JP2592973B2 - 架橋ヘモグロビンの精製方法 - Google Patents
架橋ヘモグロビンの精製方法Info
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- JP2592973B2 JP2592973B2 JP1505829A JP50582989A JP2592973B2 JP 2592973 B2 JP2592973 B2 JP 2592973B2 JP 1505829 A JP1505829 A JP 1505829A JP 50582989 A JP50582989 A JP 50582989A JP 2592973 B2 JP2592973 B2 JP 2592973B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 可成りの量の研究が、生活患者の循環系中の酸素担体
としての赤血球用代替物（substitute）の開発を指向し
て来た。この研究は、血液または赤血球全体の利用を超
える数種類の潜在的な利点を提供するという事実によっ
て促進されて来た。一つの利点として、人工酸素担体は
赤血球の場合のようにタイピング（typing）および交差
試験法を必要としない。他の利点として、人工酸素担体
はエイズまたは肝炎伝搬の危険を殆ど有していないこと
である。赤血球代替物の第三の利点は長期貯蔵の可能性
である。
としての赤血球用代替物（substitute）の開発を指向し
て来た。この研究は、血液または赤血球全体の利用を超
える数種類の潜在的な利点を提供するという事実によっ
て促進されて来た。一つの利点として、人工酸素担体は
赤血球の場合のようにタイピング（typing）および交差
試験法を必要としない。他の利点として、人工酸素担体
はエイズまたは肝炎伝搬の危険を殆ど有していないこと
である。赤血球代替物の第三の利点は長期貯蔵の可能性
である。
この分野における長期の実験は赤血球代替物として基
質を含まない（stroma−free）ヘモグロビンの使用を検
討して来た。基質非含有ヘモグロビンを動物の静脈内に
注入すると、その循環系内でそれは酸素担体として短時
間機能する。しかし、残念ながら天然のヘモグロビン四
量体は低分子量成分に解離し、これらは腎臓を経由して
容易に排出される。従って、遊離のヘモグロビンは循環
によって身体から迅速に除去され、これは酸素担体血液
代替物としての遊離ヘモグロビンの有用性を顕著に制限
するものである。
質を含まない（stroma−free）ヘモグロビンの使用を検
討して来た。基質非含有ヘモグロビンを動物の静脈内に
注入すると、その循環系内でそれは酸素担体として短時
間機能する。しかし、残念ながら天然のヘモグロビン四
量体は低分子量成分に解離し、これらは腎臓を経由して
容易に排出される。従って、遊離のヘモグロビンは循環
によって身体から迅速に除去され、これは酸素担体血液
代替物としての遊離ヘモグロビンの有用性を顕著に制限
するものである。
身体からのヘモグロビンの急速排出を阻止するための
試みにおいて、多くの研究者等はヘモグロビンの共有結
合架橋を検討して来たが、それは生成物の分子量が大き
な度合いで増加することの無い分子内架橋と、生成物の
分子量が天然のヘモグロビンの分子量よりも極端に大き
くなる（約64,000）分子内架橋との両者であった。使用
される代表的な架橋剤はグルタルアルデヒドおよび3,5
−ジブロモサリチル−ビス−フマレートである。たとえ
ば、この種の主題を取り扱っている下記の米国特許、メ
イザー（Mazur）の米国特許第3,925,344号、ボンハード
他（Bonhard et al.）の米国特許第4,336,248号、ボン
スン（Bonsen）の米国特許第4,001,200号、第4,001,401
号および第4,053,590号、モーリス他（Morris et al.）
の米国特許第4,061,736号、タイ（Tye）の米国特許第4,
529,719号、ウォルダー（Walder）の米国特許第4,598,0
64号および第4,600,531号ならびにオランダ国特許第740
4140号を参照されたい。この主題に関してはまた、可成
りの量の技術文献が存在している。
試みにおいて、多くの研究者等はヘモグロビンの共有結
合架橋を検討して来たが、それは生成物の分子量が大き
な度合いで増加することの無い分子内架橋と、生成物の
分子量が天然のヘモグロビンの分子量よりも極端に大き
くなる（約64,000）分子内架橋との両者であった。使用
される代表的な架橋剤はグルタルアルデヒドおよび3,5
−ジブロモサリチル−ビス−フマレートである。たとえ
ば、この種の主題を取り扱っている下記の米国特許、メ
イザー（Mazur）の米国特許第3,925,344号、ボンハード
他（Bonhard et al.）の米国特許第4,336,248号、ボン
スン（Bonsen）の米国特許第4,001,200号、第4,001,401
号および第4,053,590号、モーリス他（Morris et al.）
の米国特許第4,061,736号、タイ（Tye）の米国特許第4,
529,719号、ウォルダー（Walder）の米国特許第4,598,0
64号および第4,600,531号ならびにオランダ国特許第740
4140号を参照されたい。この主題に関してはまた、可成
りの量の技術文献が存在している。
ヘモグロビンを架橋剤と反応させると、その生成物は
殆ど常に可成りの量の未改質、非架橋ヘモグロビンを含
む生成物から成る混合物となる。若干の架橋ヘモグロビ
ンは、細胞非含有血液代替物としての著しい徴候を示す
が、注入の結果いずれにせよ腎臓によって未改質ヘモグ
ロビンは迅速に除去されることになるので、それを除去
するのが望ましいように思われるし、また大量の遊離、
非架橋ヘモグロビンが毒性を示す或る種の証拠が存在す
る。知られた先行技術において、未改質、非架橋ヘモグ
ロビンは架橋ヘモグロビンからたとえばクロマトグラフ
法のような技術により除去される。クロマトグラフ法は
骨が折れ、かつ高価な方法であって、生産可能な精製、
架橋へモグロビンの量に関して苛酷な拘束を強いるもの
である。
殆ど常に可成りの量の未改質、非架橋ヘモグロビンを含
む生成物から成る混合物となる。若干の架橋ヘモグロビ
ンは、細胞非含有血液代替物としての著しい徴候を示す
が、注入の結果いずれにせよ腎臓によって未改質ヘモグ
ロビンは迅速に除去されることになるので、それを除去
するのが望ましいように思われるし、また大量の遊離、
非架橋ヘモグロビンが毒性を示す或る種の証拠が存在す
る。知られた先行技術において、未改質、非架橋ヘモグ
ロビンは架橋ヘモグロビンからたとえばクロマトグラフ
法のような技術により除去される。クロマトグラフ法は
骨が折れ、かつ高価な方法であって、生産可能な精製、
架橋へモグロビンの量に関して苛酷な拘束を強いるもの
である。
その上、或る場合には架橋ヘモグロビンからの非架橋
ヘモグロビンの分離が技術的に困難であると共に高価な
ものとなる。それは反応の副生物がクロマトグラフのカ
ラムに不可逆的に結合することになり、これがカラムの
機能的能力を減少させるからである。
ヘモグロビンの分離が技術的に困難であると共に高価な
ものとなる。それは反応の副生物がクロマトグラフのカ
ラムに不可逆的に結合することになり、これがカラムの
機能的能力を減少させるからである。
本発明によって、架橋ヘモグロビンの精製方法が提供
され、これはクロマトグラフ法と比較して非常に簡略化
されると共に実質的な費用の減少を伴うものである。そ
の結果、架橋ヘモグロビンの製造が非常に容易となる。
され、これはクロマトグラフ法と比較して非常に簡略化
されると共に実質的な費用の減少を伴うものである。そ
の結果、架橋ヘモグロビンの製造が非常に容易となる。
発明の説明 本発明において、非架橋のヘモグロビンと混合してい
る架橋ヘモグロビンを精製するための方法が提供され
る。本発明によれば、所要量の架橋ヘモグロビンの沈殿
を伴うことなく、存在する非架橋ヘモグロビン（ならび
に屡々他の不純物）の可成りの量を沈殿させるに足る時
間に亘って、架橋ヘモグロビンが温度約60゜乃至85℃に
加熱される。その後、架橋ヘモグロビンから生成された
沈殿物を、代表的には遠心分離または濾過によって分離
する。
る架橋ヘモグロビンを精製するための方法が提供され
る。本発明によれば、所要量の架橋ヘモグロビンの沈殿
を伴うことなく、存在する非架橋ヘモグロビン（ならび
に屡々他の不純物）の可成りの量を沈殿させるに足る時
間に亘って、架橋ヘモグロビンが温度約60゜乃至85℃に
加熱される。その後、架橋ヘモグロビンから生成された
沈殿物を、代表的には遠心分離または濾過によって分離
する。
好ましくは、架橋ヘモグロビンは本発明に従ってpH6.
5乃至９、最も好ましくはpH7乃至８、そして具体的には
pH約7.5において処理される。加熱工程の期間は略１乃
至６時間が好ましい。
5乃至９、最も好ましくはpH7乃至８、そして具体的には
pH約7.5において処理される。加熱工程の期間は略１乃
至６時間が好ましい。
本発明の一実施態様において、ヘモグロビンは加熱の
間実質的に酸素を分離した状態に維持すればよい。これ
は様々な溶液脱ガス法によって達成することができる。
これらに包含されるが、それに限定されないものには、
不活性ガスを用いる散布、隔膜ガス交換装置を経由させ
る循環およびヘモグロビン溶液を真空に対し暴露させる
というものがある。この種の方法の適切さはそれらが、
たとえば発泡、酸性化等によってヘモグロビンの劣化を
促進する程度により制限されることになる。たとえば、
ヘモグロビンを隔膜オキシジェネータ（oxy−genato
r）、たとえば流動窒素またはアルゴンで充填されたオ
キシジェネータのガスチャンネルを備えている、ミネソ
タ州、ミネアポリスのSci−Medライフ・システム・イン
コーポレーテッドの型番号08−2A隔膜オキシジェネータ
中を通過させればよい。この種の方法によってヘモグロ
ビンを脱酸素し、引き続き本発明に従って、再酸素添加
を阻止するためにシールされた酸素非含有容器中で加熱
すればよい。他の代替法として、たとえば周知のバブル
−タイプ・オキシジェネータを利用して酸素非含有不活
性ガス、たとえば窒素またはアルゴンをもってヘモグロ
ビン溶液を散布すればよい。
間実質的に酸素を分離した状態に維持すればよい。これ
は様々な溶液脱ガス法によって達成することができる。
これらに包含されるが、それに限定されないものには、
不活性ガスを用いる散布、隔膜ガス交換装置を経由させ
る循環およびヘモグロビン溶液を真空に対し暴露させる
というものがある。この種の方法の適切さはそれらが、
たとえば発泡、酸性化等によってヘモグロビンの劣化を
促進する程度により制限されることになる。たとえば、
ヘモグロビンを隔膜オキシジェネータ（oxy−genato
r）、たとえば流動窒素またはアルゴンで充填されたオ
キシジェネータのガスチャンネルを備えている、ミネソ
タ州、ミネアポリスのSci−Medライフ・システム・イン
コーポレーテッドの型番号08−2A隔膜オキシジェネータ
中を通過させればよい。この種の方法によってヘモグロ
ビンを脱酸素し、引き続き本発明に従って、再酸素添加
を阻止するためにシールされた酸素非含有容器中で加熱
すればよい。他の代替法として、たとえば周知のバブル
−タイプ・オキシジェネータを利用して酸素非含有不活
性ガス、たとえば窒素またはアルゴンをもってヘモグロ
ビン溶液を散布すればよい。
あるいはまた、適当な還元剤を用いてヘモグロビンを
そのデオキシ形態に維持してもよい。この種の還元剤は
一般に、化学的還元体であって、これは生理学的に受容
可能であるべきであり、そして典型的にヘモグロビンに
対するアスコルビン酸塩より大きいか、あるいはより効
果的な還元潜在力を有するものである。還元されたレッ
ドクス染料およびスルフヒドリルまたはスルホキシ化合
物は数多くの受容可能な還元剤を包含している。適切な
還元剤はまた、アルカリ金属（たとえば、ナトリウムま
たはカルシウム）ジチオナイト、バイサルファイト、メ
タバイサルファイトまたはサルファイトを包含していて
もよい。この種アニオンのその他の可溶性、非毒性塩類
は同様に使用するための候補と成り得る。更に、還元し
たグルタチオンまたはジチオスレイトールも同様に使用
することができる。
そのデオキシ形態に維持してもよい。この種の還元剤は
一般に、化学的還元体であって、これは生理学的に受容
可能であるべきであり、そして典型的にヘモグロビンに
対するアスコルビン酸塩より大きいか、あるいはより効
果的な還元潜在力を有するものである。還元されたレッ
ドクス染料およびスルフヒドリルまたはスルホキシ化合
物は数多くの受容可能な還元剤を包含している。適切な
還元剤はまた、アルカリ金属（たとえば、ナトリウムま
たはカルシウム）ジチオナイト、バイサルファイト、メ
タバイサルファイトまたはサルファイトを包含していて
もよい。この種アニオンのその他の可溶性、非毒性塩類
は同様に使用するための候補と成り得る。更に、還元し
たグルタチオンまたはジチオスレイトールも同様に使用
することができる。
ヘモグロビン組成物（ヘモグロビンは典型的に、好ま
しくはデシリットル当たり１乃至10gの濃度における緩
衝水溶液として存在する）中に含まれるべき還元剤の量
はその還元剤の還元性強さ、存在するヘモグロビンの
量、加熱暴露の温度および期間ならびに当業者には明ら
かであろうようなその他の要因に左右されて変化してよ
い。従って、最適濃度はルーティンの実験、たとえば加
熱工程中のイオン交換高性能液体クロマトグラフィーに
より測定されたときのヘモグロビン組成物における変化
に従って決定される。ジチオナイトは典型的にはヘモグ
ロビン溶液中約10乃至100mM、好ましくは約20乃至40mM
（リットル当たりのmMにより表示）の濃度において使用
すればよい。
しくはデシリットル当たり１乃至10gの濃度における緩
衝水溶液として存在する）中に含まれるべき還元剤の量
はその還元剤の還元性強さ、存在するヘモグロビンの
量、加熱暴露の温度および期間ならびに当業者には明ら
かであろうようなその他の要因に左右されて変化してよ
い。従って、最適濃度はルーティンの実験、たとえば加
熱工程中のイオン交換高性能液体クロマトグラフィーに
より測定されたときのヘモグロビン組成物における変化
に従って決定される。ジチオナイトは典型的にはヘモグ
ロビン溶液中約10乃至100mM、好ましくは約20乃至40mM
（リットル当たりのmMにより表示）の濃度において使用
すればよい。
使用可能なその他の好ましい還元剤には、グルタチオ
ン、Ｎ−アセチル−ＬシステインおよびＮ−２−メルカ
プト−プロピニルグリシンがある。
ン、Ｎ−アセチル−ＬシステインおよびＮ−２−メルカ
プト−プロピニルグリシンがある。
通常、架橋および非架橋ヘモグロビンの両者ならびに
その不純物を含有する脱酸素溶液を濃度デシリットル当
たり１−10g、かつ溶液pH7乃至８において加熱すること
が好ましい。この加熱は約65または70乃至80℃で約１−
６時間、代表的には窒素またはアルゴンの不活性雰囲気
下で行えばよい。このような方法において、非架橋ヘモ
グロビンの沈殿は、架橋ヘモグロビンの生成される反応
における他の副生物のそれと同時に行われる。加熱工程
に引き続き、得られた沈殿物は遠心分離および／または
濾過によって除去可能であるのに対して、架橋ヘモグロ
ビンの大きな割合は沈殿することなく、溶液中に残留す
る。
その不純物を含有する脱酸素溶液を濃度デシリットル当
たり１−10g、かつ溶液pH7乃至８において加熱すること
が好ましい。この加熱は約65または70乃至80℃で約１−
６時間、代表的には窒素またはアルゴンの不活性雰囲気
下で行えばよい。このような方法において、非架橋ヘモ
グロビンの沈殿は、架橋ヘモグロビンの生成される反応
における他の副生物のそれと同時に行われる。加熱工程
に引き続き、得られた沈殿物は遠心分離および／または
濾過によって除去可能であるのに対して、架橋ヘモグロ
ビンの大きな割合は沈殿することなく、溶液中に残留す
る。
或はヘモグロビンを加熱の間、実質的に酸素添加した
状態に維持してもよい。このような状況下では、ヘモグ
ロビンの緩衝液を好ましくは上記した範囲内の温度およ
びpHにおいて、好ましくは約60乃至75℃、典型的には約
65℃で時間約１乃至６時間、たとえば1 1/2時間に亘り
加熱すればよい。非架橋ヘモグロビンが溶液から沈殿す
るのに対し、架橋ヘモグロビンは実質的に溶解状態で残
留する。次いで、濾過および／または遠心分離を行っ
て、主として非架橋ヘモグロビンとその他の蛋白質不純
物から成る沈殿物を除去する。
状態に維持してもよい。このような状況下では、ヘモグ
ロビンの緩衝液を好ましくは上記した範囲内の温度およ
びpHにおいて、好ましくは約60乃至75℃、典型的には約
65℃で時間約１乃至６時間、たとえば1 1/2時間に亘り
加熱すればよい。非架橋ヘモグロビンが溶液から沈殿す
るのに対し、架橋ヘモグロビンは実質的に溶解状態で残
留する。次いで、濾過および／または遠心分離を行っ
て、主として非架橋ヘモグロビンとその他の蛋白質不純
物から成る沈殿物を除去する。
しかし、この状況において、架橋ヘモグロビンからメ
トヘモグロビンへの可成りの変換が起こることになるら
しい。従って、この状況において引き続く工程が行われ
ることになるが、その場合、存在するメトヘモグロビン
は上述した割合において、上記したタイプの還元剤、た
とえばアルカリ金属ジチオナイトを用いる反応によって
還元され、機能的な架橋ヘモグロビンをもう一度再生す
る。
トヘモグロビンへの可成りの変換が起こることになるら
しい。従って、この状況において引き続く工程が行われ
ることになるが、その場合、存在するメトヘモグロビン
は上述した割合において、上記したタイプの還元剤、た
とえばアルカリ金属ジチオナイトを用いる反応によって
還元され、機能的な架橋ヘモグロビンをもう一度再生す
る。
非架橋ヘモグロビンを架橋させるために用いることが
できる試薬は代表的に、グルタルアルデヒド、デキスト
ラン、ポリエチレングリコール等であればよく、上に引
用した特許中に具体的に記載されたような架橋ヘモグロ
ビンの特定の方法を伴うものとする。特に、架橋ヘモグ
ロビンはウォルダーの米国特許第4,600,531号中に記載
されるように調製すればよい。
できる試薬は代表的に、グルタルアルデヒド、デキスト
ラン、ポリエチレングリコール等であればよく、上に引
用した特許中に具体的に記載されたような架橋ヘモグロ
ビンの特定の方法を伴うものとする。特に、架橋ヘモグ
ロビンはウォルダーの米国特許第4,600,531号中に記載
されるように調製すればよい。
実施例 １ ジアスピリン架橋ヘモグロビンから成る未精製反応混
合物は、ジブロモサリチル−ビス−フマレート（DBBF）
1.5当量を、基質を含まないヘモグロビン3g/dL、pH7.0
のりん酸ナトリウム緩衝液10mM、およびイノシトールヘ
キサホスフェート（IHP）10当量を有する脱酸素溶液に
対し添加することによって調製された。この溶液を37℃
で２時間撹拌した。この溶液の数個のアリコートを取り
出し、pHを7.4に調節し、そしてこれらのアリコートは
小容器内で６乃至７回ヘモグロビンをフラッシおよび減
圧することにより真空および窒素に対する交互の暴露を
反復することによって酸素を分離した。次いで、これら
のアリコートを70℃で変化させた時間の長さに亘り加熱
し、そして精製された沈殿物を遠心分離によって除去し
た。これらの上澄みをヘモグロビン含有量および組成に
ついて分析した。全ヘモグロビンおよび存在するメトヘ
モグロビンが分光光度法で測定されたのに対し、存在す
る架橋ヘモグロビンの量はイオン交換高性能液体クロマ
トグラフ法により評価された。後者の方法は残存非架橋
ヘモグロビンを所望の分子内架橋生成物から区別するこ
とができる。
合物は、ジブロモサリチル−ビス−フマレート（DBBF）
1.5当量を、基質を含まないヘモグロビン3g/dL、pH7.0
のりん酸ナトリウム緩衝液10mM、およびイノシトールヘ
キサホスフェート（IHP）10当量を有する脱酸素溶液に
対し添加することによって調製された。この溶液を37℃
で２時間撹拌した。この溶液の数個のアリコートを取り
出し、pHを7.4に調節し、そしてこれらのアリコートは
小容器内で６乃至７回ヘモグロビンをフラッシおよび減
圧することにより真空および窒素に対する交互の暴露を
反復することによって酸素を分離した。次いで、これら
のアリコートを70℃で変化させた時間の長さに亘り加熱
し、そして精製された沈殿物を遠心分離によって除去し
た。これらの上澄みをヘモグロビン含有量および組成に
ついて分析した。全ヘモグロビンおよび存在するメトヘ
モグロビンが分光光度法で測定されたのに対し、存在す
る架橋ヘモグロビンの量はイオン交換高性能液体クロマ
トグラフ法により評価された。後者の方法は残存非架橋
ヘモグロビンを所望の分子内架橋生成物から区別するこ
とができる。
この検討（第１表）の結果は、これらの実験条件下で
未改質ヘモグロビンが溶液から選択的に沈殿されること
を示している。より高温において、我々は両タイプのヘ
モグロビンが溶液から沈殿することを見出した。これら
の結果は適切な条件下で、未改質ヘモグロビンを、架橋
誘導体を含有する未精製反応混合物から選択的に沈殿さ
せ得ることを示している。
未改質ヘモグロビンが溶液から選択的に沈殿されること
を示している。より高温において、我々は両タイプのヘ
モグロビンが溶液から沈殿することを見出した。これら
の結果は適切な条件下で、未改質ヘモグロビンを、架橋
誘導体を含有する未精製反応混合物から選択的に沈殿さ
せ得ることを示している。
実施例 ２ ジアスピリン架橋ヘモグロビンの未精製反応混合物を
実施例１に記載されたように調製し、そしてその溶液を
して、ダイアフィルトレーション（diafiltration）お
よび「セファデックス（Sephadex）Ｇ−25」カラム上の
クロマトグラフ法によってイオン、たとえばIHP、グリ
シンおよび3,5−ジブロモサリチレートを遊離せしめる
ようにした。このヘモグロビン含有溶出液をpH7.4に調
節し、酸素分離させ、そしてアリコートを80℃で２時間
まで加熱した。試料は実施例１に記載したようにヘモグ
ロビン内容物に関し分析した。この実験（第２表）の結
果は、未精製反応混合物中に存在する１種類以上の小分
子の除去が一般にヘモグロビンの改良された熱安定性を
もたらすことを示しているが、また未改質分子の選択的
沈殿は、温度を80℃に増加させることによって依然とし
て可能であることを示している。
実施例１に記載されたように調製し、そしてその溶液を
して、ダイアフィルトレーション（diafiltration）お
よび「セファデックス（Sephadex）Ｇ−25」カラム上の
クロマトグラフ法によってイオン、たとえばIHP、グリ
シンおよび3,5−ジブロモサリチレートを遊離せしめる
ようにした。このヘモグロビン含有溶出液をpH7.4に調
節し、酸素分離させ、そしてアリコートを80℃で２時間
まで加熱した。試料は実施例１に記載したようにヘモグ
ロビン内容物に関し分析した。この実験（第２表）の結
果は、未精製反応混合物中に存在する１種類以上の小分
子の除去が一般にヘモグロビンの改良された熱安定性を
もたらすことを示しているが、また未改質分子の選択的
沈殿は、温度を80℃に増加させることによって依然とし
て可能であることを示している。
実施例 ３ ヘモグロビンは蒸留水と共に低張溶血（hypotonic ly
sis）により古い血液（outdated blood）から調製し
た。基質は、35000×ｇで１時間に亘り懸濁液の遠心分
離により除去した。架橋反応は、窒素パージにより確立
された酸素欠如条件下でpH7.2のビス−トリス緩衝液中
で行われた。この溶液はヘモグロビン1mMおよびイノシ
トールヘキサホスフェート5mMを含んでいた。DBBFの1.5
当量を添加した後、反応を37℃で２時間進行させ、次い
でこれはNaOHでpH8.0に調整された2Mのグリシンの等容
量添加によって停止された。分析等電点分離法により測
定された架橋生成物対未改質ヘモグロビンの割合は4:1
であった。
sis）により古い血液（outdated blood）から調製し
た。基質は、35000×ｇで１時間に亘り懸濁液の遠心分
離により除去した。架橋反応は、窒素パージにより確立
された酸素欠如条件下でpH7.2のビス−トリス緩衝液中
で行われた。この溶液はヘモグロビン1mMおよびイノシ
トールヘキサホスフェート5mMを含んでいた。DBBFの1.5
当量を添加した後、反応を37℃で２時間進行させ、次い
でこれはNaOHでpH8.0に調整された2Mのグリシンの等容
量添加によって停止された。分析等電点分離法により測
定された架橋生成物対未改質ヘモグロビンの割合は4:1
であった。
架橋反応の後、試料を室内空気をもって酸素添加し、
次いで65℃で1.5時間加熱した。これは全未改質ヘモグ
ロビンを含む存在する全ヘモグロビンの32％の沈殿生成
をもたらす。上澄み内に残存するヘモグロビンはメタヘ
モグロビン66％を含有していた。沈殿したヘモグロビン
は遠心分離ならびに滅菌0.22μ孔寸法の隔膜を介する濾
過によって除去された。次いで、この試料を４℃に冷却
し、酸素分離し、そしてメタヘモグロビンを還元して、
非酸化状態に復帰させるために最終濃度40mMとしてジチ
オン酸ナトリウムを添加した。この反応を５分間進行さ
せ、そして窒素をもって緩衝液をパージすることにより
酸素欠如条件下に維持した「セファデックスＧ−25」カ
ラム上のゲル濾過によって過剰のジチオナイトを引き続
いて除去した。最終生成物はメタ形状のヘモグロビン５
％を含有していた。
次いで65℃で1.5時間加熱した。これは全未改質ヘモグ
ロビンを含む存在する全ヘモグロビンの32％の沈殿生成
をもたらす。上澄み内に残存するヘモグロビンはメタヘ
モグロビン66％を含有していた。沈殿したヘモグロビン
は遠心分離ならびに滅菌0.22μ孔寸法の隔膜を介する濾
過によって除去された。次いで、この試料を４℃に冷却
し、酸素分離し、そしてメタヘモグロビンを還元して、
非酸化状態に復帰させるために最終濃度40mMとしてジチ
オン酸ナトリウムを添加した。この反応を５分間進行さ
せ、そして窒素をもって緩衝液をパージすることにより
酸素欠如条件下に維持した「セファデックスＧ−25」カ
ラム上のゲル濾過によって過剰のジチオナイトを引き続
いて除去した。最終生成物はメタ形状のヘモグロビン５
％を含有していた。
この実験は、酸素欠如条件下の加熱処理を利用して、
反応混合物中の残存未改質ヘモグロビンを選択的に変性
し、かつ沈殿させ得ること、およびこの処理から得られ
た架橋生成物の精製されたメタヘモグロビン形状を引き
続いて化学的に還元復帰させて非酸化形状とし得ること
を示している。
反応混合物中の残存未改質ヘモグロビンを選択的に変性
し、かつ沈殿させ得ること、およびこの処理から得られ
た架橋生成物の精製されたメタヘモグロビン形状を引き
続いて化学的に還元復帰させて非酸化形状とし得ること
を示している。
上記したところは例示目的のみに関して提供され、そ
して以下の請求の範囲中に定義される発明の範囲の限定
を意図するものではない。
して以下の請求の範囲中に定義される発明の範囲の限定
を意図するものではない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハイ、トン‐サット アメリカ合衆国、60046 イリノイ州、 レイク ヴィラ 202、ウォーター エ ッジ ドライブ 707 (56)参考文献 特表 昭61−501510（ＪＰ，Ａ)
Claims (10)
- 【請求項１】非架橋ヘモグロビンと混合している架橋ヘ
モグロビンの混合物から架橋ヘモグロビンを精製する方
法であって、 不活性ガス、酸素非含有ガス若しくは真空中で前記混合
物のヘモグロビンの脱酸素を行い、前記ヘモグロビンが
再度酸素添加しないように前記混合物を酸素から分離し
た状態に維持しつつ温度65℃乃至85℃で加熱して非架橋
ヘモグロビンを沈殿させ、 前記沈殿物を分離して架橋ヘモグロビンを精製する方
法。 - 【請求項２】前記混合物の加熱が、デシリットルあたり
１−10gの濃度における溶液中で行われる特許請求の範
囲１項記載の架橋ヘモグロビンを精製する方法。 - 【請求項３】前記混合物の加熱が、pH7乃至８の溶液で
行われる特許請求の範囲１項記載の架橋ヘモグロビンを
精製する方法。 - 【請求項４】前記混合物の加熱が、略１乃至６時間の期
間に亘り行われる特許請求の範囲１項記載の架橋ヘモグ
ロビンを精製する方法。 - 【請求項５】前記ヘモグロビン混合物が、少なくとも温
度65℃で酸素を分離した状態に維持されている特許請求
の範囲１項記載の架橋ヘモグロビンを精製する方法。 - 【請求項６】前記不活性ガスが窒素である特許請求の範
囲１項記載の架橋ヘモグロビンを精製する方法。 - 【請求項７】前記不活性ガスがアルゴンである特許請求
の範囲１項記載の架橋ヘモグロビンを精製する方法。 - 【請求項８】前記脱酸素は前記ヘモグロビンの混合物を
隔膜ガス交換に通過させるステップを含む特許請求の範
囲１項記載の架橋ヘモグロビンを精製する方法。 - 【請求項９】前記脱酸素は前記ヘモグロビンの混合物を
前記不活性ガスで散布するステップを含む特許請求の範
囲１又は８項記載の架橋ヘモグロビンを精製する方法。 - 【請求項１０】前記脱酸素は前記ヘモグロビンの混合物
を窒素と真空へ交互に反復して暴露するステップを含む
特許請求の範囲１又は８又は９項記載の架橋ヘモグロビ
ンを精製する方法。
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1989
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- 1989-04-10 WO PCT/US1989/001489 patent/WO1989012456A1/en not_active Application Discontinuation
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