JPH03502580A - 架橋ヘモグロビンの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 架橋へモグロヒシの精製方法 ｆ”ｉ、（組別匪 可成りの量の研究が、生活患者の循環系中のｉ＋２累担体としての赤血球用代替 物（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ　）の開発を指向して来た　この研究は、血液または 赤血球全体の利用を超える数種Ｖの潜在的な利点を提供するという事実によって 促進されて来た、一つの利点として、！、工酸素担体は赤血球の場合のようにタ イピング（【３・［・ｉｎｇ）および交差試験法を必要とじをい　池の利点とし て、ｋ工酸素担体はエイズまたは肝炎伝搬の危険を殆ど有していないことである 。赤血球代替物の第三の利点は長期貯蔵の可能性であるこの分野における初期の 実験は赤血球代替物として基質を含まない（ｓｔｒｏｍａ−ｆｒｅｅ　）ヘモグ ロビンの使用を検討して来た、基質非含有ヘモグロビンを動物の静脈内に注入す ると、そのＷｊ環系内でそれは酸素担体として短時間機能する　しかし、残念な がら天然のヘモグロビン四証体は低分子量成分に解離し。

これらは腎臓を経由して容易に排出される　６泊って、遊離のヘモグロビンは循 環によって身体から迅速に除去され、これは酸素担体血液代替物としての遊離ヘ モグロビンの有用性を蓼著に制限するものである、身体からのヘモグロビンの急 速排出を阻止するための試みにおいて、多くの研究者等はヘモグロビンの共有結 合架橋を検討して来たが、それは生成物の分子量が大きな度合いで増加すること の無い分子内架橋と、生成物の分子量が天然のヘモグロビンの分子量よりも極端 に大きくなる（約６４　、Ｑｌ川用子内架橋との両者であった　使用される代表 的な架田削はグルタルアルデヒドおよび３゜ラージブロモサリチル−ビス−フマ レートである　たとえば、二の種の主題を取り吸っている下記の米国特許、メイ ザー（ｌＩａｚｕ＋・）の米国特許第３．９２５．３４４号、ボンバード他（Ｂ ｏｎｈａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、）の米国特許第４．３３６．２４８号、ボンスン（ Ｂｏｎｓｅｎ　）の米国特許第４．（川、　２ＣＩ＋’１号、第１．１川、１川 号および第４．１’＋５３．５ＱＩ’１号、モーリス池（ｔｌｏｒｒｉｓ　ｃｔ 　ａｌ、　）の米国特許第１，１Ｊｔ）１．７３６号、タイ（Ｔ５・ｅ　）の米 国特許第４．５２９．７１９号、ウィルダー（１’１ａｌｄｅｒｌの米画持コ１ 第４　、５’−’＋８．イー１（）４号および第４．６ｍ、５３１号ならびにオ ランダ画特許第７４川１４１１号を参照されたいこの主題に関してはまた、可成 り、７）量の技術文献が存在しているヘモグロビンを架橋剤と反応させると、そ の生成物は殆ど常に可成りの量の未改質、非架橋ヘモグロビンを含む生成物から 成る混合物となる４若干の架橋ヘモグロビンは、細胞非含有血液代替物としての 著しい徴候を示すが、注入の結果いずれにせよ腎臓によって未改質ヘモグロビン は迅速に除去されることになるので、それを除去するのが望ましいように思われ るし、また大量の遊離、非架橋ヘモグロビンが毒性を示す成る種の証拠が存在す る　知られた先行技術において、未改質、非架橋ヘモグロビンは架橋ヘモグロビ ンからたとえばクロマトグラフ法のような技術により除去される。クロマ）・グ ラフ法は骨が折れ、かつ高価な方法であって、生産可能な精製、架橋ヘモグロビ ンの量に関して苛酷な拘束を強いるものて′ある その上、成る場合には架橋ヘモグロビンからの非架橋ヘモグロビンの分離が技術 的に困難であると共に高価なものとなる。それは反応の副生物がクロマトグラフ のカラムに不可逆的に結合することになり、これがカラムの機能的能力を減少さ せるからである。

本発明によって、架橋ヘモグロビンの精製方法が提供され、これはクロマトグラ フ法と比較して非常に簡略化されると共に実質的な費用の減少を伴うもの光朋百 説唱 本発明において、非架橋ヘモグロビンと混合している架橋ヘモグロビンな精製す るための方法が提供される、本発明によれば、主要量の架橋ヘモグロビンの沈殿 を伴うことなく、存在する非架橋ヘモグロビン（ならびにａＩ？他の不純物）の 可成りの量を沈殿させるに足る時間に亘って、架橋ヘモグロビンが温度約６ｒ〕 ’乃至８５°Ｃに加熱される、その後、架橋ヘモグロビンから生成された沈殿物 を５代表的には遠心分Ａ「または濾過によって分＾ｇする好ましくは、架橋ヘモ グロビンは本発明に従ってｐＨ６，５乃至９、最も好ましくはｐ）１７乃至８． そして具体的には［・Ｈ約７．５において鴇理される、加熱工程の期間は略１乃 至６時間が好ましい、 本発明の一実施！！！ｌ！様において、ヘモグロビンは加熱の間実質的に酸素を 分離した状態に維持すればよい、これは様りな溶液脱ガス法によって達成するこ とかで・きる７これらに包含されるが、それに限定されないものには、不活性ガ スを用いる散布、隔膜ガス交換装置を経由させる循環およびヘモグロビン溶液を 真空に対し暴露させるというしのがある。この種の方法の適切さはそれらが、た とえば発泡、酸性化等によってヘモグロビンの劣化を促進する程度により制限さ れることになる。たとえば、ヘモグロビンを隔膜オキシジェネータ（０＼ｙ−ｇ ｅｎａＬｏｒ　）　、たとえば流動窒素またはアルゴンで充填されたオキシジェ ネータのガス千ヤンオ、ルを備えている、ミネソタ州、ミネアポリスの５ｃｉ− ｔ４ｅｄライフ・システム・インコーボレーテヴドの型番号１）８−２Ａ隔膜オ キシジエネータ中を通過させればよい、この種の方法によってヘモグロビンを脱 酸素し、引き続き本発明に而って、再酸素添加を阻止するためにシールされた酸 素非含有容器中で加熱すればよい一泊の代替法として、たとえば周知のペブル− タイプ・オキシジェネータを利用して酸素非含有不活性ガス、たとえば窒素また はアルゴンを６ってヘモグロビン溶液を散布すればよい。

あるいはまた、適当な還元剤を用いでヘモグロビンをそのデオキシ形態に維持し てもよい、この種の還元剤は一般に、１ヒ字的還元本であって、これは生理学的 に受容可能であるべきであり、そして典型的にヘモグロビンに対するアスコルビ ン１塩より大きいか、あるいはより効果的な還元潜在力を有するものである　還 元されたし・・ｌドクス染料およびスルフヒドリルまたはスルホキシ化合物は数 多くの受容可能な還元剤を包含している、適切な還元剤はまた、アルカリ金ｇ（ たとえば、ナトリウムまたはカルシウム）ジチオナイト、パイサルファイド、メ タバイサルファイドまたはナルファーイトを包含していてもよい、この種アニオ ンのその池の可溶性、非毒性塩類は同様に使用するための候補と成り得る６更に 、還元したグルタチオンまたはジ千オスレイトールも同様に使用することができ る。

ヘモグロビン組成物（ヘモグロビンは典型的に、好ましくはデシリットル化たり １乃至１（：Ｉｇの濃度におけるＦ！！衝水溶水溶液て存在する）中に含まれる べき還元剤の量はその還元剤の還元性強さ、存在するヘモグロビンの量、加熱暴 露の温度および期間ならびに当業者には明らかであろうようなその他の要因に左 右されて変化してよいや而って、最適濃度はルー子インの実験、たとえば加熱工 程中のイオン交換高性能液体クロマトグラフィーにより測定されたときのヘモグ ロビン組成物における変ｆヒに従って決定される７ジチオナイトは典型的にはヘ モグロビン溶液巾約１（１乃至１（Ｎ：１ｍ１４、好ましくは約９乃至４１’！ ｉｔτ（す・ソトル当たりのｍｌ、１により表示）の濃度においてｒｔ用すれば よい６使用可能なその他の好ましい還元剤には、グルタチオン、Ｎ−アセチル− ＬシスティンおよびＮ２−メルカプト−プロピニルグリシンがあるう通常、架橋 および非架橋ヘモグロビンの両者ならびにその不純物を含有する脱酸素溶液を濃 度デシリットル化たり１−１（：Ｉｇ、かつ溶液ＰＨ７乃至８において加熱する ことが好ましい。この加熱は約６５または７＋’１乃至Ｐ；（ｒＣで約１−６時 間。

代表的には窒素またはアルゴンの不活性雰囲気下で行えばよい、このような方法 において、非架橋ヘモグロビンの沈殿は、架橋ヘモグロビンの生成される反応に おけるＩＩ！！の副生物のそれと同時に行われる。加熱工程に引き続き、得られ た沈殿物は遠心分離および　または濾過によって除去可能であるのに対し２°Ｃ 、架橋ヘモグロビンの大きな割合は沈殿することなく、溶液中に残留する２或は ヘモグロビンを８口熱の間、実質的に酸素添加した状態に維持してもよい、この ような状況下では、ヘモグロビンの［ｍＲを好ましくは上記した範囲内の濃度お よび「・１１において、好ましくは約６（ｌ乃至７５℃、典型的には約６５℃で 時間約１乃至６時間、たとえばＬ　Ｌ’２時間に亘り加熱すればよい、非架橋へ モグロピンが溶液から沈殿するのに対し、架橋ヘモグロビンは実質的に溶解状態 で残留する７次いで、濾過および　または遠心分離を行って、主として非架橋ヘ モグロビンとその他の蛋白質不純物から成る沈殿物を除去する。

しかし、この状況において、架橋ヘモグロビンからメトヘモグロビンへの可成り の変換が起こることになるらしい７従って、この状況において引き続く工程が行 われることになるが、その場合、存在するメトヘモグロビンは上述した割合にお いて、上記したタイプの還元剤、たとえばアルカリ金属ジチオナイトを用いる反 応によって還元され、機能的な架橋ヘモグロビンをもう一度再生する６ 非架橋ヘモグロビンを架橋させるために用いることができる試薬は代表的に、グ ルタルアルデヒド、デキストラン、ポリエチしングリコール等であればよく、上 に引用した特許中に具体的に記載されたような架橋ヘモグロビンの特定の方法を 伴うものとする。特に、架橋ヘモグロビンはウォルダーの米国特許第４．６ＣＩ ０．５３１号中に記載されるように調製すればよい。

実施例　１ ジアスピリン架橋ヘモグロビンから成る未精製反応混合物は、ジブロモサリチル −ビス−フマレート（ＤＢＢＦ）　　１．５当量を、基質を含まないヘモグロビ ン３ｇ／ｄＬ、ｐＨ７，０のりん酸ナトリウムｖＩｉｒ液ｌθｍ１４、およびイ ノシトールへキサホスフェ−１−（ＩＨＩ’　）　１１）当量を含有する脱酸素 溶液に対し添加することによって調製された。この溶液を３７°Ｃで２時間攪拌 した３この溶液の数個のアリコートを取り出し、ｒ−Ｈを７．４にｉｌｍ節し、 そしてこれらのアリコートは小容器内で６乃至７回ヘモグロビンをフラッジおよ び減圧することにより真空および窒素に対する交互のＩｋ露を反復することによ って酸素を分離した０次いで、これらのアリコートを７θ℃で変化させた時間の 長さに亘り加熱し、そして精製された沈殿物を遠心分離によって除去した。これ らの上澄みをヘモグロビン含有量および組成について分析した。全ヘモグロビン および存在するメトヘモグロビンが分光光度法で測定されたのに対し、存在する 架橋ヘモグロビンの量はイオン交換高性能液体クロマトグラフ法により評価され た。後者の方法は残存非架橋ヘモグロビンを所望の分子内架橋生成物から区別す ることができる、この検討（第１表）の結果は、これらの実験条件下で未改質ヘ モグロビンが溶液から選択的に沈殿されることを示している、より高温において 、我々は両タイプのヘモグロビンが溶液から沈殿することを見出した。これらの 結果は適切な条件下で、未改質ヘモグロビンを、架橋冨み導体を含有する未精製 反応混合物から選択的に沈殿させ得ることを示している、第１表 ７−’Ｊ’Ｃ１ｐＨ７，４における加熱中のジアスピリン（ＤＢＢＦ　）架橋ヘ モグロビンの反応混合物についての組成 残存当初蛋白質成分％ 実施例　２ ジアスピリン架橋ヘモグロビンの未精製反応混合物を実施例１に記載されたよう に調製し、そしてその溶液をして、ダイアフィルトレージョン（ｄｉａｒｉｌ− Ｌｒａｔｉｏｎ　）および「セフアゾ・１クス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ−２５ Ｊカラム上のクロマトグラフ法によってイオン、たとえばＩＨＰ　、グリシンお よび３．５−ジブロモサリチレートを遊離せしめるようにした。このヘモグロビ ン含有溶出液をｐＨ７，４に調節し、酸素分離させ、そしてアリコートを８ＣＩ ″Ｃで２時間まで加熱した。試料は実施例１に記載したようにヘモグロビン内容 物に関し分析した。この実験（第２表）の結果は、未精製反応混合物中に存在す る１種類以上の小分子の除去が一般にヘモグロビンの改良された熱安定性をもた らすことを示しているが、また未改質分子の選択的沈殿は、温度を８（“ＩＣに 増加させることによって依然として可能であることを示している。

第２表 残存当初蛋白質成分％ ｇｆＨｌＵ（時ｇ）　　　、己　ヘモグロビン　　　　　−ヘモグロビン実施例 　３ ヘモグロビンは蒸留水と共に低張溶血（ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ　１ｙｓｉｓ　）に より古い血液（ｏｕＬｄａｔｅｄ　ｂｌｏｏｄ）から調製した。基質は、３５１ ）００Ｘ　ｇで１時間に亘り懸濁液の遠心分離により除去した。架橋反応は１Ｍ 素バージにより確立された酸素欠如条件下でＰＨ７，２のビス−トリス緩衝液中 で行われた。この溶液はヘモグロビン１ｍｌおよびイノシトールへキサホスフェ ート５ｍｌ喉を含んでいた。　ＤＢＢＦの１．５当量を添加した後、反応を３７ ℃で２時間進行させ、次いでこれはＭａｉｌ（でｐ）Ｉ　８．０にｆＩｌＩ整さ れた２Ｍのグリシンの等容量添加によって停止された０分析等電点分離法により 測定された架橋生成物対未改質ヘモグロビンの割合は４：１であった。

架橋反応の後、試料を室内空気をもって酸素添加し、次いで６５℃で１．５時間 加熱した。これは全未改質ヘモグロビンを含む存在する全ヘモグロビンの３２％ の沈殿生成をもたらす、上澄み内に残存するヘモグロビンはメタヘモグロビンｂ ％を含有していた。沈殿したヘモグロビンは遠心分離ならびに滅菌０．２２μ孔 寸法の隔膜を介する濾過によって除去された１次いで、この試料を４℃に冷却し 、酸素分離し、そしてメタヘモグロビンを還元して、非酸化状態に復帰させるた めに最終濃度４ｈＭとしてジチオン酸ナトリウムを添加した。この反応を５分間 進行させ、そして窒素をもって桜ＷＩ液をパージすることにより酸素欠如条件下 に維持した「セファデックスＧ−２５ｊカラム上のゲル濾過によって過剰のジチ オナイトを引き続いて除去した。最終生成物はメタ形状のヘモグロビン５？６を 含有していた。

この実験は、酸素欠如条件下の加熱処理を利用して、反応混合物中の残存未改質 ヘモグロビンを選択的に変性し、かつ沈殿させ得ること、およびこの処理から得 られた架橋生成物の精製されたメタヘモグロビン形状を引き続いて化学的に還７ ［″１隻掃きせて非酸化形状とし得ることを示している。

上記したところは例示目的のみに関して提供され、そして以下の請求の範囲中に 定義される発明の範囲の限定を意図するものではない７１、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０１４８９ ２、発明の名称 架橋ヘモグロビンの精製方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名　称　バクスター　インターナショナル　インコーホレーテッド ４、代理人（〒１０２） 住　所　東京都千代田区一番町２２−１一番町セントラルビルディング ５、補正命令の日付 平成２年１１月６日（発送日） ６、補正の対象 国際調査報告

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．下記ヘモグロビン混合物を、温度６０°乃至８５℃において存在する非架橋 ヘモグロビンの可成りの量を沈殿させるに足る時間に亘り加熱する工程と、その 後架橋ヘモグロビンからこのようにして生成された沈殿物を分離する工程とを含 んで構成される非架橋ヘモグロビンと混合している架橋ヘモグロビンを精製する 方法。
2. ２．ｐＨ６．５乃至９において行われる請求の範囲１の方法。
3. ３．本質的にｐＨ７乃至８において行われる請求の範囲２の方法。
4. ４．前記加熱が略１乃至６時間の期間におよぶ請求の範囲１の方法。
5. ５．前記ヘモグロビン混合物が、少なくとも６５℃の温度における加熱の間、実 質的に酸素分離状態に維持される請求の範囲１の方法。
6. ６．前記ヘモグロビン混合物が加熱の間、実質的に酸素添加状態に維持される請 求の範囲１の方法。
7. ７．前記加熱後、存在するメタヘモグロビンが還元剤による反応により還元され て、機能的ヘモグロビンを再生する請求の範囲６の方法。
8. ８．前記ヘモグロビン混合物が、溶液のデシリットル当たり１−１０ｇの濃度に おいて水溶液中で加熱される請求の範囲１の方法。
9. ９．前記溶液が本質的にｐＨ７乃至８において維持される請求の範囲８の方法。
10. １０．下記ヘモグロビン混合物を、温度６５°乃至Ｓ５℃で、ｐＨ本質的に７乃 至８において略１乃至６時間の期間に亘り加熱して、存在する非架橋ヘモグロビ ンの可成りの量を沈殿させる工程と、その後架橋ヘモグロビンからこのようにし て生成された沈殿物を分離する工程とを含んで構成される非架橋ヘモグロビンと 混合している架橋ヘモグロビンを精製する方法。
11. １１．前記ヘモグロビン混合物が加熱の間、酸素分離状態に維持される請求の範 囲１０の方法。
12. １２．前記ヘモグロビン混合物が還元剤の存在によって酸素分離状態に維持され る請求の範囲１１の方法。
13. １３．前記ヘモグロビン混合物が、そのヘモグロビンからの不活性、酸素非含有 ガスまたは真空への最初の酸素交換、引き続く酸素不存在条件下におけるヘモグ ロビンの保持によって酸素分離状態に維持される請求の範囲１１の方法。
14. １４．前記ヘモグロビン混合物が、溶液デシリットル当たり１−１０ｇの濃度に おいて水溶液中で加熱される請求の範囲１０の方法。
15. １５．前記溶液は本質的にｐＨ７乃至８である請求の範囲１４の方法。
16. １６．前記ヘモグロビン混合物が加熱の間、実質的に酸素添加状態に維持される 請求の範囲１０の方法。
17. １７．前記加熱後、存在するメタヘモグロビンが還元剤による反応により還元さ れて、機能的ヘモグロビンを再生する請求の範囲１６の方法。