CZ281912B6

CZ281912B6 - Směs hemoglobinu síťovaného imidoesterem a způso b její výroby

Info

Publication number: CZ281912B6
Application number: CZ93854A
Authority: CZ
Inventors: Robert Lee Garlick; Joseph Patrick Martin Jr.; Stephen Baker Lyle
Original assignee: The Upjohn Company
Priority date: 1990-11-29
Filing date: 1991-10-03
Publication date: 1997-03-12
Also published as: EP0559655A1; IL99785A0; NZ240377A; ZA918348B; AU8546691A; CZ85493A3; SK54993A3; DE69108258T2; HUT64571A; DK0559655T3; MX9102239A; FI932461A0; NO931956D0; ES2069908T3; JPH06502848A; EP0559655B1; CA2093650A1; HU211703A9; ATE119917T1; AU650287B2

Abstract

Směs síťovaného hemoglobinu pro přenos kyslíku do živých buněk obsahuje hemoglobin podstatně bez nečistot, síťovaný imidoestery, který je přítomen převážně ve formě tetrameru a má p50 alepoň 1,73 kPa. Molekolová hmotnost síťovaného hemoglobinu ve směsi je alespoň 64000 Daltonů. Čištěný a síťovaný hemoglobin má zlepšenou stabilitu vůči samovolné oxidaci a lze jej používat jako náhrady krve u savců jako kapalinu přenášející kyslík.ŕ

Description

Hemoglobin síťovaný imidoestery a způsob jeho výroby

Oblast techniky

Vynález se týká hemoglobinu síťovaného imidoestery pro přenos kyslíku do živých buňek, který je podstatně prostý znečištění, protože obsahuje velmi nízké koncentrace bakteriálních endotoxinů a fosfolipidů, a způsobu jeho výroby. Produkt je vhodný jako náhrada krve pro transfuze u lidí a zvířat nebo jako kapalina pro přenos kyslíku.

Dosavadní stav techniky

Struktura a funkce hemoglobinu byly souhrnně popsány v Bunn H. F., Forget B. G. Hemoglobin: Molecular, Genetic and Clinical Aspects, W. B. Saunders Company, Philadelphia, 1986, 690 stran. Savčí hemoglobin je tetramer obsahující dvě z obou různých jednotek, alfa a beta. Každá jednotka má přibližnou molekulární hmotnost 16000 a obsahuje heme skupinu s centrálním atomem železa. Proteinová část neboli globin udržuje železo v heme skupině v redukované či železnaté formě, což dovoluje molekule hemoglobinu vázat reversibilně kyslík.

Nelze si představovat, že savčí hemoglobin je statický tetramer, to znamená jednotný protein s molekulární hmotností 64-68000. Místo toho je složen z jednotek spojených nekovalentními vazbami a existuje v dynamické rovnováze zahrnující interakce monomer-dimer a dimertetramer. V každém okamžiku se hemoglobin skládá z jistého podílu monomeru s molekulární hmotností asi 16000, dimerů s molekulární hmotností 32000 a tetramerů. Distribuce monomeru, dimeru a tetramerů v roztoku je závislá na koncentraci hemoglobinu, vazebném stavu hemoglobinu, jakož i na pH a solném složení roztoku, ve kterém se nachází.

Savčí hemoglobin je obsažen v červených krvinkách neboli erythrocytech. U savců tyto specializované buňky ztrácejí při dozrávání svá jádra a jsou to prostě měchy hemoglobinu, obsahující velmi malé koncentrace jiných proteinů. Hemoglobin se nachází v oběhových erythrocytech z mnoha důvodů. Za prvé, pokud by hemoglobin nebyl v buňkách, ale volně obíhal v roztoku, snadno by se dostával z oběhu průchodem kapilárními stěnami, ledvinami nebo jinými místy. Některé bezobratlé organismy vyřešily tento problém vývojem polymemích hemoglobinů s miliónovou molekulární hmotností, které jsou příliš objemné, aby prošly kapilárami a ledvinovými nefrony. Červené krvinky mimo to zajišťují ochranu molekuly hemoglobinu proti proteolytickým sérovým proteinům, zabezpečují enzymatický systém, který udržuje železo herny v redukovaném (funkčním) stavu a kontrolují přítomnost molekul s alosterickým účinkem.

Existuje řada pokusů připravit roztoky hemoglobinu zbavené pojivových tkání jako náhražky krve při transfuzích (Pennell R. B., Smith W. E.: Příprava stabilizovaných roztoků hemoglobinu, Blood, 4: 380-385, (1949), Rabiner S. F., Helbert J. R., Lopas H., Friedman L. H.: Hodnocení roztoků hemoglobinu zbavených pojivových tkání jako doplňku plazmy. J. Exp. Med. 126: 11271142 (1967), Christensen S. M., Medina F., Winslow R. W., Snell S. M., Zegna A., Marini M. A.: Příprava lidského Ao hemoglobinu jako případné náhražky krve. J. Biochem. Biophys. Meth. 17: 143-154 (1988) a Feola M., Gonzalez H., Canizaro P. C., Bingham D., Periman P.: Vývoj roztoků hovězího hemoglobinu zbaveného stromy jako náhražky krve. Surg. Gyn. Obst. 157: 399-408 (1983)). Tyto roztoky obsahují nemodifikovaný hemoglobin, který může dissociovat na své jednotky. Infuze nemodifikovaného hemoglobinu vede k rychlému odstranění hemoglobinu z oběhu. Mimo to je doloženo, že infuze nemodifikovaného hemoglobinu vede v těle k řadě škodlivých účinků včetně nefrotoxicity. Nefrotoxicita spojená s nemodifikovaným hemoglobinem přiměla Centrum pro biologické vyhodnocování a výzkum US Food and Drug Administration vydat prohlášení, že nemodifikovaný hemoglobin by neměl být obsažen v přenašeči kyslíku založeném na hemoglobinu.

- 1 CZ 281912 B6

Existují četné zprávy popisující stabilizaci roztoků hemoglobinu vytvářením kovalentních chemických spojů mezi polypeptidickými řetězci hemoglobinu (Rausch C. W., Feola M.: Zvláště čistá semisyntetická náhrada krve, mezinárodní patentová přihláška číslo PCT/US 87/02967, Int. publikace číslo WO/88/03408 z 19. května 1988, Bonhard K.., Kothe N.: Síťovaný hemoglobin s prodlouženou skladovatelností a zvýšenou schopností přenášet kyslík a způsob jeho přípravy, US patent číslo 4,777,244, Bucci E., Razynska A., Urbaitis B., Fronticelli C.: Pseudosíťování lidského hemoglobinu pomocí mono(3,5-dibromsalicyl)fumarátu. J. Biol. Chem. 264: 6191-6195 (1989) a US patent číslo 4,001,200).

Směsi síťovaného hemoglobinu byly popsány v US patentech 4,001,200, 4,011,401, 4,53,590 a 4,061736. Pracnější formy síťovaní hemoglobinu pro následující čistění jsou rovněž vyloženy v US patentu 4, 857,636. Příprava a síťovaní hovězího hemoglobinu byly popsány v Feola M., Gonzalez H., Canizaro P. C., Bingham D., Periman P.: Vývoj roztoků hovězího hemoglobinu zbaveného stromy jako náhražky krve. Surg. Gyn. Obst. 157: 399-408 (1983) a mezinárodní patentové přihlášce číslo PCT/US 87/02967, Int. publikace číslo WO/88/03408 z 19. května 1988.

Reakce dimethyladipimidátu s normálním lidským hemoglobinem (HbA) a hemoglobinem srpkovitých krvinek (HbS) byly popsány Plese C. F., Amma E. L.: Cirkulámí dichroism jako test alosterické R-T transformace hemoglobinů a modifikovaných hemoglobinů (1977). US patent 3,925,344 (1975) popisuje síťování hemoglobinu imidoestery za účelem přípravy plazmového proteinu nebo doplňku plazmy, avšak tento materiál není vhodný jako kapalina přenášející kyslík. Pennanthur-Das R., Heath R. H., Mentzer W. C., Lubin Β. H.: Modifikace hemoglobinu S dimethyladipidátem. Příspěvek jednotlivých zreagovaných jednotek ke změnám vlastností. Biochim. Biophys. Acta 704: 389-397 (1982) udávají, že síťování pomocí imidoesterů (DMA) zvyšuje afinitu hemoglobinu ke kyslíku, což jej činí nevhodným pro přenos kyslíku a jeho uvolňování. Pennanthur-Das R., Vickery L. E., Mentzer W. C., Lubin Β. H.: Modifikace hemoglobinu A dimethyladipidátem. Příspěvek jednotlivých zreagovaných jednotek ke změnám vlastností. Biochim. Biophys. Acta 580: 356-365 (1979).

Je tedy žádoucí, aby byla nalezena metoda síťování hemoglobinu, která by jej stabilizovala převážně ve formě tetrameru nebo v násobcích tetrameru, avšak s dostatečně nízkou afinitou ke kyslíku, vyjádřenou jako p50, což je parciální tlak kyslíku při polovičním nasycení. Pak by účinně transportoval kyslík a pak jej uvolňoval buňkám živého organismu. Také je důležité, aby molekulární hmotnost byla převážně alespoň 64000, což je tetramemí forma hemoglobinu, jen s malým až žádným podílem pod 64000, což jsou dimemí a monomemí formy, a s malým až žádným podílem příliš větším než 64000, kdy mohou být molekuly dosti velké, aby způsobily potíže v savčím organismu. Vývoj takové polymerizační metody je proto velmi potřebný pro úspěšný vývoj přenašeče kyslíku.

Podstata vynálezu

Jednou částí tohoto vynálezu je hemoglobin síťovaný imidoestery schopný přenášet a uvolňovat kyslík v živých buňkách. Hemoglobin je přítomen přes 50 % ve formě tetrameru a má p50, to je parciální tlak kyslíku při polovičním nasycení, alespoň 1,73 kPa při pH 7,4. Imidoesterem, kterému se při síťování hemoglobinu dává přednost, je dimethyladipimidát. Výhodné je, jestliže alespoň 80 % síťovaného hemoglobinu má molekulovou hmotnost alespoň 64000 Daltonů, ještě výhodnější však je, jestliže alespoň 90 až 95 % síťovaného hemoglobinu má molekulovou hmotnost alespoň 64000 Daltonů. Navíc je hemoglobin síťovaný imidoesterem ve srovnání se hemoglobinem síťovaným konvenčními technikami velmi stálý proti tvorbě methemoglobinu a má afinitu ke kyslíku p50 alespoň 1,733 kPa.

Hemoglobin může rovněž obsahovat farmaceuticky přijatelné nosné médium k usnadnění transfuze nebo injekce do léčeného savce nebo použití jako kapaliny přenášející kyslík pro analytické, transplantační nebo laboratorní účely. Typickým farmaceuticky přijatelným nosičem mohou být čištěná voda nebo roztok kuchyňské soli.

Jiným aspektem tohoto vynálezu je způsob výroby hemoglobinu síťovaného imidoestery pro přenos kyslíku do živých buněk, spočívající v tom, že se síťování imidoestery čištěného lyzátu hemoglobinu provádí při pH alespoň 8,0 v polymeračním roztoku ústoje Tris-HCl, až má alespoň 50 % síťovaného hemoglobinu molekulovou hmotnost 64000 a p50 alespoň 1,73 kPa při pH 7,4. ío Ve výhodném provedení vynálezu obsahuje polymerační roztok NaCl, přičemž hodnota pH může být v rozmezí od 8,0 do 12,0. Polymerační roztok s výhodou obsahuje 50 mMol Tris-HCl a od 0,1 do 2,0 Mol NaCl. Čištěný lyzát hemoglobinu se u tohoto způsobu s výhodou deoxiduje. Nízkomolekulámí hemoglobin se u tohoto způsobu odstraní velikostní frakcionací, která se s výhodou provádí pomocí chromatografú. Jako imidoesteru se s výhodou použije dimethyl15 adipimidátu. Polymerace se s výhodou provádí opakovanou reakcí čištěného hemoglobinu s ekvimolekulámím množstvím imidoesteru.

Praktické provedení způsobu zahrnuje a) odběr savčí krve, b) oddělení červených krvinek z odebrané krve a promytí červených krvinek, c) rozklad promytých červených krvinek, d) 20 odstředění rozložených červených krvinek, aby se získal lyzát hemoglobinu, e) čistění lyzátu anionaktivní nebo kationaktivní chromatografií, f) ultrafiltraci nebo mikrofiltraci eluovaného lyzátu z chromatografie. Čímž se získá čištěný hemoglobin a g) síťovaní čištěného hemoglobinu imidoesterem, aby se získal hemoglobin převážně v tetramemí formě.

Rozklad červených krvinek lze uskutečnit hypoosmotickým šokem. Ultrafiltrace se zpravidla provádí pomocí membrány s dělicí molekulovou hmotností 300000 a mikrofiltrace se zpravidla provádí pomocí filtru 0.025 až 0.040 mikrometrů. Případně lze provést krok (g), síťovaní imidoesterem po získání lyzátu červených krvinek v kroku (d). Pak stupeň (e) začíná čistěním síťovaného hemoglobinu. Způsob může zahrnovat dodatečný krok (h), ve kterém se čištěný 30 síťovaný hemoglobin dělí dle velikosti, aby se zbavil hemoglobinu s nízkou molekulovou hmotností (menší než 64000 Daltonů). Dělení dle velikosti se zpravidla provádí nízkotlakou dělicí chromatografií.

Tento vynález tedy popisuje hemoglobin síťovaný imidoesterem bez jakýchkoliv nečistot, kde 35 hemoglobin je převážně v tetramemí nebo vyšší formě. Tento hemoglobin má zlepšenou stabilitu vůči oxidaci než tradičnější formy síťovaného hemoglobinu, na příklad s glutaraldehydem a má zlepšenou stabilitu vůči síťování. Hemoglobin je vhodný jako náhrada přenosu kyslíku krví pro savce či obecně jako kapalina přenášející kyslík.

Tento vynález popisuje rovněž metodu čištění a síťovaní hemoglobinu jistými imidoestery, které nebyly používány k síťovaní hemoglobinu pro transfúzní terapii. Tyto síťující bifúnkční imidoestery zahrnují mezi jinými dimethyladipimidát a dimethylsuberimidát. Použití těchto síťujících činidel má proti předcházejícím síťovadlům hemoglobinu výhody. Byly objeveny zvláštní reakční podmínky, které poskytují úzkou distribuci molekulových hmotností a vhodné 45 vlastnosti k přenosu kyslíku.

Imidoestery jako dimethyladipimidát jsou síťující bifúnkční činidla, která reagují s proteiny specificky a rychle za mírných podmínek. S epsilon-aminoskupinami lysinových zbytků a aminem aminového konce polypeptidového řetězce se tvoří stálé amidinové addukty (Wold F.: 50 Bifúnkční reagenty. Methods in Enz. 25: 623-651 (1972), Peters K., Richards F. M.: Chemické síťování: reagenty a problémy při studiu membránových struktur. Ann. Rev. Biochem. 46: 523551 (1977).) Síťující činidla reagují zpravidla s jednou až dvěma aminoskupinami na jednotku hemoglobinu. K. nějakému síťování dochází mezi dvěma beta řetězci lysinových zbytků (beta82), což stabilizuje tetramemí formu lidského hemoglobinu. Dimethyladipimidát byl studován

- j CZ 281912 B6 jako protisrpkovité činidlo pro hemoglobin (Lubin B. H., Pěna V., Metzer W. C., Bymun E., Bradley T. B., Packer L.: Dimethyladipimidát: nové protisrpkovité činidlo. Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 72: 43-46 (1975).) Modifikace beta-82 lysinů mění konformaci deoxidované formy HbS a zabraňuje tak krystalizaci nebo želatinaci. Krystalizace je molekulární bází srpkovitosti pozorované u zasažených červených krvinek. Ačkoliv modifikace beta-82 lysinu síťujícím činidlem je nezbytná pro zabránění srpkovitosti, skutečné spojení dvou beta-82 lysinů uvnitř tetrameru hemoglobinu není nutné. Tento vynález aplikuje dimethyladipimidát na hovězí hemoglobin se záměrem vytvořit jak stabilizované tetramery zavedením mezijednotkových vazeb mezi beta-82 lysiny, tak vysokomolekulámí agregáty stabilizovaných tetramerů zavedením mezimolekulámích vazeb mezi epsilon-aminoskupinami jednotlivých stabilizovaných tetramerů hemoglobinu.

Výhoda síťování hemoglobinu imidoestery a zvláště dimethyladipimidátem je dvojí: Za prvé, síťování zpomalí disociaci tetramemího hemoglobinu o molekulové hmotnosti 64000 na dimery s molekulovou hmotností 32000. V nemodifikovaném hemoglobinu tetramemí a dimemí forma jsou v dynamické rovnováze. Stabilizace tetramemího hemoglobinu síťováním imidoestery podstatně sníží přechod hemoglobinu do ledvinových kanálků a zabrání filtraci membránou pouzdra klubíček.

Za druhé síťování vede ke vzniku vysokomolekulámích oligomerů tetramemího hemoglobinu, které budou extrémně odolné vůči ledvinové filtraci a stálejší vůči oxidaci za fyziologické teploty než nemodifikovaný hemoglobin či hemoglobin modifikovaný síťujícím činidlem glutaraldehydem.

Dimethyladipimidát je relativné levné činidlo a je k dispozici v dostatečném množství. Měřítko síťování pomocí dimethyladipimidátu lze dobře zvětšovat.

Schopnost jednotlivých forem hovězího hemoglobinu vázat kyslík se měřila a je uvedena v Tabulce I. Hodnota p50 je parciální tlak kyslíku, při kterém 50 % dosažitelných center vázalo kyslík. Hillův koeficient neboli n hodnota je vyjádření kooperativity mezi centry, která vážou kyslík. Vysoká n hodnota znamená vysokou kooperativitu. p50 hodnoty se měřily jak při oxidaci, tak při dezoxidaci roztoků hemoglobinu. Průměrné p50 hodnoty byly 1,80 kPa pro hemoglobin síťovaný dimethyladipimidátem (DMA), 1,90 kPa pro hemoglobin síťovaný glutaraldehydem (GA) a 3,17 kPa pro nemodifikovaný hovězí hemoglobin. Pokud došlo k velmi silnému síťování jak imidoestery, tak glutaraldehydem, p50 hodnoty těchto hemoglobinů byly silně snížené. Síťování hemoglobinu jak imidoestery, tak glutaraldehydem rovněž snižovalo kooperativu. Větší snížení se pozorovalo u vzorku zpracovaného glutaraldehydem.

Tabulka I

Vzorek hemoglobin	p50 oxidace kPa	p50 dezoxidace kPa	n
Hovězí Hb	3,20	3,17	2,1-2,4
Hb+GA	2,00	1,80	1,2
Přebvtek GA	0,93	0,87	1,1
Hb+DMA	1,87	1,90	1,6
Přebytek DMA	1,33	1,20	1,5

Srovnávala se stabilita různě síťovaných hemoglobinů a ukázalo se, že hemoglobiny síťované imidoestery mají lepší stabilitu. Proto imidoester dával za vhodných podmínek síťování, popsaných níže, lepší hemoglobin pro transport kyslíku, posuzováno podle stability a afinity ke kyslíku.

-4CZ 281912 B6

Během inkubace při 36-37 °C vzorky hemoglobinu síťované dimethyladipimidátem, glutaraldehydem a nemodifikovaný hemoglobin obsahovaly na počátku inkubace 2,5 %, 8 % a

3,5 % methemoglobinu. Po 5 hodinách při 36-37 °C procenta methemoglobinu byly 8,9 %,

44.4 % a 8 % pro vzorky hemoglobinu síťované dimethyladipimidátem, glutaraldehydem a nemodifikovaný hemoglobin. Po 24 hodinách koncentrace methemoglobinu byly 24,1, 87,9 a 42 % pro vzorky hemoglobinu síťované dimethyladipimidátem, glutaraldehydem a nemodifikovaný hemoglobin. Po 48 hodinách koncentrace methemoglobinu ve vzorcích hemoglobinu síťovaného dimethyladipimidátem a u nemodifikovaného hemoglobinu byly

46.5 % a 68 %. Hemoglobin síťovaný dimethyladipimidátem byl stálejší než nemodifikovaný hemoglobin proti tvorbě methemoglobinu. Literatura udává, že lidský hemoglobin síťovaný glutaraldehydem se samovolně oxiduje čtyřikrát rychleji než nemodifikovaný lidský hemoglobin. Proto se nedalo očekávat, že hemoglobin síťovaný dimethyladipimidátem bude stálejší než nemodifikovaný hemoglobin.

Stálost nemodifikovaného hovězího hemoglobinu a hovězího hemoglobinu síťovaného dimethyladipimidátem či glutaraldehydem vůči oxidaci se také měřila po skladování po 52 dnů při 4 °C ve stejném fosfátovém ústoji, jak je popsáno shora. Po 28 dnech se u hovězího hemoglobinu síťovaného dimethyladipimidátem zvýšil obsah methemoglobinu z 2,5 % na 9,6 %. V témže období zvýšil obsah methemoglobinu u hemoglobinu síťovaného glutaraldehydem z 8,0 % na

23.5 %. Při měření po 52 dnech hemoglobin síťovaný dimethyladipimidátem obsahoval 14,3 % methemoglobinu zatím co po 37 dnech nemodifikovaný hovězí hemoglobin obsahoval 16,3 % methemoglobinu. Stejně jako při inkubaci za teploty 37 °C hemoglobin síťovaný dimethyladipimidátem byl významně stálejší než hemoglobin síťovaný glutaraldehydem či nemodifikovaný hovězí hemoglobin.

Jeden aspekt tohoto vynálezu se týká zvýšení stability savčích hemoglobinů včetně hovězího hemoglobinu po síťování imidoestery včetně dimethyladipimidátu. Zde se popisuje, jak se stabilita savčích hemoglobinů může zvýšit reakcí s imidoestery, specificky s dimethyladipimidátem za zvláštních reakčnich podmínek. Mimo to je popsána metoda výroby čištěného savčího hemoglobinu, jmenovitě hovězího hemoglobinu. Hemoglobin bude podstatně zbavený nečistot, což znamená, že nebude obsahovat žádné látky, které by mohly mít nepříznivé účinky na léčeného savce. Hemoglobin bude dostatečně zbaven endotoxinú (na příklad méně než 0,5 EU/ml při koncentraci hemoglobinu alespoň 40 mg/ml), fosfolipidů, virusů a jiných nehemoglobinových proteinů před síťováním. Je však rovněž možné nejprve síťovat hemoglobin po soustředění lyžovaného hemoglobinu a pak čistit síťovaný hemoglobin. Tento postup může být účinnější při výrobě ve velkém měřítku. Čištěný a síťovaný hemoglobin bude vhodný jako náhrada krve pro transfuze u lidí a zvířat.

Hemoglobin podle tohoto vynálezu se zpravidla připraví odběrem savčí krve za aseptických podmínek, promytím červených krvinek a jejich rozkladem, odstředěním rozložených červených krvinek, ultrafiltrací pomocí membrány s molekulovou hmotností alespoň 300 000 nebo mikrofiltrací pomocí filtru 0,025 až 0,040 mikrometrů, čistěním lyzátu anionaktivní nebo kationaktivní chromatografú, aby se získal čištěný hemoglobin a potom síťováním čištěného hemoglobinu imidoesterem, případně se hemoglobin dělí dle velikosti, pomocí velikostní chromatografie nebo ultrafiltrace, aby se odstranil nízkomolekulámí hemoglobin. Alternativně se může hemoglobin síťovat po odstředění a oddělení lysátu. Čistění se pak může provádět spolu s případným dělením dle velikosti.

Takto připravený hemoglobin bude podstatně zbavený nečistot a bude tvořen převážně stabilizovaným tetramerem. Jiným způsobem charakterizace síťovaného hemoglobinu je to, že má rozdělení molekulové hmotnosti převážně alespoň 64 000. Převážně, tak jak se tu používá znamená, že produkt obsahuje alespoň 80 % síťovaného hemoglobinu, s výhodou alespoň 90 až 95 % síťovaného hemoglobinu.

-5CZ 281912 B6

Aby se připravil hemoglobin specializovaný pro přenos kyslíku, jsou specifikovány různé parametry síťující reakce. Nejprve koncentrace chloridového iontu a nebo chloridu sodného, která má významný účinek na stupeň síťování (hovězího) hemoglobinu pomocí DMA v rozmezí od 1 mMol Tris-HCl do 50 mMol Tris-HCl plus 2,0 Mol NaCl. V 1 a 10 mMol Tris-HCl po 10 5 přidáních DMA zůstalo nezpolymerováno 90,3 %, respektive 72,2 % hemoglobinu. Na rozdíl od tohoto výsledku v přítomnosti 50 mMol Tris-HCl s 0,1, 1,0 a 2,0 mMol NaCl zůstalo nesíťováno pouze 25,8, 24,4 a 20,7 % hemoglobinu. Stálý pokles nezpolymerizovaného hemoglobinu a vzestup vysoké molekulové hmotnosti (přes 400 000 Daltonů) byl pozorován při zvyšování koncentrace soli. Největší podíl hemoglobinu v rozsahu 64-400 000 se pozoroval při síťování io buď v 50 mMol Tris-HCl, nebo v 50 mMol Tris-HCl plus 100 mMol NaCl.

Za druhé se ukázalo, že na síťování má silný vliv typ ústoje. Na příklad reakce síťování DMA probíhala špatně v roztocích obsahujících glycin-HCl, ethanolamin-HCl a fosfát sodný plus lysin. Předpokládá se, že v těchto typech ústojů primární amin inhiboval síťující reakci, o které 15 se domníváme, že probíhá primárně na amino skupiny N-konce proteinu a na jeho lysinové zbytky. Největší rozsah síťování byl pozorován v přítomnosti ústoje s 2-amino-2-methyl-lpropanolem, kdy zůstalo jen 23,4 % hemoglobinu nesíťováno. Tento ústoj má rovněž primární aminovou skupinu. Následující čtyři ústoje podle účinnosti při síťování s DMA byly tris(hydroxymethyl)aminomethan, uhličitan sodný, CHES (2-(N-cyklohexylamino)ethansulfo20 nová kyselina) a CAPSO (3-(cyklohexylamino)-2-hydroxy-l-propansulfonová kyselina). Tri z nich mají primární aminovou skupinu. Naproti tomu CAPS (3-{cyklohexylamino)-l-propansulfonová kyselina) nebyl dobrým ústojem pro reakci síťování a výsledný produkt byl síťován jen na 27,2 %. Fosfát sodný nebyl rovněž vhodný výběr pro síťování.

Za třetí hrálo při polymeraci hemoglobinu imidoesterem důležitou úlohu pH. Na příklad pokusy síťovat hemoglobin DMA při pH hodnotách nižších než 8,0 byly zpravidla neúspěšné. Při pH 8,0 po 10 přidáních DMA a konečném stechiometrickém poměru DMA k hemoglobinu rovném 10, byl hemoglobin zesíťován jen na 12,2 %. Zvýšení účinnosti síťování se pozorovalo při pH 9,0, 10,0 a 10,5 s pouhými 58 %, 48 % a 50 % hemoglobinu, který zůstal nezesíťován na konci 30 přidávání DMA. Bylo tedy z těchto výsledků zřejmé, že reakce DMA s hemoglobinem vyžaduje k tomu, aby byla úspěšná, pH 9,0 nebo vyšší. Na konec bylo pozorováno, že dezoxidovaný hemoglobin se snáze síťuje než hemoglobin oxidovaný.

Po zabezpečení shora uvedených polymerizačních podmínek pro optimální síťování, 35 nezesíťovaný hemoglobin lze odfiltrovat nebo chromatografovat na výtěžek molekulové hmotnosti 64 000 nebo vyšší a pak dále odfiltrovat nebo chromatografovat, aby se získala molekulovou hmotnost převážně 64 000. Optimalizace síťování hemoglobinu tedy značně ulehčuje ekonomickou a praktickou přípravu materiálu pro přenos kyslíku podle tohoto vynálezu, který má převážnou molekulovou hmotnost 64 000 až 300 000.

Po získání zesíťovaného hemoglobinu se tento zpravidla zavede do farmaceuticky přijatelného nosiče pro transfuze nebo injekce do léčeného savce. Typický farmaceuticky přijatelný nosič mohou tvořit fyziologicky přijatelné roztoky solí, vhodné pro transfuze nebo injekce, jako jsou komerční roztoky solí. Farmaceuticky přijatelný nosič může být kterákoliv z různých kapalin, 45 které by byly relativně inertní k zesíťovanému hemoglobinu a neměly by škodlivý účinek na savce, kterému by byly podávány. Vhodné kapaliny mohou rovněž zahrnovat jiné krevní produkty, buď přirozené nebo umělé, nebo kapalné fluoruhlíky. Zesíťovaný hemoglobin dle tohoto vynálezu se zpravidla smíchá s farmaceuticky přijatelným nosičem, takže se koncentrace hemoglobinu může upravit na vhodné rozmezí od asi 40 do asi 140 mg/ml.

Předmět tohoto vynálezu je popsán v následujících příkladech podrobněji podle shora uvedených jednotlivých kroků a molekulárního složení. Popsané způsoby jsou použitelné na libovolný savčí hemoglobin, i když pro účely specifických příkladů, které popisují čistění, síťování a modifikaci, se používá hovězí hemoglobin. Hovězí hemoglobin však má výhodu v tom, že má velmi vysokou

-6CZ 281912 B6 hodnotu p50, vhodnou pro transport kyslíku.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Odběr krve a příprava hemolyzátu červených krvinek.

Krev se odebírala za aseptických podmínek Holsteinským kastrátům na farmě firmy The Upjohn Company Agricultural Division. Nejprve se oholily chlupy z krku každého býka elektrickými nůžkami. Oholená plocha se pak vytřela látkovým ručníkem nasáklým v jódové tinktuře. Následovalo omytí 95% ethanolem ze střičky. Ethanol se nechal před odběrem krve oschnout na vzduchu. Odebíralo se 0,5 až 1,0 litru krve do evakuovaných láhví pro odběr krve, které byly sterilní a zbavené pyrogenů. Před odběrem krve se přidalo do každé láhve vhodné množství sterilního roztoku sodného heparinu. Ihned po odběru se láhve uložily do ledu a v něm se dopravovaly do laboratoře. Pro počáteční zkoušky se odebíralo 2,5-5,0 litru krve.

V laboratoři se vše provádělo bud’ na ledu, nebo při 4 °C, aby se minimalizoval růst mikroorganismů a s ní spojená tvorba pyrogenů. Mimo to by se čisticí kroky měly provádět v čistém prostředí s filtrovaným vzduchem, který má nízký obsah částic. Prvé kroky čistění hemoglobinu zahrnují oddělení červených krvinek od krevní plazmy, následované opakovanými promýváními červených krvinek solným roztokem a odstředěním pro peletizaci červených krvinek. Celá krev se nejprve přenesla do 0,5 1 odstředivkových láhví zbavených pyrogenů a odstřeďovala se po 30-40 minut 4000 otáčkami/min při 4 °C. Červené krvinky se při odstřeďování peletizovaly. Odstředěná krevní plasma se oddělila odsátím. Červené krvinky se znovu suspendovaly v ledově chladném roztoku obsahujícím 16 gramů chloridu sodného (NaCl) v litru čištěné vody. Tento roztok se označuje jako 1,6. % solanka. Červené krvinky se suspendovaly mícháním sterilní skleněnou tyčinkou zbavenou pyrogenů nebo opakovaným mírným převracením odstředivkových láhví. Po suspenzaci se červené krvinky znovu odstřeďovaly po 30-40 minut 10 000 otáčkami/min při. 4 °C. Červené krvinky se opět suspendovaly v 1, 6% solance a znovu odstřeďovaly po 30-40 minut 10 000 otáčkami/min při 4 °C. Červené krvinky se promývaly v 1,6 % solance celkem třikrát před jejich prasknutím nebo lyží.

Po promytí červených krvinek se červené krvinky rozkládaly hypoosmotickým šokem následujícím způsobem. K jednomu objemu promytých peletizovaných červených krvinek se přidaly čtyři objemy ledově chladného 2,5 mMol ústoje fosforečnanu sodného s pH 7,4. Červené krvinky se suspendovaly v tomto zředěném fosforečnanovém ústoji mírným převracením odstředivkových láhví. Po úplném rozptýlení krvinek se suspenze červených krvinek inkubovaly při 0-4 °C jednu hodinu s následujícím odstřeďováním po 30-40 minut 10000 otáčkami/min při 4 °C. Po odstředění se hemoglobin v kapalině získal odsátím. V některých pokusech se postup upravil následujícím způsobem. Po jednohodinové inkubaci v 2,5 mMol ústoji fosforečnanu sodného při 4 °C se přidal 2,0 Mol roztok chloridu sodného na konečnou koncentraci 0,2 Mol NaCl před odstředěním. Přidání chloridu sodného k lyzátu červených krvinek vedlo k čistší kapalině po odstředění.

Přípravu hemolyzátu lze po odstředění vylepšit. Do odstředěného lyzátu lze zamíchat pomocný 50 filtrační prostředek, kterým může být buď celulóza, nebo křemelina, či polymerní nebo křemičitý derivát. Tento prostředek se pak odstraní buď filtrací, nebo odstředěním. Do pomocného filtračního prostředku se zachytí další úlomky stromy, jako fosfolipidy, které by se snad neodstranily odstředěním.

-7CZ 281912 B6

Alternativou k hypoosmotickému šoku pro rozklad červených krvinek je mechanické rozdrceni třeba pomocí Francouzského lisu nebo velkokapacitním buněčným homogenizátorem.

Obsah pyrogenů ve čtyřech zpracovaných hemolyzátech kolísal mezi 0,05 až 0,2 jednotek endotoxinu (EU) na ml v testu na pyrogeny užívajícího Limulus Amoebocyte Lysáte (LAL). 5 Další zpracování pomocí anionaktivní nebo kationaktivní chromatografie by odstranilo poslední stopy endotoxinu a fosfolipidů.

Příklad 2

Snížení obsahu virů.

Pokud je hovězí krev zamořena viry, určitá část virové zátěže se odstraní během promývání červených krvinek při nízkoobrátkovém odstřeďování. Další podíl se odstraní při 15 vysokoobrátkovém odstřeďování hemolyzátu a zůstane v pevném zbytku. Jiná část se ztratí při zdokonaleném čistění.

Další redukce virové zátěže je možná mikrofiltrací nebo ultrafiltrací. Mikrofiltrace pomocí filtru 0,025 až 0,040 mikrometrů podstatně sníží obsah většiny virů. Mikrofiltrační náplň Ultipor N66 20 nylon 66 firmy Pall Corporation má porezitu 0,04 mikrometrů a lze ji použít k filtraci hemolyzátu před dalším zpracováním. Navíc je v případě potřeby k dispozici ultrafiltrační membrána s oddělovací molekulovou hmotností 300000 od firmy Filtron Corporation, která se vkládá do ultrafiltrační produkční jednotky Pellicon firmy Amicon Corporation. Hemoglobin projde volně těmito ultra a mikrofiltračními membránami, zatím co část virů se zachytí. Proto 25 kombinace těchto dvou filtračních membránám podstatně sníží virovou zátěž. Oba typy filtrů vykazují nízkou zádrž proteinů.

Vedle filtrace se obsah virů ve filtrovaném hemolyzátu může zmenšit přídavkem vhodných detergentů, ethylendinitrotetraoctové kyseliny, trinitrobutylfosfátu, což je činidlo schválené 30 FDA, nebo kombinací těchto látek.

Příklad 3

Iontová výměnná chromatografie hemoglobinu.

Anionaktivní výměnná chromatografie se používala široce pro čistění lidských hemoglobinů (Williams R. C., Tsay K..: Anal. Biochem. 54: 137-45 (1973). Při vhodném pH a iontové síle se hemoglobin může zavést na anionaktivní pryskyřici tak, aby se na ni vázal. Proteinové a 40 neproteinové nečistoty se oddělí od hemoglobinu při promývání kolony. Lze rovněž zvolit podmínky, za kterých má hemoglobin malou nebo žádnou afinitu k vybrané anionaktivní pryskyřici. Za těchto podmínek nečistoty zůstanou na koloně. Hlavní nečistoty v čerstvě připraveném hemolyzátu jsou fosfolipidy, potenciální zbytkové viry, které se neodstranily v předcházejících výrobních krocích, nízkomolekulámí bakteriální endotoxiny a jiné proteiny než 45 hemoglobin. Fosfolipidy, endotoxiny a plazmové proteiny mají vyšší záporný náboj než hemoglobin a měly by vykazovat vyšší afinitu k anionaktivní pryskyřici za vybraných podmínek. Za vhodných zaváděcích a elučních podmínek anionaktivní výměnná chromatografie by měla být užitečná pro oddělení hemoglobinu od těchto nečistot. Mimo to by anionaktivní výměnná chromatografie měla dále snížit virovou zátěž.

Používali jsme tři postupy anionaktivní výměnné chromatografie pro čistění hemoglobinu: vázání při zvýšeném pH a vymývání při snižujícím se pH gradientu, vázání při zvýšeném pH a vymývání při stupňovitém gradientu nižších pH a zavádění při pH, za kterých se hemoglobin neváže na anionaktivní pryskyřici, ale prochází kolonou bez zadržení. Všechny pokusy probíhaly

-8CZ 281912 B6 na kolonách, lze však předpokládat, že lze nalézt podobné podmínky pro šaržové zpracování, které by daly téměř shodné výsledky. Anionaktivní pryskyřice používaná při těchto pokusech byla Q-Sepharose Fast Flow firmy Pharmacia. Lze však předpokládat, že tyto postupy budou použitelné s řadou komerčních anionaktivních pryskyřic pro nízký až střední tlak, které byly 5 vyvinuty pro čistění proteinů, včetně těch, které mají kvartemí aminové a diethylaminoethylové skupiny.

Kationaktivní výměnná chromatografie se rovněž široce používala pro čistění savčích hemoglobinů (Bucci E.: Příprava izolovaných řetězců lidského hemoglobinu. Meth. in Enzymol.

76: 97-106 (1981). Za vhodného pH a iontové síle hemoglobin lze zavést na kationaktivní pryskyřici tak, aby se na ni vázal. Fosfolipidy, endotoxiny a plazmové proteiny by měly vykazovat nižší afinitu ke kationaktivní pryskyřici za podmínek, při kterých se váže hemoglobin. Za vhodných zaváděcích a elučních podmínek kationaktivní výměnná chromatografie by měla být užitečná pro oddělení hemoglobinu od těchto nečistot. Mimo to by kationaktivní výměnná 15 chromatografie měla dále snížit virovou zátěž.

Byly navrženy dva postupy kationaktivní výměnné chromatografie pro čistění hemoglobinu. Při prvém se hemoglobin zaváděl za podmínek kdy se váže ke kationaktivní pryskyřici a pak se vymývá při lineárním pH gradientu. Při druhém postupu se hemoglobin zaváděl za podmínek kdy 20 se váže ke kationaktivní pryskyřici a pak se vymývá při stupňovitém pH gradientu. Při obou postupech fosfolipidy a endotoxiny procházejí bez zadržení pryskyřicí, a tím se tyto nečistoty oddělí od hemoglobinu. Lze použít řadu komerčních kationaktivních pryskyřic. S výhodou se používala kationaktivní pryskyřice S-Sepharose Fast Flow firmy Pharmacia, pro své vynikající vázání proteinů a průtokové charakteristiky. Lze předpokládat, že podobnou funkci splní mnoho 25 dalších nízko až středotlakých chromatografických pryskyřic se sulfopropylovými a karboxymethylovými skupinami. Zvětšení měřítka u těchto pryskyřic je ekonomické.

Příklad 3A

Anionaktivní výměnná chromatografie s lineárním pH gradientem.

Tento pokus ukázal podmínky anionaktivní výměnné chromatografie, při nichž se hovězí hemoglobin zaváděl na pryskyřici a pak se vymýval při lineárním pH gradientu. Kolona 2,5*5,5 35 cm s Q-Sepharose Fast Flow se připravila a vyčistila nočním vystavením 0,5 Mol NaOH. Kolona se promyla 100 mMol Tris, pH 8,5 až odtok z kolony měl pH 8,5. Pak se kolona vyvážila 50 mMol Tris, pH 8,5. Pět ml vzorku čerstvě připraveného hemolyzátu hovězích červených krvinek obsahujícím přibližně 350 mg hemoglobinu se zředilo na 10 ml s 100 mMol Tris, pH 8,5 a zavedlo na kolonu Q-Sepharose Fast Flow rychlostí 2,5 ml za minutu. Po zavedení se kolona 40 promývala 50 mMol Tris, pH 8,5, až se absorbance odtoku z kolony vrátila na základ. Kolona se pak vymývala lineárním gradientem sestávajícím z výchozího ústoje proti 50 mMol Tris, pH 6,5, na deset objemů kolony. Hemoglobin se vymýval podstatně jako jediný hlavní pík s mnoha menšími píky vymývanými před a za ním. Jediný hlavní pík obsahoval 95 % hemoglobinu, který byl zaveden na kolonu. Všechny chromatografícké postupy se prováděly při 5 °C.

Příklad 3B

Anionaktivní výměnná chromatografie se stupňovitým pH gradientem.

Tento pokus ukázal podmínky anionaktivní výměnné chromatografie, za kterých se hovězí hemoglobin zaváděl na pryskyřici a pak se vymýval jedním krokem pH gradientu. Kolona

2,5 *5,5 cm s Q-Sepharose Fast Flow se připravila a vyčistila jako v Příkladě 3 A. Osm ml vzorku hemolyzátu hovězích červených krvinek obsahujícím přibližně 400 mg hemoglobinu se zředilo

-9CZ 281912 B6 na 16 ml s 50 mMol Tris, pH 8,5 a zavedlo na kolonu rychlostí 2,7 ml za minutu. Po zavedení se kolona promývala 50 mMol Tris, pH 8,5, až se absorbance odtoku z kolony vrátila na základ.

Kolona se pak vymývala 50 mMol Tris, pH 7,4. Obsah hemoglobinu přítomného v bohaté frakci

Q-Sepharosy byl téměř shodný s tím, který byl zaveden na kolonu. To ukazovalo na téměř kvantitativní výtěžek tohoto kroku.

Příklad 3C

Anionaktivní výměnná chromatografie při níž se hemoglobin nezachycuje.

Tento pokus ukázal podmínky anionaktivní výměnné chromatografie, při kterých se hovězí hemoglobin nevázal na pryskyřici, ale procházel kolonou bez zádrže. Kolona 2,5*5,5 cm s QSepharose Fast Flow se připravila a vyčistila nočním vystavením 0,5 Mol NaOH. Kolona se promyla 100 mMoi Tris, pH 7,4 až odtok z kolony měl pH 7,4. Deset ml vzorku čerstvě připraveného hemolyzátu hovězích červených krvinek obsahujícím 880 mg hemoglobinu se zředilo na 40 ml s 50 mMol Tris, pH 7,4 a 35 ml se zavedlo na kolonu rychlostí 2,5 ml za minutu. Po zavedení se kolona promývala 50 mMol Tris, pH 7,4, až do skončení vymývání hemoglobinu. Hemoglobin procházel kolonou bez zachycení a výtěžek byl 88 %.

Příklad 3D

Kationaktivní výměnná chromatografie hemoglobinu.

Tento pokus ukázal podmínky kationaktivní výměnné chromatografie, při nichž se hovězí hemoglobin zaváděl na pryskyřici a pak se vymýval při lineárním pH gradientu. Kolona 2,5*5,5 cm s S-Sepharose Fast Flow se připravila a vyčistila nočním vystavením 0,5 Mol NaOH. Kolona se promyla 100 mMol Bis-Tris, pH 6,0 až odtok z kolony měl pH 6,0. Pak se kolona vyvážila 50 mMol Bis-Tris, pH 6,0. Pět ml vzorku čerstvě připraveného hemolyzátu hovězích červených krvinek se zředilo na 10 ml s 50 mMol Bis-Tris, pH 6,0 a zavedlo na kolonu SSepharose rychlostí 2,5 ml za minutu. Po zavedení se kolona promývala 50 mMol Bis-Tris, pH 6,0, až se absorbance odtoku z kolony vrátila na základ. Kolona se pak vymývala lineárním gradientem sestávajícím se z kolonového ústoje a 50 mMol Bis-Tris, pH 8,0, na deset objemů kolony. Všechny chromatografické postupy se prováděly při 5 °C.

Příklad 4

Síťování hovězího hemoglobinu dimethyladipimidátem.

Vzorek obsahující 170 mg čištěného hovězího hemoglobinu se zpracovával následujícím způsobem. Síťující reakce se prováděla při koncentraci tetrameru hemoglobinu 1,75 mMol nebo 112 mg/ml. Vysoké koncentrace tetrameru hemoglobinu podporují mezimolekulámí síťování tetramerů hemoglobinu. Hemoglobin se modifikuje v přítomnosti ůstoje 50 mMol Tris, pH 8,8 při 4 °C přídavkem ekvimolekulámích množství dimethyladipimidátu (např. 1,75 mMol dimethyladipimidátu-na 1,75 mMol tetrameru hemoglobinu). Reakce s dimethyladipimidátem se opakuje osmkrát v 30 minutových intervalech při 4 °C. Při každém kroku se přidá 50 mg/ml roztok dimethyladipimidátu v 0,025 Mol uhličitanu sodném, pH 9,25 až do konečné koncentrace 1,75 mMol. Roztok hemoglobinu se míchá během přidávání síťujícího činidla a pak se inkubuje na ledě po 30 minut. Po každých 30 minutách se odebral 0,4 ml vzorek a přidalo se 4 ml 0,25 Mol fosforečnanu sodného, pH 7,0. Fosfátový ústoj zastavuje síťování hydrolýzou imidoesteru. K zastavení dojde během dvou hodin při pokojové teplotě. Zbylý roztok hemoglobinu se nechá opět reagovat s čerstvým roztokem síťujícího činidla. Osm reakčních cyklů se provedlo během

- 10CZ 281912 B6

3,5 hodiny. V tomto pokusu se používal specifický imidoester dimethyladipimidát. Jiné imidoestery se mohou rovněž použít.

Příklad 5

Velikostní HPLC hemoglobinu síťovaného dimethyladipimidátem.

Koncentrace hemoglobinu se stanovovala spektrofotometricky podle publikovaných extinkčních koeficientů (Benesch R. E., Benesch R., Yund S.: Rovnice pro spektrofotometrickou analýzu směsí hemoglobinu. Anal. Biochem. 55: 245-48 (1973). Reakční produkty se sledovaly po každém přidání síťujícího činidla pomocí velikostní HPLC (SEC-HPLC). Produkty zastavené reakce se zředily na 1 mg tetrameru hemoglobinu na ml v 0,2 Mol fosforečnanu sodném, pH 7,0. Zředěný produkt se analyzoval velikostní HPLC dvěma způsoby. Při prvním se SEC kolona Zorbax GF-250 (Dupont) vyrovnala 0,2 Mol fosforečnanem sodným, pH 7,0 a provozovala při 1 ml/min. Druhý se prováděl na koloně Superose 12 FPLC (Pharmacia), vyrovnané 0,1 Mol fosforečnanem sodným, pH 7,0. Obě kolony se kalibrovaly proteiny se známou molekulovou hmotností.

Postupné kroky síťování dimethyladipimidátem vedly k postupnému zvyšování množství polymerovaného hemoglobinu se stabilizovaným tetramerem. Rozsah molekulové hmotnosti na Superose 12 FPLC bylo možno definovat následovně: 1) % přes 400000 Daltonů, 2) % přes 64 000 Daltonů a pod 400000 Daltonů a 3) % pod 64000 Daltonů. Po čtyřech krocích síťování relativní procenta byly 1)0%, 2) 40,64 %, 3) 59,36 %. Po sedmi krocích byly procentní hodnoty 1) 4,1 %, 2) 50,4 % a 3) 45,5 %. Po osmi iteracích byly procentní hodnoty 1) 7,5 %, 2) 50,6 % a 3) 41,9 %. Pík třídy 3) s hodnotou pod 64000 Daltonů sestával z jediného symetrického píku s molekulovou hmotnost 30000 Daltonů. Tato frakce se vymývala spolu s nemodifikovaným hovězím hemoglobinem. Předpokládá se, že se skládá převážné z dimeru hemoglobinu. Obsah methemoglobinu v hemoglobinu po sedmi krocích byl pod 2,5 %. Viditelné spektrum síťovaného hemoglobinu se podobalo nemodifikovanému hovězímu hemoglobinu.

Příklad 6

Elektroforéza síťovaného hemoglobinu na SDS polyakrylamidovém gelu.

Elektroforéza na polyakrylovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE) se prováděla se vzorky síťovaného a nesíťovaného hemoglobinu následovně. Vzorky hemoglobinu se zředily na 2 mg/ml v 0,005 Mol fosforečnanu sodném, pH 7,4, 0,15 Mol NaCl a zředěné vzorky se smíchaly s 3 díly standardního SDS-gelového ústoje s následující inkubací 3 hodiny při 37 °C. Vzorky se zpracovaly na 10-20 % ISS minigelech, v neredukované formě. SDS-PAGE síťovaného hemoglobinu po 7 iteracích síťování ukázala, že 80 % vzorku se síťovalo mezi jednotkami. Alespoň osm multimerů jednotkových molekulových hmotností bylo přítomno, všechny v přibližně stejných podílech.

Příklad 7

Kyslíková rovnováha síťovaného a nesíťovaného hovězího hemoglobinu.

Měření kyslíkové rovnováhy síťovaného a nesíťovaného hovězího hemoglobinu se provádělo pomocí přístroje Hemoxanalyzer firmy TCS Medical Industries. Po sedmi reakčních krocích s dimethyladipimidátem vzorek síťovaného hemoglobinu se zředil na 1,5 mg/ml solankou s fosfátovým ústojem, pH 7,4 a podrobil analýze. Za stejných podmínek se rovněž analyzoval

- 11 CZ 281912 B6 vzorek nemodifikovaného hovězího hemoglobinu a vzorek hovězího hemoglobinu, který byl síťován v naší laboratoři glutaraldehydem s použitím metody popsané v Guillochon D. aj.: Účinek glutaraldehydu na hemoglobin. Biochem. Pharm. 35: 317-23 (1986). Hodnoty p50 (parciální tlak kyslíku při polovičním nasycení u různých hemoglobinů byly: 1,80 kPa u hemoglobinu síťovaného dimethyladipimidátem, 1,90 kPa u hemoglobinu síťovaného glutaraldehydem a 3,17 kPa u nemodifikovaného hovězího hemoglobinu.

Příklad 8

Zkoušky stálosti nemodifikovaného a modifikovaného hovězího hemoglobinu.

Hovězí hemoglobin, který prošel sedmi kroky síťování dimethyladipimidátem, nemodifikovaný hovězí hemoglobin a hemoglobin síťovaný glutaraldehydem se inkubovaly při 36-37 °C v 0,125 Mol fosforečnanu sodném, pH 7,1. Koncentrace hemoglobinu byly 40 mg/ml u hemoglobinu síťovaného dimethyladipimidátem a u nemodifikovaného hovězího hemoglobinu a 28 mg/ml u hemoglobinu síťovaného glutaraldehydem. V určitých časových intervalech se z každého druhu hemoglobinu odebraly vzorky, zředily se 1/100 v 0,25 Mol fosfátovém ústoji, pH 7,3, a pozorovaly se mezi 680 až 420 nm na skanovacím spektrofotometru UV-viditelné Model 160 firmy Shimadzu. Obsah methemoglobinu se stanovil analýzou všech spekter podle publikovaných rovnic (Benesch R. E., Benesch R., Yund S.: Rovnice pro spektrofotometrickou analýzu směsí hemoglobinu. Anal. Biochem. 55: 245-48 (1973). Spektra se stanovovala při 22 °C. Hemoglobin síťovaný dimethyladipimidátem a hemoglobin síťovaný glutaraldehydem se rovněž inkubovaly při 4 °C po delší dobu. V různých časových intervalech se odebíraly vzorky a obsah methemoglobinu se stanovil shora popsaným způsobem. Hemoglobin síťovaný dimethyladipimidátem a hemoglobin síťovaný glutaraldehydem a nemodifikovaný hemoglobin obsahovaly 2,5 %, 8,0 % a 3,5 % methemoglobinu před inkubaci při 36-37 °C. Po 5 hodinách při 36-37 °C se obsah methemoglobinu zvýšil na 8,9 %, 44,4 % a 8 % u odpovídajících vzorků. Po 24 hodinách koncentrace methemoglobinu byly 24,1, 87,9 a 42 % pro hemoglobin síťovaný dimethyladipimidátem, hemoglobin síťovaný glutaraldehydem a nemodifikovaný hemoglobin. Po 48 hodinách koncentrace methemoglobinu byly u hemoglobinu síťovaného dimethyladipimidátem a nemodifikovaného hemoglobinu 46,5 % a 68 %. Hemoglobin síťovaný dimethyladipimidátem je stálejší proti vzniku methemoglobinu než nemodifikovaný hemoglobin při 36-37 °C. Podle literárních údajů se lidský hemoglobin síťovaný glutaraldehydem samovolně okysličuje čtyřikrát rychleji než nemodifikovaný lidský hemoglobin (Guillochon D. aj.: Účinek glutaraldehydu na hemoglobin. Biochem. Pharm. 35: 317-23 (1986). Proto se nedalo očekávat, že hemoglobin síťovaný dimethyladipimidátem bude stálejší vůči samovolné oxidaci než nemodifikovaný hovězí hemoglobin.

Stálost hemoglobinu síťovaného dimethyladipimidátem či glutaraldehydem vůči samovolné oxidaci se měřila po skladování po 28 dnů při 4 °C ve stejném fosfátovém ústoji, jak je popsáno shora. Po 28 dnech se u hovězího hemoglobinu síťovaného dimethyladipimidátem zvýšil obsah methemoglobinu z 2,5 % na 9,6 %. V témže období se zvýšil obsah methemoglobinu u hemoglobinu síťovaného glutaraldehydem z 8,0 % na 23,5 %.

Příklad 9

Preparativní velikostní chromatografie hemoglobinu síťovaného dimethyladipimidátem.

Preparativní velikostní chromatografie se používala k odstranění nízkomolekulámích podílů (to je pod 64 000 Daltonů) z hovězího hemoglobinu síťovaného dimethyladipimidátem. Hemoglobin síťovaný dimethyladipimidátem, 40 mg/ml, se nanesl na 2.5*90 cm kolonu Sephacryl S-200HR (Pharmacia) vyrovnanou 0,025 Mol fosforečnanem sodným, 0,15 Mol NaCl, pH 7,4. Objem

- 12 CZ 281912 B6 násady byl 1 % objemu lože kolony a průtok byl 0,45 ml/min. Píky z chromatografie se spojovaly a spojené vzorky analyzovaly SEC-HPLC na koloně Superose 12 FPLC (jak je popsáno shora), aby se stanovilo rozdělení molekulových hmotností jejich hemoglobinů. Vzorek před dělením se rovněž analyzoval na koloně Superose.

Preparativní velikostní chromatografie rozdělila hemoglobin síťovaný dimethyladipimidátem na dvě hlavní frakce. Frakce 1 obsahovala podíly síťovaného hemoglobinu s vyšší molekulovou hmotností a představovala 51,3 % celkově získaného hemoglobinu. Frakce 2 obsahovala síťovaný hemoglobin s molekulovou hmotností menší než 64 000. SEC-HPLC neděleného síťovaného hemoglobinu ukázala, že obsahuje 2,6 % frakce přes 400 000 Daltonů, 47,2 % přes 64 000 Daltonů a 50,2 % pod 64 000 Daltonů. Podle analýzy SEC-HPLC čištěná frakce 1 z preparativní velikostní chromatografie obsahovala 4,7 % frakce přes 400 000 Daltonů, 92,7 % přes 64000 Daltonů a 2,6 % pod 64 000 Daltonů. Tato metoda byla úspěšná při odstraňování nízkomolekulámích typů hemoglobinu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Hemoglobin síťovaný imidoestery pro přenos kyslíku do živých buněk, vyznačený tím, že je přítomen přes 50 % ve formě tetrameru a má p50, to je parciální tlak kyslíku při polovičním nasycení, alespoň 1,73 kPa při pH 7,4.
2. Hemoglobin podle nároku 1, vyznačený tím, že imidoester je dimethyladipimidát.
3. Hemoglobin podle nároku 1, vyznačený tím, že alespoň 80 % síťovaného hemoglobinu má molekulovou hmotnost alespoň 64 000.
4. Hemoglobin podle nároku 1, vyznačený tím, že alespoň 95 % síťovaného hemoglobinu má molekulovou hmotnost alespoň 64 000.
5. Hemoglobin podle nároku 1, vyznačený tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelné nosné médium.
6. Hemoglobin podle nároku 5, vyznačený tím, že farmaceuticky přijatelné nosné médium je čištěná voda nebo roztok kuchyňské soli.
7. Způsob výroby hemoglobinu síťovaného imidoestery pro přenos kyslíku do živých buněk, vyznačený tím, že se síťování imidoestery čištěného lyzátu hemoglobinu provádí při pH alespoň 8,0 v polymeračním roztoku ústoje Tris-HCl, až má alespoň 50 % síťovaného hemoglobinu molekulovou hmotnost 64 000 a p50 alespoň 1,73 kPa při pH 7,4.
8. Způsob výroby podle nároku 7, NaCl.

vyznačený tím, že polymerační roztok obsahuje
9.

Způsob výroby podle nároku 7, vyznačený tím, že pH je od 8,0 do 12,0.
10. Způsob výroby podle nároku 7, vyznačený tím, že polymerační roztok obsahuje 50 mMol Tris-HCl a od 0,1 do 2,0 Mol NaCl.

- 13 CZ 281912 B6
11. Způsob výroby podle nároku 7, vyznačený tím, že čištěný lyzát hemoglobinu se deoxiduje.
12. Způsob výroby podle nároku 7, vyznačený tím, že nízkomolekulámí hemoglobin se odstraní velikostní frakcionací.
13. Způsob výroby podle nároku 12, vyznačený tím, že velikostní frakcionace se provádí pomocí chromatografu.
14. Způsob výroby podle nároku 7, vyznačený tím, že imidoester je dimethyladipimidát.
15. Způsob výroby podle nároku 7, vyznačený tím, že polymerace se provádí opakovanou reakcí čištěného hemoglobinu s ekvimolekulámím množstvím imidoesteru.