SK281839B6 - Spôsob separácie vopred vybraného druhu hemoglobínu - Google Patents

Abstract

Hemoglobín je purifikovaný z nepurifikovaného roztoku hemoglobínu s cieľom získať vodný roztok obsahujúci aspoň 99 % vopred vybraného druhu hemoglobínu, pomocou dvojstupňovej vytesňovacej chromatografickej metódy. Jeden zo stupňov sa uskutočňuje za podmienok výmeny aniónov a ďalší za podmienok výmeny katiónov. Pri oboch stupňoch je kolóna na výmenu iónov naplnená tak, aby bola presýtená a mala schopnosť vytesniť formy hemoglobínu z kolóny kontaminantmi, ktoré majú vyššiu afinitu k náplni kolóny, a to s použitím nečistého hemoglobínového roztoku ako vytesňovača. Bežne aniónová výmena sa uskutočňuje ako prvá s kontaminantmi viac kyslými než hemoglobín, ktoré vytesňujú hemoglobín z kolóny a ostávajú naviazané na separačnej kolóne. Katiónový výmenný proces sa uskutočňuje ako druhý krok, s použitím výluhu získaného z prvej kolóny, pričom v tomto stupni alkalickejšie kontaminanty vytesnia za podmienok presýtenia hemoglobínu z kolóny, výsledkom čoho je získanie výrazne čistého roztoku hemoglobínu.ŕ

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka spôsobu separácie vopred vybraného druhu hemoglobínu chromatograflckou purifikáciou hemoglobínu a najmä chromatografických spôsobov purifikácie hemoglobínu v komerčnom rozsahu tak, aby sa získal roztok, v ktorom hemoglobínové zložky tvoria aspoň 99 % roztoku. Vzťahuje sa tiež k novým hemoglobínovým produktom, ktoré majú neočakávané, užitočné charakteristiky na použitie ako náhrada krvi.

Doterajší stav techniky

Vývoj substituentov krvi na báze hemoglobínu pokračuje a vynucuje si komerčnú pozornosť, pričom nedávny vývoj v týchto oblastiach ukázal, že hemoglobín z cicavčích krvných buniek po vhodnej modifikácii ako je intramolekuláme zosieťovanie a v niektorých prípadoch polymerizácia sú perspektívnou bázou v oblasti krvných náhrad. Ako vývoj pokračoval, požiadavky na čistotu hemoglobínu sa však postupne zvyšovali. Kedysi sa predpokladalo, že z hemoglobínu stačí jednoducho odstrániť strómu, bezfarebnú štrukturálnu časť červených krviniek, čo sa dosiahlo premývaním a jemnou lýzou červených krviniek a následne filtráciou lyzátu. Neskôr sa zistilo, že prítomnosť stopových množstiev zvyškov nečistôt, ako sú fosfolipidy, viedlo ku viacerým špecifickým reakciám, ako napr. ku vazokonstrikcii po aplikácii produktu v pokusoch na zvieratách. Dokonca, i keď bol produkt podrobený niekoľkým diafiltračným krokom, stále ešte obsahoval neakceptovateľné vysoké stopové množstvá potenciálne nebezpečných nečistôt, ako sú enzýmy erytrocytov, modifikované a rôzne formy hemoglobínu, fosfolipidy a povrchové antigény.

Jedna z najnaliehavejších výziev v oblasti krvných substituentov, špeciálne nosičov kyslíka na hemoglobínovom základe sa týka vývoja cenovo výhodných metód na dostatočnú a ekonomicky výhodnú purifikáciu hemoglobínu v komerčnom rozsahu. Tento musí byť schopný konkurencie s inými potenciálnymi látkami zväčšujúcimi objem krvi a tekutinami, ktoré sú nosičmi kyslíka, určenými na použitie ako substituenty krvi.

Zatiaľ čo v analytických separáciách je dôležitá úroveň rozdelenia frakcií a čas analýzy, v preparatívnej chromatografii na komerčnú alebo semi-komerčnú mieru využitia sú kritickými parametrami: množstvo materiálu izolované za jednotku času pri určitej hladine čistoty („throughput“); a ekonomika procesu, ako sú veľkosti kolón, média, tlmivé roztoky, prístroje, recyklácia a opätovné využitie zložiek, činidiel a podobne.

V minulosti neboli publikované metódy, týkajúce sa purifikácie hemoglobínu, ktoré by spĺňali kritéria pre cenovo výhodné produkčné procesy.

Krvné substituenty na hemoglobínovom základe vyžadujú, aby boli buď v jednej forme hemoglobínu, alebo ak je prítomná viac ako jedna forma, dôkladnú kontrolu zloženia známych hemoglobínových foriem. Podľa toho úspešný spôsob purifikácie hemoglobínu vyžaduje, aby bol schopný separácie jednej hemoglobínovej formy od druhej, rovnako aj separácie želanej formy hemoglobínu od kontaminujúcich červených krviniek, ako i od zložiek, ako sú enzýmy erytrocytov, proteíny, fosfolipidy a antigény.

Na purifikáciu hemoglobínových roztokov boli použité chromatografické metódy. USA Patent 4 924 474 Hsia a spol. opisuje aplikáciu techniky afinitnej chromatografie na purifikáciu hemoglobínu s použitím kolón, pri ktorých li gand - majúci lepšiu chemickú väzobnú afinitu ku DPG väzobnému miestu na hemoglobíne bol naviazaný na stacionárnu fázu kolóny.

Pri purifikácii hemoglobínu sa použili i metódy chromatografie na ionexe. Základné princípy techník, týkajúcich sa ionovo-výmennej chromatografie sú dobre známe. Zmes rôznych druhov látok v roztoku sa aplikuje na vhodne upravenú ionexovú kolónu. Každý druh látky v zmesi má rozdielnu afinitu ku chemickej skupine reaktantu v kolóne. Zmenou podmienok v kolóne, napr. zmenou pH roztoku, jednotlivé druhy látok môžu byť upravené tak, aby boli naviazané alebo uvoľnené z kolóny selektívne, a tak je umožnené separovať samotný jeden druh látky zo zmesi. Aplikácia techniky purifikácie takých proteínov ako je hemoglobín je ekonomicky neatraktívna, okrem použitia v malom rozsahu a na analytickú prácu. Keď sa hemoglobín purifikuje na veľkovýrobnej úrovni na použitie napríklad ako resuscitačnej tekutiny nesúcej kyslík (krvná náhrada), technika, ktorá sa obvykle aplikovala, je nepraktická. Množstvo hemoglobínu, ktoré sa absorbovalo a následne uvoľnilo z chromatografickej kolóny je tak veľké, že požiadavky na veľkosť kolóny sú potom neúmerne veľké a drahé.

Christensen a spol., J. Biochem. Phys. 17 (1988), 143 - 154, opísali chromatografickú purifikáciu ľudského hemoglobínu. Použitá metóda reprezentuje štandardný ionexový chromatografický prístup, ktorý neposkytuje možnosti na ekonomicky vhodnejšie rozšírenie výrobného procesu, poskytujúceho zodpovedajúce produkčné množstvá.

Winslow a Chapman, „Pilot-Scale Preparation of Hemoglobín Solutions, ..Methods in Enzymologv.“ Vol. 231, p3 (1994) opísali prípravu hemoglobínu neobsahujúceho strómu (SFH), vysoko purifikovaného hemoglobínu AO a zosieťovaného hemoglobínu s použitím expirovanej ľudskej krvi ako východiskového materiálu. SFH sa pripravuje filtráciou. Hemoglobín AO je pripravovaný zo SFH sústavou chromatografických metód s použitím silného anexového média a gradientu iónovej sily.

Obidve práce Christensen a spol. a Winslow a spol. boli uskutočnené na pracovisku Letterman Army Inštitúte for Research (LAIR), teraz známom ako Walter Reed Army Inštitúte of Research.

USA patent č. 5 084 588 Rausch and Feola (Biopure) opisuje štandardnú anexovú a katexovú chromatografiu, aplikovanú na separáciu a purifikáciu hemoglobínu. V prípade anexovej chromatografie sú v patente uvedené tri štandardné prístupy:

a) väzba Hb pri zvýšenom pH a elúcia pri klesajúcom gradiente pHw alebo postupná zmena gradientu pri nižšom pH;

b) väzba Hb pri vysokom pH, nízka iónová sila a elúcia s gradientom soli;

c) plnenie pri podmienkach pH, kedy hemoglobín sa neviaže na aniónový ionex, ale prechádza cez kolónu nezachytený, zatiaľ čo nečistoty (kyslejšie kontaminanty) sú zachytávané na kolóne.

Prístupy a) a b) boli rozsiahle dokumentované, ale nie sú atraktívne na produkciu vo veľkom rozsahu, nakoľko existuje obmedzenie z hľadiska zaťažiteľnosti, nevyhnutnej na dosiahnutie dostatočného delenia hemoglobínových produktov. Táto zaťažiteľnosť je v bežnej praxi len 20 až 30 mg/ml, a predpisujú sa nedostupne veľké a drahé kolóny na komerčnú škálu purifikácie hemoglobínu. Napríklad, jedna 50 mg dávka finálneho kyslíkového nosiča na báze hemoglobínu (HBOC) by mohla vyžadovať kolónu s objemom 1,5 - 2,5 litra.

Zatiaľ čo prístup c) zdá sa byť navonok najlepšie uskutočniteľným, v praxi je to naopak, kvôli chromatogra íickým vlastnostiam normálneho, nemodifikovaného hemoglobínu dospelého človeka Ao a niektorým hlavným kontaminantom, ako je HbAlc, ktoré nie sú dostatočne odlišné na praktickú aplikáciu tohto prístupu.

Štandardné prípravy, týkajúce sa katiónovej výmennej chromatografie hemoglobínu cicavcov majú podobné obmedzenia.

USA patent 5 084 588 tiež poukazuje, že v roztokoch hovädzieho hemoglobínu viac ako 99,9 % prítomného proteínu sú hovädzie hemoglobíny, ale nie sú uvedené údaje identifikujúce proteínové zložky.

Podstata vynálezu

Podstatou tohto vynálezu je spôsob separácie vopred vybraného druhu hemoglobínu z nepurifikovaného roztoku hemoglobínu, obsahujúceho kontaminujúce proteínové substancie, vyznačujúci sa tým, že v prvom chromatografickom stupni sa naplní chromatografická kolóna nepurifikovaným roztokom a podrobí sa chromatografii buď za podmienok aniónovej výmeny, pri ktorej zložky nepurifikovaného roztoku kyslejšie než vopred vybraný druh hemoglobínu, majú lepšiu väzbovú afinitu, alebo za podmienok katiónovej výmeny pri ktorej zložky nepurifikovaného roztoku zásaditej šie než vopred vybraný druh hemoglobínu, majú lepšiu väzbovú afinitu, potom sa pokračuje v plnení nepurifikovaným roztokom v prvom chromatografickom stupni až pokiaľ kolóna je úplne naplnená s hemoglobínovými druhmi a zložkami vyššej afinity, na čo sa ďalej pokračuje v plnení kolóny nepurifikovaným roztokom v prvom chromatografickom stupni, aby sa dosiahlo preplnenie kolóny a následne vytesnenie hemoglobínových druhov z nej, potom sa v druhom chromatografickom stupni naplnila chromatografická kolóna eluátom z prvého stupňa, ktorý obsahuje hemoglobínové druhy a podrobí sa chromatografii za podmienok aniónovej výmeny alebo katiónovej výmeny, ktoré neboli vybrané pre prvý stupeň, ďalej sa pokračovalo v plnení uvedeného eluátu v druhom chromatografickom stupni až sa kolóna naplní hemoglobínovými druhmi a zložkami s vyššou afinitou ako bolo uvedené pri podmienkach druhého stupňa, potom sa pokračovalo v plnení uvedeného eluátu v druhom chromatografickom stupni, až sa dosiahlo preplnenie a následne sa z neho vytesnili hemoglobínové druhy.

Prvý stupeň sa uskutočňuje ionexovou chromatografiou na anexe a druhý stupeň ionexovou chromatografiou na katexe.

Vopred vybraný druh hemoglobínu je ľudský hemoglobín dospelého jedinca HbAo.

Podľa ďalšieho uskutočnenia vynálezu sa prvý stupeň spôsobu výmeny aniónov uskutočňuje pri pH 7 až 10 s použitím plniaceho roztoku s vodivosťou nižšou ako 3 mS.

Podľa ďalšieho výhodného uskutočnenia sa prvý stupeň spôsobu výmeny aniónov uskutočňuje pri pH 8,5 až 9,0 s použitím plniaceho roztoku s vodivosťou nižšou ako 1 mS.

Plniaci roztok sa plní do kolóny rýchlosťou do 10 cm za minútu a má koncentráciu v rozsahu 0,1 až 20 hmotn. %.

Podľa ďalšieho uskutočnenia vynálezu sa druhý stupeň, ionexová chromatografia na katexe, uskutočňuje pri pH 6,5 až 8,5 s použitím plniaceho roztoku s vodivosťou nižšou ako 3 mS.

Podľa ešte ďalšieho uskutočnenia vynálezu sa druhý stupeň, ionexová chromatografia na katexe uskutočňuje pri pH 7 až 7,5 s použitím plniaceho roztoku s vodivosťou nižšou ako 1 mS.

Pričom plniaci roztok sa plní v druhom stupni na kolónu s katexom rýchlosťou do 10 cm za minútu a koncentrácia plniaceho roztoku pre druhý stupeň kolóny s katexom je od 2 až 6 hmotn. %.

Zásadnou úlohou tohto vynálezu je poskytnúť chromatografickú metódu, umožňujúcu získať z vodného roztoku obsahujúceho nečistoty a zároveň aspoň 60 % hemoglobínu, vodný roztok hemoglobínu s čistotou presahujúcou 99 %, a to v komerčnom rozsahu a v ekonomicky prijateľnej forme. Ďalšou, špecifickejšou úlohou tohto vynálezu je poskytnúť v komerčných množstvách vodný roztok hemoglobínu alebo zosieťovaného hemoglobínu, v ktorom zložky hemoglobínu alebo zosieťovaného hemoglobínu tvoria aspoň 99 %, sú v čistom stave a v prípade ich využitia ako krvnej náhrady in vivo, majú vlastnosti, ktoré neboli predtým zverejnené.

Tento vynález poskytuje spôsob, pri ktorom vodný roztok, vopred vybraných druhov hemoglobínu, Hb, v ktorom zložky hemoglobínu predstavujú približne od 60 % do 99 % rozpustného materiálu je podrobený dvojstupňovej ionexovej chromatografii. Jedným zo stupňov je aniónová výmenná chromatografia, druhým je katiónová výmenná chromatografia. Oba typy ionexovej chromatografie sa môžu uskutočniť v ľubovoľnom poradí. Nepurifikovaný roztok vopred vybraných druhov hemoglobínu, napríklad HbAO je aplikovaný v prvom stupni chromatografie, napríklad v anexovej chromatografii, a to pri takých podmienkach, kedy sú všetky zložky zmesového roztoku najprv adšorbované na pevnú fázu chromatografickej kolóny. Na výmenu aniónov sa vyžaduje relatívne vysoká hodnota pH. Výber podmienok je taký, aby sa dosiahlo účinné naplnenie kolóny, s použitím plniaceho roztoku s nízkou iónovou silou, kedy dôjde k stavu, v ktorom v podstate všetky dostupné miesta na pevnom chromatografickom médiu sú obsadené druhmi z aplikovaného roztoku. V tomto stupni zozbieraný eluát je zbavený proteínového produktu. Vytesnenie HbAO a nečistôt, majúcich nižšiu afinitu k pevnému médiu kolóny sa v danom stave dosiahne prívodom ďalších objemov vodného plniaceho roztoku, ako bolo už uvedené. Takto dosiahnutý stav, tu uvádzaný ako stav preplnenia, spôsobuje, že znečistené druhy, majúce vyššiu afinitu ku kolóne vytemňujú vybraný druh hemoglobínu a znečistené druhy majúce nižšiu afinitu k náplni kolóny sú vylúhované z kolóny. Ak prvým krokom chromatografickej separácie je anexová chromatografia, nečistoty, ktoré sú kyslejšie ako vybrané druhy Hb sú adsorbované na pevnú fázu chromatografickej kolóny a tak separované z vybraných druhov Hb, ktorý sa vo výluhu objavuje spolu so zásaditejšími nečistotami. V prípade, keď bola ionexová chromatografia uskutočňujúca výmenu katiónov vybraná ako prvý stupeň, alkalickejšie nečistoty sa oddelili na základe ich vyššej afinity k pevnej fáze kolóny, kyslejšie nečistoty a vybrané druhy hemoglobínu sa objavili v eluáte.

Potom v druhom chromatografickom kroku spôsobu uvedenom vo vynáleze sa uskutoční v eluáte z prvej kolóny pri odlišnom pH ďalšia výmena iónov čiastočne purifikovaných druhov hemoglobínu. Ak eluát z prvej kolóny obsahuje druhy hemoglobínu a alkalickejšie zložky, druhým chromatografickým krokom je katexová chromatografia a naopak. Napĺňanie druhej kolóny roztokom obsahujúcim nečistoty sa opäť uskutočňuje za podmienok nasýtenia a pokračuje sa ďalej, pokým sa nedosiahne stav preplnenia kolóny. Za podmienok preplnenia je vopred vybraný druh hemoglobínu vylúhovaný z kolóny prostredníctvom nečistôt, ktoré pri zvolených podmienkach majú vyššiu afinitu k pevnej fáze kolóny a tak umožňujú získať vo výluhu druhej kolóny druh hemoglobínu s veľmi vysokou čistotou. Spô sob uvedený vo vynáleze sa môže potom vo všeobecnosti nazývať ako „dvojstupňová vytesňovacia chromatografia“.

Výsledkom toho je, že druh hemoglobínu je vylúhovaný z kolóny vo výnimočne čistej forme, bežne s čistotou viac ako 99 % a to v komerčne atraktívnom výťažku. Kyslejšie nečistoty ako sú vybrané druhy hemoglobínu zostávajú viazané na jeden druh pevnej fázy ionexu a nečistoty, ktoré sú alkalickejšie ako vybrané druhy hemoglobínu zostávajú naviazané na inej pevnej fáze ionex. Kolóny sa môžu ľahko regenerovať s použitím bežných čistiacich a regeneračných postupov.

Dôležitým faktorom pre úspešný priebeh procesu najmä vo veľkom výrobnom rozsahu je dôsledné presýtenie kolón s nečistotami, ktoré umožňujú vylúhovanie druhov hemoglobínu.

Ak je metóda uvedená vo vynáleze aplikovaná na purifikáciu ľudského hemoglobínu AO, je možné získať nový ľudský hemoglobín, ktorý má zloženie a vlastnosti, ktoré neboli doposiaľ opísané. Tento hemoglobínový produkt podľa toho tvorí ďalší aspekt predkladaného vynálezu, nezávislého od opisu spôsobu purifikácie, uvedenej v tomto vynáleze.

Vlastnosti a charakteristiky tohto produktu sú veľmi žiaduce a doposiaľ neboli poznané alebo opísané, v súvislosti s akýmkoľvek známym produktom hemoglobínu AO, a je obzvlášť výhodný na použitie ako základ krvnej náhrady. K týmto vlastnostiam patrí i to, že produkt je v podstate zbavený vírových častíc, najmä častíc opuzdrených lipidmi, keď je podávaný in vi vo, nedochádza k výrazným prejavom vazoaktivity, pri in vitro inkubáciách neprejavuje sa jeho toxicita proti endotelovým bunkám, čo bolo potvrdené v porovnaní s inými prípravkami hemoglobínu, zníženým uvoľňovaním laktát dehydrogenázy. Ďalej, čo sa týka požadovaných štandardných vlastností hemoglobínu na požitie ako krvnej náhrady majú produkty, ktoré sú predmetom tohto vynálezu lepšie vlastnosti, v porovnaní s inými známymi prípravkami hemoglobínu, čo sa týka obsahu endotoxínov a ďalších pyrogénov.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 je schematickým znázornením začiatočnej časti anexovej výmeny výhodného spôsobu podľa tohto vynálezu.

Obr. 2 je obdobným znázornením druhej časti katexovej výmeny výhodného spôsobu podľa tohto vynálezu.

Obr. 3 reprezentuje chromatogram analytickej aniónovej výmeny s použitím výsledkov z ďalej uvedených príkladov 2 a 3.

Obr. 4 reprezentuje chromatogram analytickej katiónovej výmeny s použitím výsledkov z ďalej uvedeného príkladu 4.

Obr. 5 predstavuje grafické znázornenie výsledkov z ďalej uvedeného príkladu 8.

Obr. 6 reprezentuje kópiu papierových pásikov izoelektrickej fokusačnej analýzy produktov z ďalej uvedeného príkladu 13.

Obr. 7 predstavuje kópiu výsledkov z pokusov, týkajúcich sa farbenia a blotov uvedených z príkladu 13.

Obr. 8 reprezentuje grafické znázornenie výsledkov z uvedeného príkladu 14.

Obr. 9 a 9A reprezentujú grafické znázornenie výsledkov z uvedeného príkladu 15.

Obr. 10 reprezentuje grafické znázornenie výsledkov z uvedeného príkladu 16.

Vytesňovacia chromatografia alebo vytesňovacia elúcia vo všeobecnom názve predstavuje známu techniku v oblasti separácie proteínov. Je jednou z troch spôsobov, ktorým je možné získať vzorku z chromatografickej kolóny. Ak sa aplikuje na separáciu príslušných proteínov zo zmesi proteínov v roztoku, proteíny s väčšou afinitou vytesnia z matrice proteíny s nižšou afinitou, takže od vstupnej po výstupnú časť kolóny sa proteíny usporiadajú v poradí podľa lďesajúcej afinity. V prípade vytesňovania proteínov však veľmi zriedka dochádza k vytvoreniu ostrej hranice medzi jednotlivými druhmi proteínov, čo na prípravu veľmi čistých roztokov jedného proteínu, ako napríklad hemoglobínu nie je žiaduce. Ak sa pre systém vyberú jednotlivé, proteín neobsahujúce druhy, ktoré sú schopné vzájomne sa vytesniť, výsledkom môže byť to, že chromatografická matrica ich ako vysokoafinitné zložky naviaže, výsledkom čoho je veľmi zlá možnosť jej regenerácie na jej ďalšie použitie. Prednosťou spôsobu na prípravu čistého ľudského hemoglobínu, Ao (HbAo) z dospelých jedincov, je veľká komerčná využiteľnosť, čo bude v ďalšom podrobne opísané s odkazom na výhodnosť. Metóda však nemá obmedzené použitie len na purifikáciu HbAo, ale je ďalej využiteľná i na ďalšie vopred vybrané druhy hemoglobínu, ako sú vybrané zosieťované deriváty hemoglobínu, vybrané varianty hovädzieho hemoglobínu, ďalšie varianty hemoglobínu, ako je fetálny hemoglobín, hemoglobín z kosákovitých buniek atď., genetickými metódami pripravený hemoglobín atď.

Spôsob, ktorý je predmetom vynálezu, je ekonomicky mimoriadne výhodný, umožňujúci purifikovať hemoglobín HbAo v komerčnom rozsahu na účely prípravy krvných substituentov. Poskytuje mimoriadne veľmi efektívne možnosti z pohľadu plniacich kapacít kolóny. Je preto možné využiť kolóny s relatívne malou veľkosťou na purifikáciu veľkých objemov roztoku nečistého hemoglobínu. Môže sa uskutočňovať v jednom dávkovom množstve alebo kontinuálne na účely purifikácie daného dávkového množstva roztoku hemoglobínu, získaného z červených krviniek štandardnými technikami, pričom roztoky na tento účel bežne obsahujú 80 % hemoglobínu, ale obsahujú aj široké spektrum nečistôt proteínového alebo neproteínového charakteru. Samotný roztok nečistého hemoglobínu sa použije ako vytesňovacie médium. Použitie iného vytesňovacieho činidla na tento účel, ktorého sprievodným znakom sú nevýhodnosť, komplikovanosť a finančná náročnosť, sa týmto vylúči.

Typická, všetky kroky zahŕňajúca metóda na prípravu roztoku obsahujúceho purifikovaný hemoglobín, zahŕňajúca techniku uvedenú v tomto vynáleze, vychádza z normálnych ľudských červených krviniek z dospelých jedincov. Tieto sú spájané a nemusia byť filtrované na účely odstránenia leukocytov. Bunky sú premývané, aby boli odstránené sérové proteíny a rozložené na účely extrakcie hemoglobínu a ostatných bunkových komponentov. Lyzát sa filtruje, aby sa odstránili membrány červených krviniek a výsledný hemoglobín je diafiltrovaný a zahusťovaný. Extrakt nečistého hemoglobínu je spracovaný s oxidom uhoľnatým tak, aby sa vytvoril kompex Co-Hb, pasterizuje sa zahriatím, aby sa v roztoku inaktivovali kontaminanty vírového pôvodu. V ďalšom sa extrakt centrifuguje a filtruje na účely odstránenia ďalších rozbitých zvyškov buniek. V tomto štádiu je extrakt pripravený na spracovanie vytesňovacou metódou ako je uvedené v tomto vynáleze.

Vychádzajúc z podstaty predloženého vynálezu, prvým krokom chromatografickej metódy je spôsob výmeny aniónov a v druhom stupni spôsob výmeny katiónov. Tento prvý proces aniónovej výmeny sa výhodne uskutočňuje pri vysokom pH, napríklad pH 7 - 10, respektíve, výhodne pri pH 8,5 - 9,0 za podmienok nízkej iónovej sily, t. j. nízkej vodivosti. Je vhodné, ak vodivosť je menšia ako 3 mS (mi lisiemens) ale výhodne menej ako 1 mS. V týchto podmienkach proces zahŕňa použitie tlmivého roztoku bez prítomnosti soli. Za daných podmienok sa požadované druhy hemoglobínu najprv naviažu na médium kolóny spolu s ostatnými druhmi hemoglobínu. Ako napĺňanie znečisteného roztoku hemoglobínu pokračuje, tieto druhy, ktoré majú vyššiu afinitu ako HbAo k matrici, kyslejšie kontaminanty, charakteristicky postupne vytesnia z kolóny HbAo a alkalickejšie nečistoty. Nakoniec, ak sa dosiahne stav presýtenia kolóny, tak celé množstvo hemoglobínu a alkalickej šie nečistoty sú vytesnené z náplne kolóny, pričom len nečistoty kyslejšieho charakteru zostávajú naviazané. Vo väčšine prípadov dochádza tu k plneniu kolóny s oveľa väčším, nadmerným množstvom materiálu ako je odporúčané výrobcom. Chromatografické oddelenie kyslejších nečistôt z HbAo sa takto dosiahne v tomto stupni.

Plnenie kolóny s roztokom obsahujúcim nečistý hemoglobín sa uskutočňuje pri pomalej, lineárnej rýchlosti prietoku, nie väčšej ako 10 cm za minútu, výhodne približne 1 cm za minútu. Toto umožňuje vytvorenie kinetického rovnovážneho stavu kolóny. Rozpätie koncentrácie pri napĺňaní kolóny nie je kritické, ale je vhodné, ak je v rozpätí 0,1 až 20 %, výhodne v rozpätí 2 až 7 %.

Dosiahnutie podmienok preplnenia možno monitorovať analyzovaním vzoriek vytekajúcich z kolóny, pričom ak zloženie roztoku vytekajúceho z kolóny neobsahuje žiadne alebo obsahuje len stopy nečistôt kyslého charakteru, maximálne naplnenie kolóny sa prakticky dosiahlo.

Obr.l z výkresov v prílohe schematický ilustruje časť metódy výmeny aniónov, uvedenej v tomto vynáleze. Ionexová kolóna, ktorá obsahuje chemické skupiny, N⁺R₃ (typická aniónová výmenná živica, anex, ale len ako príklad), naznačená v stupni A tejto metódy, na obr. 1, je plnená s roztokom obsahujúcim zmes druhov hemoglobínu, označených hviezdičkami pre kyslejšie nečistoty, HbAo elipsami a alkalickejšie nečistoty obdĺžnikmi. Pri kapacite plnenia v stupni B v podstate všetky aktívne chemické skupiny N-R₃ pevného média kolóny sa pomocou elektrostatického náboja naviažu na jeden z druhov obsiahnutých v zmesi.

Väčšie množstvo rovnakého roztoku až k hranici kapacity kolóny je napĺňané tak, aby sa dosiahol stav presýtenia, ako je ilustrované v stupni C Obr. 1. Za tohto stavu sú všetky alkalickejšie nečistoty (obdĺžniky) a určité množstvo HbAo (znázornené elipsami) vytesnené z kolóny kyslejšími zložkami (znázornenými hviezdičkami), ktoré za daných podmienok majú väčšiu afinitu k pevnej náplni kolóny. Na obr. 1 je znázornené napĺňanie kolóny ešte väčším množstvom rovnakého roztoku, takže presycovanie kolóny pokračuje tak, aby bol dosiahnutý stav D, pri ktorom kyslé druhy majúce za zvolených podmienok vyššiu afinitu k matrici, vytesnili skutočne všetok HbAo z kolóny. V tomto stave, v kvapaline vytekajúcej z kolóny sa nenachádza detekovateľné množstvo kyslých nečistôt. Získa sa tak úplne čistý roztok HbAo, ktorý však stále obsahuje určité množstvo alkalickej ších druhov (nečistôt).

Druhý stupeň výhodnej metódy podľa tohto vynálezu využíva kolónu s katexom, ktorá sa plní s eluátom z prvej kolóny, za podobných podmienok preplnenia systému. Požadovaný HbAo a ďalšie nepotrebné kyslejšie nečistoty sú naviazané v nadbytočnom množstve. Roztok čiastočne purifikovaného hemoglobínu z prvej kolóny sa postupne plní do druhej kolóny. Používa sa opäť pritom relatívne nízka plniaca rýchlosť, výhodne 10 cm/min. alebo menej, výhodne okolo 1 cm/min., aby sa umožnilo vytvorenie kinetickej rovnováhy medzi pevnou a kvapalnou fázou. Hodnota pH výluhu z prvej kolóny je vhodne upravená tak, aby bola v rozpätí pH 5 - 9, výhodne v rozpätí pH 6,5 - 8,5 , najvý hodnejšie v rozpätí pH 7 - 8, predtým ako sa aplikuje na kolónu s katexom. Používa sa pritom nízka iónová sila roztoku, t. j. vodivosť menšia ako 3 mS, výhodne menej ako 1 mS. Vodivosti tak veľké ako 2,5 mS sú vhodné len v tom prípade, ak systém využíva pomalú rýchlosť prietoku a veľké zriedenie napĺňacieho roztoku. I v tomto prípade sa využíva stav presýtenia. Nečistoty proteínového charakteru s vyššou afinitou, t j. tie alkalickejšie ako HbAo, vytesnia HbAo z kolóny a HbAo je takto vylúhovaný a získava sa vo výnimočne čistej forme.

Obr.2 z výkresov v prílohe obdobným spôsobom ako obr.l schematicky ilustruje časť procesu, ktorý prebieha v kolóne s katexom, poukazujúci na SO₃ skupiny nosiča. Eluát z prvej kolóny, po vhodnej úprave pH je napĺňaný do druhej kolóny a na začiatku, v stupni A, a naplnenie kolóny podľa jej kapacity sa dosiahne pri oboch druhoch zložiek, pri HbAo (elipsy) a pri alkalickejších nečistotách (obdĺžniky), ktoré sa elektrostaticky naviažu na chemické skupiny náplne kolóny. Zatiaľ čo tieto sú tu znázornené ako sulfonylové skupiny, možno rovnocenne dobre vybrať na použitie i iné alternatívne skupiny, ako sú karboxylové skupiny. Plnenie roztoku výluhu do kolóny pokračuje tak, aby bol dosiahnutý stav presýtenia, ilustrovaný v stupni B. Obr. 2, v ktorom za daných podmienok alkalickej ší kontaminant, majúci vyššiu afinitu k náplni kolóny, vymení si miesto s HbAo. Pri ďalšom plnení presýtenej kolóny, ako je ilustrované v stupni C na obr. 2, sa získa vytesnením výluh obsahujúci roztok s takmer 100 % čistým HbA. Čím je väčšie plnenie kolóny, tým je väčšie percento výťažku purifikovaného HbAo z kolóny. Monitorovanie výluhu sa uskutočňuje na účely detekcie prítomnosti alkalických druhov (obdĺžniky). Stav, kedy bolo dosiahnuté maximálne plnenie kolóny, je definovaný v okamihu, keď nie je z kolóny už možné získať ďalší výťažok HbAo.

Alkalickejšie kontaminanty (znečisťujúce látky), výraz, ktorý je tu používaný, sa týka tých nečistôt, ktoré sa vylúhujú z kolóny pri vyššom pH ako je požadované na elúciu HbAo. Naopak výraz „kyslejšie kontaminanty“ sa týka tých nečistôt, ktoré sa vylúhujú z kolóny pri nižšom pH ako je požadované na elúciu HbAo. Pri výhodnom uskutočnení podľa vynálezu, kde anexová chromatografia sa vykoná najprv, pričom alkalickejšie kontaminanty sa vylúhujú pred HbAo a kyslejšie kontaminanty sa vylúhujú po HbAo. Rozdielne elučné profily s malými zmenami v poradí elúcie je možné pozorovať v závislosti od použitého ionovýmenného média v chromatografii.

Rýchlosť prietoku vybranej koncentrácie nepurifikovaného roztoku hemoglobínu by mala byť optimalizovaná pre obidve, prvú i druhú kolónu. Optimálne lineárne rýchlosti prietoku roztokov hemoglobínu v koncentrovanejšom rozpätí 2 - 7 % sú 1 cm/min. alebo menej. Rýchlosti prietoku až 2 cm/min. možno úspešne aplikovať na delenie viac zriedených roztokov, napríklad menej ako 1 % Hb. Deliaca schopnosť ionovýmennej chromatografie pri nízkych plniacich množstvách nie je obvykle citlivá od lineárnej prietokovej rýchlosti, ale pre metódu podľa tohto vynálezu, kinetická rovnováha počas chromatografie je veľmi závislá od prietokovej rýchlosti. Koncentrácia náplne však nie je kritická pre žiaden stupeň.

S vytesňovacou metódou tohto vynálezu, pri použití v prvom rade ionovýmennej chromatografie, uskutočňujúcej výmenu aniónov, na účely odstránenia kyslejších zložiek a v druhom rade ionovýmennej chromatografie, uskutočňujúcej výmenu katiónov, na účely odstránenia alkalickejších zložiek, možno z komerčného hľadiska dosiahnuť vysoké výťažky výnimočne čistého HbAo, skoro úplne zbaveného detekovateľných množstiev iných proteínov, ako sú sérové

SK 281839 Β6 proteíny a membránové proteíny. Hodnoty čistoty produktu, stanovené analytickou ionovýmennou chromatografiou, uskutočňujúcou výmenu aniónov sú vyššie ako 99 %, bežne viac ako 99,5 %.

Skutočné kapacity stupňov sú prinajmenšom o jeden rád väčšie ako kapacity, ktoré možno pozorovať pri bežných chromatografických prístupoch. Čo sa týka odstránenia kontaminantov proteínového charakteru, spôsob podľa tohto vynálezu tiež umožňuje takmer úplné odstránenie modifikovaných a ďalších nežiadaných foriem hemoglobínu, čo poskytuje takmer čistý (99,5 %) HbAo. Navyše, ako je detailnejšie opísané, tiež je možné dosiahnuť takmer úplné odstránenie opuzdrených aktívnych alebo neaktívnych vírových častíc.

Zvýšenie výhod metódy podľa tohto vynálezu, ak sa porovná s metódou využívajúcou štandardnú ionovýmennú adsorpčno-elučnú chromatografiu sú názorne dokumentované v nasledovnej tabuľke 1. Čísla v kolónke vytesnenie“ sú odvodené z uvedených pracovných príkladov spôsobu podľa tohto vynálezu. Údaje uvedené v kolónke adsorpcia-elúcia“ boli získané z predtým spomenutého článku Winslow a spol.

Tabuľka 1

Operačné parametre na purifikáciu hemoglobínu AO pri použití adsorpčno-elučnej chromatografie * vs vytesňovacej chromatografie

	Vytesňovanie	Adsorpcia-elúcia
Objem kolóny	5a31	1201
Kapacita	200 - 300 mg/ml	15 mg/ml
kolóny
g Hb naplnených	1234	1818
% Výťažok	81	55
g Hb získaných 1000 1000
Pracovný objem
tlmivého roztoku a	1321	9001

*Winslov a Chapman, ot>. cit.

Z týchto obrázkov je jasné, že vytesňovací chromatografický spôsob podľa tohto vynálezu môže prebehnúť rýchlejšie, v podstate s malými kolónami. Proces môže prebehnúť pri nízkych tlakových podmienkach a pri teplote okolia Môžu byť dosiahnuté efektívne kapacity plnenia, ktoré sú 10 až 20-krát väčšie ako kapacity opísané pre konvenčný chromatografický proces, čím vzniká možnosť použitia relatívne malých objemov kolón. Toto vedie k zníženiu požiadaviek na vodu, zmenšia sa problémy, týkajúce sa odstraňovania odpadu, znížia sa požiadavky na tlmivé roztoky, čo všetko významne zlepšuje možnosť komerčného využitia tohto spôsobu.

Prečistený hemoglobínový roztok tvorený výluhom z kolóny obsahujúcej ionex, uskutočňujúci výmenu katiónov môže byť diafiltrovaný do tlmivého roztoku podľa výberu a upravený do želanej koncentrácie HbAo.

Nie je nič zvlášť kritické pri výbere ionovýmenného gólového materiálu, ktorý sa používa v procese podľa tohto vynálezu ako stacionárna fáza Výber gélu závisí od skúseností prevádzkovateľa metódy. Môžu byť použité bežné, komerčne dostupné gély, s podmienkou, že ich je možné úspešne derivatizovať tak, aby pracovali v režime ionexov s určenými afinitnými podmienkami pre druh materiálu, ktorý má byť separovaný. Základné skupiny materiálov pre ionex zahŕňajú typy materiálov s veľkými pórmi, makroretikuláme, neporézne typy, polystyrény alebo polymetakryláty krížovozosieťované s divinylbenzénom, polyalkyléna míny, celulóza dextrán, agaróza kremičitany, keramické materiály, sklo, hliníkové alebo kovové častice a ďalšie. Komerčne dostupné materiály zahŕňajú tie predávané pod ochrannými známkami - POROS média Fractogel, HyperD, Dowex, Amberlite, Duolite, Bio-Rex, Chelex, Sephadex, Sepharose, Toypearl, Macro-prep, Bio-protocol, Accel, Mono types a ďalšie. Funkčné skupiny pripojené na tieto materiály, na účely iónovej výmeny, sú sulfónan, sulfopropyl, karboxymetyl, karboxylát, fosforečná skupina kvartémy amín, kvartémy aminoetyl, polyetylénimín, trimetylaminoetyl, dietylaminoetyl, dimetylaminoetyl, aspartátamid a ďalšie.

Vynález môže byť taktiež použitý na výrobu HbAo roztoku s čistotou prinajmenšom 99,5 % a neočakávane bez obsahu vírusových častíc, aktívnych alebo neaktívnych, obzvlášť nebude obsahovať lipidmi opuzdrené vírusy ako napríklad HIV, vírus herpes simplex (HSV), hovädzí vírus spôsobujúci hnačky, ktorý je v mnohých prípadoch modelom ľudskej hepatitídy typu C. To sú niektoré z najdôležitejších a najnepríjemnejších vírusov kontaminujúcich ľudskú krv. To, že roztok získaný touto metódou nebude obsahovať žiadne vírusové častice je významná výhoda, ktorá sa nemohla využiť predtým, než bola metóda vyskúšaná a výsledky analyzované. Zatiaľ čo uvedené metódy, ako je uvedené vo vynáleze, zahŕňajú pasterizačný krok na účely inaktivácie vírusov, dosiahnutie odstránenia vírových častíc v rámci metódy purifikácie je mimoriadne výhodné. Z materiálu nahradzujúceho krv odstráni akékoľvek aktívne vírusové častice, ktoré by mohli prežiť pasterizáciu a tiež akékoľvek zvyšky neaktívnych vírusových častíc. To všetko sa dá dosiahnuť bez použitia ďalšieho špecifického kroku na odstránenie vírusových častíc a bez pridania akýchkoľvek špeciálnych činidiel alebo látok na účely odstraňovania vírusov. Môže byť dosiahnuté celkom úplné odstránenie lipidmi opuzdrených vírusov. Takisto sa dosiahne významná redukcia v kvantite ostatných vírusov.

Pokiaľ sú si prihlasovatelia vynálezu vedomí, hemoglobínové produkty tohto vynálezu majú väčší stupeň čistoty ako akékoľvek predtým opísané hemoglobínové produkty. Možno, že kvôli ich mimoriadnej čistote alebo doteraz nie plne vysvetleným faktorom, produkty vynálezu prejavujú neočakávané a vysoko výhodné vlastnosti, doteraz neopísané pri hemoglobínových produktoch, alebo aspoň nie pri tých, ktoré sú vyrábané vo veľkom.

Presnejšie, produkty tohto vynálezu, HbAo, neobsahujú žiadne membránové proteíny červených krviniek, čo bolo zistené metódou izoeletrickej fokusácie a pomocou imunoblot analýzy. Ako bolo zistené imunoabsorpčnou technikou, prítomné sú stopové množstvá ľudského sérového albumínu (HSA), v hladinách menších ako 4 pg, obvykle v rozpätí od 2 - 4 pg HSA/100 mg Hb. Jediné ďalšie zistiteľné proteíny niekedy nájdené v produktoch vynálezu sú fragmenty a a β globínových reťazcov hemoglobínu a tieto neprekračujú však ani 1 pg na 100 mg hemoglobínu. Svojou extrémne vysokou hladinou čistoty je produkt tohto vynálezu neobyčajne pozoruhodný a demonštruje neočakávané opísané vlastnosti. Jednou z nich je zníženie alebo neprítomnosť vazokonstrikčnej aktivity. Ďalšou je znížená toxicita proti kultivovaným endotelovým bunkám.

V minulosti bolo publikované, že vysoko purifikované hemoglobíny, oba typy, zosieťované a nezosieťované, spôsobovali po infúzii zvýšenie tlaku krvi. Keďže produkty boli zdanlivo tak vysoko purifikované, súčasné teórie vychádzajú z predpokladu, že v samotnom hemoglobíne musí byť obsiahnutá vlastnosť, ktorá to spôsobuje. Presnejšie, existuje domnienka, že hemoglobín je schopný viazať oxid dusičný ktorý je za tento efekt zodpovedný. Oxid dusnatý, ktorému sa

SK 281839 Β6 tiež pripisuje vlastnosť relaxujúceho faktora endotelového pôvodu, je účinným vazodilatátorom, ktorý je syntetizovaný endotelovými bunkami cez medziprodukt enzýmu syntázy oxidu dusnatého. Pretože molekuly hemoglobínu viažu oxid dusnatý s vysokou afinitou, predpokladalo sa, a v súčasnosti je akceptovaný názor, že intravenózna infúzia hemoglobínových roztokov, obzvlášť roztokov hemoglobínu, ktorý nie je krížovo zosieťovaný, odstráni oxid dusnatý a vyvolá hypertenznú odpoveď s vazokonstrikciou.

Zistenie, že produkty tohto vynálezu sú zbavené vazopresorickej aktivity na modeloch izovolemických výmen a hemoragickom šoku, je úplne neočakávané a je v protiklade k súčasným teóriám a názorom vo vzťahu k vnútorným intrinsic“ vlastnostiam hemoglobínu . Tento vynález naznačuje, že to nie je zapríčinené vnútornou vlastnosťou hemoglobínu, ktorý je zodpovedný za jeho už predtým opísanú vazokonstrikčnú aktivitu, ale príčinou je prinajmenšom a sčasti vplyv nečistoty, ktorá je prítomná v extrémne nízkych množstvách a ktorá nebola predtým úspešne odstránená, napriek uvedeným údajom o extrémne vysokej úrovni čistoty predtým uvádzaných hemoglobínov.

Výhody neprítomnosti vazopresorickej aktivity v produktoch podľa tohto vynálezu spočívajú v zosieťovaných a polymerizovaných hemoglobínových produktoch vyrobených z produktov podľa tohto vynálezu, napr. použitie metódy opísanej v udelenom USA patente čísla 08/231 945 podaného 21. apríla 1994.

Okrem toho produkty podľa tohto vynálezu majú vysokú redukciu toxicity proti endotelovým bunkám, pri aplikácii in vitro, v porovnaní s predtým opísanými hemoglobínmi. Štúdie, ktoré predtým opísali roztoky oxyhemoglobínu, vrátane chromatografícky purifikovaných hemoglobínov, poukázali na poškodenie buniek, ktoré sa prejavilo významným zvýšením laktátdehyrogenázy v tkanivovom médiu endotelových buniek, v porovnaní k hladinám laktátdehydrogenázy v kontrolnom médiu tkanivových endotelových buniek. Laktátdehydrogenáza je markerom poškodenia buniek. Táto toxicita sa opäť považuje a akceptuje ako vnútorná vlastnosť oxyhemoglobínu, pretože testovacie roztoky obsahovali oxyhemoglobín vo vysoko purifikovanom stave.

Neočakávané a významné je zistenie, že hemoglobín získaný podľa tohto vynálezu nevyvoláva uvoľnenie laktátdehydrogenázy. Na rozdiel od hemoglobínu získaného pomocou tohto vynálezu bolo pozorované významné zvýšenie uvoľnenia laktátdehydrogenázy pri inkubácii endoteliálnych buniek s hemoglobínovými roztokmi, zbavených strómy, ktoré sa získali inými chromatografickými metódami.

Je všeobecne akceptované a skutočne evidentné, že akákoľvek krvná náhrada a akákoľvek zložka z nepurifikovaného materiálu pre krvné substituenty, by mala byť dostatočne purifikovaná tak, aby bola zbavená všetkých škodlivých kontaminantov. Ako sa predtým zistilo, medzi nebezpečné kontaminanty patria stróma buniek, endotoxíny a iné pyrogény, nehemoglobínové bielkoviny atď. Staršie umelé krvné náhrady boli označované ako úplne čisté“ bez jedného alebo viacerých takýchto kontaminantov. Termín úplne čisté“ je však relatívny, subjektívne chápaný termín, jeho interpretácia a limitácia závisí od spôsobu určenia použitého relevantného parametra a opisu v relevantnom zmysle. Vylepšené purifikačné a analytické techniky sa stali predmetom publikácií o krvných náhradách a hemoglobínových produktoch so stále vyššími a vyššími hladinami čistoty. Napríklad staršia literatúra obsahuje publikácie o hemoglobínových roztokoch, v ktorých viac ako 99,9 % z prítomných proteínov je hemoglobín, v jednej alebo druhej forme (pozri už spomenutý patent 5 084 588

Rausch a spol.). Predpokladá sa v zhode s týmto vynálezom, že dokonca takáto čistota nie je dostatočná na výrobu úspešnej krvnej náhrady, pretože charakter zvyškových nečistôt môže spôsobovať vazokonstrikčné účinky a prejavovať toxicitu na úrovni buniek.

Pri hemoglobíne, zbavenom strómy, dostupnom z Walter Reed Army Research Inštitúte (WRAIR) a všeobecne uznávaného ako priemyselný štandard pre čistotu, je možné preukázať, že obsahuje veľký počet (>10 ) rozdielnych, kontaminujúcich proteínov, mnohé z nich sú prítomné v množstve menšom ako 0,01 % všetkých proteínov. Pretože je to zdanlivo veľmi malé množstvo, faktom zostáva, že hemoglobín ako krvná náhrada je aplikovaný jedincovi v relatívne veľkých množstvách, a tak jeho celkové množstvo aplikovaného kontaminantu určuje, či je alebo nie je škodlivé, nie jeho koncentrácia v aplikovanej zmesi. Jedna jednotka hemoglobínu, ktorá tvorí základ roztoku krvnej náhrady bude obsahovať od 25 - 50 gramov hemoglobínu, takže 0,01 % nečistôt predstavuje 2,5 - 5 miligramov nečistôt. V širokej škále prítomných proteínov sa môžu nachádzať jeden alebo dva proteíny, ktoré sú v tomto množstve extrémne nebezpečné. Tento vynález poskytuje hemoglobínový produkt, ktorý má obsah nehemoglobínových proteínov nižší ako 0,5 % a skôr pod 0,1 % a pravdepodobne, ale nie nevyhnutne ako vyplýva z výsledkov, nemá žiadne rozpoznateľné vazokonstrikčné účinky a žiadnu signifikantnú toxicitu proti endotelovým bunkám. Vynález taktiež poskytuje spôsob prípravy takýchto hemoglobínových roztokov na komerčne zaujímavom princípe, ako bolo diskutované.

Okrem toho ďalšou významnou výhodou produktov podľa tohto vynálezu je ich znížená prokoagulačná aktivita. Zdá sa, že produkty majú významne zredukovaný obsah látok, ktoré vyvolávajú zrážanlivosť krvi, v porovnaní s ostatnými dostupnými a predtým publikovanými hemoglobínovými produktmi, zbavenými strómy.

Ďalší opis vynálezu je zameraný na ilustrovanie nasledovných nelimitovaných príkladov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava nepurifikovaného lyzátu Hb

Deväťdesiatšesť jednotiek (približne 30 1) populácie červených krviniek (RBCs) rovnakého typu krvi sa zmiešalo a potom rozriedilo s 24 10,9 % fyziologického roztoku. Táto zmes sa potom prefiltrovala cez 20 μ z 8 μ polypropylénové filtre, aby sa odstránili akékoľvek zvyšky leukocytov.

Po odfiltrovaní leukocytov sa červené krvinky premyli s 6 objemami 0,9 % fyziologického roztoku a diafiltrovali v konštantnom objeme pri použití plochy 3,5 m² Sepracor membrány z polyétersulfónového vlákna s pórmi 0,3 μ. Premývací tlmivý roztok bol potom nahradený 50mM Tris lyzačným tlmivým roztokom a červené krvinky boli postupne podrobené lýze do 6 objemov tohto lyzačného tlmivého roztoku. Získaný nepurifikovaný lyzát bol zahustený z približne 2,5 % celkového hemoglobínu (THb) na približne 9,0 % THb s použitím Milipore ΡΤΓΚ membrány, ktorá zachytí molekulové hmotnosti nad 30 K (MWCO). Po zahustení bol tank naplnený s CO plynom, aby konvertoval hemoglobín na formu COHb. Lyzát bol pasterizovaný pri teplote 62 ±2 °C počas 10 hodín v uzatvorenom tanku. Pasterizovaný lyzát bol ochladený a potom centrifugovaný. Následná ultrafiltrácia cez 0,8 μ Milipore filtre pripravila pasterizovaný lyzát na diafiltráciu na inej Milipore 30 K

SK 281839 Β6

PTTK membráne. Materiál sa diafiltroval s 5 mM Tris tlmivým roztokom, pH 8,9, pokiaľ jeho vodivosť bola < 0,3 mS a pH bolo 8,9 ±0,2. Potom sa zriedil na 4,5 - 5 % THb a v tomto bode bol systém pripravený na následnú chromatografickú purifikáciu.

Príklad 2

Vytesňovacia chromatografia na ionexovej živici uskutočňujúcej výmenu aniónov

Kolóna s rozmermi 1 x 10 cm, naplnená ionovýmennou živicou, uskutočňujúcou výmenu aniónov, PerSeptive Poros HQ-50 sa premyla so 4 objemami kolóny s 1 N NaCl a ekvilibrovala s 5 mM Tris-tlmivým roztokom, pH 8,8. Po ekvilibrácii kolóny sa na túto aplikovalo 50 ml 3,0 % (3 g/lOOml) nepurifikovaného hemoglobínového lyzátu (~85 % HbAo) v 5mM Tris-tlmivého roztoku, pH 8,8, 0,78 ml/min. (1 cm/min.) pripraveného tak, ako bolo opísané v príklade 1. To viedlo k prípadnému predávkovaniu kolóny -

- plnenie je 200 mg roztoku na ml živice, v porovnaní s kapacitou pre plnenie 50 mg/ml, ktoré je odporúčané výrobcom. Eluát sa zozbieral. Kolóna sa potom premyla s 2 objemami kolóny s 5 mM Tris-tlmivým roztokom, pH 8,8 a tento eluát sa zmiešal s eluátom, zozbieraným počas napĺňania. Kolóna sa potom premyla s 1 N NaCl tak, aby sa vymyli zachytené proteíny a tento eluát sa vyleje do odpadu. Kolóna sa regenerovala s použitím 3 objemov kolóny IM NaCl/HCl a 4 objemov kolóny 1 M NaOH. Hemoglobínový eluát z anexovej živice sa analyzoval na analytickej anexovej kolóne, pri použití gradientu pH, ako je nižšie detailnejšie opísané v príklade 11. Stanovilo sa približne 95

- 96 % HbAo, ako je uvedené na obr. 3, s výťažkom 90 % HbAo z množstva aplikovaného do kolóny.

Príklad 3

Vytesňovacia chromatografia na ionovýmennej živici uskutočňujúcej výmenu aniónov

Kolóna s rozmermi 1 x 10 cm naplnená gélom Merck Fractogel-TMAE sa premyla so 4 objemami kolóny s IN NaCl a ekvilibrovala s 5 mM Tris-tlmivého roztoku, pH

8.8. Po ekvilibrácii kolóny, 50 ml 3,0 % (3 g/lOOml) nepurifikovaného hemoglobínového lyzátu (~85 % HbAo) v 5mM Tris, pripraveného ako bolo opísané v príklade 1, pH

8.8, bol tento lyzát aplikovaný na kolónu pri 0,78 ml/min. (1 cm/min.). Toto obdobne viedlo k prípadnému predávkovaniu kolóny. Eluát sa zhromaždil. Kolóna sa potom premyla s 2 objemami kolóny s 5 mM Tris-tlmivého roztoku, pH 8,8 a tento eluát sa zmiešal s výluhom zozbieraným počas plnenia kolóny. Kolóna sa potom premyla s 1 N NaCl tak, aby sa odstránili zachytené proteíny a tento eluát sa vyleje do odpadu. Kolóna sa regenerovala s použitím 3 objemov kolóny 0,5 N HCl a 4 objemov kolóny 1 M NaOH. Hemoglobínový eluát z ionovýmennej živice, uskutočňujúcej výmenu aniónov bol analyzovaný na analytickej anexovej kolóne, pri použití gradientu pH ako je detailnejšie opísané v príklade 11, a stanovilo sa približne 95 - 96 % HbAo, ako je uvedené na obr. 3, s výťažkom 73 % HbAo z množstva aplikovaného na kolónu.

Príklad 4

Vytesňovacia chromatografia na ionovýmennej živici uskutočňujúcej výmenu katiónov

Kolóna s rozmermi 1 x 10 cm naplnená s Perseptive Poros HS-50 sa premyla so 4 objemami kolóny s IN NaCl a ekvilibrovala s 5 mM Tris-tlmivým roztokom, pH 7,5. Po ekvilibrácii kolóny sa na kolónu aplikovalo 120 ml 2,0 % (2 g/100 ml), na vymieflači aniónov purifikovaného ~95 % HbAo, v 5mM Tris, pH 7,5, pripraveného ako bolo opísané v príkladoch 2 a 3, rýchlosťou 0,78 ml/min. (1 cm/min.). Toto nakoniec viedlo k podstatnému presýteniu kolóny, do rozsahu približne 5-násobne vyššiemu, ako odporúča výrobca. Eluát sa zozbieral. Kolóna sa potom premyla s 2 objemami kolóny 5 mM Tris-tlmivého roztoku, pH 7,5 a tento eluát sa zmiešal s eluátom zozbieraným počas plnenia. Kolóna sa potom premyla s 1 N NaCl tak, aby sa odstránili zachytené proteíny a tento eluát sa vyleje do odpadu. Kolóna sa regenerovala s použitím 3 objemov kolóny 0,5N HCl a 4 objemov kolóny 1 M NaOH. Hemoglobínový eluát z ionovýmennej živice, uskutočňujúcej výmenu aniónov, sa analyzoval na analytickej, anexovej kolóne, pri použití pH gradientu a stanovilo sa > 99 % HbAo, ako je ilustrované na obr. 4, s výťažkom približne 90 % HbAo, z množstva aplikovaného na kolónu.

Príklad 5

Sledoval sa vplyv vodivosti na vytesňovaciu chromatografiu na ionovýmennej živici, uskutočňujúcej výmenu aniónov (prvý stupeň).

Účinnosť vytesňovacej chromatografie je v rozhodujúcej miere závislá od iónovej sily tlmivého roztoku ako aj vzorky, čo sa stanovilo vodivosťou. Experiment, ktorý je zhrnutý v tabuľke 2 sa uskutočnil tak, že nepurifíkovaný lyzát z príkladu 1 sa aplikoval na ionovýmennú živicu, uskutočňujúcu výmenu aniónov Poros HQ-50 z PerSeptive Biosystems Inc. Eluát z kolóny sa analyzoval pomocou analytickej anexovej chromatografie. Frakcie, získané počas pokusu č. 1, boli všetky bez stanoviteľného množstva kyslých kontaminantov, zatiaľ čo dokonca už prvá fiakcia z pokusu č. 2 bola kontaminovaná s kyslými nečistotami.

Tabuľka 2

Poku·	Kapacita plnenia g/«i	THb	pH	MS	ÍL x d)	Tlalvý	Rýchloiŕ prietoku ca/ein	Oditrín. kyalých kontanln.
1	200	3.0	0.0	0.2/ 0.4	10 X 1	Tri·	1	1004
2	200	2.0	0.0	2.es	10 X 1	Tria	1	01

Príklad 6

Výťažok ako funkcia dávky proteínu

Preplnením kolóny sa dosiahne väčší výťažok purifikovaného HbAo. Experimenty opísané v tabuľke 3 ukazujú veľmi veľké presýtenie na 10 ml kolóne katiónovej ionovýmennej živice Poros HS-50, ktorá zaručuje, že všetky väzobné miesta sú obsadené kontaminantmi, čo dovoľuje väčší výťažok purifikovaného HbAo. Presýtenie kolóny v prvom experimente bolo 13,5-krát väčšie ako odporúča výrobca (308 mg proteínov/ml). V druhom experimente to bolo približne 5-krát väčšie ako odporúča výrobca. Väčšie presýtenie vedie k významnému zlepšeniu výťažku množstva získaného HbAo z kolóny.

Tabuľka 3

Dávka THb pH mS Kolóna Tlmivý Rýchlosť Bez alkalic. (mg (L x D) roztok prietoku kontamin.

prote- cm/min inov m!

308	3,1	7,5	0,5	9,5x1	Tris	0,6	100% 88 % výťažok
216	2,9	7,4	0,6	9,5x1	Tris	0,6	100% 77 % výťažok

SK 281839 Β6

Príklad 7

Porovnanie medzi malými a veľkými kolónami

Proces vytesňovacej chromatografie podľa tohto vynálezu môže byť použitý na veľkých a malých kolónach. Pri použití aniónovej ionovýmennej živice Poros HQ-50, s využitím 15 1 kolóny a následne katiónovej ionovýmennej živice HS-50, s využitím 101 kolóny sa vykonalo porovnanie s 10 ml kolónami. Plniaci roztok do kolóny obsahujúcej HQ-50 sa pripravil ako je opísané v príklade 1. Výluh z HQ-50 kolóny bol plnený do HS-50 kolóny. Tabuľka 4 ilustruje podmienky a výsledky použitia Poros HQ-50 kolón. Tabuľka 5 ilustruje výsledky použitia POROS HS-50 kolón. Výsledky poukazujú, že obidva stupne procesu na komerčné využitie môžu byť rozšírené do objemu, prinajmenšom 10-15 litrových kolón.

Tabuľka 4

itaožatvc Mplnené	Milo! •g/ai	m	t*	VodívoBÍ S	Kolína (L x D)	Tlaivý roztok	Rýctil. pri»t. cx/aln	8 odacrán. kyalejiích* koncanin.
1.6 g	210	5.6	8.9	0.5	10 x 1	Tri»	1	1004
3.3 kg	200	4.7	8.8	0.3	10 x 45	Tri·	1	1OO4

Tabuľka 5

Mnoiatvo luplneni	NSloi •g/wi	THb	J>H	Vodivoeé aS	Kolóna (t D)	Tlatvý rostok	Rýchl. prieč, ca/ain	8 oditrín. «íaadlt. kantaaia.
2.4 g	308	3.1	7.5	O.5	9.5 X L	Trie	O.6	1008
1.7 kg	254	3.7	7.6	0.4	9.5 x 30	Tri·	0.6	1004

Príklad 8

Analýza nepurífikovaného hemoglobínového lyzátu a purifikovaného hemoglobínu pomocou izoelektrickej fokusácie (IEF)

Analýza izoelektrickou fokusáciou (IEF) sa uskutočnila s použitím agarózového typu gélu s pH gradientom vytvorenom s použitím komerčne dostupných amfolytov. Amfolyty boli použité tak, že 90 % z nich bolo v rozsahu pH 5 - 8 a 10 % bolo v rozsahu pH 3,5-10. Finálna koncentrácia agarózy v géli bola 1,25 % a finálna koncentrácia prítomných amfolytov bola okolo 2 %. Kvôli zámeru určenia čistoty vzoriek, na gély sa aplikoval nadbytok vzorky (1 mg proteínu bol nanesený na 1 dráhu). Elektoforéza sa uskutočnila pri malom prúde, aby sa zabezpečil pohyb proteínov v elektrickom poli v rovnakom rovnom pruhu. Po dosiahnutí ustáleného stavu, napätie a prúd sa zvýšili na krátky čas, aby sa dosiahlo ďalšie zaostrenie pruhu. Po elektoroforéze boli proteíny v agarózovom géli fixované roztokom kyseliny trichlóroctovej a sulfosalycilovej. Po fixačnom kroku sa gél zafarbil s Coomassie modrou, aby sa zviditeľnili pruhy proteínov. Kvôli detekcii bol gél vysušený a na detekciu sa potom použil laserový denzitometer na rozlíšenie dráh získaných elektrofokusáciou zo vzoriek obsahujúcich nepurifikovaný hemoglobínový lyzát a purifikovaný hemoglobín. Obrázok 5 ilustruje porovnanie medzi IEF nepurifikovaného hemoglobínového lyzátu, pripraveného ako je opísané v príklade 1, a purifikovaného HbAo pripraveného podľa tohto vynálezu. Purifikácia hemoglobínového roztoku sa uskutočnila s použitím Poros HQ-50 kolóny tak, ako je opísané v príklade 2 a následne Poros HS-50 kolóny tak, ako je opísané v príklade 4.

Príklad 9

Imuno-analýza nepurífikovaného hemoglobínového lyzátu a purifikovaného hemoglobínu

Na analýzu množstva rozličných kontaminantov v nepurifikovanom hemoglobínovom lyzáte z príkladu 1 a v puriflkovanom hemoglobíne, pripraveného podľa metódy vynálezu, sa použila imuno-farbiaca technika. Po elektrofokusácii proteínov na agarózovom géli boli proteíny premiestnené na nitrocelulózový papier s použitím kapilárnej blotačnej techniky. Zvyšné voľné väzobné miesta na papieri boli blokované inkubáciou škvrny v roztoku hydrolyzovanej želatíny z rýb. Po inkubácii sa škvrna premyla s tris-upraveným fyziologickým roztokom (TBS) potom inkubovala s primárnou protilátkou. (Primárna protilátka je protilátka, proti ktorej má byť vzorka testovaná, napr. proti-ľudskému sérovému albumínu (anti-HSA) by mala byť použitá na testovanie HSA v hemoglobínových roztokoch). Po tejto inkubácii sa škvrna premyla s TBS a potom inkubovala so sekundárnou protilátkou, konjugovanou na enzýmový marker (napr. chrenová peroxidáza), ktorá je protilátkou proti primárnej protilátke.

Po inkubácii so sekundárnou protilátkou sa škvma znova premyla s TBS a potom sa pridal substrát pre enzýmový marker. Farebná zrazenina sa objaví tam, kde sa sekundárna protilátka naviazala na primárnu protilátku, ktorá je naviazaná na jeho antigén, a takto indikuje množstvo a polohu antigénu proti primárnemu antigénu na IEF géli.

Výsledky sú uvedené v tabuľke 6, na ktorej „+ + + + + +“ naznačuje silný signál, „+“ naznačuje sotva zachytiteľný signál aoznačuje, že žiaden signál nebolo možné zaznamenať.

Tabuľka 6

POUŽITÉ PROTILÁTKY	NEPURIFIKOVANÝ Hb LYZÁT	HEMOGLOBÍN
Ľudský sérový albumín	+++++++++++	+»
Erytrocyty (Er)	+++++++	+b
Membrány Er	+ + 4- + +	-
Ľudská plazma	+++++++++++	+C
CO2 anhydráza I	+ + +	-
Spektrín	+ + + +	-
Glykoforín	+ +	-

a) Ľudský sérový albumín bol použitý ako štandarda pre imunobloty, jeho stanovená koncentrácia v purifikovanom HbAo bola < 5 pg/mg Hb (< 50 ppm).

b) Krížovými reakciami s protilátkami erytrocytov bol zistený kontaminant v stopovom množstve s pi ~ 5,2. Iní autori tiež uvádzajú podobný proteín v ich roztokoch purifikovaného Hb - pozri Christensen a spol., od. cit.

c) Protilátkami proti ľudskému sérovému albumínu prítomnými v anti-ľudskej plazme sa zisťovala prítomnosť ľudského sérového albumínu v purifikovanom HbAo.

Príklad 10

Ľudský sérový albumín - imuno detekcia (HSA-1D)

Na kvantitatívne stanovenie ľudského sérového albumínu v roztoku hemoglobínu bola použitá chromatografická metóda. Metóda využívala kovalentne viazanú protilátku (anti-HSA) na matricu v kolóne. Keď sa vzorka aplikovala na kolónu, všetko okrem antigénu protilátky prešlo cez kolónu v priebehu plniaceho a vymývacieho kroku. Pri použití elučného tlmivého roztoku viazaný antigén (HSA) sa uvoľnil z kolóny a plocha tohto vrcholu sa používala na kvantitatívne stanovenie antigénu prítomného vo vzorke.

Imunodetekčná* (ID) testovacia súprava bola od firmy PerSeptive Biosystems. Prietoková rýchlosť na stanovenie bola 2 ml/min. Náboju podobná kolóna (1,6 mmD x 26 mml) bola ekvilibrovaná s plniacim 10 mM fosfátovým tlmivým roztokom + 300 mM NaCl, pH 7,2), a potom sa aplikovalo 50 TI vzorky. Plniaci tlmivý roztok sa použil na premývanie kolóny počas 0,25 minúty, a potom sa použil elučný tlmivý roztok (počas 3,5 minúty) tak, aby sa vylúhoval viazaný HSA z kolóny. Eluát bol monitorovaný Beckmanovým diódovým detektorom pri 220 nm a 414 nm. Kolóna bola potom reekvilibrovaná s plniacim tlmivým roztokom pre ďalšiu aplikáciu. Pri použití tejto metódy stanovené množstvo ľudského sérového albumínu nachádzajúce sa v purifikovanom hemoglobíne nebolo vyššie ako 0,0005 % hmotnosti, v prepočte na hemoglobín.

* ochranná známka

Prikladll

Analytická ionexová chromatografia

Chromatografická metóda, ktorá sa použila na analýzu čistoty hemoglobínu v produktoch uvedených v príklade 2 a 4 bola nasledovná. Stanovenie sa zakladalo na metóde uverejnenej Huismanom & Dozym '⁴\kde sa vzorka aplikovala na anióny vymieňajúcu ionexová kolónu pri vysokom pH (pH 8,5 ), takže všetky proteíny sa naviazali na kolónu a potom sa využil pH gradient od pH 8,5 po pH 6,5, aby sa postupne vylúhovali proteíny z kolóny. Použitím tejto chromatografickej metódy sa môžu separovať veľmi podobné proteíny (napr. rôzne varianty hemoglobínu). Na stanovenie sa použila 4,6 mm x 100 mm analytická anióny vymieňajúca ionexová kolóna z PerSeptive Biosystemu. Použité tlmivé roztoky boli A) 25 mM Tris + 25 mM Bistris, pH 8,5 a B)25 mM Tris + 25 mM Bis-tris, pH 6,5. Stanovenie sa uskutočňovalo pri rýchlosti prietoku 5 ml/min. Potom, ako bola kolóna ekvilibrovaná s tlmivým roztokom B, 10 [1 vzorky (koncentr. 10 mg THb/ml) sa aplikovalo na kolónu, na ktorú sa začalo pôsobiť gradientom (100 % tl mivého roztoku A ku 100 % tlmivému roztoku B na 25 objemových jednotiek kolóny). Eluát sa monitoroval UV detekciou pri 280 nm, na účely identifikácie proteínových vrcholov. Obrázok 3 ilustruje chromatografický profil anióny vymieňajúcej ionovýmennej purifikácie hemoglobínu (produkt z príkladu 2) a obrázok 4 ilustruje purifikáciu HbAo (produkt z príkladu 4), keď boli analyzované touto metódou.

Táto metóda je štandardným stanovením na zistenie čistoty hemoglobínových roztokov. Purifikovaný HbAo v tomto vynáleze bol zbavený všetkých kontaminantov pozorovaných pri hemoglobíne zbavenom strómy. Malý susediaci vrchol, predchádzajúci vrcholu HbAo sa príležitostne vyskytoval a bol pripisovaný oxidovanej forme HbAo (MetHbAo). Čistota produktu v tomto vynáleze je bežne vyššia než 99,5 % pri tejto analytickej metóde.

Príklad 12

Odstránenie vírusov

Proces v predkladanom vynáleze bol testovaný na jeho schopnosť odstrániť vírusy z nepuriíikovaného hemoglobínu.

K vzorkám pripraveného nepurifikovaného lyzátu, ako bolo opísané v príklade 1, a ku vzorkám čiastočne purifikovaného roztoku hemoglobínu vytekajúceho z aniónovej kolóny, napr. produkt z príkladu 2 a 3, sa použil test, ktorý kvantifikuje nasledovné, pridané vírusy v aktívnej forme:

Poliovírus typ 1

Human Immunodeficiency (HIV) (vírus spôsobujúci AIDS) Bovine Diarrhea Vírus (ktorý je modelom pre ľudský vírus hepatitídy) (hovädzí vírus vyvolávajúci hnačky) Herpes simplex Vírus typ 1 (HSV-1).

Alikvotné časti eluátu z príslušných kolón sa pridali k testovaciemu bunkovému systému. V prípade poliovírusu, herpesového vírusu a hovädzieho diarhea vírusu, prítomné aktívne vírusy reagujú s testovacími bunkami a vytvárajú plaky. Použili sa bežne známe štandardné metódy. V prípade HIV, alikvotné časti výluhov z kolón sa pridali k médiám tkanivových kultúr. Množstvo prítomných vírusov sa stanovilo zmenou rastu bunkových línií. Tieto zmeny sú známe ako TCID₅o (infekcia 50% tkanivových kultúr). Tieto výsledky sú uvedené v tabuľke 7.

Tabuľka 7

Log redukcie vírusov dosiahnutý v priebehu chromatografie

Vírus	Poliovírus typ 1	Human immunodeficiency	Bovine vírus diarrhea	Herpes simplex vírus typ II
Genóm	RNA	RNA	RNA	RNA
Obalený	Nie	Áno	Áno	Áno
Testovací systém	Bunky Vero	Bunky MT-4	Bunky EBTr	Bunky Vero
Aniónová nálož	1,4 x 107 pfu/ml	1,4x10° TCIDso/ml	1,7 x 105 pfu/ml	5,3x106 pfu/ml
Aniónový výluh	8,5 x 106pfu/ml	<3 TCID50ML	<20 pfu/ml	< 3 pfu/ml
Log redukcie	<1	>5	>4	>6
Katiónová nálož	3,1 x 107pfu/ml	3,2 x 106 TCIDjo/ml	2,8 x 105 pfu/ml	2,0 x 106 pfu/ml
Katiónový výluh	7,5 x 106 pfu/ml	5,6 x 102 pfu/ml	2,1 x 104 pfu/ml	4,1x103 pfu/ml
Log redukcie	<1	>3	>1	>3

Tieto výsledky poukazujú na malú redukciu množstva poliovírusu pri použití krokov buď výmeny aniónov, alebo katiónov vytesňovacou ionovýmennou chromatografiou, uvedenou v tomto vynáleze, ale poukazuje na výraznú redukciu vírusov po aplikácii vírusov na kolónu v prípade HIV, HSV bovine diarrhea a po následnej, anióny vymie ňajúcej ionexovej chromatografii a v menšej miere po následnej, katióny vymieňajúcej ionexovej chromatografii. Tento nález bol úplne neočakávaný, ale predstavuje významnú výhodu použitia tohto vynálezu.

SK 281839 Β6

Príklad 13

Analýza čistoty pomocou izoelektrickej fokusácie a westem blotu

Pre pokusy, týkajúce sa izoelektrickej fokusácie (IEF) sa použila technika podľa Saravisa a Zamchecka.^<5)

Zariadenie na prípravu IEF gélov sa naplnili agarózou (finálna koncentrácia 1 %) a gradient pH sa vytvoril pomocou amfolytov (Pharmacia Biotech Inc., Piscatawaz, N. J.) tak, že 90 % bolo v rozpätí pH 5 - 8 a 10 % v rozpätí pH 3,5 - 10. Zvyčajne 10 J1 z roztokov hemoglobínu s obsahom 100 mg/ml sa nanieslo na IEF gél. Po fokusácii proteinov gél sa fixoval s 10 % kyselinou trichlóroctovou (TCA), vysušil a farbil s Coomassie modrou [3]. Obvykle sa nanáša 1 mg celkových proteínov na jednu dráhu.

Izoelektrická fókusačná analýza (IEF) bola použitá na porovnanie čistoty SFH so štyrmi (4) rozličnými šaižami HbAo purifikovaného podľa tohto vynálezu. Nanieslo sa 50 ’fg alebo 1 mg celkového Hb na jednu dráhu. Výsledky sú ilustrované na obr. 6. Dráha 20 predstavuje hemoglobín neobsahujúci strómu, ak bolo nanesených 50 f g celkového Hb a dráhy 22, 24, 26 a 28 predstavujú šarže purifikovaného Hb podľa tohto vynálezu pri rovnakom nanesení vzoriek Dráha 30 predstavuje 1 mg celkove naneseného SFH a dráhy 32, 34, 36 a 38 predstavujú šarže purifikovaného Hb podľa tohto vynálezu pri rovnakom nanesení vzoriek. 50 Jg celkove nanesenej vzorky ukázalo, že purifikovaný HbAo a SFH majú podobnú čistotu. Ale, ak sa nanieslo 1 mg celkového Hb/diáhu, množstvo proteínov červených krviniek buď plazmatických, alebo membránových proteínov bolo pozorovaných v dráhe SFH, pričom tieto proteíny neboli zistené v dráhe purifikovaného HbAo. Veľmi slabý pruh proteínu s pl približne 5,2 sa zistil v dráhe purifikovaného HbAo, pravdepodobne z fragmentov globínového reťazca. Pruhy nad pruhom HbAo v dráhach, na ktoré sa aplikovalo 50 Tg vzorky sa vyskytujú kvôli prítomnosti viac kladne nabitých druhov MetHb, ktoré vznikajú počas elektrofokusácie.

Po ukončení izoelektrickej fokusácie sa pokračovalo technikou Westemovej blotačnej analýzy, ktorej princípom je farebná reakcia v prítomnosti protilátky (imuno-farebná reakcia), aby sa ďalej vyšetrila čistota produktu uvádzaného v tomto vynáleze. Proteíny z IEF gélu boli s použitím kapilárneho blotingu prenesené na nitrocelulózový papier. Zostávajúce voľné miesta na nitrocelulózovom papieri boli blokované inkubáciou škvrny (blotu) s hydrolyzovanou želatínou rýb (Hipure Liquid Gelatin, Norland Products Inc., New Brunswick, N. J.). Potom sa blot inkuboval s králičou protilátkou proti ľudskej plazme (Dáko Corp., Šanta Barbara, CA, šarža #010) (protilátky boli zriedené 1 : 500 v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku). Po inkubácii cez noc sa škvrna premyla s Tris-pufrovaným fyziologickým roztokom (TBS) obsahujúcim 1% želatínu z rýb a potom sa inkubovala s kozou-protikráličou IgG-chrenovou peroxidázou (HRP) (zriedenou 1 : 1000 v TBS). Po jednohodinovej inkubácii škvrna sa opäť premyla s TBS obsahujúcom 1 % želatínu z rýb. Komplex antigén-protilátka-HRP sa vizualizoval so 4-chlór-l-naftolom (30 mg/20 ml metanolu) a peroxidom vodíka (50 fl v 100 ml TBS). Prítomnosť antigénov, špeciálne plazmatických proteínov indikovali tmavopurpurové pruhy zrazeniny.

Vzorky hemoglobínu zbaveného strómy v duplikátoch, Hb podľa vynálezu, IEF Hb podľa vynálezu, purifikovaný Hb z Walter Reed Army Inštitúte (WRAIR) (purifikovaný spôsobom opísaným v spomenutej práci Winslow a spol.) a purifikovaný Hb zo Sigma Corporation (ako je opísané v ich bežnom katalógu diagnostických činidiel, ako Hemoglobín Ao, kód H 0267) boli podrobené fokusácii na IEF géli. Jedna polovina gélu bola zafarbená s Coomassie-modrou a druhá bola preblotovaná na nitrocelulózový pa pier. Potom sa blot zafarbil, aby bolo možné vizualizovať komplex ľudská plazma - protilátka proti ľudskej plazme. Výsledky sú uvedené na obr. 7. Na tomto obrázku, na dráhe 40 je znázornený hemoglobín zbavený strómy, zafarbený Coomassie-modrou a na dráhach 42,44 a 46 sú znázornené príslušné dráhy HbAo podľa tohto vynálezu, Hb z WRAIR H od Sigmy. Na dráhe 48 je znázornený test Westem blot - protilátka proti ľudskej plazme hemoglobínu, zbaveného strómy a dráhy 50, 52 a 54 reprezentujú príslušné dráhy HbAo podľa vynálezu, Hb z WRAIR a Hb od Sigmy.

Významné množstvá plazmatických proteínov boli zistené vo vzorkách SFH. Na druhej strane v dráhe produktu podľa vynálezu sa zistili len veľmi nepatrné stopy ľudského sérového albumínu (HSA). V produkte podľa vynálezu neboli zistené ďalšie plazmatické proteíny. Nezistili sa detekovateľné hladiny HSA v HbAo z WRAIR, ale potvrdila sa prítomnosť veľkého počtu ďalších plazmatických proteínov nad a pod pruhmi reprezentujúcimi HbAo. Štandarda HbAo od Sigmy obsahuje veľký počet plazmatických kontaminantov zahŕňajúcich významné koncentrácie HSA.

Príklad 14

Akútna hypovolemická štúdia na potkanoch pri vedomí

Produkt tohto vynálezu bol testovaný na vazopresorickú aktivitu.

Potkany kmeňa Sprague-Dawley, náhodne rozdelené do 6 skupín (n=6), mohli sa 4 dni aklimatizovať a v tom čase sa im zaviedla permanentná kanyla podľa techniky Tabata a Changa⁽⁶⁾. Náležíte kanylovaným zvieratám sa intravenózne aplikoval heparín v dávke 150 IU/kg. Jedna arteriálna kanyla bola napojená na Strathamov tlakový transduktor na meranie tlaku krvi a frekvencie srdca Tieto parametre boli priebežne zaznamenávané na Grassovom polygrafický záznamníku. Po dosiahnutí ustáleného stavu, ktorý dokumentuje základná línia záznamu, sa vyvolal letálny hemoragický šok podľa metódy Wiggcrsa, pri ktorom sa odstránilo 67 % celkového objemu krvi cez inú arteriálnu kanylu pri rýchlosti 0,5 ml/min., v dvoch stupňoch. Okamžite po vyvolaní šoku každému potkanovi sa aplikoval testovaný materiál rýchlosťou 0,5 ml/min., t j. homologizovaná krv, HbAo podľa vynálezu (HbAo), alebo krížovozosieťovaný HbAo podľa vynálezu, pri ktorom sa HbAo nechal zreagovať s o-rafinózovým činidlom, spôsobujúcim sieťovanie ako bolo opísané v uverejnenej USA patentovej prihláške 08/231 945 podanej 21. apríla 1994 (objem x 3). Priemerný arteriálny tlak (MAP) a frekvencia srdca boli zaznamenávané až do 30 min. po ukončení infúzie. Každý potkan sa umiestnil do separátnej klietky a počas 14 dní bola monitorovaná jeho váha, hematokrit a prežitie.

Výsledky sú znázornené graficky na obrázku 8, kde MAP je vynesený oproti času.

Tieto údaje ilustrujú, že produkt podľa tohto vynálezu je vysoko purifikovaná forma hemoglobínu Ao, ktorá je rovnako účinná ako celá krv pri obnove priemerného arteriálneho tlaku po hemoragickom šoku modelového potkana pri vedomí. Neboli pozorované žiadne rozdiely pri obnove arteriálneho tlaku a vo frekvencii srdca v skupine potkanov, ktorým bola aplikovaná celá krv a HbAo.

Príklad 15

Hemodynamické účinky potkanov po izovolemickej výmennej transfúzii

HbAo v tomto vynáleze sa testoval, aby sa vyhodnotili hemodynamické účinky pri izovolemickej výmennej transfúzií na potkanoch pri vedomí.

Do externej iliakálnej vény a artérie potkanov sa zaviedla kanyla cez femorálnu oblasť, pozri Keipert a Chang⁽⁸⁾. Po 24 hodinách oddychového obdobia, zvieratá, ktoré boli pri vedomí sa podrobili kontinuálnym 50 % izovolemickým výmenným transfúziám. Počas výmennej transfúzie bol objem krvi odstránenej cez iliakálnu artériu nahradený testovaným roztokom cez iliakálnu žilu rýchlosťou 0,5 ml/min. pomocou konštantnej prietokovej infuznej pumpy. Tlak krvi a frekvencia srdca sa monitorovala nepretržite: (1) 30 min. pred výmenou, (2) v priebehu a (3) 2 až 3 hodiny po výmene. Priemerný arteriálny tlak a frekvencia srdca boli vypočítané zo záznamov krvného tlaku.

Jedna skupina potkanov (4 v jednej skupine) dostala transfúziu ľudského sérového albumínu, HSA. V ďalšej skupine potkanov (6 potkanov v skupine) sa použil roztok hemoglobínu, neobsahujúci strómu (SFH) ako testovací roztok. V ďalšej skupine potkanov (8 potkanov v skupine) bol testovaným roztokom produkt vynálezu.

Výsledky sú prezentované graficky na obr. 9 a 9a.

Pri všetkých testovaných roztokoch sa priemerný tlak krvi zvýšil o 10-20 mm líg v priebehu výmennej transfúzie. Pri kontrolnom albumíhovom roztoku sa priemerný arteriálny tlak znížil o 15 mm Hg pod východiskovú úroveň pri monitorovaní počas oddychu po výmennej procedúre a zotrval na zníženej úrovni počas celej monitorovacej fázy po výmene približne 2,5-hodiny. (Obrázok 9). Tieto pozorovania sú v zhode s predchádzajúcimi publikovanými pozorovaniami Keiperta a Changa⁽⁸’

Pri hemoglobíne zbavenom strómy priemerný arteriálny tlak krvi klesol späť na pôvodnú úroveň na konci výmennej periódy, ale zvýšil sa v priebehu monitorovacej fázy po výmene maximálne o 15 mm Hg nad východiskovú úroveň 30 - 40 minút po výmene (obrázok 9a).

Naopak pri HbAo z tohto vynálezu sa priemerný arteriálny tlak krvi počas výmeny vrátil na pôvodnú úroveň a zvýšil sa po výmene nie viac ako o 5 mm Hg a tak zachoval MAP v normálnom rozsahu.

Výsledky tejto štúdie ukazujú, že HbAo vo vynáleze je zbavený účinnej vazoaktivity spojenej s výmennou transfúziou s hemoglobínom zbaveným strómy.

Príklad 16

In vitro stanovenie pomocou tkanivách kultúr na účely merania oxidatívneho poškodenia v endotelových bunkách predtým vystavených hemoglobínovým prípravkom

HbAo tohto vynálezu bol testovaný na schopnosť či môže vyvolať oxidatívne poškodenie kultúry endotelových buniek. Detekcia vyplavenej laktátdehydrogenázy do média je markerom na poškodenie buniek a cytotoxicitu.

Endotelové bunky z torakálnej aorty ošípanej sa kultivovali, pokým kultúra bola konfluentná, opakované pasážovanie buniek sa uskutočňovalo v pomere 1 : 3. Na pokus sa použili bunky z pasáže 7, rastúce v rámci pasáže nie viac ako 48 hodín. Poškodenie buniek sa stanovilo meraním množstva uvoľnenej laktátdehydrogenázy z buniek do média. Predtým ako boli hemoglobínové roztoky pridané, odstránilo sa médium a bunky boli dvakrát premyté s fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom. Bunky boli inkubované s hemoglobínom (250 fM herne) v kompletnom EGM médiu počas 6 alebo 24 hodín pri teplote 37°C (n = 4 - 6). Bunky inkubované v kompletnom EGM médiu bez pridanej testovanej látky tvorili negatívnu kontrolu. Na konci inkubácie 50 TI média bolo odobratých z každej jamky a stanovila sa aktivita laktát-dehydrogenázy pomocou laktátdehydrogenázového testu (Sigma).

Aktivita laktátdehydrogenázy v každej jamke bola porovnávaná s aktivitou enzýmu, ktorý sa uvoľnil z buniek po pridaní 2 % Tritonu X-100 (celkové uvoľnenie LDH) vyjadrené ako percento celkového uvoľnenia enzýmu.

Po 6 hodinách inkubácie sa pozorovalo signifikantne zvýšené uvoľnenie laktát dehydrogenázy za prítomnosti hemoglobínu zbaveného strómy SFH (74,4 ±4,2 %, p<0,005). Podobné, ale menšie zvýšenie sa pozorovalo pri purifikovanom hemoglobíne z Walter Reed Anny Inštitúte of Research. Nebolo pozorované žiadne zvýšenie pri HbAo tohto vynálezu (39,8 ±2,3 %) pri porovnaní s kontrolou (37,5 ±2,2 %). Uvoľňovanie laktátdehydrogenázy bolo aj naďalej zvýšené po 24 hodinách inkubácie za prítomnosti hemoglobínu (99,6 ±3,5 %), zatiaľ čo pri HbAo podľa tohto vynálezu (41,6 ±4,6 %) sa nepozorovali žiadne zmeny v porovnaní s kontrolou (34,1 ±2,6 %).

Inkubácia tkanivových kultúr endotelových buniek s HbAo, ktorý bol pripravený metódami opísanými v tomto vynáleze, nevyvolával uvoľnenie laktátdehydrogenázovej aktivity, ktorá je markerom pre poškodenie bunky. Preto cytotoxický účinok na kultivované endotelové bunky nie je vnútornou vlastnosťou hemoglobínových roztokov a purifikácia HbAo odstraňuje cytotoxické komponenty, ktoré sú prítomné pri hemoglobíne neobsahujúcom strómu.

Príklad 17

Odstránenie prokoagulačnej aktivity

Produkt tohto vynálezu bol testovaný na obsah látok, ktoré potencujú koaguláciu krvi. Použila sa metóda podľa Biesselsa a spol.⁽⁹⁾

Morčatá boli anestezované Hyponormom™ a silikónová kanyla bola zavedená do artérie carotis. Po zavedení kanyly sa odobralo 30 % objemu krvi (vypočítané ako 2 % telesnej hmotnosti) a nahradené ekvivalentným objemom testovaného roztoku. Infúzia 1 % ľudského albumínu rýchlosťou 2,5 ml za hodinu mala uchovať prístup ku kanyle. Začiatok albumínovej infúzie bol považovaný za začiatok experimentu. Fibrino peptid A (FPA), ktorý je známy, že sa tvorí z fibrinogénu pri koagulácii krvi bol meraný pred a po infúzii Faktora Xa (8-9 mikrogramov/kg) v dávke, ktorá samotná nevyvoláva koaguláciu. Vzorky krvi sa zbierali do antikoagulačnej zmesi heparínu (1000 U/ml), Trasylolu (1000 U/ml) a citranu sodného (3,8 %), oddelili a plazma sa uskladnila na ľade.

Vzorky plazmy sa spracovali podľa metódy Leessmana,198O⁽¹°⁵ na stanovenie FPA a vytvorený FPA sa stanovoval RIA metódou predtým publikovanou Gerritsom^(ll). Plazmatické proteíny sa vyzrážali ekvivalentným objemom 40 % PEG 6000 vo fyziologickom roztoku pufŕovanom fosfátom. Roztoky supematantu sa zahrievali vo vriacom vodnom kúpeli, centrifugované a uskladnené na stanovenie. Výsledky sú ilustrované v tabuľke 8.

Tabuľka 8

Testovaná vzorka	Opis	AUC10*
SFH	Rýchle, prechodné zvýšenie FPA z 1,4 ng/ml na 13,8 +/- 3 ng/ml v priebehu prvých 10 minút, ktoré po 40 minútach kleslo na východiskové hodnoty.	87,6+/-12
HSA	Zvýšenie FPA z východiskovej hodnoty 1,4 ng/ml na maximum 5,5 +/-1,5 ng/ml.	45,7 +/- 8,2
HbAo	Zvýšenie PFA z východiskovej hodnoty 1,4 ng/ml na maximum 5,0 +/-1,2 ng/ml	31,8+/-2,9

SK 281839 Β6 * Oblasť pod krivkou v počiatočných 10 minútach po aplikácii Faktora Xa.

Výsledky ukazujú, že produkt tohto vynálezu nemá esenciálnu prokoagulačnú aktivitu pri porovnaní s hemoglobínom neobsahujúcim strómu. Uvažuje sa, že takáto prokoagulačná aktivita je založená vo väčšej miere na kontaminácii testovaných roztokov lipidmi a fosfolipidmi.

Príklad 18

Kvantifikácia kontaminácie ľudského sérového albumínu pomocou elisa techník

Množstvo sérových proteínových kontaminantov pri purifikovanom hemoglobínovom produkte podľa tohto vynálezu sa stanovilo a porovnávalo s inými dostupnými hemoglobínovými produktmi pomocou viacvrstvovej („sendvičovej“) ELISA techniky. V tomto príklade sa použili všeobecné postupy a techniky viacvrstvovej ELISA techniky podľa Butlera, J. E. (12).

Dynatech 96 jamkových, 1 mm 4 mikrotiter platne sa potiahli s pevnou fázou kozieho séra absorbovaného na králičiu protilátku s protilátkami proti ľudskému séru (Dáko Corporation, Šanta Barbara, CA, šaiža # 072), zriedenou v pomere 1 : 40 v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku. Po 2 hodinovej inkubácii pri 37 °C, sa plame premyli s Tris-pufrovaným fyziologickým roztokom (TBS) a zostávajúce voľné miesta na platni boli blokované inkubáciou s hydrolyzovanou želatínou rýb (Hipure Liquid Gelatin, Norland Products Inc., New Brunswick, N. J.). Po 1 hodinovej inkubácii sa platne premyli s TBS a testované zložky sa pridali pri použití dvojnásobného postupného riedenia Po 1 hodinovej inkubácii sa platne znovu premyli s TBS a inkubovali s pevnou fázou králičieho séra potiahnutého kozími protilátkami proti ľudskému séru, IgG frakciou (Accurale Chemical and Scientific Corporation, Westbury N. Y., šarža #HO36), obsahujúca 1 % želatínu rýb riedenú 1 :1000 v TBS. Po 1 hodinovej inkubácii sa platne premyli s TBS a potom inkubovali s afinitnou chromatografiou purifikovanou králičou, protikozou protilátkou, IgG frakciou (konjugovaná chrenová peroxidáza HRP) (BioRad šarža #75312) riedenou 1:250 v TBS. Po 2 hodinovej inkubácii sa platne premyli s TBS. Komplex antigén-protilátkaHRP sa vizualizoval pomocou o-fenyldiamin-dichloridu (ODP - 26 mg/15 ml kyseliny citrónovej, pH 5,0). Bledožlté zafarbenie indikuje prítomnosť antigénu, obzvlášť sérových proteínov. Ich absorbancia bola odčítaná pomocou prístroja Molecular Devices Diermomax Microplate reader, pri 490 nm.

Vzorky normálneho ľudského séra v duplikátoch (Dimension Laboratories Inc., Mississauga, Ontario, šarža # 30317), purifikovaný hemoglobín HbAo zo Sigma Corporation (H0267), purifikovaný HbAo z Walter Reed Army Inštitúte of Research (WRAIR) (šarža #92092) a purifikovaný HbAo z tohto vynálezu sa testovali. Výsledky sú sumarizované v tabuľke 9. Je zrejmé, že produkt tohto vynálezu obsahuje nie viac ako 0,0004 % sérových proteínov, zatiaľ čo iné testované vzorky sú v tomto ohľade aspoň o jeden rád vyššie.

Tabuľka 9

Vzorka	Obsah sérových proteínov (hmotn. % v prepočte na Hb)	Sérové proteiny v prepočte miligram na ml roztoku
HbAo z tohto vynálezu (Roztok s celkovým obsahom 8% Hb)	0,0004 %	0,000328 mg/ml
WRAIR HbAo (Roztok s celkovým obsahom 6,7 % Hb)	0,0039 %	0,00263 mg/ml
SIGMA HbAo (Roztok s celkovým obsahom 1,1 % Hb)	0,0029 %	0,000328 mg/ml

Vo všetkých vykonaných stanoveniach jediným detegovaným proteínom v produkte podľa tohto vynálezu bol ľudský sérový albumín. Sérové proteiny, ktoré sa našli v iných konkurenčných produktoch, zdá sa, že sú heterogénnou zmesou zahŕňajúcou HSA a ďalšie sérové proteiny.

Literatúra

1. HESS a spol., „Systemic & Pulmonary Hypertension After Resuscitacion with Cell-Free Hemoglobín“ 1993.

2. Chang a spol., „Effect of single Replacement...“, BIOMAT, Art Cells and Immob. Biotech. 20(2-4), pp. 503 - 510, (1992).

3. Simori a spol., „Reaction of Human Endothelial Cells to bovine Hemoglobín Solutions and Tumor Necrosis Factor“,

4. Huisman a spol., „Studies on the Heterogeneity of Hemoglobins. IX - The Use of Tris-Hcl Buffers in the Anión -Exchange Chromatography of Hemoglobins“, J. Chromatog.. 19.160 - 169, (1965).

5. Savavis a Zamcheck

6. Tabata a Chang, Artificial Organs, 6 213 - 214 (1982).

7. Wigger, C. J., „Physiology of Shock“, New York, The Common Fund, pp 138-139 (1950).

8. Keipert a Chang, „Effects of partial ...“, Vox. Sang 53.7 - 14 (1987).

9. Biessels a spol., Annual Report of the Karí Landsteiner Foundation, 1991.

10. Leeksma a spol.. Blood 67: 650 - 654,1986

11. Gerrits a spol.. Thromb. Res 5:197,1974.

12. Buttler, J. E., ELISA and other Solid Phase Immunoassays, edited by M. Kemeny and S. J. Challacombe, John Wiley and Sons Ltd, 1988, pp 1-180.

Claims (11)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob separácie vopred vybraného druhu hemoglobínu z nepurifikovaného roztoku hemoglobínu, obsahujúceho kontaminujúce proteínové substancie, vyznačujúci sa tým, že v prvom chromatografickom stupni sa naplní chromatografická kolóna nepurifikovaným roztokom a podrobí sa chromatografii buď za podmienok aniónovej výmeny, pri ktorej zložky nepurifikovaného roztoku kyslejšie než vopred vybraný druh hemoglobínu, majú lepšiu väzbovú afinitu, alebo za podmienok katiónovej výmeny, pri ktorej zložky nepurifikovaného roztoku zásadnejšie než vopred vybraný druh hemoglobínu, majú lepšiu väzbovú afinitu, potom sa pokračuje v plnení nepurifikovaným roztokom v prvom chromatografickom stupni až pokiaľ kolóna je úplne naplnená s hemoglobínovými druhmi a zložkami vyššej afinity, na čo sa ďalej pokračuje v plnení kolóny nepurifikovaným roztokom v prvom chromatografickom stupni, aby sa dosiahlo preplnenie kolóny a následne vytesnenie hemoglobínových druhov z nej, potom sa v druhom chromatografickom stupni naplnila chromatografická kolóna eluátom z prvého stupňa, ktorý obsahuje hemoglobínové druhy a podrobí sa chromatografii za podmienok aniónovej výmeny alebo katiónovej výmeny, ktoré neboli vybrané pre prvý stupeň, ďalej sa pokračovalo v plnení uvedeného eluátu v druhom chromatografickom stupni až sa kolóna naplní hemoglobínovými druhmi a zložkami s vyššou afinitou ako bolo uvedené pri podmienkach druhého stupňa, potom sa pokračovalo v plnení uvedeného eluátu v druhom chromatografickom stupni, až sa dosiahlo preplnenie a následne sa z neho vytesnili hemoglobínové druhy.
2. 2. Spôsob podľa patentového nároku 1, vyznačujúci sa tým, že prvý stupeň sa uskutočňuje ionexovou chromatografiou na anexe a druhý stupeň ionexovou chromatografiou na katexe.
3. 3. Spôsob podľa patentového nároku 2, vyznačujúci sa tým, že vopred vybraný druh hemoglobínu je ľudský hemoglobín dospelého jedinca HbAo.
4. 4. Spôsob podľa patentového nároku 3, vyznačujúci sa tým, že prvý stupeň spôsobu výmeny aniónov sa uskutočňuje pri pH 7 až 10 s použitím plniaceho roztoku s vodivosťou nižšou ako 3 mS.
5. 5. Spôsob podľa patentového nároku 4, vyznačujúci sa tým, že prvý stupeň spôsobu výmeny aniónov sa uskutočňuje pri pH 8,5 až 9,0 s použitím plniaceho roztoku s vodivosťou nižšou ako 1 mS.
6. 6. Spôsob podľa patentového nároku 4, vyznačujúci sa tým, že plniaci roztok sa plní do kolóny rýchlosťou do 10 cm za minútu.
7. 7. Spôsob podľa patentového nároku 6, vyznačujúci sa tým, že plniaci roztok má koncentráciu v rozsahu 0,1 až 20 hmotn. %.
8. 8. Spôsob podľa patentového nároku 4, vyznačujúci sa tým, že druhý stupeň, ionexová chromatografia na katexe sa uskutočňuje pri pH 6,5 až 8,5 s použitím plniaceho roztoku s vodivosťou nižšou ako 3 mS.
9. 9. Spôsob podľa patentového nároku 8, vyznačujúci sa tým, že druhý stupeň, ionexová chromatografia na katexe sa uskutočňuje pri pH 7 až 7,5 s použitím plniaceho roztoku s vodivosťou nižšou ako 1 mS.
10. 10. Spôsob podľa patentového nároku 8, vyznačujúci sa tým, že plniaci roztok sa plní v druhom stupni na kolónu s katexom rýchlosťou do 10 cm za minútu.
11. 11. Spôsob podľa patentového nároku 8, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia plniaceho roztoku pre druhý stupeň kolóny s katexom je od 2 až 6 hmotn. %.