза для лизиса
- 7 027238
КВС, изображенная на фиг. 2, используется для этих целей. После лизиса КВС молекулы гемоглобина изолируются от других белков путем тангенциальной проточной ультрафильтрацией, используя мембрану 100 кДа. Гемоглобин в фильтрате собирают для проточной колоночной хроматографии и далее концентрируют до 12-14 г/дл с помощью мембраны 30 кДа. Колоночная хроматография выполняется для удаления белковых примесей.
Концентрированный гемоглобиновый раствор сначала реагирует с ΌΒδΡ для формирования теплостойких сшитых тетрамерных гемоглобиновых молекул. Этап термической обработки затем выполняется в бескислородной среде при 90°С в течение от 30 с до 3 мин перед окончательным смешиванием и упаковкой.
Пример 2. Временной и контролируемый гипотонический лизис и фильтрация.
Бычью цельную кровь собирают свежей и транспортируют в охлажденном состоянии (от 2 до 10°С). Эритроциты отделяют от плазмы путем промывки клеток и далее фильтрацией 0,65 мкм. После промывания фильтрата эритроцитов (КВС) 0,9%-ным солевым раствором фильтрат разрушают гипотоническим лизисом. Гипотонический лизис проводят с помощью установки мгновенного цитолиза, изображенной на фиг. 2. Установка мгновенного цитолиза включает в себя статический смеситель для осуществления клеточного лизиса. Суспензия КВС с контролируемой концентрацией гемоглобина (12-14 г/дл) смешивается с 4 об. очищенной воды для зарождения гипотонического шока в клеточных мембранах КВС. Период гипотонического шока контролируется, чтобы избежать нежелательного лизиса белых кровяных клеток и тромбоцитов. Гипотонический раствор проходит через участок статического смесителя установки мгновенного цитолиза в течение от 2 до 30 с или, в любом случае, за время, достаточное для лизиса красных кровяных клеток, предпочтительно 30 с. Шок прекращается через 30 с путем смешивания лизата с 1/10 об. гипертонического буфера, когда он покидает статический смеситель. Используют гипертонический раствор, содержащий 0,1 моль фосфатного буфера, 7,4% №С1. рН 7,4. Установка мгновенного цитолиза на фиг. 2 может обрабатывать от 50 до 1000 л лизата в час и предпочтительно по меньшей мере 300 л/ч на непрерывной основе.
После лизиса КВС лизат эритроцитов фильтруют на фильтре 0,22 мкм для получения гемоглобинового раствора. Нуклеиновые кислоты из белых кровяных клеток и фосфолипидные примеси не обнаруживаются в гемоглобиновом растворе полимеразной цепной реакцией (предел обнаружения = 64 пг) и ВЭЖХ (предел обнаружения = 1 мкг/мл) соответственно. Первая ультрафильтрация 100 кДа проводится для удаления примесей с более высоким молекулярным весом, чем у гемоглобина. Проточная колоночная хроматография используется далее для дальнейшей очистки гемоглобинового раствора. Вторая ультрафильтрация 30 кДа проводится затем для удаления примесей с более низким молекулярным весом, чем у гемоглобина, и для концентрации.
Пример 3. Исследование очистки от вирусов в гемоглобиновом растворе без стромы.
Для того чтобы продемонстрировать безопасность продукта по настоящему изобретению, показывают возможность удаления вирусов на (1) этапе диафильтрации через 0,65 мкм фильтр и на (2) этапе ультрафильтрации через мембрану 100 кДа во время постановочного исследования. Его проводят путем намеренного введения на маломасштабных вариантах этих двух процессов различных модельных вирусов (вирус энцефаломиокардита, вирус псевдобешенства, вирусной диареи крупного рогатого скота и парвовируса крупного рогатого скота). В данном исследовании использовали четыре типа вирусов (см. табл. 3). Указанные вирусы отличаются по своим биофизическим и структурным характеристикам и демонстрируют различную устойчивость к физическим и химическим агентам или обработкам.
Таблица 3
| Целевой вирус | Модельный вирус | Таксоно мия | Геном | Структура | Размер [им] | Стабиль- ность* |
| Вирус гепатита С | Вирус диареи крупного рогатого скота (Βνον) | Флави- вирусы | Одноцепочечная РНК | Оболо- чечная | 40-60 | Низкая |
| - | Вирус энцефаломио- кардита (ЕМСУ) | Пикорна- вирус | Одноцепочечная РНК | Безоболо- чечная | 25-30 | Средняя |
| Парво- вирус В19 | Бычий Парвовирус (ВРУ)) | Парво- вирусный | Одноцепочечная ДНК | Безоболо- чечная | 18-26 | Очень высокая |
| Вирус гепатита В | Вирус псевдобешенства (РПУ) | Герпе- вирусная | Двухцепочечная ДНК | Оболо- чечная | 120-200 | От малой до средней |
Схема постановки опытов кратко отражена в табл. 4.
Таблица 4
- 8 027238
| Диафильтрация | Ул ьтрафил ьтрация |
| Промывка клеток 1 | Введение вируса 1 |
| Введение вируса 1 | Ультрафильтрация 1 |
| Диафильтрация 1 | Тесты на вирусы |
| Тесты на вирусы |
Обобщенные данные по зарегистрированным результатам удаления 4 вирусов при (1) диафильтрации через фильтр 0,65 мкм и (2) ультрафильтрации через мембрану 100 кДа показаны в следующей табл.
5. Все четыре вируса, ВУОУ, ВРУ, ЕМСУ и РКУ, эффективно удалены через фильтр диафильтрацией 0,65 мкм и через мембрану ультрафильтрацией 100 кДа.
Таблица 5
| Вирусы | ВУОУ | ВРУ | ЕМСУ | РКУ | ||||
| Проскок | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 |
| Диафильтрация 0,65 мкм | 2,69 | 3,20 | 3,73 | 3,53 | 3,25 | 2 3,90 | 2,67 | 2,63 |
| Ультрафильтрация 100 кДа | 2 4,68 | 2 4,38 | 5,87 | 5,92 | 3,60 | 3,43 | 2 6,05 | 3,27 |
| Совокупный максимум | 2 7,88 | 9,65 | 2 7,50 | 2 8,72 | ||||
| Совокупный минимум | 2 7,07 | 9,40 | 6,68 | 5,90 |
Комментарий: > остаточной инфекционности не обнаружено
Пример 4. Проточная колоночная хроматография.
Колонка СМ (на рынке реализуется компанией ОЕ Неаййеате) используется для дальнейшего удаления белковых примесей. Начальный буфер содержит 20 ммоль натрий ацетата (рН 8,0), и буфер элюции содержит 20 ммоль натрий ацетата, 2 моль ЫаС1 (рН 8,0). После уравновешивания СМ колонки начальным буфером образец белка подают в колонку. Несвязанные белковые примеси промывают по меньшей мере 5 об. колонки начального буфера. Элюцию проводят, используя элюционный буфер 25% (0-0,5 моль ЫаС1) в 8 об. колонки. Профиль элюции показан на фиг. 4; гемоглобиновый раствор находится в проскоке. Чистота фракции проскока анализируется иммуносорбентным ферментным анализом. Результаты приведены в следующей табл. 6.
Таблица 6
| Белковые примеси | |||
| Иммуноглобин С | Карбоангидраза | Альбумин | |
| До колонки СМ | 1320 нг/мл | 860,3 мкг/мл | 435,2 нг/мл |
| Проточная (содержащая гемоглобин) | 44,3 нг/мл | 81,2 мкг/мл | 20,4 нг/мл |
Так как гемоглобиновый раствор находится в проскоке от СМ колоночной хроматографии при рН 8 (не в элюате), то это дает хороший подход для непрерывного производства в промышленных масштабах. Первая установка ультрафильтрации соединена непосредственно с проточной СМ колоночной хроматографической системой, а проточную трубку можно соединить со второй установкой ультрафильтрации для производства в промышленных масштабах. Схематическая организация промышленного процесса показана на фиг. 5.
Пример 5. Получение термостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина.
(5а) Реакция перекрестной сшивки с ΌΒ8Ρ в бескислородной среде.
Реакция перекрестной сшивки проводится в бескислородной среде, то есть при уровне менее 0,1
ч./млн растворенного кислорода. ΌΒ8Ρ добавляют в гемоглобиновый раствор для образования перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина без образования полимерного гемоглобина. Стабилизационный процесс ΌΒ8Ρ стабилизирует тетрамерную форму гемоглобина (65 кДа) и предотвращает диссоциацию на димеры (32 кДа), которые выводятся через почки. В этом варианте осуществления изобретения используется молярное соотношение гемоглобина к ΌΒ8Ρ 1:2,5, а рН равняется 8,6. Этот процесс осущест- 9 027238 вляется в течение периода от 3 до 16 ч при температуре окружающей среды (15-25°С) в инертной атмосфере азота для предотвращения окисления гемоглобина с формированием окисного метгемоглобина, который физиологически неактивен (поддерживаемый уровень растворенного кислорода менее 0,1 ч./млн). Полнота реакции с ΌΒ8Ρ контролируется путём измерения остаточной ΌΒ8Ρ с помощью ВЭЖХ. Выход ΌΒ8Ρ реакции значителен, >99%. Формирование β-β поперечных сшивок порядка по меньшей мере приблизительно 40%.
(5Ь) Этап НТ8Т термической обработки.
Установка высокотемпературной кратковременной (НТ8Т) обработки показана на фиг. 6. Этап термической обработки с помощью установки НТ8Т обработки выполняется на сшитом тетрамерном гемоглобине. В этом примере условия термической обработки - это 90°С от 30 с до 3 мин и предпочтительно от 45 до 60 с, хотя и другие условия можно выбрать, как рассмотрено выше, и установку, модифицированную соответствующим образом. Раствор, содержащий перекрестно-сшитый гемоглобин, с необязательно добавленным к нему 0,2% Ν-ацетилцистеином, перекачивают в установку НТ8Т обработки (первая часть НТ8Т теплообменника предварительно нагревается и поддерживается при 90°С) при скорости потока 1,0 л/мин, время пребывания в первой секции установки от 45 до 60 с, затем раствор проводится при той же скорости потока в другую секцию теплообменника, который поддерживается при 25°С.
Время, необходимое для охлаждения, от 15 до 30 с. Непосредственно после охлаждения до 25°С Νацетилцистеин добавляют в концентрации от 0,2 до 0,4%. Настройки установки термической обработки легко контролируются для промышленной эксплуатации. Температурный профиль с содержанием димера показан на фиг. 7. Если гемоглобин не сшит, он не является термостойким и выпадает в осадок после этапа термической обработки. Осадок затем удаляют путем центрифугирования или фильтрации для получения чистого раствора.
Далее в табл. 7 показано, что белковые примеси, такие как иммуноглобин О, альбумин, карбоангидраза и нежелательный нестабилизированный тетрамер или димер, удаляют после этапа термической обработки. Количество иммуноглобина О, альбумина и карбоангидразы измеряется с помощью ЕЫ8А, а количество димера определяют с помощью ВЭЖХ. Чистота термостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина крайне высока после НТ8Т термической обработки, в диапазоне от 98,0 до 100%.
Таблица 7
| Состояние образца | Белковые загрязнения (иммуносорбентный ферментный анализ) | ВЭЖХ | |||
| Иммуноглобин С (мкг/мл) | Альбумин (мкг/мл) | Карбоангидраз а (мкг/мл) | Тетра мер {%) | Димер (%) | |
| Без | |||||
| термической | 0,29 | 0,52 | 261,80 | 91,8 | 5,3 |
| обработки | |||||
| 90’С в | Невыявля | 0,016 | 96,1 | Невыявля- | |
| течение | емый | 0,02 | емый | ||
| 2 мин. | |||||
| Удаление(%) | 100,0 | 96,15 | 99,99 | 100,0 |
(5с) Предотвращение формирования метгемоглобина добавлением 0,025-0,2% Ν-ацетилцистеина. Непосредственно после термической обработки и охлаждения добавляют Ν-ацетилцистеин (Ν-АЦ) в перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин в концентрации приблизительно 0,025-0,2% для предотвращения формирования метгемоглобина. В разные временные интервалы процент метгемоглобина измеряют по методу сооксиметрии. В табл. 8 показан процент метгемоглобина в сшитом тетрамерном гемоглобине после добавления Ν-АЦ в течение 5 месяцев. Как видно из табл. 8, уровень метгемоглобина в термообработанном сшитом тетрамерном гемоглобине сохраняется постоянным и очень мал после добавления Ν-АЦ, в диапазоне 1,8-5,1%.
- 10 027238
Таблица 8
| Общий уровень Ν-АЦ | % метгемоглобина в термообработанном сшитом тетрамерном гемоглобине после добавления Ν-АЦ | |||
| 1 неделя | 1 месяц | 3 месяца | 5 месяцев | |
| 0,2% Ν-АЦ | 3,8 | 2,5 | 3,5 | 4,3 |
| 0,1% Ν-АЦ | 5,1 | 4,3 | 2,9 | 3,8 |
| 0,05% Ν-АЦ | 3,7 | 3,3 | 2,3 | 4,0 |
| 0,025% Ν-АЦ | 3,6 | 2,5 | 1,8 | 2,7 |
Пример 6. Упаковка.
Так как продукт по настоящему изобретению стабилен в бескислородной среде, упаковка продукта важна в минимизации газовой проницаемости. Для внутривенного применения специально разработан инфузионный мешок емкостью 100 мл, изготавливаемый из пяти слоев материала, покрытого ЭВА/ЭВС, толщиной до 0,4 мм, с кислородной проницаемостью от 0,006 до 0.132 см3 на 100 кв.дюймов в сутки в атмосфере при комнатной температуре. Этот материал представляет собой пластик класса VI (как определено в Фармакопее США <88>), который отвечает требованиям испытаний ίη-νίνο на биологическую активность и физико-химических испытаний и пригоден для целей изготовления контейнеров для внутривенных инъекций (отметим, что другие формы упаковки можно изготовить из этого материала, также в зависимости от области применения). Вторичный упаковочный алюминиевый пленочный мешок также применяется на первичном упаковочном инфузионном мешке, что обеспечивает дополнительный барьер, минимизируя воздействие света и кислородную диффузию. Слои мешка включают в себя 0,012 мм полиэтилентерефталата (ПЭТ), 0,007 мм алюминия (Α1), 0,015 мм нейлона (ΝΥ) и 0,1 мм полиэтилена (ПЭ). Упаковочная пленка имеет толщину 0,14 мм и кислородопроницаемость 0,006 см3 на 100 кв.дюймов в сутки в атмосфере при комнатной температуре. Схематическое описание инфузионного мешка приведено на фиг. 8. Общая кислородная проницаемость для каждого инфузионного мешка по настоящему изобретению составляет 0,0025 см3 в сутки в атмосфере при комнатной температуре.
Пример 7. Характеристика перекрестно-сшитого бычьего гемоглобина (в условиях перекрестной сшивки в бескислородной среде).
(7а) Разделение глобиновых цепей обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ).
Глобиновые цепи природного бычьего гемоглобина и сшитые глобиновые цепи ΌΒδΡперекрестной сшивки бычьего гемоглобина расщепляются на колонке νΥΩΑΟ С4 с помощью градиентов, разработанных Шелтоном и др., 1984 г., с незначительными изменениями.
(7Ь) Анализ электрофорезом в натрий додецилсульфат-полиакриламидном геле (δΌδ-ΡΑΟΕ) ΌΒδΡперекрестно-сшитого бычьего гемоглобина.
Раствор натурального бычьего гемоглобина и ΌΒδΡ-перекрестно-сшитого бычьего гемоглобина готовят путем смешивания с восстанавливающим буфером для образца (62 ммоль трис-НС1 (рН 6,8), 10% (об./об.) глицерина, 5% (об./об.) меркаптоэтанола и 2,3% (вес./об.) натрия додецилсульфата), и нагревается до 95°С в течении 10 мин. Смесь-образец расщепляется с помощью 15% акриламидного отслаивающего геля и 4% заполняющего геля. Электрофорез проводят при постоянном токе 60 мА. После электрофореза гель δΌδ-ΡΑΟΕ помечают 0,1% (вес./об.) кумасси синим К350, 20% (об./об.) метанолом и 10% (об./об.) уксусной кислоты. Для оценки процента различных типов перекрестной сшивки в ΌΒδΡ-сшитом бычьем гемоглобине, интенсивности расщепленных белковых зон, выявленных блоком невидимого излучения (БНИ), определяются количественно с помощью программного обеспечения Риш1-Апа1у81 3.1.
(7с) Трипсиновое разложение расщепленной глобиновой цепи.
Белковая полоса, соответствующая крупнейшей сшитой глобиновой цепи, выделяется из геля δΌδΡΑΟΕ, разрезается на кубики (1x1 мм) и снимается метка 10% метанола/10% уксусной кислоты. Кубики геля со снятыми метками расщепляют с помощью 10 ммоль ΌΤΤ в 25 мм ΝΗ4ί'Ό3 и алкилируют 55 ммоль иодоацетамида в 25 ммоль ΝΗ4ί'Ό3 на протяжении 45 мин в темноте, а затем в геле разлагаются с помощью 20 нг/мкл измененного трипсина в 25 мм ΝΗ4ί'Ό3 при 37°С всю ночь. После разложения трипсином разложенные трипсином пептиды извлекают путем диффузии в 50% (об./об.) ацетонитриле (АЦН) и 1% (об./об.) трифторуксусной кислоте (ТФК).
(7й) Ионизация лазерной десорбцией с использованием матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационно, времяпролетной масс-спектрометрии (ΜΑΡΌΙ-ΤΘΡ) масс-спектрометрический (Μδ) анализ.
Разложенные трипсином пептиды, извлеченные из белковой полосы, помещают на пластину Αηс1югс1ир. на которую предварительно наносят 1 мкл матричного раствора (2 мг/мл циано-4гидроксикоричной кислоты, насыщенной в 50% АЦН/0,1% ТФК, и оставляют сохнуть. После сушки нанесенный образец промывают 10 ммоль монофосфатного буфера и перекристаллизовывают с помощью раствора этанола:ацетона:0,1% ТФК (соотношение 6:3:1). Анализ ΜΑΡΌΙ-ΤΘΡ выполняют на Ргиксг
- 11 027238
АнЮЛех III (Вгикег Οαΐΐοηίο ОшЬН, Бремен, Германия), работающем в режиме рефлектрона в диапазоне м/з 800-3500 Да, а параметры установливают следующим образом: ионный источник 25 кВ для пептидной массовой карты (ПМК) и отражатель 26,3 кВ для ПМК. Внешняя калибровка выполняется с помощью калибровочного стандарта пептидной смеси Вгикег. Пики с соотношением сигнал/шум более 4 автоматически маркируются установкой Р1ех-Апа1у818 (Вгикег Ωαΐΐοηίο ОтЬН, Бремен, Германия). Данные Μδ далее анализируются в программном обеспечении ΜΑδΟΘΤ 2.2.04 и Βίοΐοοίδ 2.1 (Вгикег Ωαΐΐοηίο ОтЬН, Бремен, Германия), и в этих данных искались белки млекопитающих по неизбыточной базе данных Национального центра биотехнологической информации. Следующие параметры используют для поиска в базе данных: моноизотопная массовая точность <250 ч./млн, заряд исходного элемента +1, пропущенные разрывы 1, карбамидометилирование цистеина как постоянное изменение, окисление метионина как переменное изменение.
(7е) Анализ жидкостной хроматомасс-спектрометрией (Μδ/Μδ) с электрораспылительной ионизацией (ЬС-ΕδΙ).
Нано-ЬС МС/МС анализ разложенных трипсином пептидов белковой полосы выполняли с помощью капиллярной ВЭЖХ, связанной непосредственно с НСТ И11га ΕδΙ -масс-спектрометрической ионной ловушкой (Вгикег Ωαΐΐοηίο ОтЬН, Бремен, Германия). Продукты разложения пептидов растворяются в 0,1% муравьиной кислоты и 2% АЦН до подачи в колонку. Градиент от 4-90% (0,001% муравьиной кислоты и 0,001% муравьиной кислоты в 80% АЦН) используют для разделения пептидов с помощью колонки С18 (15 см, 75 нм, ЬС РАСК1ИО). Скорость потока составляет 250 нг/мин при 25°С. Элюаты из колонки С18 подают в НСТ И11га ΕδΙ - масс-спектрометрическую ионную ловушку, работающую в линейном режиме для анализа в режиме реального времени. Масс-спектрометрическая ионная ловушка оптимизирована по наноисточнику с напряжением распылителя 137 В и нагреваемой капиллярной температурой 160°С. Время накопления ионов пептидов в ионной ловушке задается на 200 мс, а соотношение масса/заряд выбирается для анализа МС/МС от 100 до 1800 Да с состоянием заряда 1-3.
Обращенно-фазная ВЭЖХ на колонке С4 УУИАС, контролируемая на длине волны 220 нм, используется для разделения различных типов перекрестно-поперечных сшивок, возникающих между α и β цепями ^ΒδΡ-перекрестно-сшитого бычьего гемоглобина. Характерные хроматографические участки, полученные с помощью бычьего гемоглобина до и после перекрестной сшивки с ^ΒδΡ, показаны на фиг. 9. На фиг. 9 α-цепи более мобильны, чем β-цепи естественного бычьего гемоглобина (как показано пунктирной линией). Их идентичность подтверждена анализом ΜΑΕΌΙ-ΤΘΡ. После реакции с ^ΒδΡ β-цепи сшиваются, хотя подавляющее большинство α-цепей остаются самостоятельными (как показано сплошной линией). В результате перекрестной сшивки с ^ΒδΡ, сформировалось 6 крупных глобиновых пиков с большей гидрофобностью, чем исходные β-цепи. Сшитые глобиновые цепи в ^ΒδΡ-сшитом бычьем гемоглобине также расщепляются 15% δΌδ-РАОЕ, как показано на фиг. 10. Крупнейшая сшитая глобиновая цепь (В6 на фиг. 10) подвергается трипсиновому разложению и последующему анализу ΜΑ^^IΤΘΡ, и она определяется только как β-глобиновая цепь, на основании своей пептидной массовой карты, как показано на фиг. 11.
Вышеизложенное изобретение было описано с учетом различных вариантов осуществления изобретения, но такие варианты осуществления изобретения не являются ограничивающими. Многочисленные изменения и дополнения будут понятны специалистам, обладающим знаниями в данной области техники. Такие дополнения и изменения считаются включенными в объем следующей формулы изобретения.
Claims (18)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостойкий переносчик кислорода на основе гемоглобина, который, по существу, состоит из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, имеющего β-β перекрестную сшивку более чем 40%, содержащий стадии:a) предоставление цельной крови млекопитающего, содержащей, по меньшей мере, эритроциты и плазму;b) отделение эритроцитов от плазмы в цельной крови млекопитающего;c) фильтрация эритроцитов, которые были отделены от плазмы, для получения фракции отфильтрованных эритроцитов;й) промывка фракции отфильтрованных эритроцитов для удаления белковых примесей из плазмы, образующихся в промываемых эритроцитах;е) разрушение промытых эритроцитов для получения раствора, включающего в себя лизат разрушенных эритроцитов;ί) осуществление фильтрации в лизате разрушенных эритроцитов для удаления по меньшей мере части концентрата отходов из лизата для получения первого гемоглобинового раствора;д) выполнение по меньшей мере одного процесса очистки для удаления одного или нескольких вирусов, концентрата отходов или белковых примесей для получения второго гемоглобинового раствора;й) перекрестная сшивка второго гемоглобинового раствора бис-3,5-дибромсалицилфумаратом для- 12 027238 получения перекрёстно-сшитого гемоглобина в оксигенированной среде, где перекрестно-сшитый гемоглобин является неполимерным перекрестно-сшитым тетрамерным гемоглобином, имеющим по меньшей мере 40% β-β перекрестную сшивку;ί) удаление любых остаточных химических веществ в перекрёстно-сшитом тетрамерном гемоглобине;_)) термическая обработка перекрестно-сшитого гемоглобина в дезоксигенированной среде для денатурирования и осаждения любого остаточного нестабилизированного/неперекрестно-сшитого гемоглобина, любого димерного гемоглобина и любых других белковых примесей таким образом, чтобы получаемый термостойкий перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин содержал неопределяемую концентрацию димера и состоял, по существу, из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина с β-β сшивкой по меньшей мере 40% и кислородной аффинностью больше, чем кислородная аффинность исходного гемоглобина того же вида, измеренная в существенно сходных условиях;k) удаление осадка в перекрестно-сшитом гемоглобине путем центрифугирования или фильтрации для получения очищенного и термоустойчивого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина;l) добавление очищенного и термостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина к фармацевтически приемлемому носителю.
- 2. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостабильный переносчик кислорода по п.1, отличающийся тем, что этап термической обработки Ц является высокотемпературным кратковременным (ΗΤδΤ) процессом, проводимым в интервале от приблизительно 70 до приблизительно 95°С в течение от 30 с до 3 ч, с последующим немедленным охлаждением и добавлением 0,2-0,4% Ν-ацетилцистеина непосредственно после охлаждения.
- 3. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостойкий переносчик кислорода по п.1, отличающийся тем, что цельной кровью является бычья цельная кровь, а ββ поперечная сшивка составляет более 50% и значение р50 меньше чем приблизительно 23 мм рт.ст.
- 4. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостойкий переносчик кислорода по п.1, отличающийся тем, что цельной кровью является бычья цельная кровь, а ββ поперечная сшивка составляет более 60% и значение р50 меньше чем приблизительно 23 мм рт.ст.
- 5. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостойкий переносчик кислорода по п.1, отличающийся тем, что очистку на этапе д) выполняют с помощью хроматографии, в которой применяют одну или несколько катионообменных колонок или анионообменных колонок.
- 6. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостойкий переносчик кислорода по п.5, отличающийся тем, что хроматографическая колонка представляет собой одну или более диэтиламиноэтиловую колонку и/или гидроксиапатитовую колонку.
- 7. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостойкий переносчик кислорода по п.1, отличающийся тем, что цельной кровью является человеческая кровь.
- 8. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостойкий переносчик кислорода по п.1, отличающийся тем, что цельной кровью является свиная кровь, лошадиная кровь или собачья кровь.
- 9. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостабильный переносчик кислорода по п.1, отличающийся тем, что этапом термической обработки Ц является высокотемпературный кратковременный (ΗΤδΤ) процесс, проводимый при температуре от приблизительно 70 до приблизительно 95°С в течение от 30 с до 3 ч, с последующим немедленным охлаждением и добавлением от 0,025 до 0,4% Ν-ацетилцистеина непосредственно после охлаждения.
- 10. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостабильный переносчик кислорода по п.1, отличающийся тем, что этапом термической обработки Ц является высокотемпературный кратковременный (ΗΤδΤ) процесс, проводимый при температуре приблизительно от 70 приблизительно до 95°С в течение от 30 с до 3 ч, с последующим немедленным охлаждением и добавлением от 0,025 до 0,2% Ν-ацетилцистеина непосредственно после охлаждения.
- 11. Высокоочищенная фармацевтическая композиция, содержащая термостабильный переносчик кислорода на основе гемоглобина, который, по существу, состоит из неполимерного перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина, имеющего β-β сшивку более 40%, полученный способом по п.1.
- 12. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостойкий переносчик кислорода на основе гемоглобина, который, по существу, состоит из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, имеющего β-β сшивку более 50%, содержащий стадии:a) предоставление цельной крови млекопитающего, содержащей, по меньшей мере, эритроциты и плазму;b) отделение эритроцитов от плазмы в цельной крови млекопитающего;c) фильтрация эритроцитов, которые были отделены от плазмы, для получения фракции фильтрованных эритроцитов;б) промывка фракции отфильтрованных эритроцитов для удаления белковых примесей из плазмы,- 13 027238 образующихся в промываемых эритроцитах;е) разрушение промытых эритроцитов для получения раствора, включающего в себя лизат разрушенных эритроцитов;ί) осуществление фильтрации в лизате разрушенных эритроцитов для удаления по меньшей мере части концентрата отходов из лизата для получения первого гемоглобинового раствора;д) выполнение по меньшей мере одного процесса очистки для удаления одного или нескольких вирусов, концентрата отходов или белковых примесей для получения второго гемоглобинового раствора;Е) перекрестная сшивка второго гемоглобинового раствора бис-3,5-дибромсалицилфумаратом для получения перекрестно-сшитого гемоглобина в дезоксигенированной среде, где перекрестно-сшитый гемоглобин является неполимерным сшитым тетрамерным гемоглобином, имеющим по меньшей мере 50% β-β сшивку;ί) удаление любых остаточных химических веществ в перекрёстно-сшитом тетрамерном гемоглобине;_)) термическая обработка перекрестно-сшитого гемоглобина в дезоксигенированной среде для денатурирования и осаждения любого остаточного нестабилизированного/неперекрестно-сшитого гемоглобина, любого димерного гемоглобина и любых других белковых примесей таким образом, чтобы получаемый термостойкий перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин содержал неопределяемую концентрацию димера и состоял, по существу. из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина с β-β сшивкой по меньшей мере 50%, имеющего кислородную аффинность меньше, чем кислородная аффинность исходного гемоглобина того же вида, измеренная в существенно сходных условиях;k) удаление осадка в перекрёстно-сшитом тетрамерном гемоглобине путем центрифугирования или фильтрации для получения очищенного и термоустойчивого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина; иl) добавление очищенного и термостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина к фармацевтически приемлемому носителю.
- 13. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостабильный переносчик кислорода по п.12, отличающийся тем, что цельной кровью является бычья цельная кровь, а кислородная аффинность перекрестно-сшитого тетрамерного бычьего гемоглобина имеет значение р50 порядка от приблизительно 38 до приблизительно 50 мм рт.ст.
- 14. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостабильный переносчик кислорода по п.13, отличающийся тем, что этапом термической обработки Ц является высокотемпературный кратковременный (НТЗТ) процесс, проводимый при температуре от приблизительно 70 приблизительно до 95°С в течение от 30 с до 3 ч, с последующим немедленным охлаждением и добавлением от 0,025 до 0,4% Ν-ацетилцистеина непосредственно после охлаждения.
- 15. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостабильный переносчик кислорода по п.13, отличающийся тем, что этапом термической обработки Ц является высокотемпературный кратковременный (НТЗТ) процесс, проводимый при температуре от приблизительно 70 приблизительно до 95°С в течение от 30 с до 3 ч, с последующим немедленным охлаждением и добавлением от 0,025 до 0,2% Ν-ацетилцистеина непосредственно после охлаждения.
- 16. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостабильный переносчик кислорода по п.13, отличающийся тем, что этапом термической обработки Ц является высокотемпературный кратковременный (НТЗТ) процесс, проводимый при температуре от приблизительно 70 до приблизительно 95°С в течение от 30 с до 3 ч, с последующим немедленным охлаждением и добавлением от 0,2 до 0,4% Ν-ацетилцистеина непосредственно после охлаждения.
- 17. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостабильный переносчик кислорода на основе гемоглобина, по существу, состоящий из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, имеющего β-β сшивку более 40%, содержащий следующие стадии:a) предоставление цельной крови млекопитающего, содержащей, по меньшей мере, эритроциты и плазму;b) отделение эритроцитов от плазмы в цельной крови млекопитающего;c) фильтрация эритроцитов, которые были отделены от плазмы, для получения фракции отфильтрованных эритроцитов;б) промывка фракции фильтрованных эритроцитов для удаления белковых примесей из плазмы, образующихся в промываемых эритроцитах;е) разрушение промытых эритроцитов для получения раствора, включающего в себя лизат разрушенных эритроцитов;ί) осуществление фильтрации для удаления в лизате разрушенных эритроцитов по меньшей мере части концентрата отходов из лизата для получения первого гемоглобинового раствора;д) выполнение по меньшей мере одного процесса очистки для удаления одного или нескольких вирусов, концентрата отходов или белковых примесей для получения второго гемоглобинового раствора;- 14 027238й) перекрестная сшивка второго гемоглобинового раствора бис-3,5-дибромсалицилфумаратом для получения перекрестно-сшитого гемоглобина в оксигенированной среде, где перекрестно-сшитый гемоглобин является неполимерным сшитым тетрамерным гемоглобином, имеющим по меньшей мере 40% ββ сшивку;ί) удаление любых остаточных химических веществ в перекрестно-сшитом тетрамерном гемоглобине;_)) термическая обработка перекрестно-сшитого гемоглобина в дезоксигенированной среде для денатурирования и осаждения любого остаточного нестабилизированного/неперекрестно-сшитого гемоглобина, любого димерного гемоглобина и любых других белковых примесей таким образом, чтобы получаемый термостойкий перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин содержал неопределяемую концентрацию димера и состоял, по существу, из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина с β-β сшивкой по меньшей мере 40% и кислородной аффинностью больше, чем кислородная аффинность исходного гемоглобина того же вида, измеренная, по существу, в сходных условиях;k) охлаждение полученного термостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина;l) добавление 0,025-0,4% Ν-ацетилцистеина к термоустойчивому перекрёстно-сшитому тетрамерному гемоглобину;т) удаление осадка в термоустойчивом перекрестно-сшитом гемоглобине путем центрифугирования или фильтрации для получения очищенного и термоустойчивого перекрёстно-сшитого тетрамерного гемоглобина ип) добавление очищенного и термостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина к фармацевтически приемлемому носителю.
- 18. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостабильный переносчик кислорода, на основе гемоглобина, который, по существу, состоит из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, имеющего β-β сшивку более 50%, содержащий следующие стадии:a) предоставление цельной крови млекопитающего, содержащей, по меньшей мере, эритроциты и плазму;b) отделение эритроцитов от плазмы в цельной крови млекопитающего;c) фильтрация эритроцитов, которые были отделены от плазмы, для получения фракции отфильтрованных эритроцитов;ά) промывка фракции фильтрованных эритроцитов для удаления плазменных белковых примесей, образующихся в промываемых эритроцитах;е) разрушение промытых эритроцитов для получения раствора, включающего в себя лизат разрушенных эритроцитов;ί) осуществление фильтрации для удаления в лизате разрушенных эритроцитов по меньшей мере части концентрата отходов из лизата для получения первого гемоглобинового раствора;д) выполнение по меньшей мере одного процесса очистки для удаления одного или нескольких вирусов, концентрата отходов или белковых примесей для получения второго гемоглобинового раствора;й) перекрестная сшивка второго гемоглобинового раствора бис-3,5-дибромсалицилфумаратом для получения перекрестно-сшитого гемоглобина в дезоксигенированной среде, где перекрестно-сшитый гемоглобин является неполимерным сшитым тетрамерным гемоглобином, имеющим по меньшей мере 50% β-β сшивку;ί) удаление любых остаточных химических веществ в перекрестно-сшитом тетрамерном гемоглобине;_)) термическая обработка перекрестно-сшитого гемоглобина в дезоксигенированной среде для денатурирования и осаждения любого остаточного нестабилизированного/неперекрестно-сшитого гемоглобина, любого димерного гемоглобина и любых других белковых примесей таким образом, чтобы получаемый термостойкий перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин содержал неопределяемую концентрацию димера и состоял преимущественно из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина с β-β сшивкой по меньшей мере 50%, имеющего кислородную аффинность меньше, чем кислородная аффинность исходного гемоглобина того же вида, измеренная, по существу. в сходных условиях;k) охлаждение полученного термостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина;l) добавление 0,025-0,4% Ν-ацетилцистеина к термоустойчивому перекрёстно-сшитому тетрамерному гемоглобину;т) удаление осадка в термоустойчивом перекрестно-сшитом гемоглобине путем центрифугирования или фильтрации для получения очищенного и термоустойчивого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина,п) добавление очищенного и термостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина к фармацевтически приемлемому носителю.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201161529279P | 2011-08-31 | 2011-08-31 | |
| US13/225,797 US20130052232A1 (en) | 2011-08-31 | 2011-09-06 | Method for the preparation of a heat stable oxygen carrier-containing composition facilating beta-beta cross-linking |
| US13/275,366 US8106011B1 (en) | 2011-08-31 | 2011-10-18 | Method for the preparation of a heat stable oxygen carrier-containing composition facilating beta-beta cross-linking |
| PCT/US2012/051959 WO2013032828A2 (en) | 2011-08-31 | 2012-08-23 | Method for the preparation of a heat stable oxygen carrier-containing composition facilating beta-beta cross-linking |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201400169A1 EA201400169A1 (ru) | 2014-06-30 |
| EA027238B1 true EA027238B1 (ru) | 2017-07-31 |
Family
ID=45508128
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201400169A EA027238B1 (ru) | 2011-08-31 | 2012-08-23 | Способ получения композиции, содержащей термостойкий переносчик кислорода на основе гемоглобина |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20130052232A1 (ru) |
| EP (1) | EP2750700B1 (ru) |
| JP (1) | JP6148673B2 (ru) |
| KR (1) | KR101794932B1 (ru) |
| CN (1) | CN103796671A (ru) |
| AP (1) | AP3848A (ru) |
| AU (1) | AU2012300475B2 (ru) |
| BR (1) | BR112014003480A2 (ru) |
| CA (1) | CA2844510C (ru) |
| CL (1) | CL2014000328A1 (ru) |
| DK (1) | DK2750700T3 (ru) |
| EA (1) | EA027238B1 (ru) |
| ES (1) | ES2664589T3 (ru) |
| IL (1) | IL231198A0 (ru) |
| MA (1) | MA35358B1 (ru) |
| MX (1) | MX352941B (ru) |
| MY (1) | MY163300A (ru) |
| SG (1) | SG2014011498A (ru) |
| TW (2) | TWI408145B (ru) |
| WO (1) | WO2013032828A2 (ru) |
| ZA (1) | ZA201401518B (ru) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013036383A1 (en) | 2011-09-06 | 2013-03-14 | Bing Lou Wong | Oral delivery for hemoglobin based oxygen carriers |
| MX358785B (es) * | 2012-03-29 | 2018-09-04 | Sangart Inc | Hemoglobina pegilada reticulada con diaspirina. |
| US10385116B2 (en) | 2013-01-07 | 2019-08-20 | Omniox, Inc. | Polymeric forms of H-NOX proteins |
| EA032164B1 (ru) * | 2013-05-13 | 2019-04-30 | Вижн Глобал Холдингс Лтд. | Содержащая модифицированное лекарственное вещество на основе гемоглобина фармацевтическая композиция для таргетной терапии рака и диагностической визуализации |
| US9814759B2 (en) | 2014-07-02 | 2017-11-14 | Cheer Global Ltd. | Pharmaceutical composition comprising recombinant hemoglobin protein or subunit-based therapeutic agent for cancer targeting treatment |
| US9763889B2 (en) | 2015-06-29 | 2017-09-19 | Billion King International Ltd. | Oral delivery system for hemoglobin based oxygen carriers |
| US10052290B2 (en) | 2016-02-04 | 2018-08-21 | Billion King International Ltd. | Enteric-coated hemoglobin multiparticulate for oral delivery of hemoglobin based oxygen carriers |
| AU2018304174A1 (en) | 2017-07-18 | 2020-02-06 | VirTech Bio, Inc. | Blood substitutes comprising hemoglobin and methods of making |
| BR112022003751A2 (pt) * | 2019-08-29 | 2022-05-31 | Billion King Int Ltd | Análogos de hemoglobina reticulada com tiosuccinila e métodos de uso e preparação dos mesmos |
| CN110522904A (zh) * | 2019-09-09 | 2019-12-03 | 润方（北京）生物医药研究院有限公司 | 一种抑制血压升高的聚合血红蛋白 |
| CN114514034A (zh) * | 2019-10-11 | 2022-05-17 | 医疗技术协会第二股份有限公司 | 稳定的血红蛋白组合物及其药物制剂 |
| WO2022184005A1 (en) * | 2021-03-01 | 2022-09-09 | Billion King International Limited | Thiosuccinyl-crosslinked hemoglobin conjugates and methods of use and preparation thereof |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100035797A1 (en) * | 2006-10-23 | 2010-02-11 | IKOR Inc., a South Dakota Corporation | Nitric oxide-blocked cross-linked tetrameric hemoglobin |
| US7932356B1 (en) * | 2010-06-23 | 2011-04-26 | Bing Lou Wong | Method for the preparation of a heat stable oxygen carrier-containing pharmaceutical composition |
| US7989593B1 (en) * | 2010-05-27 | 2011-08-02 | Bing Lou Wong | Method for the preparation of a high-temperature stable oxygen-carrier-containing pharmaceutical composition and the use thereof |
Family Cites Families (60)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4529719A (en) | 1983-05-04 | 1985-07-16 | Tye Ross W | Modified crosslinked stroma-free tetrameric hemoglobin |
| FR2548671B1 (fr) | 1983-07-07 | 1986-05-02 | Merieux Inst | Procede de preparation de globine a partir d'hemoglobine et globine obtenue par ce procede |
| US4831012A (en) | 1984-03-23 | 1989-05-16 | Baxter International Inc. | Purified hemoglobin solutions and method for making same |
| USRE34271E (en) | 1984-06-27 | 1993-06-01 | University Of Iowa Research Foundation | Production of alpha-alpha cross-linked hemoglobins in high yield |
| US4598064A (en) | 1984-06-27 | 1986-07-01 | University Of Iowa Research Foundation | Alpha-alpha cross-linked hemoglobins |
| US4600531A (en) | 1984-06-27 | 1986-07-15 | University Of Iowa Research Foundation | Production of alpha-alpha cross-linked hemoglobins in high yield |
| US5464814A (en) | 1986-06-20 | 1995-11-07 | Northfield Laboratories, Inc. | Acellular red blood cell substitute |
| JPH0750329B2 (ja) | 1986-06-23 | 1995-05-31 | 富士写真フイルム株式会社 | 画像形成材料 |
| US5084558A (en) | 1987-10-13 | 1992-01-28 | Biopure Corporation | Extra pure semi-synthetic blood substitute |
| US5955581A (en) | 1986-11-10 | 1999-09-21 | Biopure Corporation | Method for producing a stable polymerized hemoglobin blood-substitute |
| CA1312009C (en) | 1986-11-10 | 1992-12-29 | Carl W. Rausch | Extra pure semi-synthetic blood substitute |
| US5753616A (en) | 1986-11-10 | 1998-05-19 | Biopure Corporation | Method for producing a stable polymerized hemoglobin blood-substitute |
| US5189146A (en) | 1987-05-05 | 1993-02-23 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of National Defence | Pasteurizable, freeze-driable hemoglobin-based blood substitute |
| JP2592973B2 (ja) | 1988-06-15 | 1997-03-19 | バクスター インターナショナル インコーポレーテッド | 架橋ヘモグロビンの精製方法 |
| US5439882A (en) | 1989-12-29 | 1995-08-08 | Texas Tech University Health Sciences Center | Blood substitute |
| US5250665A (en) | 1991-05-31 | 1993-10-05 | The University Of Toronto Innovations Foundation | Specifically β-β cross-linked hemoglobins and method of preparation |
| US5344393A (en) | 1992-02-28 | 1994-09-06 | Alliance Pharmaceutical Corp. | Use of synthetic oxygen carriers to facilitate oxygen delivery |
| US6187744B1 (en) | 1992-03-11 | 2001-02-13 | Michael W. Rooney | Methods and compositions for regulating the intravascular flow and oxygenating activity of hemoglobin in a human or animal subject |
| US5840851A (en) | 1993-07-23 | 1998-11-24 | Plomer; J. Jeffrey | Purification of hemoglobin |
| US5767089A (en) | 1993-08-16 | 1998-06-16 | Hsia; Jen-Chang | Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules |
| US5741893A (en) | 1993-08-16 | 1998-04-21 | Hsia; Jen-Chang | Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules |
| US5725839A (en) | 1993-08-16 | 1998-03-10 | Hsia; Jen-Chang | Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules for ERI or MRI |
| US5840701A (en) | 1993-08-16 | 1998-11-24 | Hsia; Jen-Chang | Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules |
| US5804561A (en) | 1993-08-16 | 1998-09-08 | Hsia; Jen-Chang | Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules |
| TW381022B (en) | 1993-08-16 | 2000-02-01 | Hsia Jen Chang | Compositions and methods utilizing nitroxides to avoid oxygen toxicity, particularly in stabilized, polymerized, conjugated, or encapsulated hemoglobin used as a red cell substitute |
| US5817632A (en) | 1993-08-16 | 1998-10-06 | Hsia; Jen-Chang | Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules |
| US5824781A (en) | 1993-08-16 | 1998-10-20 | Hsia; Jen-Chang | Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules |
| US5807831A (en) | 1993-08-16 | 1998-09-15 | Hsia; Jen-Chang | Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules |
| US5631219A (en) | 1994-03-08 | 1997-05-20 | Somatogen, Inc. | Method of stimulating hematopoiesis with hemoglobin |
| US6242417B1 (en) | 1994-03-08 | 2001-06-05 | Somatogen, Inc. | Stabilized compositions containing hemoglobin |
| EP0804734B1 (en) | 1994-05-13 | 2005-05-04 | Miltenyi Biotec GmbH | Sterile and pyrogen-free columns coupled to protein for binding and removal of substances from blood |
| SE9500724D0 (sv) | 1994-06-23 | 1995-02-24 | Pharmacia Ab | Filtrering |
| US6288027B1 (en) | 1995-03-23 | 2001-09-11 | Biopure Corporation | Preserving a hemoglobin blood substitute with a transparent overwrap |
| US5895810A (en) | 1995-03-23 | 1999-04-20 | Biopure Corporation | Stable polymerized hemoglobin and use thereof |
| US6610832B1 (en) | 1995-03-23 | 2003-08-26 | Biopure Corporation | Preserving a hemoglobin blood substitute with a transparent overwrap |
| US5691453A (en) | 1995-06-07 | 1997-11-25 | Biopure Corporation | Separation of polymerized hemoglobin from unpolymerized hemoglobin on hydroxyapatite using HPLC |
| US5865784A (en) | 1995-06-07 | 1999-02-02 | Alliance Pharmaceutical Corp. | Method of hemodilution facilitated by monitoring oxygenation status |
| US5741894A (en) | 1995-09-22 | 1998-04-21 | Baxter International, Inc. | Preparation of pharmaceutical grade hemoglobins by heat treatment in partially oxygenated form |
| WO1997019956A1 (en) | 1995-11-30 | 1997-06-05 | Somatogen, Inc. | Method for control of functionality during cross-linking of hemoglobins |
| ES2205074T3 (es) | 1996-03-21 | 2004-05-01 | KOBUSCH-SENGEWALD GMBH & CO.KG | Pelicula multicapa y procedimiento para su produccion, y su utilizacion. |
| DE69733664T3 (de) | 1996-04-19 | 2011-04-14 | Grifols Inc. (n.d. Ges.d.Staates Delaware), Los Angeles | Verfahren zur INaktivierung von Viren und Lyophilisierung von Blutproteinen |
| US5814601A (en) | 1997-02-28 | 1998-09-29 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for optimization of oxygen transport by cell-free systems |
| DE69831248T2 (de) | 1997-02-28 | 2006-04-13 | The Regents Of The University Of California, Oakland | Verfahren und zusammensetzungen zur optimierung des sauerstofftransportes in zellfreien systemen |
| CN1203900C (zh) | 1998-01-06 | 2005-06-01 | 塞鲁斯公司 | 用于淬灭生物材料中病原体灭活剂的方法 |
| US6894150B1 (en) | 1999-10-01 | 2005-05-17 | Ross Walden Tye | Non-pyrogenic, endotoxin-free, stroma-free tetrameric hemoglobin |
| US6747132B2 (en) | 2000-11-29 | 2004-06-08 | Apex Biosciences, Inc. | Methods for the synthesis of a modified hemoglobin solution |
| US6518010B2 (en) | 2001-02-28 | 2003-02-11 | Biopure Corporation | Use of defibrinated blood for manufacture of a hemoglobin-based oxygen carrier |
| CN100338093C (zh) | 2001-04-18 | 2007-09-19 | 北方实验室公司 | 储存稳定的血红蛋白溶液的柔韧性容器系统 |
| JP4260417B2 (ja) | 2001-05-23 | 2009-04-30 | ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト | 溶液を輸送し脱酸素するためのシステム及び方法 |
| US7038016B2 (en) | 2001-08-21 | 2006-05-02 | Apex Bioscience, Inc. | Methods for purification of an activated PEG solution and for the synthesis of a modified hemoglobin solution |
| US20050164915A1 (en) | 2002-04-01 | 2005-07-28 | Sangart, Inc. | Compositions for oxygen transport comprising a high oxygen affinity modified hemoglobin |
| US20030153491A1 (en) | 2002-01-11 | 2003-08-14 | Winslow Robert M. | Methods and compositions for oxygen transport comprising a high oxygen affinity modified hemoglobin |
| US7501499B2 (en) | 2002-12-23 | 2009-03-10 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Modified hemoglobin and methods of making same |
| US7135553B2 (en) | 2003-01-29 | 2006-11-14 | Northfield Laboratories, Inc. | Polymerized hemoglobin solutions having reduced amounts of tetramer and method for preparing |
| CN101094692A (zh) | 2004-10-29 | 2007-12-26 | 塞鲁斯公司 | 用于红细胞灭活过程的改进的猝灭方法 |
| WO2007065265A1 (en) | 2005-12-08 | 2007-06-14 | Ronald Kluger | Cross-linking reagents for hemoglobin and hemoglobin products cross-linked therewith |
| US7759306B2 (en) | 2006-05-16 | 2010-07-20 | Simoni Jan S | Methods of treating acute blood loss |
| US7795401B2 (en) | 2006-09-06 | 2010-09-14 | National Chung Cheng University | Modified hemoglobin with allosteric effector conjugated |
| US7494974B2 (en) | 2006-10-24 | 2009-02-24 | Ikor, Inc. | Carboxymethylated cross-linked tetrameric hemoglobin |
| US20110319332A1 (en) * | 2010-06-23 | 2011-12-29 | Bing Lou Wong | Treatment methods using a heat stable oxygen carrier-containing pharmaceutical composition |
-
2011
- 2011-09-06 US US13/225,797 patent/US20130052232A1/en not_active Abandoned
- 2011-10-18 US US13/275,366 patent/US8106011B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-08-23 KR KR1020147005337A patent/KR101794932B1/ko active IP Right Grant
- 2012-08-23 DK DK12828756.2T patent/DK2750700T3/en active
- 2012-08-23 SG SG2014011498A patent/SG2014011498A/en unknown
- 2012-08-23 AU AU2012300475A patent/AU2012300475B2/en not_active Ceased
- 2012-08-23 EP EP12828756.2A patent/EP2750700B1/en not_active Not-in-force
- 2012-08-23 MY MYPI2014000538A patent/MY163300A/en unknown
- 2012-08-23 MX MX2014002327A patent/MX352941B/es active IP Right Grant
- 2012-08-23 ES ES12828756.2T patent/ES2664589T3/es active Active
- 2012-08-23 CA CA2844510A patent/CA2844510C/en active Active
- 2012-08-23 WO PCT/US2012/051959 patent/WO2013032828A2/en active Application Filing
- 2012-08-23 EA EA201400169A patent/EA027238B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2012-08-23 TW TW101130613A patent/TWI408145B/zh not_active IP Right Cessation
- 2012-08-23 JP JP2014528460A patent/JP6148673B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2012-08-23 TW TW102123160A patent/TWI526218B/zh active
- 2012-08-23 CN CN201280038971.4A patent/CN103796671A/zh active Pending
- 2012-08-23 BR BR112014003480A patent/BR112014003480A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2012-08-23 AP AP2014007545A patent/AP3848A/en active
-
2014
- 2014-02-10 CL CL2014000328A patent/CL2014000328A1/es unknown
- 2014-02-24 MA MA36775A patent/MA35358B1/fr unknown
- 2014-02-27 ZA ZA2014/01518A patent/ZA201401518B/en unknown
- 2014-02-27 IL IL231198A patent/IL231198A0/en active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100035797A1 (en) * | 2006-10-23 | 2010-02-11 | IKOR Inc., a South Dakota Corporation | Nitric oxide-blocked cross-linked tetrameric hemoglobin |
| US7989593B1 (en) * | 2010-05-27 | 2011-08-02 | Bing Lou Wong | Method for the preparation of a high-temperature stable oxygen-carrier-containing pharmaceutical composition and the use thereof |
| US7932356B1 (en) * | 2010-06-23 | 2011-04-26 | Bing Lou Wong | Method for the preparation of a heat stable oxygen carrier-containing pharmaceutical composition |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GOEBEL, C. et al. Methodologies for Detection of Hemoglobin-Based Oxygen Carriers. Journal of Chromatographic Science. 2005. Vol. 43, pp. 39-46. See the whole document * |
| HARRIS, D.R. et al. Modern Cross-linking Strategies for Synthesizing Acellular Hemoglobin-Based Oxygen Carriers. Biotechnol. Prog. 2008. Vol. 24, No. 6, pp. 1215-1225. See the whole document * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA027238B1 (ru) | Способ получения композиции, содержащей термостойкий переносчик кислорода на основе гемоглобина | |
| AU2011221433B2 (en) | A method for the preparation of a high-temperature stable oxygen-carrier-containing pharmaceutical composition and the use thereof | |
| AU2011201619B8 (en) | A method for the preparation of a heat stable oxygen carrier-containing pharmaceutical composition | |
| EA023689B1 (ru) | Способ приготовления фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода | |
| US8742073B2 (en) | Method for the preparation of a high-temperature stable oxygen-carrier-containing pharmaceutical composition and the use thereof | |
| OA16419A (en) | Method for the preparation of a heat stable oxygen carrier-containing composition facilitating beta-beta cross-linking. | |
| NZ620913B2 (en) | Method for the preparation of a heat stable oxygen carrier-containing composition facilitating beta-beta cross-linking |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM RU |