CZ287589B6 - Process of separating a preselected hemoglobin species from a crude solution thereof - Google Patents
Process of separating a preselected hemoglobin species from a crude solution thereof Download PDFInfo
- Publication number
- CZ287589B6 CZ287589B6 CZ19951287A CZ128795A CZ287589B6 CZ 287589 B6 CZ287589 B6 CZ 287589B6 CZ 19951287 A CZ19951287 A CZ 19951287A CZ 128795 A CZ128795 A CZ 128795A CZ 287589 B6 CZ287589 B6 CZ 287589B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- hemoglobin
- column
- solution
- hbao
- chromatography
- Prior art date
Links
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 title claims abstract description 192
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 title claims abstract description 192
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 83
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 35
- 239000012045 crude solution Substances 0.000 title claims description 14
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 69
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 57
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 38
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 22
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 18
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims description 16
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims description 13
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 claims description 12
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 11
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 17
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 17
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 14
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 43
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 43
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 23
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 23
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 21
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 20
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 19
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 17
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 17
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 17
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 16
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 16
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 15
- 239000003633 blood substitute Substances 0.000 description 14
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 13
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 13
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 11
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 10
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 10
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 10
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 9
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 230000004872 arterial blood pressure Effects 0.000 description 9
- 238000002086 displacement chromatography Methods 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 108010001708 stroma free hemoglobin Proteins 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 8
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 8
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- JWICNZAGYSIBAR-LEEGLKINSA-N (4s)-4-[[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-aminopropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]acetyl]amino]-5-[[2-[[(2s)-3-carboxy-1-[[(2s)-1-[[1-[[(2s)-1-[[(2s)-4-carboxy-1-[[2-[[2-[[2-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-4-(diaminomethylideneamino Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N)CC1=CC=CC=C1 JWICNZAGYSIBAR-LEEGLKINSA-N 0.000 description 7
- INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 2-(furan-2-yl)-7-methyl-1h-1,8-naphthyridin-4-one Chemical compound N=1C2=NC(C)=CC=C2C(O)=CC=1C1=CC=CO1 INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 101800000974 Fibrinopeptide A Proteins 0.000 description 7
- 102400000525 Fibrinopeptide A Human genes 0.000 description 7
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 7
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 7
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 7
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 7
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 6
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 6
- -1 polyalkyleneamines Polymers 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 238000002146 exchange transfusion Methods 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010064719 Oxyhemoglobins Proteins 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 229940124572 antihypotensive agent Drugs 0.000 description 3
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 3
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 3
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 3
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 3
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 3
- 210000001624 hip Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 3
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 3
- 239000005526 vasoconstrictor agent Substances 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 2
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 2
- 208000032456 Hemorrhagic Shock Diseases 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010049771 Shock haemorrhagic Diseases 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 239000012500 ion exchange media Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DSLBDPPHINVUID-REOHCLBHSA-N (2s)-2-aminobutanediamide Chemical compound NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DSLBDPPHINVUID-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WXHLLJAMBQLULT-UHFFFAOYSA-N 2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]-2-methylpyrimidin-4-yl]amino]-n-(2-methyl-6-sulfanylphenyl)-1,3-thiazole-5-carboxamide;hydrate Chemical compound O.C=1C(N2CCN(CCO)CC2)=NC(C)=NC=1NC(S1)=NC=C1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1S WXHLLJAMBQLULT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 5-fluoro-3-(3-oxo-1h-2-benzofuran-1-yl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1C(F)=CNC(=O)N1C1C2=CC=CC=C2C(=O)O1 LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 241001631457 Cannula Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010044495 Fetal Hemoglobin Proteins 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 239000001828 Gelatine Substances 0.000 description 1
- 102000028180 Glycophorins Human genes 0.000 description 1
- 108091005250 Glycophorins Proteins 0.000 description 1
- 102100027685 Hemoglobin subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 108091005902 Hemoglobin subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 241000709701 Human poliovirus 1 Species 0.000 description 1
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 206010021137 Hypovolaemia Diseases 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000008299 Nitric Oxide Synthase Human genes 0.000 description 1
- 108010021487 Nitric Oxide Synthase Proteins 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000012518 Poros HS 50 resin Substances 0.000 description 1
- ULQISTXYYBZJSJ-UHFFFAOYSA-N R-12-HOA Natural products CCCCCCC(O)CCCCCCCCCCC(O)=O ULQISTXYYBZJSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 102000005890 Spectrin Human genes 0.000 description 1
- 108010019965 Spectrin Proteins 0.000 description 1
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 206010047139 Vasoconstriction Diseases 0.000 description 1
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 210000002376 aorta thoracic Anatomy 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 230000005889 cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 238000007813 chromatographic assay Methods 0.000 description 1
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 238000007821 culture assay Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000066 endothelium dependent relaxing factor Substances 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 230000001435 haemodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 1
- 230000000004 hemodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 108010036302 hemoglobin AS Proteins 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 230000001631 hypertensive effect Effects 0.000 description 1
- 210000003090 iliac artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002843 lactate dehydrogenase assay Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N norethisterone Chemical compound O=C1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011020 pilot scale process Methods 0.000 description 1
- 239000003058 plasma substitute Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 1
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000018883 protein targeting Effects 0.000 description 1
- 208000002815 pulmonary hypertension Diseases 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 229920000260 silastic Polymers 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000010572 single replacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 229940108519 trasylol Drugs 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000025033 vasoconstriction Effects 0.000 description 1
- 230000003639 vasoconstrictive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002618 waking effect Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/42—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the development mode, e.g. by displacement or by elution
- B01D15/422—Displacement mode
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Způsob oddělování hemoglobinových druhů ze surového roztoku hemoglobinu
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu oddělování hemoglobinových druhů ze surového roztoku hemoglobinu obsahujícího jako nečistoty proteinové látky.
Dosavadní stav techniky
Vývoj náhrad krve na bázi hemoglobinu je stále v popředí obchodného zájmu a nejnovější vývoj ukázal, že hemoglobin ze savčích krevních buněk, po vhodné úpravě, jako je mezibuněčné zesítění a v některých případech polymerace, je velmi slibnou bází pro náhrady krve. S pokračujícím vývojem se však ukázalo, že trvale vzrůstají požadavky na čistotu hemoglobinu. V jednu chvíli se mělo zato, že hemoglobin musí být jednoduše prost vazivové tkáně, což je stav dosahovaný promýváním a mírným lyžováním červených krvinek s následnou filtrací lyzátu. Následně se zjistilo, že přítomnost stopových zbytků nečistot, jako jsou fosfolipidy, vede ke specifičtějším reakcím, například ke zužování cév, při pokusech na zvířatech. Ani když byl výrobek podroben několikastupňové diafiltraci, obsahuje stále nepřijatelně vysoké stopy potenciálně škodlivých nečistot, jako jsou erythrocytové enzymy, modifikované a variantní formy hemoglobinu, fosfolipidy a povrchové antigeny.
Jednou z nejnaléhavějších výzev v oboru náhrad krve, specificky nosičů kyslíku na bázi hemoglobinu, je vyvinout cenově schůdné procesy pro účinné a ekonomické čištění hemoglobinu v provozním měřítku. Musí účinně konkurovat ostatním potenciálním látkám zvětšujícím objem plazmy a kapalným nosičům kyslíku navrhovaným k použití jako náhrady krve.
Zatímco při analytických separacích je významná doba rozlišovací a trvání analýzy, jsou rozhodujícími parametry v preparativní chromatografíí pro provozní nebo poloprovozní použití:
- množství materiálu izolovaného v jednotce času, při specifické úrovni čistoty (prosazení) a
- ekonomie procesu, jako jsou rozměry kolon, prostředí, pufry, zařízení, recyklování a opětné využití reakčních činidel a pod.
Nejsou popsány způsoby čištění hemoglobinu, které by vyhovovaly kritériím pro nákladově účinný výrobní proces.
Náhrada krve na bázi hemoglobinu musí být založena buď na jediné formě hemoglobinu, nebo je-li přítomno více forem, na pečlivě řízeném složení známých forem hemoglobinu. Podle toho má být úspěšný způsob čištění hemoglobinu schopen oddělovat jednotlivé formy hemoglobinu jednu od druhé, stejně jako oddělovat žádanou formu hemoglobinu od znečištěnin červených krvinek, jako jsou erythrocytové enzymy, proteiny, fosfolipidy a protilátky.
K čištění hemoglobinových roztoků bylo použito chromatografických metod. V americkém patentovém spise číslo 4 925474 (Hsia a kol.) se popisuje použití afinitní chromatografie k čištění hemoglobinu za použití sloupců, v nichž ligand vykazující preferenční vazebnou afinitu k DPG místu v hemoglobinu se váže na stacionární fázi sloupce.
Techniky ionexové chromatografie bylo také použito k čištění hemoglobinu. Základní principy ionexové chromatografie jsou dobře známy. Směs rozdílných látek v roztoku se aplikuje na vhodně upravený ionexový sloupec. Každá z těchto látek ve směsi má jinou afinitu k chemickým reakčním skupinám sloupce. Měněním podmínek sloupce, například hodnoty pH roztoku, se mohou jednotlivé látky uspořádat tak, aby se selektivně vázaly nebo eluovaly ze sloupce tak, aby se jedna látka oddělila ze směsi. Použití techniky čištění proteinů jako je hemoglobin je
-1 CZ 287589 B6 ekonomicky neatraktivní, kromě případů, kdy se jí použije k operacím v malém měřítku a pro analytické účely. Má-li být hemoglobin čištěn v provozním měřítku, pro použití například jako kyslík přinášející resuscitační kapaliny (náhrady krve), je tato technika při běžném použití nepraktická. Množství hemoglobinu, jež by se mělo absorbovat a potom eluovat z chromatografického sloupce je tak velké, že požadavky na rozměry sloupce by byly neproveditelně velké a nákladné.
Christensen a kol., J. Biochem Phys. 17 (1988), str. 143 až 154, popisuje chromatografické čištění lidského hemoglobinu. Použitá metodika představuje standardní ionexovou chromatografíi, která neumožňuje ekonomické rozšíření na provozní měřítko.
Winslow a Chapman, „Pilot-Scale Preparation of Hemoglobin Solutions“ (Příprava hemoglobinových roztoků v poloprovozním měřítku), v knize Methods in Enzymology sv. 231, str. 3 (1994) popisuje přípravu hemoglobinu prostého podpůrné vazivové tkáně („stroma free hemoglobin“ = SFH), vysoce vyčištěného hemoglobinu AO a zesítěného hemoglobinu při použití prošlé lidské krve jako výchozí látky. SFH se připraví filtrací. Hemoglobin AO se připravuje z SFH způsobem stupňovité chromatografie za použití silného anexového prostředí a silného iontového gradientu.
Jak Cristensen a kol., tak Winslow a kol. referují o práci provedeného v ústavu Letterman Army Institute for Research (LAIR), dnes známém jako Walter Reed Army Institute of Research.
V americkém patentovém spise číslo 5 084588 (Rausch a Feola, Biopure) se popisují standardní anexové a katexové chromatografické způsoby pro oddělování a čištění hemoglobinu. V případě anexové chromatografie se uvádějí tři standardní přístupy:
a) vázáni Hb při zvýšené hodnotě pH a eluování s klesajícím gradientem hodnoty pH nebo stupňovitým gradientem s nižší hodnotou pH,
b) vázání Hb při vysoké hodnotě pH, nízké iontové pevnosti a eluování s nižším solným gradientem,
c) plnění za podmínek hodnoty pH, kdy se hemoglobin neváže na anex, ale prochází sloupcem nezadržen, zatímco nečistoty (kyselejší nečistoty) se na sloupci zachycují.
Přístupy a) a b) byly rozsáhle dokumentovány, nejsou však atraktivní pro velkoprovozní výrobu, vzhledem k nedostatku nízkých náplňových kapacit, potřebných k dosažení postačujícího rozlišení hemoglobinových produktů. Tyto plnicí kapacity jsou obvykle pouze 20 až 30 mg/ml a vyžadují nemožně velké a nákladné kolony pro komerční čištění hemoglobinu. Například jediná 50 mg dávka nosiče kyslíku na bázi hemoglobinu (HBOC) by vyžadovala sloupec 1,5 až 2,5 litrový.
Ačkoli se přístup c) jeví zpočátku jako nejvýhodnější, v praxi se ukazuje, že chromatografické vlastnosti normálního lidského dospělého nemodifikovaného hemoglobinu AO a některé jeho hlavní nečistoty, jako HbAlc, nejsou dostatečně odlišné pro praktickou aplikaci tohoto přístupu.
Standardní přístupy ke katexové chromatografií savčího hemoglobinu mají podobná omezení.
V americkém patentovém spise 5 084588 se také uvádějí roztoky hovězího hemoglobinu, kde více než 99,9 % přítomného proteinu je hovězí hemoglobin, neuvádějí se však identifikační data proteinových látek.
Úkolem tohoto vynálezu je poskytnout nový chromatografický způsob čištění hemoglobinu.
-2CZ 287589 B6
Je rovněž úkolem vynálezu zajistit chromatografický proces, schopný poskytovat v provozním měřítku a ekonomicky přijatelným způsobem hemoglobin ve vodném roztoku s čistotou přesahující 99 % z jeho znečištěného vodného roztoku obsahujícího nejméně 60 % hemoglobinu.
Dalším specifičtějším úkolem vynálezu je zajistit v provozních množstvích vodný roztok hemoglobinu nebo zesítěného hemoglobinu, v němž hemoglobin nebo zesítěný hemoglobin tvoří nejméně 99 % roztoku a je v čistém stavu a je-li ho použito jako náhrady krve, vykazuje in vivo vlastnosti dosud nezveřejněné.
Podstata vynálezu
Způsob oddělování hemoglobinových druhů z jeho surového roztoku obsahujícího jako nečistoty proteinové látky spočívá podle vynálezu v tom, že se v prvním chromatografickém stupni vnáší surový roztok na chromatografický sloupec a podrobuje se chromatografii buď za podmínek výměny aniontů, kdy kyselejší složky surového roztoku než předem zvolený hemoglobin mají ke sloupci větší vazebnou afinitu, nebo za podmínek výměny kationtů, kdy zásaditější složky surového roztoku než předem zvolený hemoglobin mají ke sloupci větší vazebnou afinitu; pokračuje se ve vnášení surového roztoku do prvního chromatografického stupně, dokud není sloupec plně vytížen hemoglobinovými druhy a složkami s větší afinitou;
dále se pokračuje ve vnášení surového roztoku do prvního chromatografického stupně k přetížení sloupce a k následnému vytěsnění hemoglobinových druhů ze sloupce;
ve druhém chromatografickém stupni se vnáší eluant obsahující hemoglobinové druhy z prvního stupně na chromatografický sloupec a podrobuje se chromatografii za podmínek aniontové výměny nebo kationtové výměny nezvolené pro první stupeň;
dále se pokračuje ve vnášení eluantu do druhého chromatografického stupně, dokud není sloupec plně vytížen hemoglobinovými druhy a složkami s větší afinitou za podmínek tohoto druhého stupně;
dále se pokračuje ve vnášení eluantu do druhého chromatografického stupně k přetížení sloupce a k následnému vytěsnění hemoglobinových druhů ze sloupce.
Podle vynálezu se tedy vodný roztok předem selektovaných hemoglobinových druhů, Hb, kde Hb tvoří přibližně 60 až 99 % rozpuštěného materiálu, podrobuje dvoustupňové ionexové chromatografii. Jedním stupněm je anexová chromatografie a druhým stupněm je katexová chromatografie. Oba typy ionexové chromatografie lze provádět v libovolném pořadí. Surový roztok předem selektovaných hemoglobinových druhů, například HbAO, se vnese do prvního stupně chromatografie, například anexové chromatografie, za podmínek zvolených tak, aby všechny složky smíšeného roztoku se napřed adsorbovaly na pevné fázi chromatografického sloupce. Při anexové chromatografii to vyžaduje poměrně vysokou hodnotu pH. Podmínky se volí také tak, aby bylo dosaženo velmi vysokého účinného vytížení sloupce, použitím nízké iontové pevnosti vnášeného roztoku, což vede k situaci, kdy v podstatě všechny dostupná místa pevného chromatografického média jsou obsazena druhy plnicího roztoku. Eluát, shromážděný v tomto stupni, je zbaven proteinového produktu. Vytěsnění HbAO a nečistot, majících nižší afinitu ke sloupci za zvolených podmínek, se pak dosahuje plněním přídavných objemů vodného plnicího roztoku jak shora uvedeno. Takto dosažený stav, zde nazývaný stav přetížení, způsobí, že znečišťující látky, mající větší afinitu ke sloupci, vytěsní zvolený Hb a látky mající menší afinitu ke sloupci se ze sloupce eluují. Je-li tímto prvním stupněm chromatografické separace anexová chromatografie, absorbují se nečistoty, jež jsou kyselejší než zvolený druh Hb, na pevné fázi chromatografického sloupce a jsou tak odděleny od zvoleného druhu Hb, který se objeví v eluátu spolu se zásaditějšími nečistotami. V případě, že se zvolí katexová chromatografie jako první stupeň, oddělí se zásaditější nečistoty s větší afinitou ke sloupci, přičemž se v eluátu objeví kyselejší nečistoty a zvolený druh hemoglobinu.
Pak se ve druhém chromatografickém stupni podle vynálezu provede druhý iontoměničový chromatografický krok, na částečně vyčištěném hemoglobinovém druhu obsaženém v eluátu
-3CZ 287589 B6 z prvního sloupce, za odlišných podmínek hodnoty pH. Jestliže eluát z prvního stupně obsahuje hemoglobinové druhy a zásaditější složky, je druhým stupněm chromatografie katexová chromatografie a naopak. Tento nečistý roztok se opět vnáší do druhého sloupce dokud se nedosáhne a nepřekročí saturační plnění, takže se vytvoří ve sloupci stav přetížení. Ve stavu přetížení je zvolený druh hemoglobinu eluován ze sloupce vytěsněním způsobeným nečistotami s větší afinitou za zvolených podmínek a hemoglobinový druh je tak shromažďován v eluátu z druhého sloupce, ve velmi vysokém stupni čistoty. Proces podle vynálezu lze tudíž obecně nazývat „dvoustupňová samočinně vytěsňující chromatografie“.
Výsledkem je, že se druh Hb ze sloupce eluuje, ve výjimečně čisté formě, normálně v čistotě přesahující 99 % a v obchodně atraktivním výtěžku. Nečistoty kyselejší než zvolený druh Hb zůstávají vázány na pryskyřici jednoho sloupce a nečistoty zásaditější než zvolený druh Hb zůstávají vázány na pryskyřici druhého sloupce. Sloupce lze snadno regenerovat tradičními čisticími a regeneračními postupy.
Významným činitelem při úspěšném provádění způsobu podle vynálezu, zvláště ve velkém výrobním měřítku, je selektivní vysoké vytěžování sloupců nečistotami, umožňující eluování druhů Hb.
Je-li způsobu podle vynálezu použito k čištění lidského hemoglobinu AO, vytvoří se nový lidský hemoglobin, který má složení a vlastnosti dosud nepublikované. Tohoto hemoglobinového produktu se vynález rovněž týká, nezávisle na dosud popisovaném způsobu čištění. Tento výrobek má vysoce žádoucí vlastnosti a charakteristiky dosud neznámé nebo nepopisované v souvislosti s jakýmkoli výrobkem lidského hemoglobinu AO a obzvlášť blahodárné v souvislosti sjeho použitím jako náhrady krve. Mezi tyto vlastnosti patří v podstatě úplná nepřítomnost virových částic, jmenovitě částic lipidy zapouzdřených virů; v podstatě chybějící účinek na cévy při podávání výrobku in vivo; nejedovatost vůči endotheliálním buňkám při inkubaci in vitro, projevující se sníženým uvolňováním laktátové dehydrogenázy ve srovnání s podobným podáváním jiných hemoglobinových preparátů. Kromě toho, z pohledu standardních žádoucích vlastností hemoglobinu k použití jako náhrada krve, jako je nepřítomnost endotoxinů a nepřítomnost jiných pyrogenů, jsou výroby podle vynálezu také zlepšeny oproti jiným známým hemoglobinovým preparátům.
Vynález blíže objasňují přiložené obrázky:
na obr. 1 je schematické znázornění anexové části výhodného provedení vynálezu, na obr. 2 je podobné znázornění druhé, katexové části výhodného provedení podle vynálezu, na obr. 3 je analytický chromatogram výměny aniontů odvozený z příkladů 2 a 3, na obr. 4 je analytický chromatogram výměny kationtů odvozený z příkladu 4, na obr. 5 je grafické znázornění výsledků z příkladu 8, na obr. 6 je kopie záznamu na isoelektricky zaostřené pásky analýzy výrobků z příkladu 13, na obr. 7 je kopie výsledků pokusů barvení a filtrování z příkladu 13, na obr. 8 je grafické znázornění výsledků podle z 14, na obr. 9 a 9A je grafické znázornění výsledků z příkladu 15, na obr. 10 je grafické znázornění výsledků z příkladu 16.
Vytěsňovací chromatografie, nebo vytěsňovací eluování, jak se běžně nazývá, je známou technikou v oboru separace proteinů. Je to jeden ze tří způsobů, jimiž se vzorek získává z chromatografického sloupce. Je-li ho použito k oddělování příslušných proteinů ze směsi proteinů v roztoku, vytěsňují proteiny s vyšší afinitou proteiny s nižší afinitou na matrici, takže hierarchie proteinů ve sloupci klesá s klesajícím řádem afinity od vstupu k výstupu. Vytěsňují-li proteiny jiné proteiny, vyskytuje se zřídka kdy ostrá demarkační čára mezi druhy. Aplikace této techniky k přípravě vysoce čistých roztoků jediného proteinu, jako je hemoglobin je tudíž kontraindikativní. Zvolí-li se separátní neproteinové vytěsňovací druhy, může být výsledkem, že
-4CZ 287589 B6 chromatografícká matrice na sebe naváže materiály mající velmi vysokou afinitu, což se velmi obtížně regeneruje k opětnému použití.
Hlavní komerční využití vykazuje způsob podle vynálezu v přípravě vyčištěného dospělého lidského hemoglobinu Ao (HbAo) a je proto pro jednoduchost popisován podrobně ve vztahu kněmu. Proces se však neomezuje na čištění HbAo, ale je dodatečně použitelný na jiné hemoglobinové druhy, jako jsou vybrané zesítěné hemoglobinové deriváty, vybrané varianty hovězího hemoglobinu, jiné varianty hemoglobinu, jako je například plodový hemoglobin, hemoglobin srpkovitých buněk a hemoglobin získaný genetickým inženýrstvím.
Způsob podle vynálezu je extrémně atraktivní obchodně, k použití na čištění hemoglobinu HbAo v provozním měřítku k výrobě krevních náhrad. Poskytuje velmi vysoké účinné kapacity zatížení sloupce. V důsledku toho může využívat kolon poměrně malých rozměrů k čištění poměrně velkých objemů nečistého hemoglobinového roztoku. Postup může probíhat po dávkách nebo kontinuálně k vyčištění dávky hemoglobinového roztoku získaného z červených krvinek standardními technikami, roztoků, které normálně obsahují řádově 80 % hemoglobinu jak proteinového, tak neproteinového. Kromě toho se samotného nečistého hemoglobinového roztoku používá jako vytěsňovacího média. Tím je umožněno vyhnout se opatřování a používání samostatného vytěsňovadla s jeho očekávanou nevhodností, komplikacemi a náklady.
Typický celkový proces výroby čištěného roztoku HbAo podle tohoto vynálezu vychází z normálních dospělých lidských červených krvinek. Ty se nechají usadit a případně se podrobí filtraci k odstranění leukocytů. Krvinky se promyjí k odstranění sérových proteinů a lysují se k extrahování hemoglobinu a ostatních buněčných složek. Lysát se zfiltruje k odstranění krvinkových membrán a pak se výsledný hemoglobinový roztok diafiltruje a zkoncentruje. Nečistý hemoglobinový extrakt se zpracuje oxidem uhelnatým za vytvoření komplexu CO-Hb a zahřeje se k pasteraci, čímž se inaktivují virové nečistoty v roztoku. Pak se odstředí a zfiltruje k odstranění dalších zbytků a buněčných zlomků. Nyní je připraven k podrobení procesu samočinného vytěsňování podle tohoto vynálezu.
Podle výhodného provedení způsobu podle vynálezu je prvním stádiem chromatografického procesu výměna aniontů a druhým stádiem je výměna kationtů. Tento první proces výměny aniontů probíhá s výhodou při vysoké hodnotě pH, například při hodnotě pH 7 až 10 a s výhodou při hodnotě pH 8,5 až 9,0 a za podmínek nízké iontové pevnosti, to je nízké vodivosti. Vodivost je vhodně nižší než 3 mS (mili Siemens) a výhodně nižší než 1 mS. Takové podmínky zahrnují v podstatě soli prostý pufr. Požadované druhy HbAo se napřed váží za těchto podmínek na médium sloupce, spolu se všemi ostatními druhy. Když vnášení roztoku nečistého HbAo do sloupce pokračuje, pak druhy, vykazující vyšší afinitu k matrici než HbAo, typicky kyselejší nečistoty, vytěsní postupně HbAo a zásaditější nečistoty ze sloupce. Případně se dosáhne přetížení sloupce, takže veškerý HbAo a zásaditější nečistoty se vytěsní, přičemž ponechají ke sloupci vázané pouze kyselejší nečistoty. Ve většině případů je toto zatížení daleko větší než doporučuje výrobce sloupce. V tomto stádiu se tudíž dosáhne chromatografického oddělení kyselejších nečistot od HbAo.
Pomalou průtočnou rychlostí nepřesahující 10 cm za minutu a s výhodou přibližně 1 cm za minutu se zavede náplň nečistého hemoglobinového roztoku. To umožní kinetické vyvážení sloupce. Rozsah koncentrace vnášeného roztoku není rozhodující, avšak vhodný je rozsah 0,1 až 20 %, s výhodou 2 až 7 %.
Dosažení stavu přetížení lze sledovat analýzou sloupcového eluentu - nevykazuje-li složení eluentu žádné kyselé nečistoty, nebo jenom jejich stopy, bylo dosaženo prakticky maximálního zatížení sloupce.
Na přiloženém obr. 1 je formou diagramu znázorněna část anexového procesu podle vynálezu. Iontoměničový sloupec mající chemické skupiny -N+R3 (typické pro anexové pryskyřice, avšak
-5CZ 287589 B6 pouze jako příklad) znázorněný ve stavu A procesu na obr. 1, je plněn roztokem obsahujícím směs druhů s kyselejšími nečistotami představovanými hvězdičkami, elipsami znázorňujícími HbAo a obdélníčky představujícími zásaditější nečistoty. Při zatížení na kapacitní stav B, jsou elektrostatickým nábojem v podstatě všechny aktivní chemické skupiny N-R3 sloupce vázány na jeden z druhů obsažených ve směsi.
K dosažení přetíženého stavu sloupce se přivádí větší množství téhož roztoku, což je znázorněno stavem C na obr. 1. Nyní jsou všechny zásaditější nečistoty (obdélníčky) a něco HbAo (představovaného elipsami) ze sloupce vytěsněny kyselejší složkou (představovanou hvězdičkami), která vykazuje za těchto podmínek větší afinitu ke sloupci. Pokračuje vnášení ještě většího množství téhož roztoku do přetíženého sloupce k dosažení stavu D, znázorněného na obr. 1, při kterém kyselé druhy vytěsnily v podstatě veškerý HbAo ze sloupce vzhledem ke své větší afinitě za zvolených podmínek. Nyní neobsahuje eluent opouštějící sloupec v podstatě žádné detekovatelné množství kyselých nečistot. Získá se tudíž dosti čistý roztok HbAo, obsahující stále ještě zásaditější druhy (nečistoty).
Ve druhém stádiu výhodného způsobu podle vynálezu se používá katexového sloupce, do něhož se vnáší eluát z prvního sloupce k dosažení podobného přetíženého stavu. V přetíženém množství se váže žádaný HbAo a jiné, nežádoucí, zásaditější nečistoty. Pokračuje vnášení částečně vyčištěného hemoglobinového roztoku z prvního sloupce do sloupce druhého. Opět se použije pomalého vnášení, s výhodou lOcm/min nebo méně a výhodně 1 cm/min k umožnění kinetického vyvážení pevné a tekuté fáze. Hodnota pH eluátu z prvního sloupce se s výhodou nastaví na pH 5 až 9, výhodněji na pH 6,5 až 8,5 a nejvýhodněji na pH 7 až 8 před vnášením eluátu do katexového sloupce. Použije se nízké iontové pevnosti roztoku, to je vodivosti nižší než 3 mS, s výhodou nižší než 1 mS. Vodivosti 2,5 mS jsou užitečné pouze použije-li se velmi nízkých průtočných rychlostí a velmi vysokého zředění. Opět se použije podmínek přetížení. Proteinové nečistoty s větší afinitou, to je zásaditější než HbAo, vytěsní HbAo ze sloupce a HbAo je tudíž eluován a získán v mimořádně čisté formě.
Na přiloženém obr. 2 je formou diagramu podobně jako na obr. 1 znázorněna část katexového procesu podle vynálezu probíhající v katexovém sloupci, majícím skupiny SO3. Po vhodném nastavení hodnoty pH se do sloupce vnáší eluát z prvního sloupce a zpočátku, ve stavu A, se dosahuje kapacitního zatížení jak HbAo (elipsy), tak zásaditějšími nečistotami (obdélníčky) vázanými elektrostaticky k chemickým skupinám na sloupci. I když jsou tyto skupiny znázorněny jako skupiny sulfonové, lze stejně dobře zvolit jiné alternativy, jako například skupiny karboxylové. Vnášení eluátového roztoku do sloupce pokračuje až k dosažení přetíženého stavu znázorněného stavem B na obr. 2, kdy zásaditější nečistota, vzhledem ke své větší afinitě ke sloupci za těchto podmínek vytěsní HbAo ze sloupce. Při pokračujícím vnášení do přetíženého sloupce, znázorněném stavem C na obr. 2, je vytěsněno téměř 100 % HbAo a získá se v roztoku v podobě eluentu ze sloupce. Podle toho, čím je vyšší zatížení sloupce, tím větší je procento výtěžku vyčištěného HbAo ze sloupce. Eluát se sleduje k detekci zásaditých druhů (obdélníčky) v eluátu. Dalšího výtěžku HbAo vytěsněním ze sloupce se nedosáhne a maximální zatížení je v tomto okamžiku definováno.
Zde použitým pojmem zásaditější nečistoty se vždy míní nečistoty, které eluují ze sloupce při vyšší hodnotě pH, než jaká je potřeba k eluování HbAo. Naopak pojmem „kyselejší nečistoty“ se vždy míní takové nečistoty, které eluují ze sloupce při nižší hodnotě pH, než jaká je potřeba k eluování HbAo. Při výhodném způsobu podle vynálezu, kdy se provádí anexová chromatografie jako první, se zásaditější nečistoty eluují před HbAo a kyselejší nečistoty se eluují po HbAo. V závislosti na ionexových médiích, použitých ke chromatografii, lze pozorovat rozdílné eluční profily s malými změnami v pořadí eluování.
Jak u prvního, tak u druhého sloupce je třeba průtočné rychlosti roztoku nečistého hemoglobinu optimalizovat pro zvolenou koncentraci nečistého hemoglobinového roztoku. Pro hemoglobinové roztoky v koncentrovanějším rozmezí 2 až 7 % jsou optimální lineární průtočné rychlosti
-6CZ 287589 B6 cm/min nebo nižší. Průtočné rychlosti až 2 cm/min lze s úspěchem použít k rozlišení zředěnějších roztoků, například méně než 1 % Hb. Rozlišení u ionexové chromatografie při nízkých kapacitách zatížení je obvykle necitlivé na lineární průtočnou rychlost; avšak pro způsob podle vynálezu závisí kinetické vyvážení v průběhu chromatografie silně na průtočné rychlosti. Koncentrace vnášeného roztoku není však v žádném stádiu rozhodující.
Způsobem vytěsňovací chromatografie podle vynálezu, kde se používá napřed anexové chromatografie k odstranění kyselejších složek a pak katexové chromatografie k odstranění zásaditějších složek, lze dosáhnout vysokých výtěžků mimořádně čistého HbAo, v podstatě prostého detekovatelných množství jiných proteinů jako jsou sérové proteiny a membránové proteiny v provozním měřítku. Čistoty, zjišťované anexovou chromatografii, jsou vyšší než 99 % a obvykle přesahují 99,5 %. Efektivní kapacity stádií jsou nejméně o řád vyšší než kapacity pozorované při normálních chromatografických postupech. Vedle odstranění proteinových nečistot, umožňuje způsob podle vynálezu také v podstatě úplné odstranění modifikovaných a jiných nežádoucích forem hemoglobinu a poskytuje v podstatě čistý (>99,5 %) HbAo. Kromě toho, jak bude dále podrobněji popsáno, je možno dosahovat v podstatě úplného odstranění zapouzdřených virových částic, aktivních i inaktivováných.
Řádově vyšší přednosti způsobu podle vynálezu, ve srovnání s procesem používajícím standardní ionexové absorpčně/eluční chromatografie, ukazuje následující tabulka I. Čísla ve sloupci „samočinné vytěsnění“ jsou odvozena z dále popsaných pracovních příkladů způsobu podle vynálezu. Čísla ve sloupci „adsorpce/eluování“ jsou převzata ze zmíněného článku Winslowa a kol.
Tabulka I
Provozní parametry čištění hemoglobinu AO pomocí absorpčně/eluční chromatografie * ve srovnání s chromatografii samočinného vytěsňování
| Samočinné vytěsnění | Absorpce/eluování | |
| Objem sloupce | 5 a 3 1 | 1201 |
| Kapacita sloupce | 200 až 300 mg/ml | 15 mg/ml |
| g vneseného Hb | 1234 | 1818 |
| % výtěžku | 81 | 55 |
| g shromážděného Hb | 1000 | 1000 |
| objem pufru na průběh a | 1321 | 9001 |
* Winslow a Chapman citovaný shora.
Z těchto čísel vyplývá, že proces samočinného vytěsňování podle vynálezu může probíhat rychleji s rozumně malými sloupci. Může být provozován za podmínek nižšího tlaku a za teploty okolí. Lze dosáhnout efektivních kapacit plnění, jež jsou 10 až 20-krát větší než kapacity uváděné u konvenčních chromatografických procesů, což umožňuje použití relativně malých objemů sloupců. To vede ke sníženým požadavkům na vodu, sníženému ukládání odpadu a sníženým požadavkům na pufr, což vše významně zlepšuje komerční ekonomii procesu.
Vyčištěný hemoglobinový roztok, tvořící eluát z katexového sloupce, může být diafiltrován do zvoleného pufru a nastaven na požadovanou koncentraci HbAo.
Pokud jde o gelový ionexový materiál použitý při způsobu podle vynálezu jako stabilní fáze, není nic obzvlášť rozhodujícího. Volba závisí na znalostech pracovníka v oboru. Lze použít jakéhokoliv obchodně dostupného gelu za předpokladu, že ho lze snadno derivatizovat, aby fungoval ionexovým způsobem za zvolených podmínek afinity pro druhy, jež mají být separovány. Obecnými třídami nosičů iontoměničových médií jsou například makroporézní,
-7CZ 287589 B6 makromřížkové a neporézní typy, divinylbenzenem zesítěné polystyreny nebo polymetakryláty, polyalkylenaminy, celulóza, dextran, agaróza, oxid křemičitý, keramika, sklo, oxid hlinitý nebo kovové částice. Mezi obchodně dostupné nosiče patří media, například prodávaná pod obchodními názvy POROS, Fractogel, HyperD, Dowex, Amberlite, Duolite, Bio-Rex, Chelex, Sephadex, Sepharosa, Toyopearl, Macro-prep, Bio-protocol, Accell a Mono typy. Funkční skupiny, vázané k takovým nosičům pro účely výměny iontů, zahrnují například skupinu sulfonátovou, sulfopropylovou, karboxymethylovou, karboxylátovou, fosfoskupinu, quartemamí aminoskupinu, quartemí aminoethylovou skupinu, skupinu polyethyleniminovou, trimethylaminoethylovou, diethylaminoethylovou, dimethylaminoethylovou a aspartamidovou skupinu.
Způsob podle vynálezu lze provozovat také k vytváření roztoku HbAo o čistotě nejméně 99,5 % a neočekávaně prostého virových částic, aktivních nebo desaktivovaných, zejména v lipidech zapouzdřených virů, jako je HIV, herpes simplex virus (HSV) a hovězí diarrhea virus, který je v mnoha případech modelem pro virus lidské hepatitis C. To je jen několik nejzávažnějších a nejobtížnějších virů znečišťujících krev. Z použití tohoto vynálezu vyplývá další, velmi významná přednost, kterou nebylo možno předvídat, dokud nebyl proces vyzkoušen a výsledky analyzovány. I když výhodné postupy provádění způsobu podle vynálezu zahrnují pasteraci k inaktivaci virů, před čištěním, jak bylo shora popsáno, je odstranění virových části jako součást čisticího procesu obzvlášť výhodné. Z materiálu, sloužícího jako náhrada krve, odstraňuje veškeré aktivní virové částice, které mohly přežít pasteraci a jakékoli zbytkové inaktivované virové částice. Toho všeho lze dosáhnout bez použití přídavných kroků zaměřených specificky k odstraňování virových částic a bez přidávání jakýchkoli speciálních činidel nebo podobně za účelem odstranění virů. Dá se dosáhnout v podstatě úplného odstranění v lipidech zapouzdřených virů. Dosahuje se též významného snížení množství jiných virů.
Zjistilo se, že hemoglobinové produkty podle vynálezu mají vyšší stupeň čistoty než kterékoli dříve uváděné hemoglobinové produkty. Snad pro svůj výjimečný stav čistoty, nebo snad pro jejich jiné dosud ne zcela vysvětlené charakteristiky, vykazují produkty podle vynálezu neočekávané a vysoce výhodné vlastnosti, dosud u hemoglobinových produktů neuváděné, alespoň pokud jde o produkty vyráběné ve velkém měřítku.
Zvláště jsou produkty podle vynálezu HbAo, prosté všech membránových proteinů červených krvinek zjišťovaných isoelektrickým zaměřováním a analýzou „imunoblot“. Podle imunoabsorpční techniky jsou přítomna stopová množství lidského sérového albuminu (HSA) v míře menší než 4 pg a zpravidla 2 až 4 pg HSA/100 mg Hb. Jinými pouze občas zjistitelnými proteiny v produktech podle vynálezu jsou fragmenty a a β globinových řetězců hemoglobinu v množství nepřesahujícím 1 pg na 100 mg hemoglobinu. Při této mimořádně vysoké čistotě je produkt podle vynálezu jedinečný a vykazuje dále popsané neočekávané vlastnosti. Jednou z nich je snížené nebo zcela chybějící působení na zužování cév a skutečnost, že nejsou toxické vůči pěstovaným endotheliálním buňkám.
Uvedené vysoce vyčištěné hemoglobiny jak zesítěné, tak nezesítěné se projevují působením na krevní tlak při infuzi (Hess a kol., „Systemic & Pulmonary Hypertension Afiter Resuscitation with Cell-Free Hemoglobin“, 1993, Chang a kol., „Effect of Single Replacement..“ Biomat, Art Cells and Immob. Biotech, 20 (2-4), str. 503 až 510, 1992). Jelikož byly produkty tak vysoce vyčištěny, má se podle běžných teorií za to, že to musí být inherentní vlastností hemoglobinu samotného. Zvláště se mělo za to, že jde o schopnost hemoglobinu vázat oxid dusičný, který je za tento jev zodpovědný. Oxid dusičný, označovaný jako endotheliem odvozený relaxující faktor, je mocným rozšiřovatelem cév, syntetizovaný buňkami cévních výstelek intermediámí synthasou oxidu dusičného. Jelikož hemoglobinové molekuly vážou oxid dusičný s vysokou afinitou, vznikla domněnka, a dosud je běžně přijímána, že intravenosní infuze hemoglobinových roztoků, obzvláště roztoků nezesítěného hemoglobinu bude oddělovat oxid dusičný a vyvolávat hypertensní odezvu, se zúžením cév.
-8CZ 287589 B6
Poznatek, že výrobky podle tohoto vynálezu jsou prosty vasopresorové aktivity, na modelech isovolemické výměny a hemorragického šoku, je tudíž zcela neočekávaný a odporuje běžným teoriím a domněnkám, týkajících se vnitřních vlastností hemoglobinu. Tento vynález dokazuje, že to není plně vnitřní vlastnost hemoglobinu, která zodpovídá za jeho uvedenou vasostriktivní aktivitu, ale že alespoň zčásti je dána nečistotou, která je přítomna v extrémně malém množství a která nebyla dříve úspěšně odstraněna, přes zprávy o extrémně vysokých stupních čistoty dříve uváděných hemoglobinů.
Výhoda nepřítomnosti vasopresorové aktivity produktů podle vynálezu se uchovává u zesítěných a polymerovaných hemoglobinových výrobků získaných z produktů podle vynálezu, například postupem popsaným v běžně uváděném americkém patentovém spise číslo 08/231945 z 21. dubna 1994.
Kromě toho vykazují produkty podle vynálezu značně sníženou toxicitu vůči endotheliálním buňkám při podávání in vitro, ve srovnání s dříve uváděnými hemoglobiny. Studie, které dříve popisovaly oxyhemoglobinové roztoky, včetně chromatograficky čištěných hemoglobinů vykazovaly buněčné poškozování indikované významným nárůstem laktátové dehydrogenázy na médiu k pěstování endotheliálních buněk vůči úrovni laktátové dehydrogenáty v médiu řídícím kultury endotheliálních buněk. Laktátová dehydrogenáza je známkou buněčného poškozování. Tato toxicita byla opět považována a přijata za vnitřní vlastnost oxyhemoglobinu, jelikož zkušební roztoky obsahovaly oxyhemoglobin ve vysoce vyčištěném stavu (Simori a kol., „Reaction of Human Endothelial Cells to Bovine Haemoglobulin Solutions and Tumor Necrosis Factor“.
Mimo očekávání a významnou měrou bylo prokázáno, že hemoglobin podle vynálezu nezprostředkuje uvolňování laktátové dehydrogenázy. Na rozdíl od hemoglobinu podle tohoto vynálezu se pozorují u inkubace endotheliálních buněk s hemoglobinovými roztoky prostými vazivových buněk vyčištěnými jinými chromatografickými procesy významné nárůsty uvolňované laktátové dehydrogenázy.
Všeobecně se má zato a je to ve skutečnosti evidentní, že jakákoli náhrada krve a jakákoli složka nebo surovina pro náhradu krve by měla být dostatečně vyčištěná, tak, aby byla prosta nečistot, o kterých je známo, že jsou škodlivé. Mezi takové škodlivé nečistoty se například počítá buněčná vazivová tkáň, endotoxiny a jiné pyrogeny nehemoglobinové proteiny a fosfolipidy. O dřívějších náhradách krve se prohlašovalo, že jsou „v podstatě prosté“ jedné nebo více takových nečistot. Pojem „v podstatě prostý“ je však relativní, subjektivní pojem, jehož interpretace a vymezení závisí na způsobu stanovení použitých relevantních parametrů, popsaných v příslušném stavu techniky. Zlepšené čištění a analytické techniky vedly ke zprávám o náhradách krve a hemoglobinových produktech se stále vyšší úrovní čistoty. Například dřívější literatura obsahuje zprávy o hemoglobinových roztocích, v nichž více než 99,9 % přítomného proteinu je hemoglobin v jedné nebo v jiné formě (viz shora uvedený americký patentový spis číslo 5 084588, Rausch a kol.). V souladu s tímto vynálezem existuje domněnka, že ani tato čistota není postačující pro úspěšné náhrady krve, jelikož povaha zbytkových nečistot může způsobovat zužování cév a vykazovat buněčnou toxicitu.
Hemoglobin prostý vazivové tkáně, který je obchodním produktem společnosti Walter Reed Army Research Institute (WRAIR) a je všeobecně uznávaným průmyslovým standardem čistoty, může obsahovat velký počet (více než 10%) různých znečišťujících proteinů, z nichž mnohé jsou přítomny v množství menším než 0,01 % celkového proteinu. Ačkoli to je z povrchního pohledu velmi malé množství, je skutečností, že hemoglobin jako náhrada krve je podáván pacientům v poměrně velkém množství a je tudíž celkové množství podané nečistoty určující, zdaje či není škodlivá, nikoli její koncentrace v jakékoli podávané směsi. Jediná jednotka roztoku náhrady krve založená na hemoglobinu bude obsahovat 25 až 50 g hemoglobinu, takže 0,01 % nečistoty představuje 2,5 až 5 miligramů nečistoty. Mezi velmi rozmanitými přítomnými proteiny může dobře být jeden nebo dva, jež jsou extrémně škodlivé při takovém množství. Tímto vynálezem
-9CZ 287589 B6 jsou získávány hemoglobinové produkty, jež mají obsah nehemoglobinového proteinu pod 0,5 % a s výhodou pod 0,1 % a podle předpokladu nikoli však nutně, nevykazuje jako důsledek žádné škodlivé vasokonstriktivní účinky a žádnou významnou toxicitu vůči endotheliálním buňkám. Vynález také poskytuje způsob, jímž je možno takové hemoglobinové roztoky připravovat v obchodně atraktivním měřítku, jak bude níže popsáno.
Ještě jinou významnou výhodou výrobků podle tohoto vynálezu je jejich snížení prokoagulační aktivita. Zdá se, že v těchto výrobcích je velmi výrazně snížen obsah činidel, která podporují srážení krve ve srovnání s jinými vazivových tkání prostými dostupnými a prve uvedenými hemoglobinovými produkty.
Vynález je dále popsán pro ilustraci následujícími, vynález nikterak neomezujícími příklady.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Devadesát šest jednotek (přibližně 30 litrů) náplně červených krvinek („red blood cells“ - RBCs) stejného krevního typu se spojí a zředí se 24 litry 0,9% solankového roztoku. Vše se zfíltruje polypropylenovými filtry 20 pm a 8 pm k odstranění zbylých leukocytů.
Po odfiltrování leukocytů se RBCs promyjí 6 objemy 0,9 % solanky v konstantním objemu diafiltrací pomocí 3,5 m2 0,3 pm polyethersulfonových membrán z dutých vláken Sepracor. Promývací pufr se pak nahradí 50 mM tris lysovacím pufrem a RBC se postupně lysují 6 objemy tohoto lysovacího pufru.
Surový lysát se shromáždí a zkoncentruje z přibližně 2,5 % celkového hemoglobinu (Total Hemoglobin - THb) na přibližně 9,0 % THb pomocí 30K milipórové membrány PTTK (Molecular Weight Cut Off -MWCO). Po zkoncentrování se tank naplní plynným oxidem uhelnatým k převedení hemoglobinu na formu COHb. Lysát se pasterizuje při 62 ± 2 °C po dobu 10 hodin v opláštěném tanku. Pasterizovaný lysát se ochladí a pak se odstředí. Další hluboká filtrace filtry Millipore 0,8 pm připraví pasterizovaný lysát k diafiltrací na jiné milliporové PTTK membráně 30K. Materiál se diafiltruje 5 mM Tris pH 8,9 dokud jeho vodivost se nesníží na méně než 0,3 mS a hodnota pH je 8,9 ± 0,2. Pak se zředí na 4,5 -5 % THb a v tomto okamžiku je připraven k následujícímu chromatografickému čištění.
Příklad 2
Samočinně vytěsňovací chromatografie na anexové pryskyřici
Sloupec 1 x 10 cm naplněný anexovou pryskyřicí. PerSeptive Poros HQ-50 se promyje 4 objemy sloupce IN roztoku chloridu sodného a vyváží se 5 mM Tris pufru, s hodnotou pH 8,8. Po dosažení rovnováhy se vnese na sloupec průtočnou rychlostí 0,78 ml/min (1 cm/min) 50 ml 3,0% (3 g/100 ml) surového hemoglobinového lysátu (přibližně 85% HbAo) v 5 mM Tris připraveného podle příkladu 1, s hodnotou pH 8,8. To vede k případnému přetížení sloupce200 mg roztoku vneseno na 1 ml pryskyřice, ve srovnání s výrobcem udávanou kapacitou 50 mg/ml. Eluční činidlo se shromáždí. Sloupec se promyje dvěma objemy sloupce pufru Tris 5 mM, s hodnotou pH 8,8 a tento eluant se shromáždí spolu s eluantem shromážděným v průběhu vnášení. Tento sloupec se pak promyje IN roztokem chloridu sodného k eluování zachycených proteinů a tento promývací eluant se vyhodí. Sloupec se regeneruje 3 objemy sloupce systémem IM roztok chloridu sodného/kyselina chlorovodíková a 4 objemy IM hydroxidu sodného. Hemoglobinové eluční činidlo z anexové pryskyřice se analyzuje na
-10CZ 287589 B6 analytickém anexovém sloupci používajícím gradient pH, jak dále popsáno v příkladu 11. Zjistí se přibližně 95 až 96 % HbAo, jak znázorněno na obr. 3, s výtěžkem 90 % HbAo vneseného na sloupec.
Příklad 3
Samočinně vytěsňovací chromatografie na anexové pryskyřici
Sloupec 1 x 10 cm naplněný gelem Měrek Fractogel-TMAE se promyje 4 objemy sloupce IN roztoku chloridu sodného a vyváží se 5 mM Tris pufru, s hodnotou pH 8,8. Po dosažení rovnováhy se vnese na sloupec průtočnou rychlostí 0,78 ml/min (1 cm/min) 50 ml 3,0 % (3g/100ml) surového hemoglobinového lysátu (přibližně 85% HbAo) v 5 mM Tris připraveného podle příkladu 1, s hodnotou pH 8,8. To podobně vede k případnému přetížení sloupce. Eluční činidlo se shromáždí. Sloupec se pak promyje 2 objemy sloupce pufru Tris 5 mM, s hodnotou pH 8,8 a toto eluční činidlo se usadí s elučním činidlem shromážděným v průběhu vnášení. Sloupec se pak promyje IN roztokem chloridu sodného k eluování zachycených proteinů a promývací eluant se vyhodí. Sloupec se regeneruje třemi objemy sloupce 0,5 N kyselinou chlorovodíkovou a čtyřmi objemy sloupce IM hydroxidu sodného. Hemoglobinové eluční činidlo z anexové pryskyřice se analyzuje na analytickém anexovém sloupci používajícím gradient pH jak dále popsáno v příkladu 11. Zjistí se přibližně 95 až 96 % HbAo, jak znázorněno na obr. 3, s výtěžkem 73 % HbAo vneseného na sloupec.
Příklad 4
Samočinně vytěsňovací chromatografie na katexové pryskyřici
Sloupec 1 x 10 cm naplněný gelem Perseptive Poros HS 50 se promyje 4 objemy sloupce IN roztoku chloridu sodného a vyváží se 5 mM Tris pufru, s hodnotou pH 7,5. Po dosažení rovnováhy se vnese na sloupec průtočnou rychlostí 0,78 ml/min (1 cm/min) 120 ml 2,0% (2 g/100 ml) anexově vyčištěného hemoglobinu 95 % HbAo) v 5 mM Tris, připraveného podle příkladech 2 a 3, s hodnotou pH 7,5. To vede k případnému přetížení sloupce v míře přibližně 5násobné oproti výrobcovu doporučení. Eluant se shromáždí. Sloupec se pak promyje 2 objemy sloupce pufru Tris 5 mM, s hodnotou pH 7,5 a tento eluent (=eluční činidlo) se vyhodí. Sloupec se regeneruje třemi objemy sloupce 0,5 N kyseliny chlorovodíkové a 4 objemy sloupce IM chloridem sodným. Hemoglobinový eluant z anexové pryskyřice se analyzuje na analytickém anexovém sloupci používajícím gradient pH a zjistí se více než 99 % HbAo, jak znázorněno na obr. 4, s výtěžkem přibližně 90 % HbAo vneseného na sloupec.
Příklad 5
Studuje se účinek vodivosti na samočinně vytěsňovací chromatografii na anexové pryskyřici (první stádium).
Účinná vytěsňovací chromatografie je rozhodujícím způsobem závislá na iontové síle pufru a/nebo vzorku určované vodivostí. Pokus vyhodnocený v tabulce II se provádí vnášením surového lysátu z příkladu 1 na anexovou pryskyřici Poros HQ-50 od PerSeptive Biosystems lne. Eluant ze sloupce se analyzuje analytickou anexovou chromatografií. Frakce získané v průběhu 1. průběhu jsou všechny prosté stanovitelných kyselých nečistot, zatímco jen první frakce z druhého průběhu je znečištěna kyselými nečistotami.
-11CZ 287589 B6
Tabulka II
| Běh | Kapacita náplně mg/ml | THb | pH | mS | Sloupec (LxD) | Pufr | Průtočná rychlost (cm/min) | Odstranění kyselých nečistot |
| 1 | 200 | 3,0 | 8,8 | 0,2/ | ΙΟχ 1 | Tris | 1 | 100% |
| 0,4 | ||||||||
| 2 | 200 | 2,8 | 8,8 | 2,85 | ΙΟχ 1 | Tris | 1 | 0% |
Příklad 6
Výtěžek jako funkce proteinové náplně
Přetížením sloupce se dosahuje vyššího výtěžku vyčištěného HbAo. Pokusy vyhodnocení v tabulce III ukazují velmi vysoké přetížení 10 ml sloupce katexové pryskyřice Poros HS-50, což zaručuje, že všechna místa, schopná vazby, jsou obsazena nečistotami, čímž je umožněn vysoký výtěžek vyčištěného HbAo. Přetížení v prvním pokusu je 13,5-násobné oproti doporučení výrobce (308 mg proteinu/ml). Ve druhém pokusu je přetížení přibližně 5-násobné oproti doporučení výrobce. Vyšší přetížení vede k významnému zlepšení výtěžnosti HbAo ze sloupce.
Tabulka III
| Náplň (mg) proteinu ml | THb | PH | mS | Sloupec (LxD) | Pufr | Průtočná rychlost cm/min | Nepřítomnost základních nečistot |
| 308 | 3,1 | 7,5 | 0,5 | 9,5 x 1 | Tris | 0,6 | 100% |
| 88 % výtěžek | |||||||
| 216 | 2,9 | 7,4 | 0,6 | 9,5 x 1 | Tris | 0,6 | 100% |
| 77 % výtěžek |
Příklad 7
Porovnání mezi malými a velkými sloupci
Vytěsňovací chromatografií podle vynálezu lze provádět na malých i velkých sloupcích (kolonách). Porovnání je provedeno pomocí anexové pryskyřice Poros HQ-50 a katexové pryskyřice Poros HS-50 následně se sloupci 15 a 10 litrovými a se sloupcem 10 ml. Vnášený roztok pro Poros HQ-50 se připraví jak popsáno v příkladu 1. Eluční činidlo ze sloupce HQ-50 se vnese do sloupce HS-50. V tabulce IV jsou uvedeny podmínky a výsledky použití sloupců Poros HQ-50. Tabulka V obsahuje výsledky s použitím sloupců Poros HS-50. Výsledky ukazují, že obě stádia procesu lze zvýšit na nejméně 10 až 15 litrovou velikost sloupce k obchodnímu využití.
-12CZ 287589 B6
Tabulka IV
| Vnesené množství | Náplň mg/ml | THb | PH | Vodivost mS | Sloupec LxD | Pufr | Průtočná rychlost cm/min | % kyselejších odstraněných nečistot |
| 1,6 g | 210 | 5,6 | 8,9 | 0,5 | ΙΟχ 1 | Tris | 1 | 100% |
| 3,2 kg | 200 | 4,7 | 8,8 | 0,3 | 10x45 | Tris | 1 | 100% |
Tabulka V
| Vnesené množství | Náplň mg/ml | THb | PH | Vodivost mS | Sloupec LxD | Pufr | Průtočná rychlost cm/min | % kyselejších odstraněných nečistot |
| 2,4 g | 308 | 3,1 | 7,5 | 0,5 | 9,5 x 1 | Tris | 0,6 | 100 % |
| 1,7 kg | 254 | 3,7 | 7,6 | 0,4 | 9,5 x 30 | Tris | 0,6 | 100% |
Příklad 8
Analýza surového hemoglobinového lysátu a vyčištěného hemoglobinu isoelektrickým změřováním (isoelectric focusing -IEF)
Provede se analýza (IEF) pomocí gelu na bázi agarózy, v němž se ustaví stabilní gradient pH pomocí obchodně dostupných amfolytů. Používá se amfolytů, z nichž 90 % má hodnotu pH 5 až 8 a 10 % má hodnotu pH 3,5 až 10. Konečná koncentrace agarózy v gelu je 2,25 % a amfolyty jsou přítomny v konečné koncentraci přibližně 2 %. K posouzení čistoty se gely silně přetíží (1 mg proteinu se vnese na pás). Elektroforéza se provede při nízkém nastavení proudu k zaručení, že proteiny migrují jako stejnoměrná přímá zóna. Po dosažení ustáleného stavu se napětí a proud zvýší na krátkou chvíli k dalšímu zaostření zón. Po elektroforéze se proteiny v agarózovém gelu fixují pomocí roztoku kyseliny trichloroctové a sulfosalicylové. Po fixaci se gel vybarví Comasiovou modří ke zviditelnění proteinových zón. Ke snímacím účelům se gel vysuší na vzduchu a pak se použije laserového densitometru k získání stop elektrozaostřených pruhů obsahujících surový hemoglobinový lysát a vyčištěný hemoglobin. Na obr. 5 je znázorněno porovnání mezi IEF lysátem surového hemoglobinu, připraveného podle příkladu 1 a vyčištěným HbAo připraveným podle vynálezu. Homí graf je pro surový Hb lysát a spodní pro čištěný HbAo. Na ose x je vždy vynesena relativní migrace a na ose y relativní hustota. Vyčištění hemoglobinového roztoku se provádí pomocí postupně sloupce Poros HQ-50, jak popsáno v příkladu 2, a sloupce Poros HS-50, jak je popsáno v příkladu 4.
Příklad 9
Imunoanalýza surového hemoglobinového lysátu a vyčištěného hemoglobinu
K analyzování množství různých nečistot v lysátu surového hemoglobinu z příkladu 1 a vyčištěného hemoglobinu, připraveného způsobem podle vynálezu, se použije techniky imunovybarvování. Po elektrozaměření proteinů na agarózovém gelu se proteiny převedou na nitrocelulózový papír pomocí kapilárního vytvoření skvrn. Zbývající volná vazebná místa na papíru se blokují inkubací skvrny v hydrolyzovaném roztoku rybí želatiny. Po inkubaci se skvrna promyje tris-pufrovou solankou (TBS) a pak se inkubuje s primární protilátkou. (Primární protilátka je protilátka, proti které se vzorek testuje, například se používá k testování HSA v hemoglobinových roztocích anti-lidského sérového albuminu (anti HSA)). Po této inkubaci se skvrna promyje TBS a pak se inkubuje se sekundární protilátkou přidruženou k markerovému enzymu (markér = signální znak) (například křenová peroxidáza), která je protilátkou proti
-13CZ 287589 B6 primární protilátce. Po inkubaci se sekundární protilátkou se skvrna opět promyje TBS a pak se přidá substrát pro markerový enzym. Tam, kde se sekundární protilátka váže na primární protilátku, která se vázala na svůj antigen, se objeví zabarvená sraženina, což vyznačuje množství a polohu antigenu vůči primárnímu antigenu na gelu IEF.
Výsledky obsahuje tabulka VII, kde „++++++“ značí silný signál a „+“ značí sotva znatelný signál a značí žádný zjistitelný signál.
Tabulka VII
| Použitá protilátka | Surový lysát HB | Hemoglobin |
| Albumin lidského séra | +++++++++++ | +a |
| Červené krvinky (RBC) | +++++++ | +b |
| Membrána RBC | + + + + + | - |
| Lidská plazma | +++++++++++ | +c |
| Uhlíková anhydráza I | + + + | - |
| Spectrin | + + + + | - |
| Glykoforin | + + | - |
a. Použitím standardů HSA na imunoskvmách, se stanoví HSA přítomný ve vyčištěném HbAo < 5 pg/mg Hb (< 50 ppm).
b. Detekuje se stopové znečištění s pl přibližně 5,2, které je sesítěné s protilátkou anti-RBC. Jiní pracovníci v oboru uvádějí podobný protein ve vyčištěných roztocích Hb (Christensen a kol., práce provedené v ústavu Letterman Army Institute for Research (LAIR), dnes známém jako Walter Reed Army Institute of Research.
c. Protilátka anti-HSA přítomná v anti-lidské plazmě detekuje HSA přítomný ve vyčištěném HbAo.
Příklad 10
Albumin lidského séra -imunodetekce (HSA-ID)
Ke kvantifikaci množství HSA přítomného v hemoglobinových roztocích se použije chromatografícké metody. Metoda používá protilátek (anti-HSA) kovalentně vázaných k matrici ve sloupci. Je-li vzorek injektován na sloupec, prochází skrz něj v průběhu vnášení/promývání vše kromě antigenu pro protilátku (HSA). Při použití eluovaného pufru se vázaný antigen (HSA) eluuje ze sloupce a plochy vrcholu se použije ke kvantifikaci antigenu přítomného ve vzorku.
K testu použité patrony obchodního označení ImmunoDetection (ID) společnosti PerSeptive Biosystems. Použitá průtočná rychlost je 2 ml/min. Sloupec ve tvaru pouzdra (1,6 mmD x 26 mmL) se vyváží vnášecím pufrem (10 mM fosfátový pufr + 300 mM chloridu sodného, hodnota pH 7,2) a pak se injektuje 50 μΐ vzorku. K promytí sloupce po dobu 0,25 minut se použije vnášecího pufru a pak se použije elučního pufru (po dobu 3,5 minut) k eluování vázaného HSA ze sloupce. Eluční činidlo se monitoruje pomocí sestavy paprskového detektoru sBeckmanovou diodou při 220 nm a 414 nm. Sloupec se pak znovu vyváží vnášecím pufrem k dalšímu injektování. Tímto způsobem se určí množství přítomného HSA ve vyčištěném hemoglobinu nepřesahující hmotnostně 0,0005 %, vztaženo na hemoglobin.
-14CZ 287589 B6
Příklad 11
Analytická ionexová chromatografie
K analyzování čistoty hemoglobinu ve výrobcích z příkladů 2 a 4 se použije následující chromatografické metody. Test je založen na způsobu, který popsal Huisman a Dozy (Huisman a kol., „Studies on the Heterogenity of Hemoglobins. IX - The Use of Tris-HCl Buffers in the Anion-Exange Chromatography of Hemoglobins“, J. Chromatog., 19, str. 160 až 169, 1965). Vzorek se vnáší na anexový sloupec při vysoké hodnotě pH (pH 8,5), přičemž se na sloupec váže veškerý protein a pak se použije gradientu hodnoty pH 8,5 až 6,5 k postupnému eluování proteinů ze sloupce. Pomocí tohoto chromatografického testu lze oddělit velmi podobné proteiny (například různé varianty hemoglobinu). Ke zkoušce se použije analytického anexového sloupce 4,6 mm x 100 mm společnosti PerSeptive Biosystems. Použitými pufry jsou: A) 25 mM Tris + 25 mM Bis-tris, hodnota pH 8,5 a B) 25 mM Tris + 25 mM Bis-tris, hodnota pH 6,5. Zkouška se provádí při průtočné rychlosti 5 ml/min. Po vyvážení sloupce pufrem B, se na sloupec vnese 10 μΐ vzorek (koncentrovaný 10 mg THb/ml) a započne se s gradientem (100 % pufru A až 100 % pufru B na 25 objemů sloupce). Eluant se monitoruje UV detekcí při 280 nm k identifikaci proteinových vrcholů. Na obr. 3 je chromatografický profil anexově vyčištěného hemoglobinu (výrobek příkladu 2) a na obr. 4 je vyčištěný HbAo (výrobek podle příkladu 4) po analýze tímto testem.
Tato metoda je standardním testem ke kontrole čistoty hemoglobinových roztoků. Zjišťuje se, že vyčištěný HbAo podle vynálezu je prost nečistot pozorovaných v hemoglobinu prostém tkání. Případně je patrný malý hrb předcházející vrchol HbAo, což je možno přičítat oxidované formě HbAo (MetHbAo). Běžně se dosahuje touto analytickou metodou čistoty podle vynálezu větší než 99,5 %.
Příklad 12
Odstraňování virů
Způsob podle vynálezu se testuje na schopnost odstraňovat viry ze surového hemoglobinu.
Do vzorků surového lysátu připraveného podle příkladu 1 a do vzorků roztoku částečně vyčištěného hemoglobinu pocházejících z anexového sloupce, to je produktů z příkladů 2 a 3, se přidají zkušební množství následujících virů v aktivním stavu: poliovirus typ 1 virus lidské imunitní nedostatečnosti (HIV) virus hovězího diarrhea (který je modelem pro virus lidské hepatitis)
Herpes Simplex Virus typu 1 (HSV-1).
Do systémů zkušebních buněk se přidají alikvoty elučních činidel z příslušných sloupců. V případě polioviru, herpes viru a viru hovězího průjmu představuje aktivní virus interakci s buňkami k vytvoření destiček. Provedou se známé standardní testy. V případě HIV se alikvoty přidají do média tkáňové kultury. Množství přítomného viru se stanoví změnou nárůstu buněčné linie. Tato změna je známa jako TCID50 (tissue culture infections dose endpoint at 50 % koncový bod infekční dávky tkáňové kultury při 50 %). Výsledky obsahuje tabulka VII.
-15CZ 287589 B6
Tabulka VII
Log snížení viru dosažený chromatografií
| Virus | Poliovirus typ 1 | Virus lidské imunitní nedostatečnosti | Virus hovězího diarrhea | Herpes Simplex virus typ π |
| Genom | RNA | RNA | RNA | RNA |
| Zapouzdřený | ne | ano | ano | ano |
| Zkuš. systém | Věro buňky | buňky MT - 4 | buňky EBTr | Věro buňky |
| Anion. náplň | 1,4 x 10' pfu/ml | 1,4 x 10’TCIDjo/ml | 1,7 x 10’ pfu/ml | 5,3 x 10” pfu/ml |
| Anion. eluát | 8,5 x 10° pfu/ml | < 3 TCIDso/ml | < 20 pfu/ml | < 3 pfu/ml |
| Log snížení | <1 | >5 | >4 | >6 |
| Kation. náplň | 3,1 x 10' pfu/ml | 3,2 x 10° pfu/ml | 2,8 x 10’ pfu/ml | 2,0 x 10° pfu/ml |
| Kation. eluát | 7,5 x 10° pfu/ml | 5,6 x 10 TCIDso/ml | 2,1 x 10“ pfu/ml | 4,1 x 10’ pfu/ml |
| Log snížení | < 1 | >3 | > 1 | >3 |
Tyto výsledky ukazují malé snížení množství polioviru při použití jak anexového, tak katexového samočinného výměnného vytěsňování podle tohoto vynálezu, avšak pozoruhodné snížení vírové náplně v případech HIV, HSV a hovězího diarrhea následkem anexové výměnné chromatografie a v menší míře následkem katexové výměnné chromatografie. To bylo zcela neočekávané, avšak představuje to významnou přednost pro použití tohoto vynálezu.
Příklad 13
Analýza čistoty isoelektrickým zaměřováním a Western „blotting“
Technikou Saravise a Zamchecka5 se provádějí pokusy isoelektrického zaměřování (isoelectric focussing - IEF)
Pomocí agarózy (1% konečné koncentrace) se odlijí IEF gely a vytvoří se gradient pH pomocí amfolytů (Pharmacia Biotech lne. Piscataway, N. J.) tak, že 90 % amfolytů je v rozmezí hodnot pH 5 až 8 a 10 % je v rozmezí hodnot pH 3,5 až 10. Typicky se vnáší na IEF gel 10 μΐ 100 mg/ml Hb roztoků. Po zaměření proteinů se gel fixuje pomocí 10 % trichloroctové kyseliny (TCA), vysuší se, obarví Coomassiovou modří [3]. Normálně je celkové množství vneseného proteinu 1 mg na pruh.
K porovnání čistoty SFH se čtyřmi (4) různými dávkami vyčištěného HbAo podle vynálezu se provede analýza isoelektrického zaměřování (IEF). Celkově se vnese 50 pg Hb nebo 1 mg celkového Hb na pruh. Výsledky jsou na obr. 6. Pruh 20 představuje vazivové tkáně prostý hemoglobin při celkové náplni 50 ph Hb a pruhy 22, 24, 26 a 28 představují dávky vyčištěného Hb podle vynálezu při stejném vnesení. Pruh 30 představuje SFH při 1 mg celkové náplně a pruhy 32, 34, 36 a 38 představují dávky vyčištěného Hb podle vynálezu při stejné náplni. Ukazuje se, že při 40 pg celkové náplně vzorkem Hb má vyčištěný HbAo stejnou čistotu jako SFH. Avšak při celkové náplni 1 mg na pruh četnými proteiny červených krvinek, lze pozorovat jak plazmové proteiny nebo membránové proteiny v pruhu SFH, které jsou úplně nepřítomny v pruhu vyčištěného HbAo. Velmi jemný proteinový pás pí kolem 5,2 lze pozorovat v pruhu vyčištěného HbAo pravděpodobně v důsledku fragmentů globinového řetězce. Pásy nad pásem HbAo v pruzích náplně 50 pg vzorku jsou způsobeny kladněji nabitými druhy MetHb, jež se tvoří při elektrozaměřování.
Po isoelektrickém zaměřování se provede Western blotting, který zahrnuje použití proti látkového vybarvování, k dalšímu vyčíslení čistoty produktu podle vynálezu. Proteiny z IEF gelu se tudíž převedou na nitrocelulózový papír pomocí kapilárního rozpíjení. Zbývající volná místa na nitrocelulózovém papíru se blokují inkubací skvrny v hydrolyzovaném roztoku rybí želatiny. (Hipure Liquid Gelatin, Nordland Products lne., New Brunswick, N. J). Pak se skvrna inkubuje
-16CZ 287589 B6 králičí protilátkou na lidskou plazmu (Dako Corp., Santa Barbara Ca, dávka #010) (protilátky zředěny 1:500 v tris-pufrové solance). Po inkubaci přes noc se skvrna promyje tris-pufrovou solankou (TBS) obsahující 1 % rybí želatiny a pak se inkubuje kozí-protikráličí IgG-křenovou peroxidázou (HRP) (zředěné 1:1000 v TBS). Po jednohodinové inkubaci se skvrna opět promyje TBS obsahující 1% rybí želatiny. Komplex antigen-protilátka-HRP se zviditelní pomocí 4chlor-l-naftolu (30 mg/20ml methanolu) a peroxidu vodíku (50 μΐ ve 100 ml TBS). Pásy tmavočervené sraženiny vyznačují přítomnost antigenů, specielně plazmových proteinů.
Duplikátní vzorky vazivové tkáně prostého hemoglobinu, Hb podle vynálezu, IEF Hb podle vynálezu, vyčištěné Hb od Walter Reed Army Institute (WRAIR) (vyčištěné jak popsáno ve zmíněném článku Winslowově a kol.) a vyčištěných Hb od Sigma Corporation (jak popsáno v jejich běžném katalogu diagnostických reagencií jako „hemoglobin Ao“, odkaz H 0267) se zaměří na IEF gel. Polovina gelu se obarví Comasiovou modří a druhá polovina se rozpije na nitrocelulózový papír. Skvrna se pak vybarví ke zviditelnění komplexů protilátek lidská plazmalidská plazma.
Výsledky jsou na obr. 7. Na tomto obrázku je pruh 40 IEF Comasiovou modří vybarvený vazivové tkáně prostý hemoglobin a pruhy 42, 44 a 46 jsou odpovídající pruhy z HbAo podle vynálezu, WRAIR Hb a Sigma Hb. Pruh 48 je Western Blot - protilátkový test lidské plazmy hemoglobinu prostého vazivové tkáně a pruhy 50, 52 a 54 jsou odpovídající pruhy z HbAo podle vynálezu, WRAIR Hb a Sigma Hb.
V SHF se zjišťují významná množství plazmových proteinů. Naopak pouze nepatrné stopy albuminu lidského séra (HSA) se zjišťují v pruhu podle vynálezu. Ve výrobku podle vynálezu se nezjišťují žádné jiné plazmové proteiny. Žádné zjistitelné úrovně HSA se nenacházejí ve WRAIR HbAo, zjišťují se však četné jiné plazmové proteiny nad pruhy HbAo a pod nimi. Standard Sigma HbAo obsahuje četné plazmové nečistoty včetně významných koncentrací HSA.
Příklad 14
Akutní hypovolemická studie krys v bdělém stavu
Výrobek podle vynálezu se testuje na vasopresorovou aktivitu.
Krysy Sprague-Dawley, náhodně rozdělené do skupiny po 6 (n=6), se nechají aklimatizovat po dobu čtyř dnů, kdy se u nich provádí chronická kanylace technikou Tabaty a Changa (Artificial Organs 4, str. 213 až 214, 1982). Správně kanylovaná zvířata dostávají intravenosně heparin, 150 mezinárodních jednotek/kg. Jedna tepenná kanyla se spojí se Strathamovým snímačem tlaku k měření krevního tlaku a tepu. Tyto parametry se plynule zaznamenávají na polygrafickém Grassově zapisovači. Po dosažení ustáleného záznamu se navodí lethální hemorrhagický šok metodou Wiggersovou, která znamená odběr 67 % celkového objemu krve jiným tepenným katetrem rychlostí 0,5 ml/min ve dvou stupních. Bezprostředně po vyvolání šoku dostane každá krysa zkušební materiál rychlostí 0,5 ml/min, to je homologovou krev, HbAo podle vynálezu (HbAo) nebo zesítěné HbAo podle vynálezu, jež byla podrobena reakcí s o-raffinosním zesíťujícím reakčním činidlem jak popsáno ve zmíněné americké přihlášce vynálezu číslo 08/231945 podaném 21. dubna, 1994 (objem x 3). Střední tepenný tlak (Mean Arterial Pressure MAP) a srdeční tep se zaznamenávají do 30 minut po ukončení infuze. Každá krysa se vrátí do oddělené klece a sleduje se 14 dní se zřetelem na tělesnou hmotnost, hematokritu a přežití. Výsledky jsou znázorněny graficky na obr. 8, kde je MAP vynesen v závislosti na čase (plné kolečko znamená Hb Ao sesítěný, prázdné kolečko Hb Ao a trojúhelníček krysí krev, na ose x je vynesen čas v minutách a na ose y střední tepenný tlak v mm rtuti).
Data ukazují, že výrobek podle vynálezu je vysokou měrou vyčištěn od hemoglobinu Ao, to je tak účinně, že u krys v bdělém stavu se po hemorrhagickém šoku zotaví střední tepenný tlak
-17CZ 287589 B6 veškeré krve. Nepozorují se žádné rozdíly v restaurovaném krevním tlaku nebo srdečním tepu mezi plnou krví a skupinami ošetřenými HbAo.
Příklad 15
Hemodynamické účinky isovolemických výměnných transfuzí u krys
HbAo podle vynálezu se testuje k vyhodnocení hemodynamických účinků po isovolemické výměnné transfuzi u krys v bdělém stavu.
Cestou kyčelní oblasti se kanylují vnější kyčelní tepny a žíly krys způsobem, který popsal Keipert a Chang („Effect of Partial....“, Vox. Sang 53, str. 7 až 14, 1987). Po 24-hodinové zotavovací periodě se zvířata v bdělém stavu podrobí kontinuálním 50% isovolemickým výměnným transfuzím. V průběhu výměnné transfuze se objem krve odebrané kyčelní tepnou nahradí zkušebním roztokem kyčelní žílou rychlostí 0,5 ml/min pomocí infuzního čerpadla s konstantním průtokem. Trvale se sleduje krevní tlak a srdeční tep: (1) 30 minut před výměnou; (2) v průběhu výměny a (3) 2 až 3 hodiny po výměně. Ze záznamu krevního tlaku se vypočte střední tepenný tlak a srdeční tep.
U jedné skupiny krys (čtyři jedinci) se provede transfuze albuminem lidského séra HSA. U jiné skupiny krys (šest jedinců) je zkušebním roztokem hemoglobin prostý vazivové tkáně (SHF). U další skupiny (osm jedinců) je zkušebním roztokem produkt podle vynálezu HbAo.
Výsledky jsou znázorněny graficky na obr. 9 a 9a (na ose x je vynesen čas v minutách a na ose y střední tepenný tlak v mm rtuti).
U všech zkušebních roztoků stoupl v průběhu výměnné transfuze střední tepenný tlak o 10 až 20 mm Hg. U albuminového kontrolního roztoku poklesl střední tepenný tlak o 15 mm Hg pod základní čáru po zbytek sledované periody po výměně a zůstal na pokleslé úrovni po celou sledovanou dobu po výměně, přibližně 2,5 hodiny (obr. 9). Tato pozorování souhlasí s dříve publikovanými poznatky Keiperta a Changa („Effect of Partial.....Vox. Sang 53, str. 7 až 14,
1987).
U hemoglobinu prostého vazivových tkání poklesl střední tepenný tlak k základní čáře na konci výměnné periody, avšak stoupnul v průběhu periody sledování po výměně na maximálně přibližně 15 mm Hg nad základní čáru při 30 až 40 minutách po výměně (obr. 9a).
Na rozdíl od toho se u HbAo podle vynálezu střední tepenný tlak po výměně vrátí na základní čáru a nezvýší se po výměně o více než 5 mm Hg, čímž zůstává MAP v normálních mezích.
Výsledky této studie ukazují, že HbAo podle vynálezu je postrádá mocnou vasoaktivitu spojenou s výměnnou transfuzí hemoglobinem prostým vazivových tkání.
Příklad 16
Test tkáňové kultury in vitro k měření oxidačního poškození endotheliálních buněk předem vystavených působení hemoglobinových preparátů
HbAo podle vynálezu se testuje z hlediska vlastností, které mohou vyvolávat oxidační poškození endotheliálních buněk v kultuře. Uvolňování laktátové dehydrogenázy v médiu je znamením buněčného poškození a cytotoxicity.
-18CZ 287589 B6
Endotheliální buňky z vepřové thoraktické aorty se pěstují ke konfluenci, subkulturované v poměru 1:3 v opakovaných krocích. Ve 48 hodinách kroku 7 se buňky použijí k pokusu. Narušení buněk se posuzuje měřením množství uvolněné laktátové dehydrogenázy z buněk do média. Před přidáním hemoglobinových roztoků se médium odstraní a buňky se promyjí dvakrát fosfátem pufrovanou solankou. Buňky se inkubují s hemoglobiny (250 μΜ heme) v úplném médiu EGM sloužícím samotné jako negativní kontrola. Na konci inkubační periody se z každé jamky odebere 50 μΐ média a určí se aktivita laktátové dehydrogenázy testem laktátové dehydrogenázy (Sigma). Aktivita laktátové dehydrogenázy každé jamky se porovná s laktátovou hydrogenázou, uvolněnou z buněk po přidání 2% Tritonu X-100 (celkové uvolnění LDH) a vyjádří se jako procento celkového uvolnění.
Po 6-hodinové inkubaci se pozoruje významný nárůst uvolněné laktátové dehydrogenázy v přítomnosti hemoglobinu prostého vazivových tkání SFH (74,4 ± 4,2 %, p <0,005). Podobný, avšak menší nárůst se pozoruje u vyčištěného hemoglobinu z ústavu Walter Reed Army Institute of Research. Žádný nárůst se nepozoruje u vyčištěného HbAo podle vynálezu (39,8 ± 2,3 %) ve srovnání s kontrolním vzorkem (37,5 ± 2,2 %). Uvolňování laktátové dehydrogenázy dále narůstá pod 24 hodinách inkubace v přítomnosti vazivových tkání prostého hemoglobinu (99,6 ± 3,5), zatímco u HbAo podle vynálezu se nepozoruje žádná změna (41,6 ±4,6%) ve srovnání s kontrolním vzorkem (24,1 ± 2,6 %).
Inkubace pěstovaných endotheliálních buněk s HbAo připraveným způsoby popsanými v tomto vynálezu nezpůsobuje uvolnění aktivity laktátové dehydrogenázy, jako význaku narušení buněk. Následně není cytotoxicita vůči pěstovaným endotheliálním buňkám podstatnou vlastností hemoglobinových roztoků a čištění HbAo odstraňuje cytotoxické složky přítomné v hemoglobinu prostém vazivových tkání.
Příklad 17
Odstranění prokoagulačních aktivit
Výrobek podle vynálezu se testuje z hlediska jeho obsahu činidel jež podporují srážení krve. Používá se způsobu, který popsal Biessels a kol. (Annual Report of the Karl Landsteiner Foundation, 1991).
Hydronormem™ se uspí morčata a do aorty carotis se zavedou silastické kanyly. Po kanylaci se odebere 30 % obsahu krve (vypočteno jako 2 % hmotnosti) a nahradí se stejným objemem zkušebního roztoku. K udržení přístupnosti kanyly se infuzí dodává 1% roztok lidského albuminu 2,5 ml za hodinu. S infuzí albuminu se započne současně se začátkem pokusu. Před infuzí a po infuzi faktoru Xa (8 až 9 mikrogramů/kg) což je dávka jež sama nezpůsobí srážení, se měří fibrinopeptid A (FPA), o němž je známo, že se vyrábí z fibrinogenu po sražení krve. Krevní vzorky se shromažďují do protisrážlivé směsi heparinu (1000 jednotek/ml), Trasylolu (1000 jednotek/ml) a citrátu sodného (3,8 %), oddělí se a plazma se uloží k ledu.
Vzorky plazmy se zpracují jak popsal pro test FPA Leeksma a kol. (Blood 67, str. 650 až 654, 1986) a vytvořený FPA se měří způsobem RIA, který dříve popsal Gerrits a kol. (Thromb. Res 5, str. 197, 1974). Plazmové proteiny se vysrážejí stejným objemem 40% PEG 6000 ve fosfátem pufrované solance. Supematantní roztoky se zahřejí v lázni vroucí vody, odstředí se a uloží k testu. Výsledky jsou uvedeny v tabulce VIII.
-19CZ 287589 B6
Tabulka VIII
| Zkušební vzorek | Popis | AUCio* |
| SFH | Rychlý, přechodný nárůst FPA z 1,4 ng/ml na 13,8 ± 3 ng/ml v prvních 10 minutách s následným poklesem k základní čáře po 40 minutách. | 87,6 ± 12 |
| HSA | Nárůst v FPA ze základní čáry 1,4 ng/ml na maximum 5,5 ± 1,5 ng/ml. | 45,7 ± 8,2 |
| HbAo | Nárůst v FPA ze základní čáry 1,4 ng/ml na maximum 5,0 ± 1,2 ng/ml. | 31,8 ±2,9 |
* Plocha pod křivkou v prvních 10 minutách po podání Faktoru Xa.
Tyto údaje ukazují, že výrobek podle vynálezu nemá v podstatě žádné prokoagulační působení ve srovnání s hemoglobinem prostým vazivových tkání. Má se zato, že takové prokoagulační chování je silně založeno na znečištění zkušebních roztoků lipidy a fosfolipidy.
Příklad 18
Kvantifikace znečištění proteiny lidského séra technikou ELIS A
Množství nečistot sérového proteinu ve vyčištěném hemoglobinovém výrobku podle vynálezu se měří a porovnání s množstvím nečistot v jiných hemoglobinových výrobcích technikou ELISA.
V tomto příkladu je použito sendvičové techniky ELISA podle Butlerových J. E. všeobecných postupů a technik (ELISA and other solid Phase Immunoassay, vyd. D. M. Kemeny a S. J. Challacombe, John Wiley and Sons Ltd, 1988, str. 1 až 180).
Čtyři mikrotitrové destičky Dynatech s 96 důlky 1 mm se povléknou pevnou fází protilátky kozího séra absorbovaného protilátkou králičího anti-lidského séra (Dako Corporation, Santa Barbara, CA šarže # 072) zředěnou 1:40 v Tris-pufrované solance. Po dvouhodinové inkubaci při teplotě 37 °C se destička promyje Tris-pufrovanou solankou (TBS) a zbylá volná místa na destičce se blokují inkubací hydrolyzovanou rybí želatinou (Hipure Liquid Gelatine, Norland Products lne., New Brunswick, N. J.). Po jednohodinové inkubaci se destička promyje TBS a přidají zkušební články pomocí dvojnásobného sériového zředění. Po jednohodinové inkubaci se opět destička promyje TBS a inkubuje se s pevnou protilátkou fáze králičího séra povlečenou kozím anti-lidským sérem, IgF frakcí (Accurate Chemical and Scientifíc Corporation, Westbury, N. Y., šarže # H036) obsahující 1 % rybí želatiny, zředěno 1:1000 v TBS. Po jednohodinové inkubaci se destička promyje TBS a pak se inkubuje s affinitně vyčištěnou králičí anti-kozí protilátkou, IgG frakcí (konjugovanou křenovou peroxidázou HRP) (BioRoad šarže # 75312) zředěnou 1:250 v TBS. Po dvouhodinové inkubaci se destička promyje TBS. Antigenový protilátkový HRP komplex se zviditelní pomocí o-fenyldiamindichloridu (OPD -26 mg/15 ml kyseliny citrónové, s hodnotou pH 5,0). Bledě žluté zabarvení indikuje přítomnost antigenů, zvláště sérových proteinů. Jejich absorbance se odečte pomocí čtecího zařízení Molekular Device Thermomax Microplate při 490 nm.
Testu se podrobí zdvojené vzorky normálního lidského séra (Dimension Laboratories lne., Mississauga, Ontario, šarže # 30317), vyčištěný HbAo společnosti Sigma Corporation (H-0267), vyčištěný HbAo organizace Walter Reed Army Corporatin (H-0267), vyčištěný HbAo
-20CZ 287589 B6 organizace Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) (šarže # 92092) a vyčištěný HbAo podle vynálezu. Výsledky jsou shrnuty v tabulce IX. Je zřejmé, že produkt podle vynálezu neobsahuje více než 0,0004 % sérových proteinů, zatímco ostatní zkoušené vzorky jsou v tomto ohledu nejméně o řád vyšší.
Tabulka IX
| Vzorek | Obsah sérového proteinu (hm. % vztaženo na Hb) | Sérový protein jako mg/ml roztoku |
| HbAo podle vynálezu (roztok 8% celkového Hb) | 0,0004 % | 0,000328 mg/ml |
| WRAIR HbAo (roztok 6,7% celkového Hb) | 0,0039 % | 0,00263 mg/ml |
| SIGMA HbAo (roztok 1,1% celkového Hb) | 0,0029 % | 0,000328 mg/ml |
U všech provedených testů je jediným sérovým proteinem zjištěným v produktu podle vynálezu albumin lidského séra. Sérové proteiny, nalezené v ostatních konkurenčních produktech, jsou heterogenní směsí sestávající z HSA a ostatních sérových proteinů. Na obr. 10 znamená prázdný čtvereček 6 hodin, čárkovaný 24 hodin, na ose y je uvolňování LDH jako % celku.
Průmyslová využitelnost
Čištění hemoglobinu chromatografií a zvláště chromatografické procesy k čištění hemoglobinu v provozním měřítku k získání roztoku, ve kterém tvoří hemoglobin alespoň 99 % rozpuštěné látky. Hemoglobinové výrobky mající neočekávané příznivé vlastnosti jako náhrada krve.
Claims (11)
1. Způsob oddělování hemoglobinových druhů ze surového roztoku hemoglobinu obsahujícího jako nečistoty proteinové látky, vyznačující se tím, že se v prvním chromatografickém stupni vnáší surový roztok na chromatografický sloupec a podrobuje se chromatografií buď za podmínek výměny aniontů, kdy kyselejší složky surového roztoku než předem zvolený hemoglobin mají ke sloupci větší vazebnou afinitu, nebo za podmínek výměny kationtů, kdy zásaditější složky surového roztoku než předem zvolený hemoglobin mají ke sloupci větší vazebnou afinitu;
pokračuje se ve vnášení surového roztoku do prvního chromatografického stupně, dokud není sloupec plně vytížen hemoglobinovými druhy a složkami s větší afinitou;
dále se pokračuje ve vnášení surového roztoku do prvního chromatografického stupně k přetížení sloupce a k následnému vytěsnění hemoglobinových druhů ze sloupce;
ve druhém chromatografickém stupni se vnáší eluant obsahující hemoglobinové druhy z prvního stupně na chromatografický sloupec a podrobuje se chromatografií za podmínek aniontové výměny nebo kationtové výměny nezvolené pro první stupeň;
dále se pokračuje ve vnášení eluantu do druhého chromatografického stupně, dokud není sloupec plně vytížen hemoglobinovými druhy a složkami s větší afinitou za podmínek tohoto druhého stupně;
dále se pokračuje ve vnášení eluantu do druhého chromatografického stupně k přetížení sloupce a k následnému vytěsnění hemoglobinových druhů ze sloupce.
-21CZ 287589 B6
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že prvním stupněm je anexová chromatografie a druhým stupněm je katexová chromatografie.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že předem zvoleným hemoglobinovým druhem je normální dospělý lidský hemoglobin HbAo.
4. Způsob podle nároku 3, vy z n ačuj í cí se t í m , že anexový proces prvního stupně se provádí při hodnotě pH 7 až 10 a používá se vnášeného roztoku s vodivostí menší než 3 mS.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že anexový proces prvního stupně se provádí při hodnotě pH 8,5 až 9 a používá se vnášeného roztoku s vodivostí menší než 1 mS.
6. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že vnášený roztok se přivádí do sloupce rychlostí nepřesahující 10 cm za minutu.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že koncentrace vnášeného roztoku je 0,1 až 20 % hmotnostních.
8. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že katexová chromatografie druhého stupně se provádí při hodnotě pH 6,5 až 8,5 a používá se vnášeného roztoku s vodivostí menší než 3 mS.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že katexová chromatografie druhého stupně se provádí při hodnotě pH 7 až 7,5 a používá se vnášeného roztoku s vodivostí menší než 1 mS.
10. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že vnášený roztok se přivádí do druhého stupně katexového sloupce rychlostí nepřesahující 10 cm za minutu.
11. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že koncentrace roztoku vnášeného do druhého stupně katexového sloupce je 2 až 6 % hmotnostních.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CA002106612A CA2106612C (en) | 1993-09-21 | 1993-09-21 | Displacement chromatography process |
| ZA951034A ZA951034B (en) | 1993-09-21 | 1995-02-09 | Displacements chromatography process and purified hemoglobin product |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ128795A3 CZ128795A3 (en) | 1995-12-13 |
| CZ287589B6 true CZ287589B6 (en) | 2000-12-13 |
Family
ID=25676656
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19951287A CZ287589B6 (en) | 1993-09-21 | 1994-09-20 | Process of separating a preselected hemoglobin species from a crude solution thereof |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5439591A (cs) |
| EP (1) | EP0668877B1 (cs) |
| CN (1) | CN1051317C (cs) |
| AU (1) | AU681438B2 (cs) |
| CA (1) | CA2106612C (cs) |
| CZ (1) | CZ287589B6 (cs) |
| PL (1) | PL179525B1 (cs) |
| SK (1) | SK281839B6 (cs) |
| WO (1) | WO1995008574A1 (cs) |
Families Citing this family (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5545328A (en) * | 1993-09-21 | 1996-08-13 | Hemosol Inc. | Purification of hemoglobin by displacement chromatography |
| US5741894A (en) * | 1995-09-22 | 1998-04-21 | Baxter International, Inc. | Preparation of pharmaceutical grade hemoglobins by heat treatment in partially oxygenated form |
| ATE257712T1 (de) * | 1996-08-27 | 2004-01-15 | Hemosol Inc | Gesteigerte stimulation der erythropoesis |
| US5814601A (en) * | 1997-02-28 | 1998-09-29 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for optimization of oxygen transport by cell-free systems |
| DE69831248T2 (de) * | 1997-02-28 | 2006-04-13 | The Regents Of The University Of California, Oakland | Verfahren und zusammensetzungen zur optimierung des sauerstofftransportes in zellfreien systemen |
| US5851400A (en) * | 1997-03-21 | 1998-12-22 | University Of Maryland At Baltimore County | Method for eliminating the displacer in displacement chromatography of proteins |
| US6423233B1 (en) * | 2000-08-15 | 2002-07-23 | Biogal Gyogyszergyar Rt. | Purification process |
| GB9707696D0 (en) * | 1997-04-16 | 1997-06-04 | Agner Erik | Improvements in or relating to chromatography |
| US6239262B1 (en) | 1998-01-07 | 2001-05-29 | Rensselaer Polytechnic Institute | Low molecular weight displacers for protein purification in hydrophobic interaction and reversed phase chromatographic systems |
| CA2233725A1 (en) | 1998-03-31 | 1999-09-30 | Hemosol Inc. | Hemoglobin-hydroxyethyl starch complexes |
| GB9822963D0 (en) * | 1998-10-20 | 1998-12-16 | Agner Erik | Improvements in or relating to chromatography |
| US6573373B1 (en) | 1999-06-29 | 2003-06-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | High affinity, low molecular weight displacers for oligonucleotide purification |
| US6747132B2 (en) | 2000-11-29 | 2004-06-08 | Apex Biosciences, Inc. | Methods for the synthesis of a modified hemoglobin solution |
| US7195923B2 (en) * | 2001-01-31 | 2007-03-27 | Scripps Laboratories, Inc. | Ratiometric determination of glycated protein |
| EP1373868B1 (en) * | 2001-02-01 | 2015-05-20 | Sigma-Aldrich Co. LLC | Improved affinity matrices with enhanced visibility for molecular pull-down and immunoprecipitation applications |
| US20030153491A1 (en) * | 2002-01-11 | 2003-08-14 | Winslow Robert M. | Methods and compositions for oxygen transport comprising a high oxygen affinity modified hemoglobin |
| US20050164915A1 (en) * | 2002-04-01 | 2005-07-28 | Sangart, Inc. | Compositions for oxygen transport comprising a high oxygen affinity modified hemoglobin |
| AU2003213642A1 (en) * | 2002-02-28 | 2003-09-16 | Rensselaer Polytechnic Institute | High-affinity, low-molecular-mass displacers for ion-exchange chromatography |
| JP3912206B2 (ja) * | 2002-07-05 | 2007-05-09 | 株式会社日立製作所 | 筒内直接燃料噴射装置用燃料ポンプ |
| SI1869065T1 (sl) | 2005-03-11 | 2020-08-31 | Wyeth Llc | Postopek kromatografije z nizko porazdelitvijo |
| JP2008537153A (ja) * | 2005-04-22 | 2008-09-11 | ウオーターズ・インベストメンツ・リミテツド | 生体高分子の質量分析管理された精製のための装置および方法 |
| JP5001949B2 (ja) * | 2005-12-02 | 2012-08-15 | サッチェム，インコーポレイテッド | 陰イオン交換置換クロマトグラフィー方法および陰イオン交換置換クロマトグラフィー方法における置換剤化合物として用いられる陰イオン性有機化合物 |
| US7976708B2 (en) * | 2008-05-12 | 2011-07-12 | Secretary, Department of Atormic Energy | Innovative cut-and-feed operation for enhancing the performance of ion-exchange chromatographic separation |
| ES2978373T3 (es) * | 2008-08-14 | 2024-09-11 | Genentech Inc | Métodos para eliminar un contaminante usando cromatografía de membrana de intercambio iónico de desplazamiento de proteínas indígenas |
| RU2573894C2 (ru) | 2009-08-06 | 2016-01-27 | Дженентек, Инк. | Способ усовершенствования процесса удаления вирусов при очистке белков |
| US8304248B2 (en) | 2009-11-16 | 2012-11-06 | Torres Anthony R | Protein separation via ion-exchange chromatography and associated methods, systems, and devices |
| ES2991883T3 (es) * | 2010-05-25 | 2024-12-05 | Hoffmann La Roche | Procedimientos de purificación de polipéptidos |
| AU2011329053A1 (en) | 2010-11-15 | 2013-06-06 | Biogen Inc. | Enrichment and concentration of select product isoforms by overloaded bind and elute chromatography |
| US8293115B2 (en) * | 2011-01-20 | 2012-10-23 | Gordon Rossiter | Ionic impurities rejection and chromatographic purification using ion exchange |
| GB201103363D0 (en) * | 2011-02-28 | 2011-04-13 | Ge Healthcare Uk Ltd | Sample preservation method and sample application substrate |
| RS58472B2 (sr) * | 2011-11-02 | 2024-10-31 | Hoffmann La Roche | Hromatografija preopterećenja i eluata |
| WO2013075740A1 (en) | 2011-11-23 | 2013-05-30 | Sanofi | Antibody purification method |
| CN103665098B (zh) * | 2012-09-20 | 2015-08-05 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 双相柱膜蛋白质微反应器及其应用 |
| EP2994485B1 (en) | 2013-05-06 | 2018-01-10 | Sanofi | Continuous multistep process for purifying antibodies |
| EP3546475A1 (en) | 2018-03-27 | 2019-10-02 | Sanofi | Full flow-through process for purifying recombinant proteins |
| US12203945B2 (en) * | 2018-04-18 | 2025-01-21 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Haemoglobin analysis method for detecting abnormal haemoglobins and/or thalassemia markers |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3971842A (en) * | 1974-08-08 | 1976-07-27 | Atlantic Richfield Company | Continuous displacement chromatographic separation |
| FR2548670B1 (fr) * | 1983-07-07 | 1985-10-25 | Merieux Inst | Procede de preparation des principales proteines du sang hemolyse sous forme non denaturee |
| JPS6075530A (ja) * | 1983-09-30 | 1985-04-27 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 金属元素の新しい分離精製方法 |
| CA1244349A (en) * | 1985-06-26 | 1988-11-08 | Jen-Chang Hsia | Purification of hemoglobin and modified hemoglobin by affinity chromatography |
| US5084558A (en) * | 1987-10-13 | 1992-01-28 | Biopure Corporation | Extra pure semi-synthetic blood substitute |
| US5340474A (en) * | 1988-03-24 | 1994-08-23 | Terrapin Technologies, Inc. | Panels of analyte-binding ligands |
| CA1338244C (en) * | 1988-08-17 | 1996-04-09 | Xiang-Fu Wu | Purification of hemoglobin and methemoglobin by bioselective elution |
| US5028696A (en) * | 1988-10-28 | 1991-07-02 | Torres Anthony R | Ion exchange and separation method |
| US5149436A (en) * | 1988-11-28 | 1992-09-22 | Union Oil Company Of California | Continuous displacement chromatographic method |
| IT1232311B (it) * | 1989-09-04 | 1992-01-28 | Sclavo Spa | Metodo di purificazione di composti a struttura peptidica o pseudo peptidica a basso peso molecolare. |
| US5264555A (en) * | 1992-07-14 | 1993-11-23 | Enzon, Inc. | Process for hemoglobin extraction and purification |
-
1993
- 1993-09-21 CA CA002106612A patent/CA2106612C/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-01-27 US US08/187,316 patent/US5439591A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-20 CN CN94190708A patent/CN1051317C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-20 WO PCT/CA1994/000514 patent/WO1995008574A1/en active IP Right Grant
- 1994-09-20 EP EP94926756A patent/EP0668877B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-20 CZ CZ19951287A patent/CZ287589B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-09-20 PL PL94309034A patent/PL179525B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-09-20 SK SK678-95A patent/SK281839B6/sk unknown
- 1994-09-20 AU AU76503/94A patent/AU681438B2/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2106612A1 (en) | 1995-03-22 |
| US5439591A (en) | 1995-08-08 |
| PL179525B1 (pl) | 2000-09-29 |
| PL309034A1 (en) | 1995-09-18 |
| CN1114836A (zh) | 1996-01-10 |
| WO1995008574A1 (en) | 1995-03-30 |
| CZ128795A3 (en) | 1995-12-13 |
| EP0668877A1 (en) | 1995-08-30 |
| SK67895A3 (cs) | 1995-09-13 |
| SK281839B6 (sk) | 2001-08-06 |
| AU7650394A (en) | 1995-04-10 |
| CA2106612C (en) | 2001-02-06 |
| AU681438B2 (en) | 1997-08-28 |
| EP0668877B1 (en) | 1999-01-20 |
| CN1051317C (zh) | 2000-04-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ287589B6 (en) | Process of separating a preselected hemoglobin species from a crude solution thereof | |
| KR101250095B1 (ko) | 항-Ａ 및 항-Ｂ 항체 그리고 다중반응성 ＩｇＧｓ가 결핍된면역글로블린 Ｇ(ＩｇＧ) 농축물 | |
| RU2055593C1 (ru) | Способ выделения фактора viii из других белков в плазме крови | |
| US5545328A (en) | Purification of hemoglobin by displacement chromatography | |
| EP0239565B1 (en) | Method of separating proteins | |
| JP4057049B2 (ja) | 置換クロマトグラフィー法および精製ヘモグロビン産物 | |
| CZ281912B6 (cs) | Směs hemoglobinu síťovaného imidoesterem a způso b její výroby | |
| Craig et al. | Dialysis studies. IX. On the conformational stability of glucagon, adrenocorticotropic hormone, and similar peptides | |
| Austen | The chromatographic separation of factor VIII on aminohexyl sepharose | |
| EP0391974B1 (en) | Process for the purification of vitamin k-dependent blood clotting factors | |
| Ehrsson et al. | Degradation of melphalan in aqueous solutions—influence of human albumin binding | |
| US5445958A (en) | Process for purifying blood clotting factors | |
| AU2005297061B2 (en) | Method for the isolation of haptoglobin | |
| Chaimanee et al. | Binding of haemoglobin to spectrin of human erythrocytes | |
| Blackburn et al. | Factors affecting iron and transferrin release from rabbit reticulocyte ghosts to cytosol | |
| Paulssen et al. | Purification of the antihemophilic factor by gel filtration on agarose | |
| HAMOGLOBIN et al. | EUROPEAN PATENT SPECIFICATION | |
| Sekiguchi | Studies on the quality control of stroma-free hemoglobin | |
| Ruttyn et al. | Chromatography of human plasma on aminohexyl sepharose: Separation of factor VIII/vWf and behaviour of factors II, VII, IX and X and antithrombin III | |
| KR20240132350A (ko) | 전체 혈장에서 표적 성분을 정제하거나 제거하는 방법 | |
| AU627446C (en) | Chemical process | |
| Dyr et al. | On the increased retention volume of human haemoglobin in high-performance gel filtration | |
| HUE025551T2 (en) | A method of producing virus-inactivated FV concentrate starting from human plasma, which can be increased to industrial sizes | |
| MXPA00008770A (en) | Improved methods for producing factor viii proteins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20080920 |