RS58472B2 - Hromatografija preopterećenja i eluata - Google Patents

Hromatografija preopterećenja i eluata

Info

Publication number
RS58472B2
RS58472B2 RS20190358A RSP20190358A RS58472B2 RS 58472 B2 RS58472 B2 RS 58472B2 RS 20190358 A RS20190358 A RS 20190358A RS P20190358 A RSP20190358 A RS P20190358A RS 58472 B2 RS58472 B2 RS 58472B2
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
polypeptide
chromatography
antibodies
buffer
Prior art date
Application number
RS20190358A
Other languages
English (en)
Inventor
Deepa Nadarajah
Amit Mehta
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=48192803&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS58472(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of RS58472B1 publication Critical patent/RS58472B1/sr
Publication of RS58472B2 publication Critical patent/RS58472B2/sr

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/14—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the introduction of the feed to the apparatus
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/42—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the development mode, e.g. by displacement or by elution
    • B01D15/424—Elution mode
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/32—Bonded phase chromatography
    • B01D15/325—Reversed phase
    • B01D15/327—Reversed phase with hydrophobic interaction
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction, e.g. ion-exchange, ion-pair, ion-suppression or ion-exclusion
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/363—Anion-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 and B01D15/30 - B01D15/36, e.g. affinity, ligand exchange or chiral chromatography
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 and B01D15/30 - B01D15/36, e.g. affinity, ligand exchange or chiral chromatography
    • B01D15/3847—Multimodal interactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/165—Extraction; Separation; Purification by chromatography mixed-mode chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

OPIS
SRODNE PRIJAVE OBLAST PRONALASKA
Predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za prečišćavanje proizvoda iz kompozicije koja sadrži proizvod i najmanje jedan kontaminat i formulacije koje sadrže proizvod prečišćen postupcima.
OSNOVA PRONALASKA
Anjonoizmenjivačka hromatografija (AEX) često se koristi u protočnom načinu kao korak poliranja platforme za monoklonska antitela (MAbs). Određeni MAb koji se vezuju za AEX smolu u standardnim protočnim uslovima može predstavljati izazove za postrojenja. Za klinički razvoj u ranoj fazi, gde je zahtev za masom tipično nizak, ovi neplatformski MAb su prečišćeni korišćenjem AEX ili smole sa mešanim načinom vezivanja i eluiranja. Međutim, zbog niske dinamičke sposobnosti vezivanja (DBC) ovih smola, implementacija u kasnoj fazi zahtevala bi kolone veličine oko 1000 L ili više ciklusa na manjoj koloni, čime bi se ograničila propusnost postrojenja.
Prečišćavanje MAb se tipično izvodi upotrebom hromatografije vezivanja i eluiranja (B/E) ili protočne (F/T) hromatografije. Nedavno su hromatografija slabog particionisanja (Kelley, BD i dr., 2008 Biotechnol Bioeng 101(3):553-566; US patentna prijava br.
2007/0060741) i hromatografija preopterećenja (WO2011150110) uvedene na AEX smolama i smolama za izmenu katjona (CEX) datim redosledom, da bi se povećalo MAb prečišćavanje. Opšti mehanizam i ograničenja svakog od ovih režima hromatografije istaknuti su u nastavku.
Hromatografija vezivanja i eluiranja: Pomoću B/E hromatografije proizvod se obično puni da bi se maksimizovao DBC do hromatografskog materijala, a zatim su uslovi ispiranja i eluiranja identifikovani tako da se u eluatu postiže maksimalna čistoća proizvoda. Ograničenje B/E hromatografije je ograničenje gustine punjenja u odnosu na stvarnu smolu DBC
Protočna hromatografija: Korišćenjem F/T hromatografije, utvrđuju se uslovi punjenja gde se nečistoće čvrsto vezuju za hromatografski materijal dok proizvod prolazi kroz njega. F/T hromatografija omogućava visoku gustinu punjenja za standardne MAb, ali ne može biti primenjiva za neplatformske MAb ili uslove rastvora koji omogućuju F/T operaciju za ove neplatformske MAb jer mogu biti takvi da se ne mogu primeniti u postojećim proizvodnim postrojenjima.
Particiona hromatografija: Ovaj način poboljšava F/T način rada tako što identifikuje uslove rastvora u kojima postoji slabo vezivanje MAb za smolu (2 g/L do 20 g/L). U ovim uslovima nečistoće se vežu jače nego u F/T načinu i stoga se dobija poboljšano pročišćavanje. Međutim, uslovi punjenja su usmereni na nizak koeficijent podele proizvoda (Kp) u opsegu 0,1–20.
Hromatografija pod preopterećenjem: U ovom režimu hromatografije, proizvod od interesa je napunjen preko dinamičkog kapaciteta vezivanja hromatografskog materijala za proizvod, stoga se naziva preopterećenje. Dokazano je da ovaj način rada obezbeđuje prečišćavanje MAb pomoću medija za razmenu katjona (CEX), a naročito sa membranama. Međutim, ograničenje ovog pristupa je da može biti niskog prinosa sa smolom jer ne postoji faza eluiranja.
Ekonomično, u velikim razmerama, prečišćavanje polipeptida do dovoljne čistoće za upotrebu u obliku terapijskog sredstva za čoveka, ostaje veliki izazov.
WO2012068134A1 se odnosi na obogaćivanje i koncentraciju izoforma selektivnih proizvoda preko preopterećene i eluirane hromatografije. WO2006116064A2 se odnosi na uređaje i postupke za masovno spektrometrijsko usmereno prečišćavanje biopolimera. Liu, HF i dr., 2011 J Chrom A 1218 (39): 6943-6952 se odnosi na istraživanje preopterećene katjonske hromatografije za prečišćavanje monoklonskih antitela. WO9508574A1 se odnosi na proces hromatografije zamene i prečišćeni produkt hemoglobina. WO2011035282A1 se odnosi na razdvajanje sa dvostrukim hvatanjem. US2011065901A1 se odnosi na postupke za prečišćavanje ciljnog proteina iz jedne ili više nečistoća u uzorku.
KRATAK REZIME
Pronalazak obezbeđuje postupke za prečišćavanje antitela iz kompozicije koja sadrži antitelo i jedan ili više kontaminata, a navedeni postupak sadrži a) punjenje kompozicije u mešoviti način, materijal za hromatografiju u količini od viška dinamičkog kapaciteta vezivanja hromatografskog materijala za antitelo korišćenjem pufera za punjenje, pri čemu je koeficijent raspodele hromatografskog materijala za antitelo veći od 100, b) eluiranje antitela iz hromatografskog materijala pod uslovima u kojima jedan ili više kontaminata ostaju vezani za hromatografski materijal upotrebom pufera za eluiranje, pri čemu pufer za eluiranje ima provodljivost manju od provodljivosti pufera za punjenje i c) objedinjavanje frakcija koje sadrže antitelo u hromatografskom efluentu iz koraka a) i b).
U nekim primerima izvođenja, antitelo je monoklonsko antitelo; na primer, ali ne ograničavajući se na himerno antitelo, humanizovano antitelo ili humano antitelo.
U nekim primerima izvođenja, antitelo je antigen vezujući fragment; na primer, ali ne ograničavajući se na Fab fragment, Fab’ fragment, F(ab')2 fragment, scFv, di-scFv, bi-scFv, tandem (di,tri)-scFv, Fv, sdAb, trifunkcionalno antitelo, BiTE, dijatelo i trijatelo.
U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, polipeptid je enzim, hormon, fuzioni protein, protein koji sadrži Fc, imunokonjugat, citokin ili interleukin.
U nekim primerima izvođenja, polipeptid je prečišćen iz kompozicije koja sadrži jednu ili više kontaminata; na primer, protein jajne ćelije kineskog hrčka (CHOP), protein ćelije domaćina (HCP), izlučeni protein A, nukleinsku kiselinu, DNK, varijante proizvoda, agregirani protein, komponentu medija za kulturu ćelija, gentamicin, fragmente polipeptida, endotoksine i viralni kontaminat.
U nekim primerima izvođenja, kompozicija se nanosi na hromatografski materijal pri dinamičkim kapacitetima vezivanja hromatografskog materijala za jedan ili više kontaminata.
U nekim primerima izvođenja, postupci obezbeđuju OEC, pri čemu je pufer za eluiranje ima provodljivost manju od provodljivosti pufera za punjenje. U nekim primerima izvođenja, postupci obezbeđuju OEC, pri čemu je pufer za eluiranje ima pH manji od pH pufera za punjenje. U drugim primerima izvođenja, pufer za eluiranje ima pH veći od pH pufera za punjenje.
U nekim primerima izvođenja, polipeptid postupaka je u eluentu iz afinitetne hromatografije, hromatografije sa katjonskom razmenom, hromatografije anjonske razmene, hromatografije mešanog načina i hromatografije hidrofobne interakcije. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je u eluentu iz hromatografije proteina A.
U nekim primerima izvođenja, polipeptid postupaka je dalje prečišćen; na primer, filtracijom virusa, afinitetnom hromatografijom, hromatografijom razmene katjona, hromatografijom anjonske razmene, hromatografijom mešanog načina i/ili hromatografijom hidrofobnih interakcija. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je dalje koncentrovan; na primer ultrafiltracijom, diafiltracijom ili kombinacijom ultrafiltracije i diafiltracije. U nekim primerima izvođenja, polipeptid postupaka je dalje kombinovan sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.
KRATAK OPIS SLIKA
Slika 1 pokazuje visokopropusni skrining (HTS) na „Capto Adhere” smoli pod uslovima vezivanja smeše za MAb 3. Slika 1A prikazuje konture konstantnih vrednosti Kpza MAb 3. Slika 1B pokazuje stvarni kapacitet vezivanja MAb 3 u supernatantu pri 80 g/L izazivanja proizvoda smole. Slika 1C pokazuje stvarni kapacitet vezivanja nečistoće (proteina ćelije domaćina) u supernatantu pri 80 g/L izazivanja proizvoda smole. Sve konturne slike su generisane korišćenjem modela površinske reakcije izvedenog iz neobrađenih podataka.
Slika 2 prikazuje hromatogram za optimizirani OEC način rada. Za ovaj rad je korišćen MAb 3 sa gustinom punjenja od 180 g/L.
Slika 3 prikazuje optimizaciju punjenja za OEC način rada pomoću MAb 3.
Slika 4 prikazuje hromatogram sa uslovima ciljnog punjenja za OEC način rada. Slični uslovi za punjenje i eluiranje rezultiraju repom, a stoga i povećanjem zapremina bazena za 45%. Za ovaj rad je korišćen MAb 3 sa gustinom punjenja od 180 g/L.
Slika 5 prikazuje optimizaciju eluiranja za OEC način rada pomoću MAb 3.
Slika 6 prikazuje analizu nečistoća u frakcijama i kumulativnu analizu nečistoća. Slika 7 prikazuje MAb 3 CHOP probojnu analizu „Capto Adhere” smole u OEC načinu rada pri gustini punjenja od 1000 g/L.
Slika 8 prikazuje analizu prinosa kroz sprovođenje skale u širokom opsegu gustine punjenja od 70 g/L do 180 g/L.
Slika 9 prikazuje poređenje načina rada hromatografije slabog particionisanja i načina rada hromatografije preopterećenja i eluata. Proizvod je bio MAb 3, a hromatografski materijal je bio „Capto Adhere” smola.
Slika 10 prikazuje MAb 3 CHOP analizu na QMA smoli pod OEC načinom rada pri gustini punjenja od 150 g/L.
Slika 11 prikazuje MAb 4 CHOP analizu na „Capto Adhere” smoli pod OEC načinom rada pri gustini punjenja od 150 g/L.
Slika 12 prikazuje MAb 4 CHOP analizu na „Capto MMC” smoli pod OEC načinom rada pri gustini punjenja od 150 g/L.
Slika 13 prikazuje MAb 3 CHOP probojnu analizu na „Capto Adhere” smoli u OEC načinu rada pri gustini punjenja od 200 g/L. Protein MAb 3 A bazen je napunjen sa „Capto Adhere” smolom do 200 g/L (što je iznad njegovog kapaciteta vezivanja proizvoda od 50 g/L). CHOP probojna analiza je pokazala da se CHOP nije probio do 200 g/L MAb obrade.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
I. Definicije
Termin „proizvod”, kao što je ovde opisano, jeste supstanca koju treba očistiti pomoću OEC; na primer, polipeptidom.
Termin „polipeptid” ili „protein” ovde se koristi naizmenično i odnosi se na polimere aminokiselina bilo koje dužine. Polimer može biti linearan ili razgranat, može da sadrži modifikovane aminokiseline i može biti prekinut neaminokiselinama. Termini takođe obuhvataju polimer aminokiseline koji je modifikovan prirodno ili intervencijom; na primer, formiranjem disulfidne veze, glikozilacijom, lipidacijom, acetilacijom, fosforilacijom ili bilo kojom drugom manipulacijom ili modifikacijom, kao što je konjugacija sa komponentom obeležavanja. U definiciju su uključeni, na primer, polipeptidi koji sadrže jedan ili više analoga aminokiseline (uključujući, na primer, neprirodne aminokiseline, itd.), kao i druge modifikacije poznate u struci. Termini „polipeptid” i „protein” kako se ovde koriste specifično obuhvataju antitela.
„Prečišćeni” polipeptid (npr. antitelo ili imunoadhezin) znači da je polipeptidu povećana čistoća, tako da postoji u obliku koji je čistiji nego što postoji u njegovom prirodnom okruženju i/ili kada je prvobitno sintetizovan i/ili pojačan u laboratorijskim uslovima. Čistoća je relativan pojam i ne znači nužno apsolutnu čistoću.
Termin „označen epitopom”, kada se ovde koristi, odnosi se na himerni polipeptid koji sadrži polipeptid spojen na „označeni polipeptid”. Označeni polipeptid ima dovoljno ostataka da obezbedi epitop protiv kojeg se može napraviti antitelo, ali je dovoljno kratak da ne ometa aktivnost polipeptida na koji je spojen. Za označeni polipeptid, takođe je poželjno da je prilično jedinstven, tako da antitelo ne reaguje unakrsno sa drugim epitopima. Prikladni označeni polipeptidi obično imaju najmanje šest aminokiselinskih ostataka i obično između oko 8 i 50 aminokiselinskih ostataka (poželjno između oko 10 i 20 aminokiselinskih ostataka).
„Aktivno” ili „aktivnost”, za potrebe ovog dokumenta, odnosi se na oblik(e) polipeptida koji zadržava biološku i/ili imunološku aktivnost prirodnog ili polipeptida koji se javlja u prirodi, pri čemu se „biološka” aktivnost odnosi na biološku funkciju (bilo inhibitornu ili stimulativnu) uzrokovanu prirodnim ili polipeptidom koji se javlja u prirodi, osim sposobnosti da indukuje proizvodnju antitela protiv antigenog epitopa koje poseduje prirodni ili polipeptid koji se javlja u prirodi i „imunološka” aktivnost se odnosi na sposobnost indukovanja proizvodnje antitela protiv antigenskog epitopa koji ima prirodni ili polipeptid koji se javlja u prirodi.
Termin „antagonist” se koristi u najširem smislu i uključuje bilo koji molekul koji delimično ili potpuno blokira, inhibira ili neutrališe biološku aktivnost prirodnog polipeptida. Na sličan način, termin „agonist” se koristi u najširem smislu i uključuje bilo koji molekul koji oponaša biološku aktivnost prirodnog polipeptida. Prikladni molekuli agonista ili antagonista specifično obuhvataju agonistička ili antagonistička antitela ili fragmente antitela, fragmente ili varijante aminokiselinske sekvence prirodnih polipeptida, itd. Postupci za identifikaciju agonista ili antagonista polipeptida mogu da obuhvataju kontakte polipeptida sa molekulom kandidata agonista ili antagonista i merenje detektovane promena u jednoj ili više bioloških aktivnosti normalno povezanih sa polipeptidom.
„Komplementarna zavisna citotoksičnost” ili se odnosi na sposobnost molekula da lizira metu u prisustvu komplementa. Staza aktivacije komplementa inicira se vezivanjem prve komponente komplementarnog sistema (C1q) za molekul (npr. polipeptid (npr. antitelo)) kompleksiran sa srodnim antigenom. Za procenu aktivacije komplementa, CDC test, npr. kako je opisao u Gazzano-Santoro i dr., J. Immunol. Methods 202:163 (1996), mogu se izvršiti.
Polipeptid „koje vezuje” antigen od interesa, npr. ciljani polipeptidni antigen vezan za tumor, onaj je koji vezuje antigen sa dovoljnim afinitetom tako da je polipeptid koristan kao dijagnostički i/ili terapeutski agens u ciljanju ćelije ili tkiva koje eksprimira antigen, a nema značajnu unakrsnu reakciju sa drugim polipeptidima. U takvim primerima izvođenja, obim vezivanja polipeptida na „neciljani” polipeptid biće manji od oko 10% vezivanja polipeptida sa njegovim specifičnim ciljnim polipeptidom, kao što je određeno pomoću analize sortiranja ćelija sa fluorescentnim aktiviranjem (FACS) ili radioimunske precipitacije (RIA).
Što se tiče vezivanja polipeptida na ciljani molekul, termin „specifično vezivanje” ili „specifično vezivanje za” ili „specifičan za” određeni polipeptid ili epitop na određenom polipeptidnom cilju znači vezivanje koje je merljivo različito od nespecifične interakcije.
Specifično vezivanje može se izmeriti, na primer, određivanjem vezivanja molekula u poređenju sa vezivanjem kontrolnog molekula, koji je uglavnom molekul slične strukture koja nema vezujuću aktivnost. Na primer, specifično vezivanje može se odrediti konkurencijom sa kontrolnim molekulom koji je sličan cilju, na primer, viškom neoznačenog cilja. U ovom slučaju, specifično vezivanje je naznačeno ako je vezivanje označene mete na sondu konkurentno inhibirano viškom neobeleženog cilja.
Termin „antitelo” je ovde upotrebljen u najširem smislu i specifično pokriva monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) nastala od najmanje dva netaknuta antitela i fragmente antitela, dokle god pokazuju željenu biološku aktivnost. Termin „imunoglobulin” (Ig) se ovde koristi kao zamenjiv antitelom.
Antitela su prirodni molekuli imunoglobulina koji imaju različite strukture, a sve se zasnivaju na imunoglobulinu. Na primer, IgG antitela imaju dva „teška” lanca i dva „laka” lanca koji su vezani za disulfid i da bi formirali funkcionalno antitelo. Svaki teški i laki lanac sadrži „konstantu” (C) i „varijabilnu” (V) regiju. V regioni određuju specifičnost vezivanja antigena antitela, dok C regioni obezbeđuju strukturnu podršku i funkciju u neantigenspecifičnim interakcijama s imunskim efektorima. Specifičnost antigen vezujućeg ili antigenvezujućeg fragmenta antitela jeste sposobnost antitela da se specifično veže za određeni antigen.
Specifičnost antigen vezujućeg antitela određena je strukturnim karakteristikama V regiona. Varijabilnost nije ravnomerno raspoređena u rasponu od 110 aminokiselina varijabilnih domena. Umesto toga, regioni V sadrže relativno invarijantne proteine nazvane okružni regioni (FR – framework regions) od 15–30 aminokiselina odvojenih kraćim područjima ekstremne varijabilnosti pod nazivom „hipervarijabilni regioni” koji su dužine 9– 12 aminokiselina. Svaki varijabilni domen nativnih teških i lakih lanaca obuhvata četiri FR, koji u velikoj meri zauzimaju konfiguraciju β-ravni, povezanu sa tri hipervarijabilna regiona, koji formiraju petlje koje povezuju, a u nekim slučajevima i formiraju, deo konfiguracije βravni. Hipervarijabilni regioni u svakom lancu držani su zajedno u neposrednoj blizini od strane FR, sa hipervarijabilnim regionima iz drugog lanca, doprinose stvaranju antigenvezujućeg mesta antitela (videti Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antitela antigenu, ali pokazuju različite efektorske funkcije, kao što je učešće antitela u ćelijskoj citotoksičnosti zavisno od antitela (ADCC).
Svaka V regija tipično sadrži tri regije za određivanje komplementarnosti („CDR”, od kojih svaka sadrži „hipervarijabilnu petlju”) i četiri okvirna regiona. Vezivno mesto antitela, minimalna strukturna jedinica koja je potrebna da se veže sa značajnim afinitetom za određeni željeni antigen, zbog toga će tipično uključivati tri CDR, i najmanje tri, poželjno četiri, okvirna regiona koja su tu međusobno raspoređena da drže i prikažu CDR u odgovarajućoj konformaciji. Klasična antitela sa četiri lanca imaju mesta za vezivanja antigena koja su definisana VHi VLdomenima u saradnji. Određena antitela, kao što su antitela od kamila i ajkula, nemaju lake lance i oslanjaju se na mesta vezivanja koja su formirana samo od teških lanaca. Mogu se pripremiti imunoglobulini sa jednom domenom, u kojima su vezivna mesta formirana samo od teških lanaca ili lakih lanaca, u odsustvu saradnje između VHi VL.
Termin „varijabla” se odnosi na činjenicu da se određeni delovi varijabilnih domena znatno razlikuju u sekvenci između antitela i koriste se za vezivanje i specifičnost svakog pojedinačnog antitela za njegov specifični antigen. Međutim, varijabilnost nije ravnomerno raspoređena po varijabilnim domenima antitela. Koncentrisana je u tri segmenta koji se nazivaju hipervarijabilni regioni u varijabilnim domenima lakog i teškog lanca. Više konzervirani delovi varijabilnih domena nazivaju se okvirni regioni (FRs). Svaki varijabilni domen nativnih teških i lakih lanaca obuhvata četiri FR, koji u velikoj meri zauzimaju konfiguraciju β-ravni, povezanu sa tri hipervarijabilna regiona, koji formiraju petlje koje povezuju, a u nekim slučajevima i formiraju, deo konfiguracije β-ravni. Hipervarijabilni regioni u svakom lancu držani su zajedno u neposrednoj blizini od strane FR, sa hipervarijabilnim regionima iz drugog lanca, doprinose stvaranju antigen-vezujućeg mesta antitela (videti Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antitela antigenu, ali pokazuju različite efektorske funkcije, kao što je učešće antitela u ćelijskoj citotoksičnosti zavisno od antitela (ADCC).
Termin „hipervarijabilni region” kada se ovde koristi odnosi se na aminokiselinske ostatke antitela koji su odgovorni za vezivanje antigena. Hipervarijabilni region može da sadrži aminokiselinske ostatke iz „regiona za određivanje komplementarnosti” ili „CDR” (npr.
oko ostataka 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) u VL, i oko 31-35B (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) u VH(Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) i/ili one ostatke iz „hipervarijabilne petlje” (npr. ostaci 26-32 (L1), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) u VL, i 26-32 (H1), 52A-55 (H2) i 96-101 (H3) u VH(Chothia i Lesk J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)).
„Okvirni” ili „FR” ostaci su oni ostaci varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona kao što su ovde definisani.
„Fragmenti antitela” obuhvataju deo netaknutog antitela, poželjno sadrže njegov antigen-vezujući region. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', F(ab')2i Fv fragmente; dijatela; tandemska dijatela (taDb), linearna antitela (npr . U.S. Patent No.
5,641,870, Example 2; Zapata i dr., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)); jednoručna antitela, antitela s jednim varijabilnim domenom, minitela, molekuli jednolančanih antitela; multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela (npr, uključujući, bez ograničenja, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3, (scFV)4-Fc, di-scFv, bi-scFv ili tandem (di, tri)-scFv); i Bispecifični aktivatori T-ćelija (BiTE).
Digestija antitela papainom dala je dva identična fragmenta za vezivanje antitela, pod nazivom „Fab” fragmenti, svaki sa jednim mestom zavezivanje antigena, a ostatak je „Fc” fragment, oznaka koja odražava sposobnost lake kristalizacije. Tretman pepsinom daje F(ab')2fragment koji ima dva mesta za vezivanje antigena i još uvek je sposoban za umrežavanje antigena.
„Fv” je minimalni fragment antitela koji sadrži kompletno mesto za prepoznavanje i vezivanje antigena. Ovaj region se sastoji od dimera jednog teškog lanca i jednog varijabilnog domena lakog lanca u uskoj, nekovalentnoj asocijaciji. U ovoj konfiguraciji, tri hipervarijabilna regiona svakog varijablnog domena vrše interakciju i definišu mesto vezivanja antigena na površini VH-VLdimera. Zajedno, šest hipervarijabilnih regiona daje antigen-vezujuću specifičnost antitelu. Međutim, čak i jedan varijabilni domen (ili polovina Fv koja sadrži samo tri hipervarijabilna regiona specifična za antigen) ima sposobnost prepoznavanja i vezivanja antigena, ali sa nižim afinitetom od celog mesta vezivanja.
Fab fragment takođe sadrži konstantni domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. Fab’ fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata dodavanjem nekoliko ostataka na karboksi terminusu CH1 domena teškog lanca uključujući jedan ili više cisteina iz regiona zgloba antitela. Fab’-SH je ovde oznaka za Fab’ u kojoj ostatak(ostaci) cisteina konstantnih domena nosi najmanje jednu slobodnu tiol grupu. F(ab’)2fragmenti antitela su prvobitno proizvedeni kao parovi Fab’ fragmenata koji imaju između sebe zglobove cisteina. Takođe su poznati drugi hemijski sklopovi fragmenata antitela.
„Laki lanci” antitela (imunoglobulini) iz bilo koje vrste kičmenjaka mogu se svrstati u jedan od dva jasno odvojena tipa, koji se nazivaju kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinskih sekvenci njihovih konstantnih domena.
U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena njihovih teških lanaca, antitela se mogu svrstati u različite klase. Postoji pet glavnih klasa netaknutih antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama antitela zovu se α, δ, ε, γ, odnosno μ. Podjedinične strukture i trodimenzione konfiguracije različitih klasa imunoglobulina dobro su poznate.
Fragmenti „jednolančanog Fv” ili „scFv” antitela obuhvataju VHi VLdomene antitela, naznačene time što su ovi domeni prisutni u jednom polipeptidnom lanacu. U nekim primerima izvođenja, Fv polipeptid dalje sadrži polipeptidni linker između VHi VLdomena koji omogućava da scFv formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Za pregled pogledati Plückthun u The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994).
Termin „dijatela” se odnosi na male fragmente antitela sa dva mesta za vezivanje antigena, čiji fragmenti obuhvataju varijabilni domen teškog lanca (VH) koji je povezan sa varijabilnom domenom lakog lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH–VL). Koristeći linker koji je prekratak da bi se omogućilo uparivanje između dva domena na istom lancu, domeni su prisiljeni da se uparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i stvaraju dva mesta vezivanja antigena. Dijatela su detaljnije opisana u, na primer, EP 404.097; WO 93/11161; i Hollinger i dr. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).
Termin „multispecifično antitelo” se koristi u najširem smislu i specifično pokriva antitelo koje ima poliepitopsku specifičnost. Takva multispecifična antitela uključuju, bez ograničenja, antitelo koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH)i varijabilni domen lakog lanca (VL),gde VHVLjedinica ima poliepitopsku specifičnost, antitela koji imaju dva ili više VLi VHdomena sa svakom VHVLjedinicom koja se vezuje na različit epitop, antitela koji imaju dva ili više pojedinačnih varijabilnih domena sa svakim pojedinačnim varijabilnim domenom koji se vezuje za različit epitop, antitela pune dužine, fragmenti antitela kao što su Fab, Fv, dsFv, scFv, dijatela, bispecifična dijatela, trijatela, trifunkcionalna antitela, fragmenti antitela koji su kovalentno ili nekovalentno vezani. „Poliepitopska specifičnost” se odnosi na sposobnost da se specifično veže na dva ili više različitih epitopa na istim ili različitim ciljevima. „Monospecifični” se odnosi na sposobnost vezivanja samo jednog epitopa. U skladu sa jednim primerom izvođenja, multispecifično antitelo je IgG antitelo koje se vezuje za svaki epitop sa afinitetom od 5 µM do 0,001 pM, 3 µM do 0,001 pM, 1 µM do 0,001 pM, 0,5 µM do 0,001 pM, ili 0,1 µM do 0,001 pM.
Izraz „antitela jednog domena” (sdAbs) ili „pojedinačna varijabilna domena (SVD) antitela” uopšteno se odnosi na antitela u kojima jedan varijabilni domen (VH ili VL) može da vezuje antigen. Drugim rečima, pojedinačni varijabilni domen ne treba da stupa u interakciju sa drugim varijabilnim domenom da bi prepoznao ciljni antigen. Primeri antitela sa jednim domenom uključuju one izvedene od kamelida (lama i kamila) i riba s hrskavičastim skeletom (npr. morski pas dadilja) i one izvedene iz rekombinantnih postupaka od humanih i mišijih antitela (Nature (1989) 341:544-546; Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56; Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235; Trends Biotechnol (2003):21:484-490; WO 2005/035572; WO 03/035694; Febs Lett (1994) 339:285-290; WO00/29004; WO 02/051870).
Termin „monoklonsko antitelo”, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo, dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačnih antitela, koja čine populaciju sa identičnim i/ili se vezuju za isti epitop, osim za moguće varijante koje mogu nastati tokom proizvodnje monoklonskog antitela, a takve su varijante uopšteno prisutne u manjim količinama. Nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopa), svako monoklonsko antitelo je usmereno protiv jedne determinante na antigenu. Pored specifičnosti, prednost monoklonskih antitela je što nisu kontaminirana drugim imunoglobulinima. Reč „monoklonska” ukazuje na karakter antitela koje je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela i ne treba da se tumači tako da se zahteva proizvodnja antitela nekim određenim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja se koriste u skladu sa ovde datim postupcima mogu biti napravljena postupkom hibridoma, koju su prvi opisali Kohler i dr., Nature, 256:495 (1975) ili se mogu napraviti postupcima rekombinantne DNK (pogledati npr. U.S. Patent No.
4,816,567). „Monoklonska antitela” se takođe mogu izolovati iz kolekcije antitela faga, pomoću tehnika opisanih u npr.: Clackson i dr., Nature 352:624-628 (1991) i Marks i dr., J. Mol. Biol.222:581-597 (1991).
Monoklonska antitela ovde specifično uključuju „himerna” antitela (imunoglobuline), kod kojih je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homologan sa odgovarajućim sekvencama antitela dobijenih od određenih vrsta, ili koji pripadaju naročitoj klasi ili potklasi antitela, dok je ostatak lan(a)ca identičan ili homologan sa odgovarajućim sekvencama antitela dobijenih od drugih vrsta, ili koje pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok oni ispoljavaju željenu biološku aktivnost (U.S. Patent No.
4,816,567; Morrison i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Himerna antitela od interesa ovde obuhvataju „primatizovana” antitela, koja sadrže antigen-vezujuće sekvence varijabilnog domena, izvedene iz nehumanih primata (npr. majmun iz starog sveta, kao što je pavijan, rezus ili cinomolgus majmun) i sekvence humanog konstantnog regiona (US Pat. No.5,693,780).
„Humanizovani” oblici nehumanih (npr. mišjih) antitela su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu dobijenu iz nehumanog imunoglobulina. Najvećim delom, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (antitelo primalac) kod kojih su ostaci hipervarijabilnog regiona primaoca zamenjeni ostacima hipervarijabilnog regiona nehumane vrste (donorsko antitelo), kao što je miš, pacov, zec ili nehumani primat koji ima željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci okvirnog regiona (FR) humanog imunoglobulina zamenjeni su odgovarajućim nehumanim ostacima. Nadalje, humanizovana antitela mogu da uključe ostatke koji nisu nađeni u antitelu primaocu ili u donorskom antitelu. Te modifikacije su načinjene kako bi se dodatno preradilo dejstvo antitela. Uopšteno, humanizovano antitelo će obuhvatati suštinski sve od bar jednog, a tipično dva, varijabilna domena, kod kojih sve ili suštinski sve hipervarijabilne petlje odgovaraju onima nehumanog imunoglobulina, a svi ili suštinski svi FR su od sekvence humanog imunoglobulina, osim FR supstitucije (sipstitucija), kao što je gore navedeno. Humanizovano antitelo će opciono takođe da obuhvati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina, tipično humanog imunoglobulina. Za više detalja pogledajte: Jones i dr., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann i dr., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
Za potrebe ovog dokumenta, „netaknuto antitelo” je ono koje sadrži teške i lake varijabilne domene, kao i Fc region. Konstantni domeni mogu biti konstantni domeni nativne sekvence (npr. konstantni domeni humane nativne sekvence) ili varijanta aminokiselinske sekvence od toga. Poželjno, netaknuto antitelo ima jednu ili više efektorskih funkcija.
„Nativna antitela” su obično heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. Svaki laki lanac je povezan sa teškim lancem pomoću jedne kovalentne disulfidne veze, dok broj disulfidnih veza varira između teških lanaca različitih imunoglobulinskih izotipova. Svaki teški i laki lanac takođe ima pravilno razmaknute intralančane disulfidne mostove. Svaki teški lanac ima na jednom kraju varijabilni domen (VH), praćen nizom konstantnih domena. Svaki laki lanac ima varijabilni domen na jednom kraju (VL) i konstantni domen na drugom kraju; konstantni domen lakog lanca je poravnat sa prvim konstantnim domenom teškog lanca, a varijabilni domen lakog lanca je poravnat sa varijabilnim domenom teškog lanca. Veruje se da određeni aminokiselinski ostaci formiraju interfejs između varijabilnih domena lakog i teškog lanca.
„Golo antitelo” je antitelo (kao što je ovde definisano) koje nije konjugovano sa heterolognim molekulom, kao što je citotoksični deo ili radiološka oznaka.
U nekim primerima izvođenja, „efektorske funkcije” antitela odnose se na one biološke aktivnosti koje se pripisuju Fc regionu (Fc region nativne sekvence ili varijante Fc regiona aminokiselinske sekvence) antitela, i koje variraju sa izotipom antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: Vezivanje C1q i citotoksičnost zavisnu od komplementa; Fc receptorsko vezivanje; ćelijski-posredovanu citotoksičnost zavisno od antitela (ADCC); fagocitozu; nishodnu regulaciju površinskih ćelijskih receptora.
„Ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela” i „ADCC” se odnosi na reakciju posredovanu ćelijama u kojoj nespecifične citotoksične ćelije koje eksprimiraju Fc receptore (FcR) (npr. prirodne ubojite (NK) stanice, neutrofili i makrofagi) prepoznaju vezano antitelo na ciljnu ćeliju i zatim izazvati liziju ciljne ćelije. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo FcγRIII, dok monociti eksprimiraju FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Izraz FcR na hematopoetskim ćelijama je rezimiran u tabeli br.3 na strani 464 Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). Da bi se procenila aktivnost ADCC molekula od interesa, in vitro ADCC test može se izvršiti kao što je opisano u US Patentu br.5,500,362 ili 5,821,337. Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost željenog molekula može se odrediti uživo, npr. na životinjskom modelu, kao što je onaj koji su objavili Clynes i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998).
„Ljudske efektorske ćelije” su leukociti koji izražavaju jedan ili više FcR i izvršavaju efektorske funkcije. U nekim primerima izvođenja, ćelije eksprimiraju najmanje FcγRIII i vrše ADCC efektorsku funkciju. Primeri ljudskih leukocita koji posreduju ADCC uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), ćelije prirodne ubice (NK), monocite, citotoksične T ćelije i neutrofile; sa PBMC i NK ćelijama koje su poželjne.
Termini „Fc receptor” ili „FcR” se koriste za opisivanje receptora koji se vezuje za Fc region antitela. U nekim primerima izvođenja, FcR je humani FcR nativne sekvence. Štaviše, poželjan FcR je onaj koji vezuje IgG antitelo (gama receptor) i uključuje receptore FcγRI, FcγRII i FcγRIII potklase, uključujući alelne varijante i alternativno spojene oblike ovih receptora. FcγRII receptori uključuju FcγRIIA („aktivacijski receptor”) i FcγRIIB („inhibitorni receptor”), koji imaju slične aminokiselinske sekvence koje se prvenstveno razlikuju u svojim citoplazmatskim domenima. Aktiviranje receptora FcγRIIA sadrži imunoreceptorski motiv za aktivaciju na bazi tirozina (ITAM) u svom citoplazmatskom domenu. Inhibitorski receptor FcγRIIA sadrži imunoreceptorski motiv za aktivaciju na bazi tirozina (ITAM) u svom citoplazmatskom domenu. (videti Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). FcRs su razmotreni u Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel i dr., Immunomethods 4:25-34 (1994); i u de Haas i dr., J. Lab. Clin. Med.126:330-41 (1995). Ostali FcR, uključujući i one koji će se identifikovati u budućnosti, ovde su obuhvaćeni terminom „FcR”. Termin takođe uključuje neonatalni receptor, FcRn, koji je odgovoran za prenos majčinih IgG na fetus (Guyer i dr., J. Immunol. 117:587 (1976) i Kim i dr., J. Immunol. 24:249 (1994)).
Termin „sekvencijalno”, kako se ovde koristi u vezi sa hromatografijom, odnosi se na prvu hromatografiju koja je praćena drugom hromatografijom. Dodatni koraci mogu biti uključeni između prve hromatografije i druge hromatografije.
Termin „kontinuirani”, kako se ovde koristi u vezi sa hromatografijom, odnosi se na prvi hromatografski materijal i drugi hromatografski materijal koji je direktno povezan ili na neki drugi mehanizam koji omogućava kontinuirani protok između dva hromatografska materijala.
„kontaminati” se odnosi na materijale koji se razlikuju od željenog polipeptidnog proizvoda. kontaminat uključuje, bez ograničenja: materijale ćelija domaćina, kao što je CHOP; izlučeni protein A; nukleinsku kiselinu; varijantu, fragment, agregat ili derivat željenog polipeptida; drugi polipeptid; endotoksin; viralni kontaminat; komponentu medija za kulturu ćelija, itd. U nekim primerima, kontaminat može biti protein ćelije domaćina (HCP) iz, na primer, ali ne ograničavajući se na, bakterijske ćelije kao što je ćelija E. coli, ćelije insekta, prokariotske ćelije, eukariotske ćelije, ćelije kvasca, ćelije sisara, ptičje ćelija, ćelije gljivica.
„Dinamički kapacitet vezivanja” hromatografskog materijala je količina proizvoda, npr. polipeptida, materijal će se vezati pod stvarnim uslovima protoka pre nego što dođe do značajnog prodora nevezanog proizvoda.
„Koeficijent podele”, Kp, kako se ovde koristi, odnosi se na molarnu koncentraciju proizvoda, npr. polipeptida, u stacionarnoj fazi podeljenoj sa molarnom koncentracijom proizvoda u mobilnoj fazi.
„Gustina opterećenja” se odnosi na količinu, npr. grama, kompozicije stavljene u kontakt sa zapreminom hromatografskog materijala, npr. litara. U nekim primerima gustina punjenja izražena je u g/L.
Referenca za vrednosti „oko” ili parametra ovde obuhvata (i opisuje) varijacije koje su usmerene na tu vrednost ili parametar po sebi. Na primer, opis koji se odnosi na „oko X” uključuje opis „X”.
Kako se ovde koristi i u priloženim patentnim zahtevima, oblici u jednini „jedan”, „ili” i „taj” podrazumevaju oblike i u množini, osim ako kontekst izričito ne nalaže drugačije. Podrazumeva se da aspekti i varijacije pronalaska koji su ovde opisani, obuhvataju „sastoje se” i/ili „sastoje se u suštini od” aspekata i varijacija.
II. Postupci prečišćavanja
Ovde su obezbeđeni postupci za prečišćavanje proizvoda, kao što je polipeptid, iz kompozicije koja sadrži proizvod i najmanje jednog kontaminata korišćenjem hromatografije preopterećenja i eluata (OEC). OEC obezbeđuje način rada gde se koristi od različitih načina hromatografije ostvaruju u okviru jednog hromatografskog načina. OEC se može primeniti na više smola, a istovremeno obezbeđuje poboljšano uklanjanja nečistoća i značajne proizvodne prednosti, kao što su manje kolone, bolja montaža postrojenja i niži troškovi. OEC način rada može se podeliti na tri različite komponente.
1. Preopterećenje – kompozicija se nanosi na hromatografski materijal tako da se proizvod, npr. polipeptid, nanosi na hromatografski materijal u količini koja prelazi dinamički kapacitet vezivanja (DBC) materijala za proizvod. U nekim primerima izvođenja, uslovi punjenja, kao što su pH i provodljivost, određeni su tamo gde se nečistoće jako vežu za hromatografski materijal. U nekim primerima izvođenja, uslovi za hromatografiju su izabrani tako da, čak i ako se proizvod probije nakon vezivanja, većina, ako ne i sve nečistoća, to ne čine. U nekim primerima izvođenja, kompozicija se nanosi na ili blizu DBC materijala za jedan ili više kontaminata. Režim preopterećenja omogućava da se hromatografski materijal koristi izvan tipičnog DBC materijala za proizvod.
2. Udruživanje – udruživanje proizvoda, npr. polipeptida, u eluatu počinje kod prodora proizvoda. Pošto su uslovi punjenja takvi da se nečistoće nastavljaju vezivati tokom faze proboja, u eluatu se može dobiti čisti bazen proizvoda tokom hromatografije faze punjenja.
3. Eluiranje – po završetku punjenja kompozicije na hromatografskom materijalu, proizvod, npr. polipeptid, eluira se iz hromatografskog materijala korišćenjem eluacionih uslova koji su identifikovani tako da vezani proizvod eluira dok je većina nečistoća vezana za hromatografski materijal.
U nekim aspektima, OEC povećava iskorišćenost hromatografskog materijala znatno iznad DBC materijala za proizvod i na taj način obezbeđuje prednost u poređenju sa drugim hromatografskim postupcima. Na primer, upotreba 10-strukog hromatografskog materijala može dovesti do znatno niže cene.
Za razliku od tradicionalne hromatografije vezanja i eluiranja, gde je punjenje hromatografskog materijala optimizovano da maksimizuje vezivanje za proizvod, npr. polipeptid, do hromatografske smole, u OEC uslovima punjenja mogu biti optimizovani da maksimizuju vezivanje kontaminata za hromatografski materijal i ne vezuju proizvod za hromatografski materijal. U nekim aspektima, kompozicija se nanosi na hromatografski materijal u količini koja prelazi dinamički kapacitet vezivanja hromatografskog materijala za proizvod. U procesu punjenja hromatografskog materijala, neki od proizvoda će se probiti u ispiranju, a neki od proizvoda će ostati vezan za hromatografski materijal. Po završetku punjenja, preostali proizvod vezan za hromatografski materijal može da se eluira iz hromatografskog materijala. U nekim primerima izvođenja gorenavedenog, hromatografski materijal je hromatografska kolona. U nekim primerima izvođenja gorenavedenog, hromatografski materijal je hromatografska membrana.
U nekim aspektima pronalaska, kompozicija se nanosi na hromatografski materijal pri dinamičkom kapacitetu vezivanja hromatografskog materijala za jedan ili više kontaminata u kompoziciji. U nekim primerima izvođenja, kompozicija se nanosi na hromatografski materijal u količini koja prelazi kapacitet vezivanja hromatografskog materijala za proizvod. U nekim primerima izvođenja, kompozicija se nanosi na hromatografski materijal pri približno dinamičkom kapacitetu vezivanja hromatografskog materijala za jedan ili više kontaminata i prekoračuje kapacitet vezivanja hromatografskog materijala za proizvod. U nekim primerima izvođenja, kompozicija se nanosi na hromatografski materijal 20 puta DBC hromatografskog materijala za proizvod. U nekim primerima izvođenja, kompozicija se nanosi na hromatografski materijal 100 puta DBC hromatografskog materijala za proizvod. U nekim primerima izvođenja, kompozicija se nanosi na hromatografski materijal pri približno dinamičkom kapacitetu vezivanja hromatografskog materijala za sve kontaminate u kompoziciji. U nekim primerima izvođenja, kompozicija se nanosi na hromatografski materijal pri približno dinamičkom kapacitetu vezivanja hromatografskog materijala za sve kontaminate i prekoračuje kapacitet vezivanja hromatografskog materijala za proizvod. U nekim primerima izvođenja, kompozicija se nanosi na hromatografski materijal na manje od dinamičkog kapacitetg vezivanja hromatografskog materijala za sve kontaminate i prekoračuje kapacitet vezivanja hromatografskog materijala za proizvod. U nekim primerima izvođenja gorenavedenog, hromatografski materijal je u hromatografskoj koloni. U nekim primerima izvođenja, hromatografska kolona je kolona za hromatografiju industrijskih razmera. U nekim primerima izvođenja gorenavedenog, hromatografski materijal je hromatografska membrana.
Dinamički kapacitet vezivanja hromatografskog materijala za proizvod i za jedan kontaminat ili više kontaminata može se proceniti određivanjem koeficijenta raspodele (Kp) za proizvod ili kontaminate kao funkcija koncentracije pH i kontrajona za određeni hromatografski materijal. Na primer, može se odrediti dinamički kapacitet vezivanja hromatografskog materijala, npr. smole mešanim načinom, za polipeptid. Stvarni kapacitet vezivanja hromatografskog materijala za proizvod ili kontaminat pri specifičnoj kombinaciji pH i koncentracije kontrajona može se odrediti izazivanjem vezivanja sa viškom proizvoda i/ili kontaminata.
Uslovi za OEC određene kompozicije koja sadrži proizvod, kao što je polipeptid i kontaminat, mogu se odrediti merenjem Kpi dinamičkog kapaciteta vezivanja određenog hromatografskog materijala pri različitim koncentracijama pH i kontrajona. Visokopropusni skrining se može sprovesti da bi se odredili OEC uslovi gde je vezanje kontaminata veliko i gde se proizvod može eluirati bez eluiranja većine, ako ne i svih kontaminata. Na primer, kompozicija može biti inkubirana sa hromatografskim materijalom u puferu pri različitim koncentracijama pH i kontrajonima pod sistemom visokog protoka; na primer, u bazenčićima ploče sa višestrukim bunarčićima. Nakon perioda inkubacije, supernatant je odvojen od hromatografskog materijala i određena je količina proizvoda ili kontaminata u supernatantu. U nekim primerima izvođenja, niske koncentracije kompozicije se koriste za određivanje Kp. U nekim primerima izvođenja, visoke koncentracije kompozicije se koriste za određivanje dinamičkih sposobnosti vezivanja.
Pored pružanja informacija u vezi sa Kpi dinamičkim kapacitetom vezivanja hromatografskog materijala za određene proizvode i kontaminate, visokopropusni skrining obezbeđuje smernice za punjenje i eluiranje uslova u smislu pH i koncentracije kontrajona. Na primer, U nekim primerima izvođenja, pufer za punjenje je odabran putem visokopropusnog skrininga za koncentraciju pH i kontrajona da bi se maksimizovalo vezivanje kontaminata za hromatografski materijal, ali i da se maksimizuje količina proizvoda, npr. polipeptida, u eluentu, uz minimizovanje količine kontaminata, npr. protein ćelije domaćina, u eluentu. U nekim primerima izvođenja, kompozicija se nanosi na hromatografski materijal pri pH i određene provodljivosti visokopropusnim skriningom, pri čemu se svi kontaminati u kompoziciji vezuju za hromatografski materijal. U nekim primerima izvođenja, proizvod se eluira iz hromatografskog materijala pri pH i određene provodljivosti visokopropusnim skriningom, pri čemu su svi eluati proizvoda iz hromatografskog materijala i oko svih kontaminata vezani za hromatografski materijal.
U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupke za identifikaciju radnih uslova (npr. korišćenjem tehnike visokopropusnog skrininga) koje uzrokuju da hromatografski materijal veže maksimalnu količinu kontaminata bez obzira na količinu vezanog proizvoda po mL hromatografskog materijala. Korak skrininga se koristi da bi se identifikovali uslovi eluiranja, tako da se vezani proizvod eluira iz hromatografskog materijala, a nečistoće ostaju čvrsto vezane za hromatografski materijal.
U nekim primerima izvođenja bilo kog od ovdeopisanih postupaka, hromatografski materijal je materijal mešovitog načina koji sadrži funkcionalne grupe sposobne za jednu od više sledećih funkcionalnosti: anjonsku razmenu, katjonsku razmenu, vodoničnu vezu i hidrofobne interakcije. U nekim primerima izvođenja, materijal mešovitog načina sadrži funkcionalne grupe sposobne za anjonsku razmenu i hidrofobne interakcije. Materijal mešovitog načina može da sadrži N-benzil-N-metil etanolamin, 4-merkapto-etil-piridin, heksilamin ili fenilpropilamin kao ligand ili sadrži umreženi polialilamin. Primeri materijala mešovitog načina su „Capto Adhere” smola, „QMA” smola, „Capto MMC” smola, „MEP HyperCel” smola, „HEA HyperCel” smola, „PPA HyperCel” smola, ili „ChromaSorb” membrana ili „Sartobind STIC”. U nekim primerima izvođenja, materijal mešovitog načina je „Capto Adhere” smola. U nekim primerima izvođenja gorenavedenog, materijal mešovitog načina je hromatografska kolona sa mešovitim načinom. U nekim primerima izvođenja gorenavedenog, materijal mešovitog načina je membrana sa mešovitim načinom.
Punjenje kompozicije na hromatografski materijal može biti optimizovano za odvajanje proizvoda od kontaminata pomoću OEC. U nekim primerima izvođenja, proizvod je polipeptid. U nekim primerima izvođenja, punjenje kompozicije na hromatografski materijal je optimizovano za vezivanje kontaminata za hromatografski materijal. Na primer, kompozicija može biti nanesena na hromatografski materijal, npr. hromatografsku kolonu, u puferu za opterećenje pri broju različitih pH dok je provodljivost pufera za punjenje konstantna. Alternativno, kompozicija može biti nanesena na hromatografski materijal u puferu za punjenje na više različitih provodljivosti, dok je pH pufera za punjenje konstantan. Po završetku punjenja kompozicije na hromatografskom materijalu i eluiranja proizvoda iz hromatografskog materijala u frakciju bazena, količina kontaminata u frakciji bazena daje informacije koje se odnose na odvajanje proizvoda od zagađivača za dati pH ili provodljivost. U nekim primerima izvođenja, bilo kog od postupaka koji su ovde opisani, kompozicija se nanosi na hromatografski materijal pri gustini punjenja polipeptida većoj od oko 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 100 g/L, 110 g/L, 120 g/L, 130 g/L, 140 g/L, 150 g/L, 160 g/L, 170 g/L, 180 g/L, 190 g/L, 200 g/L, 300 g/L, 400 g/L, 500 g/L, 550 g/L, 600 g/L, 650 g/L, 700 g/L, 800 g/L, 900 g/L, 1000 g/L, 2000 g/L ili 5000 g/L materijala za hromatografiju. U nekim primerima izvođenja, kompozicija se nanosi na hromatografski materijal pri gustini punjenja polipeptida od oko 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 100 g/L, 110 g/L, 120 g/L, 130 g/L, 140 g/L, 150 g/L, 160 g/L, 170 g/L, 180 g/L, 190 g/L, 200 g/L, 300 g/L, 400 g/L, 500 g/L, 550 g/L, 600 g/L, 650 g/L, 700 g/L, 800 g/L, 900 g/L, 1000 g/L ili 2000 g/L materijala za hromatografiju. Kompozicija može biti nanesena na hromatografski materijal pri gustini punjenja polipeptida od oko 30 g/L i 2000 g/L, 30 g/L i 1000 g/L, 30 g/L i 200 g/L, 30 g/L i 180 g/L, 50 g/L i 2000 g/L, 50 g/L i 1000 g/L, 50 g/L i 200 g/L, 50 g/L i 180 g/L, 150 g/L i 2000 g/L, 150 g/L i 1500 g/L, 150 g/L i 1000 g/L, 200 g/L i 1000 g/L, 200 g/L i 1500 g/L, 300 g/L i 1500 g/L, 400 g/L i 1000 g/L, ili 500 g/L i 1000 g/L materijala za hromatografiju.
U nekim primerima izvođenja, bilo kog od postupaka koji su ovde opisani, kompozicija se nanosi na hromatografski materijal mešanog načina pri gustini punjenja polipeptida većoj od oko 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 100 g/L, 110 g/L, 120 g/L, 130 g/L, 140 g/L, 150 g/L, 160 g/L, 170 g/L, 180 g/L, 190 g/L, 200 g/L, 300 g/L, 400 g/L, 500 g/L, 550 g/L, 600 g/L, 650 g/L, 700 g/L, 800 g/L, 900 g/L, 1000 g/L, 2000 g/L ili 5000 g/L materijala za hromatografiju mešanog načina. U nekim primerima izvođenja, kompozicija se nanosi na hromatografski materijal mešanog načina pri gustini punjenja polipeptida od oko 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 100 g/L, 110 g/L, 120 g/L, 130 g/L, 140 g/L, 150 g/L, 160 g/L, 170 g/L, 180 g/L, 190 g/L, 200 g/L, 300 g/L, 400 g/L, 500 g/L, 550 g/L, 600 g/L, 650 g/L, 700 g/L, 800 g/L, 900 g/L, 1000 g/L ili 2000 g/L materijala za hromatografiju mešanog načina. Kompozicija može biti nanesena na hromatografski materijal mešanog načina pri gustini punjenja polipeptida od oko 30 g/L i 2000 g/L, 30 g/L i 1000 g/L, 30 g/L i 200 g/L, 30 g/L i 180 g/L, 50 g/L i 2000 g/L, 50 g/L i 1000 g/L, 50 g/L i 200 g/L, 50 g/L i 180 g/L, 150 g/L i 2000 g/L, 150 g/L i 1500 g/L, 150 g/L i 1000 g/L, 200 g/L i 1000 g/L, 200 g/L i 1500 g/L, 300 g/L i 1500 g/L, 400 g/L i 1000 g/L, ili 500 g/L i 1000 g/L materijala za hromatografiju mešanog načina. U nekim primerima izvođenja, polipeptid se nanosi na hromatografski materijal pri gustini od 70 g/L do 180 g/L. U nekim primerima izvođenja ovog pronalaska, hromatografija mešanog režima je „Capto Adhere” smola. U nekim primerima izvođenja, polipeptid se nanosi na „Capto Adhere” hromatografski materijal pri gustini od 70 g/L do 180 g/L. U daljim primerima izvođenja gorenavedenih realizacija, polipeptid je antitelo ili njegov fragment.
Goreopisani postupci mogu dalje obuhvatati korak punjenja na materijal za afinitetnu hromatografiju proteina A. U nekim primerima izvođenja polipeptidni proizvod je antitelo ili fragment od toga koji je prvo prečišćen afinitetnom hromatografijom proteina A pre OEC. Korak punjenja na Protein A hromatografski materijal je uopšteno, ali ne i nužno, izveden pre drugog (drugih) koraka hromatografije. U nekim primerima izvođenja, korak punjenja na Protein A afinitetni hromatografski materijal se može kombinovati sa sekvencijalnim koracima preopterećene razmene i eluatskom hromatografijom. U nekim primerima izvođenja, sekvencijalni koraci su kontinuirani. U nekim primerima izvođenja, kontinuirano prečišćavanje koristi istu brzinu protoka, provodljivosti i/ili pH.
Eluiranje proizvoda kao što je polipeptid iz hromatografskog materijala pod OEC načinom može biti optimizovano za prinos proizvoda sa minimalnim kontaminatima i na minimalnoj zapremini bazena. Na primer, kompozicija može biti nanesena na hromatografski materijal, npr. hromatografsku kolonu, u puferu za punjenje. Po završetku punjenja, proizvod se eluira puferima na više različitih pH dok je provodljivost pufera za eluiranje konstantna. Alternativno, proizvod se može eluirati iz hromatografskog materijala u puferu za eluiranje na više različitih provodljivosti dok je pH pufera za eluiranje konstantna. Po završetku eluiranja proizvoda iz hromatografskog materijala, količina zagađivača u frakciji bazena daje informacije koje se odnose na odvajanje proizvoda od zagađivača za datu pH ili provodljivost. Eluiranje proizvoda u velikom broju frakcija (npr. osam zapreminskih kolona) označava „rep” profila eluiranja. U nekim primerima izvođenja ovog pronalaska, rep eluiranja je sveden na minimum.
Različiti puferi koji se mogu koristiti zavise, na primer, od željenog pH pufera, željene provodljivosti pufera, karakteristika proteina od interesa i postupaka prečišćavanja. U nekim primerima izvođenja bilo kojih ovdeopisanih postupaka, postupci obuhvataju upotrebu pufera. Pufer može biti pufer za punjenje, pufer za ekvilibraciju ili pufer za ispiranje. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više pufera za punjenje, pufer za ekvilibraciju i/ili pufer za ispiranje su isti. U nekim primerima izvođenja, pufer za punjenje, pufer za ekvilibraciju i/ili pufer za ispiranje su različiti. U nekim primerima izvođenja, bilo kog od ovde opisanih postupaka, pufer sadrži so. Pufer za punjenje može da sadrži natrijum-hlorid, natrij-acetat ili smešu od toga. U nekim primerima izvođenja, pufer za punjenje je pufer natrijum hlorida. U nekim primerima izvođenja, pufer za punjenje je pufer natrijum acetata.
Punjenje, kako se ovde koristi, predstavlja kompoziciju napunjenu na hromatografski materijal. Pufer za punjenje je pufer koji se koristi za punjenje kompozicije koja sadrži željeni proizvod na hromatografski materijal. Materijal za hromatografiju može se uravnotežiti sa puferom za ekvilibraciju pre punjenja kompozicije koju treba prečistiti. U nekim primerima, pufer za ispiranje se koristi nakon punjenja kompozicije na hromatografski materijal i pre eluiranja polipeptida od interesa iz čvrste faze. Međutim, neki od proizvoda od interesa, npr. polipeptid, može se ukloniti iz materijala za hromatografiju pomoću pufera za ispiranje (npr. sličan režim protoka).
Elucija, kako se ovde koristi, uklanjanje je proizvoda, npr. polipeptida, iz materijala za hromatografiju. Pufer za ispiranje je pufer koji se koristi za eluiranje polipeptida ili drugog proizvoda od interesa iz hromatografskog materijala. U mnogim slučajevima, pufer za eluiranje ima različite fizičke karakteristike od pufera za punjenje. Na primer, pufer za eluiranje može imati različitu provodljivost od pufera za punjenje ili različit pH od pufera za punjenje. U nekim primerima izvođenja, pufer za eluiranje ima manju provodljivost od pufera za punjenje. U nekim primerima izvođenja otkrića, pufer za eluiranje ima veću provodljivost od pufera za punjenje. U nekim primerima izvođenja, pufer za eluiranje ima niži pH od pufera za punjenje. U nekim primerima izvođenja, pufer za eluiranje ima viši pH od pufera za punjenje. U nekim primerima izvođenja, pufer za eluiranje ima različitu provodljivost i različit pH od pufera za punjenje. Pufer za eluiranje može imati bilo koju kombinaciju niže provodljivosti i višeg ili nižeg pH.
Provodljivost se odnosi na sposobnost vodenog rastvora da provodi električnu struju između dvije elektrode. U rešenju, struja teče transportom jona. Zbog toga, sa povećanom količinom jona prisutnih u vodenom rastvoru, rastvor će imati veću provodljivost. Osnovna merna jedinica za provodljivost je Simens (ili mho), mho (mS/cm), i može se meriti pomoću merila provodljivosti, kao što su različiti modeli Orionovih merila provodljivosti. Pošto je elektrolitička provodljivost kapacitet jona u rastvoru da nose električnu struju, provodljivost rastvora može se promeniti promenom koncentracije jona u njoj. Na primer, koncentracija puferskog agensa i/ili koncentracije soli (npr. natrijum-hlorid, natrijum-acetat ili kalijumhlorid) u rastvoru može biti promenjen da bi se postigla željena provodljivost. Poželjno je da je koncentracija soli različitih pufera modifikovana da bi se postigla željena provodljivost.
U nekim primerima izvođenja, bilo kog od ovde opisanih postupaka, pufer za punjenje ima provodljivost veću od bilo koje od 4,0 mS/cm, 4,5 mS/cm, 5,0 mS/cm, 5,5 mS/cm, 6,0 mS/cm, 6,5 mS/cm, 7,0 mS/cm, 7,5 mS/cm, 8,0 mS/cm, 8,5 mS/cm, 9,0 mS/cm, 9,5 mS/cm, ili 10 mS/cm. Provodljivost može biti između bilo koje od 4 mS/cm i 17 mS/cm, 4 mS/cm i 10 mS/cm, 4 mS/cm i 7 mS/cm, 5 mS/cm i 17 mS/cm, 5 mS/cm i 10 mS/cm ili 5 mS/cm i 7 mS/cm. U nekim primerima izvođenja, provodljivost je oko 4 mS/cm, 4,5 mS/cm, 5,0 mS/cm, 5,5 mS/cm, 6,0 mS/cm, 6,5 mS/cm, 7,0 mS/cm, 7,5 mS/cm, 8,0 mS/cm, 8,5 mS/cm, 9,0 mS/cm, 9,5 mS/cm, ili 10 mS/cm. U jednom aspektu, provodljivost je provodljivost pufera za punjenje, pufera za ekvilibraciju i/ili pufera za ispiranje. U nekim primerima izvođenja, provodljivost jednog ili više pufera za punjenje, pufera za ekvilibraciju i pufera za ispiranje su isti. U nekim primerima izvođenja, provodljivost pufera za punjenje je različita od provodljivosti pufera za ispiranje i/ili pufera za ekvilibraciju. U nekim primerima izvođenja, kompozicija se nanosi na hromatografski materijal mešanog načina u puferu sa provodnošću od oko 5,5 mS/cm. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je antitelo ili fragment od toga.
U nekim primerima izvođenja, pufer za eluiranje ima provodljivost manju od provodljivosti pufera za punjenje. U nekim primerima izvođenja, bilo kog od ovde opisanih postupaka, pufer za eluiranje ima provodljivost manju od bilo koje od 0,0 mS/cm, 0,5 mS/cm, 1,0 mS/cm, 1,5 mS/cm, 2,0 mS/cm, 2,5 mS/cm, 3,0 mS/cm, 3,5 mS/cm, 4,0 mS/cm, 4,5 mS/cm, 5,0 mS/cm, 5,5 mS/cm, 6,0 mS/cm, 6,5 mS/cm, ili 7,0 mS/cm. Provodljivost može biti između bilo koje od 0 mS/cm i 7 mS/cm, 1 mS/cm i 7 mS/cm, 2 mS/cm i 7 mS/cm, 3 mS/cm i 7 mS/cm, ili 4 mS/cm i 7 mS/cm, 0 mS/cm i 5.0 mS/cm, 1 mS/cm i 5 mS/cm, 2 mS/cm i 5 mS/cm, 3 mS/cm i 5 mS/cm, ili 4 mS/cm i 5 mS/cm. U nekim primerima izvođenja, provodljivost pufera za eluiranje je oko bilo kog od 0,0 mS/cm, 0,5 mS/cm, 1,0 mS/cm, 1,5 mS/cm, 2,0 mS/cm, 2,5 mS/cm, 3,0 mS/cm, 3,5 mS/cm, 4 mS/cm, 4,5 mS/cm, 5,0 mS/cm, 5,5 mS/cm, 6,0 mS/cm, 6,5 mS/cm, ili 7,0 mS/cm. U nekim primerima izvođenja, goreopisani puferi za eluiranje se koriste u OEC mešovitom načinu.
U nekim primerima izvođenja otkrića, pufer za eluiranje ima provodljivost veću od provodljivosti pufera za punjenje. U nekim primerima izvođenja, bilo kog od ovde opisanih postupaka, pufer za eluiranje ima provodljivost veću od bilo koje od 5,5 mS/cm, 6,0 mS/cm, 6,5 mS/cm, 7,0 mS/cm, 7,5 mS/cm, 8,0 mS/cm, 8,5 mS/cm, 9,0 mS/cm, 9,5 mS/cm, 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, 17,0 mS/cm, 18,0 mS/cm, 19,0 mS/cm, 20,0 mS/cm, 21,0 mS/cm, 22,0 mS/cm, 23,0 mS/cm, 24,0 mS/cm ili 25,0 mS/cm. Provodljivost može biti između bilo koje od 5,5 mS/cm i 17 mS/cm, 6,0 mS/cm i 17 mS/cm, 7 mS/cm i 17 mS/cm, 8 mS/cm i 17 mS/cm, 9 mS/cm i 17 mS/cm ili 10 mS/cm i 17 mS/cm. U nekim primerima izvođenja, provodljivost pufera za eluiranje je oko bilo kog od 5,5 mS/cm, 6,0 mS/cm, 6,5 mS/cm, 7,0 mS/cm, 7,5 mS/cm, 8,0 mS/cm, 8,5 mS/cm, 9,0 mS/cm, 9,5 mS/cm, 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, ili 17,0 mS/cm. U nekim primerima izvođenja otkrića, goreopisani puferi za eluiranje se koriste u OEC mešovitom načinu rada. U nekim primerima izvođenja otkrića, polipeptid se eluira iz hromatografije sa mešovitim načinom pri provodljivosti od oko 4 do oko 1 mS/cm. U nekim primerima izvođenja otkrića, polipeptid se eluira iz „Capto Adhere” hromatografije pri provodljivosti od oko 4 do oko 1 mS/cm. U nekim primerima izvođenja otkrića, antitelo ili fragment od njega se eluira iz „Capto Adhere” hromatografije na provodljivosti od oko 4 mS/cm do oko 1 mS/cm.
U nekim aspektima otkrića, provodljivost pufera za eluiranje je promenjena od pufera za punjenja i/ili ispiranje po stepenastom ili linearnom gradijentu.
U nekim primerima izvođenja pronalaska, kompozicija koja sadrži polipeptid se nanosi na hromatografski materijal u puferu sa provodljivošću od oko 5,5 mS/cm i polipeptid se eluira sa hromatografskog materijala u puferu za eluiranje sa provodljivošću od oko 4 mS/cm. U nekim primerima izvođenja, pufer za punjenje ima provodljivost od oko 5,5 mS/cm a pufer za eluiranje ima provodljivost od oko 3 mS/cm. U nekim primerima izvođenja, pufer za punjenje ima provodljivost od oko 5,5 mS/cm a pufer za eluiranje ima provodljivost od oko 2 mS/cm. U nekim primerima izvođenja, pufer za punjenje ima provodljivost od oko 5,5 mS/cm a pufer za eluiranje ima provodljivost od oko 1 mS/cm. U daljem primeru izvođenja, gorenavedenih realizacija, hromatografski materijal je „Capto Adhere” smola. U daljem primeru izvođenja, gorenavedenih realizacija, polipeptid je antitelo ili njegov fragment.
U nekim aspektima otkrića, provodljivost pufera za eluiranje je promenjena od pufera za punjenja i/ili ispiranje po stepenastom ili linearnom gradijentu. U nekim primerima izvođenja otkrića, kompozicija koja sadrži polipeptid se nanosi na „Capto Adhere” hromatografiju na oko 5,5 mS/cm i polipeptid od interesa se eluira iz „Capto Adhere” hromatografije linearnim gradijentom provodljivosti od oko 5,5 mS/cm do oko 1 mS/cm preko oko 5 zapremina kolone (CV). U nekim primerima izvođenja otkrića, kompozicija koja sadrži polipeptid se nanosi na „Capto Adhere” hromatografiju na oko 5,5 mS/cm i polipeptid od interesa se eluira iz „Capto Adhere” hromatografije linearnim gradijentom provodljivosti od oko 5,5 mS/cm do oko 1 mS/cm preko 10,0 CV. U nekim primerima izvođenja otkrića, kompozicija koja sadrži polipeptid se nanosi na „Capto Adhere” hromatografiju na oko 10 mS/cm i polipeptid od interesa se eluira iz „Capto Adhere” hromatografije linearnim gradijentom provodljivosti od oko 10,0 mS/cm do oko 1 mS/cm preko 5 CV. U nekim primerima izvođenja otkrića, kompozicija koja sadrži polipeptid se nanosi na „Capto Adhere” hromatografiju na oko 10 mS/cm i polipeptid od interesa se eluira iz „Capto Adhere” hromatografije linearnim gradijentom provodljivosti od oko 10,0 mS/cm do 1 mS/cm preko oko 10 CV. U nekim primerima izvođenja otkrića, kompozicija koja sadrži polipeptid se nanosi na „Capto Adhere” hromatografiju na oko 10 mS/cm i polipeptid od interesa se eluira iz „Capto Adhere” hromatografije linearnim gradijentom provodljivosti od oko 10,0 mS/cm do oko 1 mS/cm preko oko 15 CV.
U nekim aspektima bilo kog od otkrića, provodljivost pufera za eluiranje je promenjena od pufera za punjenja i/ili ispiranje po stepenastom ili linearnom gradijentu. U nekim primerima izvođenja ovog otkrića, kompozicija koja sadrži polipeptid se nanosi na hromatografski materijal na oko 5,5 mS/cm i polipeptid od interesa se eluira iz materijala za hromatografiju linearnim gradijentom provodljivosti između 5,5 mS/cm do 1 mS/cm preko 5 zapremina kolone, 5,5 mS/cm do 1 mS/cm preko 10,0 zapremina kolone. U nekim primerima izvođenja ovog otkrića, kompozicija koja sadrži polipeptid se nanosi na hromatografski materijal na oko 10,0 mS/cm i polipeptid od interesa se eluira iz materijala za hromatografiju linearnim gradijentom provodljivosti između 10,0 mS/cm do 1 mS/cm preko 5 zapremina kolone, 10,0 mS/cm do 1 mS/cm preko 10 zapremina kolone, 10,0 mS/cm do 1 mS/cm preko 15 zapremina kolone.
U nekim primerima izvođenja, bilo kog od ovde opisanih postupaka, pufer za punjenje ima pH manji od bilo kog od 10, 9, 8, 7, 6 ili 5. U nekim primerima izvođenja, bilo kog od ovde opisanih postupaka, pufer za punjenje ima pH veći od bilo kog od 4, 5, 6, 7, 8 ili 9.
Pufer za punjenje može imati pH između oko 4 i 9, 4 i 8, 4 i 7, 5 i 9, 5 i 8, 5 i 7, 5 i 6. U nekim primerima izvođenja, pH pufera za punjenje je oko bilo koje od 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 ili 8. pH može biti pH pufera za punjenje, pufera za ekvilibraciju ili pufera za ispiranje. U nekim primerima izvođenja, pH jednog ili više pufera za punjenje, pufera za ekvilibraciju i/ili pufera za ispiranje su isti. U nekim primerima izvođenja, pH pufera za punjenje je različit od pH pufera za ekvilibraciju i/ili pufera za ispiranje.
U nekim primerima izvođenja, pufer za eluiranje ima pH manji od pH pufera za punjenje. U nekim primerima izvođenja, bilo kog od ovde opisanih postupaka, pufer za eluiranje ima pH manji od bilo kog od 8, 7, 6, 5, 4, 3 ili 2. pH pufera za eluiranje može biti između oko 4 i 9, 4 i 8, 4 i 7, 4 i 6, 4 i 5, 5 i 9, 5 i 8, 5 i 7, 5 i 6, 6 i 9, 6 i 8, 6 i 7. U nekim primerima izvođenja, pH pufera za eluiranje je oko 4,0, 4,5, 5,0.5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5 ili 9,0.
U nekim primerima izvođenja, pufer za eluiranje ima pH veći od pH pufera za punjenje. U nekim primerima izvođenja, bilo kog od ovde opisanih postupaka, pufer za eluiranje ima pH veći od bilo kog od 5, 6, 7, 8 ili 9. pH pufera za eluiranje može biti između oko 4 i 9, 5 i 9, 6 i 9, 7 i 9, 8 i 9, 4 i 8, 5 i 8, 6 i 8, 7 i 8, 4 i 7, 5 i 7 i 6 i 7. U nekim primerima izvođenja, pH pufera za eluiranje je oko 4,0, 4,5, 5,0.5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5 ili 9,0 U nekim aspektima bilo kog od gorenavedenih izvođenja, pH pufera za eluiranje je promenjen od punjenja i/ili pufera za ispiranje po stepenastom ili linearnom gradijentom.
U nekim primerima izvođenja bilo kog od ovde opisanih postupaka, brzina protoka je manja od bilo koje od 50 CV/hr, 40 CV/hr, ili 30 CV/hr. Brzina protoka može biti između oko 5 CV/hr i 50 CV/hr, 10 CV/hr i 40 CV/hr, ili 18 CV/hr i 36 CV/hr. U nekim primerima izvođenja, brzina protoka je oko 9 CV/hr, 18 CV/hr, 25 CV/hr, 30 CV/hr, 36 CV/hr, or 40 CV/hr. U nekim primerima izvođenja bilo kog od ovde opisanih postupaka, brzina protoka je manja od bilo koje od 100 cm/hr, 75 cm/hr, or 50 cm/hr. Brzina protoka može biti između oko 25 cm/h i 150 cm/h, 25 cm/h i 100 cm/h, 50 cm/h i 100 cm/h ili 65 cm/h i 85 cm/h.
Visina sloja je visina hromatografskog materijala koji se koristi. U nekim primerima izvođenja, bilo kog od ovdeopisanih postupaka, visina sloja je veća od bilo koje od 3 cm, 10 cm ili 15 cm. Visina sloja može biti između oko 3 cm i 35 cm, 5 cm i 15 cm, 3 cm i 10 cm, ili 5 cm i 8 cm. U nekim primerima izvođenja, visina sloja je oko 3 cm, 5 cm, 10 cm ili 15 cm.
U nekim primerima izvođenja, visina sloja se određuje na osnovu količine polipeptida ili kontaminata u punjenju.
U nekim primerima izvođenja, hromatografija je u koloni posude sa zapreminom većom od oko 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 75 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL, 1 L, 2 L, 3 L, 4 L, 5 L, 6 L, 7 L, 8 L, 9 L, 10 L, 25 L, 50 L, 100 L, 200 L, 300 L, 400 L, 500 L, 600 L , 700 L, 800 L, 900 L ili 100 L.
U nekim primerima izvođenja pronalaska, frakcije su sakupljene iz hromatografije. U nekim primerima izvođenja sakupljene frakcije su veće od 0,01 CV, 0,02 CV, 0,03 CV, 0,04 CV, 0,05 CV, 0,06 CV, 0,07 CV, 0,08 CV, 0,09 CV, 0,1 CV, 0,2 CV, 0,3 CV, 0,4 CV, 0,5 CV, 0,6 CV, 0,7 CV, 0,8 CV, 0,9 CV, 1,0 CV, 2,0 CV, 3,0 CV, 4,0 CV, 5,0 CV, 6,0 CV, 7,0 CV, 8,0 CV, 9,0 CV, ili 10,0 CV. U nekim primerima izvođenja, frakcije koje sadrže proizvod, npr. polipeptid, su udružene. U nekim primerima izvođenja, frakcije koje sadrže polipeptid iz frakcija punjenja i iz frakcija eluiranja su udružene. Količina polipeptida u frakciji može biti određena od strane stručnjaka u ovoj oblasti; na primer, količina polipeptida u frakciji može se odrediti UV spektroskopijom. U nekim primerima izvođenja frakcije koje sadrže detektabilni polipeptidni fragment su udružene.
U nekim primerima izvođenja, bilo kog od ovde opisanih postupaka, najmanje jedan kontaminat je jedan ili više materijala ćelija domaćina, kao što je CHOP; izlučeni protein A; nukleinska kiselina; varijanta, fragment, agregat ili derivat željenog polipeptida; drugi polipeptid; endotoksin; virusni kontaminat; komponenta medija za kulturu ćelija, gentamicin, itd. U nekim primerima, kontaminat može biti protein ćelije domaćina (HCP) iz, na primer, ali ne ograničavajući se na, bakterijske ćelije kao što je ćelija E. coli, ćelije insekta, prokariotske ćelije, eukariotske ćelije, ćelije kvasca, ćelije sisara, ptičje ćelija, ćelije gljivica.
Proteini ćelije domaćina (HCP) su proteini iz ćelija u kojima je proizveden polipeptid. Na primer, CHOP su proteini iz ćelija domaćina, tj. proteini jajnika kineskog hrčka. Količina CHOP može se meri tipomoću enzim-vezanog imunosorbentnog testa („ELISA”) ili „Meso Scale Discovery” („MSO”). U nekim primerima izvođenja, bilo kog od ovde opisanih postupaka, količina HCP (npr. CHOP) je smanjena za više od oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% , 90%, ili 95%. Količina HCP može se smanjiti između 10% i 99%, 30% i 95%, 30% i 99%, 50% i 95%, 50% i 99%, 75% i 99%, ili 85%. % i 99%. U nekim primerima izvođenja, količina HCP je smanjena za oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% . U nekim primerima izvođenja, redukcija se određuje upoređivanjem količine HCP u kompoziciji koja je dobijena iz koraka prečišćavanja sa količinom HCP u kompoziciji pre koraka prečišćavanja.
Agregirani polipeptid može biti protein visoke molekulske mase (HMW). U nekim primerima izvođenja, agregirani polipeptid je multimer od polipeptida od interesa. HMW protein može biti dimer, do 8x monomer ili veći polipeptid od interesa. Postupci za merenje agregiranog proteina (npr. HMW proteina) su poznate u struci i opisane su u delu sa primerima. U nekim primerima izvođenja, bilo kog od ovde opisanih postupaka, količina agregiranog proteina je smanjena za više od oko 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% , 90%, ili 95%. Količina agregiranog proteina može se smanjiti za oko 10% i 99%, 30% i 95%, 30% i 99%, 50% i 95%, 50% i 99%, 75% i 99% ili 85% i 99%. Količina agregiranog proteina može se smanjiti za oko 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95%. U nekim primerima izvođenja, redukcija se određuje upoređivanjem količine agregiranog proteina (npr. HMW proteina) u kompoziciji dobijenoj od koraka prečišćavanja do količine agregiranog proteina (npr. HMW proteina) u kompoziciji pre koraka prečišćavanja.
Fragmentni polipeptid može biti protein male molekulske mase (LMW). U nekim primerima izvođenja, fragmentisani polipeptid je fragment polipeptida od interesa. Primeri LMW proteina uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab (Vezivanje fragmenta antigena), Fc (fragment, kristalizirajući) regioni ili kombinaciju oba ili bilo koji nasumično fragmentirani deo antitela od interesa. Postupci merenja fragmentovanog proteina (npr. LMW proteina) su poznati u struci i opisani u delu sa primerima. U nekim primerima izvođenja, bilo kog od ovde opisanih postupaka, količina LMW proteina je smanjena za više od oko 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% , 90%, ili 95%. Količina LMW proteina može se smanjiti za oko 10% i 99%, 30% i 95%, 30% i 99%, 50% i 95%, 50% i 99%, 75% i 99% ili 85% i 99%. Količina LMW proteina može se smanjiti za oko 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95%. U nekim primerima izvođenja, redukcija se određuje upoređivanjem količine fragmentovanog proteina (npr. LMW proteina) u kompoziciji dobijenoj iz koraka prečišćavanja do količine fragmentovanog proteina (npr. LMW proteina) u kompoziciji pre koraka prečišćavanja.
Izlučeni protein A je odvojen ili ispran iz čvrste faze na koju je vezan. Na primer, izlučeni protein A može se izlučiti iz Protein A kolone za hromatografiju. Količina proteina A može se meriti, na primer, sa ELISA. U nekim primerima izvođenja, bilo kog od ovde opisanih postupaka, količina izlučenog proteina A je smanjena za više od oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ili 90 %. Količina izlučenog proteina A može se smanjiti između oko 10% i 99%, 30% i 95%, 30% i 99%, 50% i 95%, 50% i 99%, 75% i 99% ili 85% i 99%. U nekim primerima izvođenja, količina izlučenog proteina A je smanjena za oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95%. U nekim primerima izvođenja, redukcija se određuje upoređivanjem količine izlučenog proteina A u kompoziciji koja je dobijena iz koraka prečišćavanja sa količinom izlučenog proteina A u kompoziciji pre koraka prečišćavanja.
Postupci merenja DNK, kao što je DNK ćelije domaćina, poznate su u struci i opisani u delu sa primerima. U nekim primerima izvođenja, bilo kog od ovde opisanih postupaka, količina DNK je smanjena za više od oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ili 90 %. Količina DNK može se smanjiti između 10% i 99%, 30% i 95%, 30% i 99%, 50% i 95%, 50% i 99%, 75% i 99%, ili 85%. % i 99%. Količina DNK može se smanjiti za oko 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ili 99 %. U nekim primerima izvođenja, redukcija se određuje upoređivanjem količine DNK u kompoziciji koja je dobijena iz koraka prečišćavanja sa količinom DNK u kompoziciji pre koraka prečišćavanja.
Komponenta medija za kulturu ćelija odnosi se na komponentu prisutnu u mediju za kulturu stanica. Medij za kulturu ćelija može biti medij za kulturu ćelija u vreme sakupljanja ćelija. U nekim primerima izvođenja, medijska komponenta kulture ćelija je gentamicin. Količina gentamicina može se meriti sa ELISA. U nekim primerima izvođenja, bilo kog od ovdeopisanih postupaka, količina medijske komponente ćelijske kulture je smanjena za više od oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ili 90 %. Količina medijske komponente ćelijske kulture može se smanjiti između 10% i 99%, 30% i 95%, 30% i 99%, 50% i 95%, 50% i 99%, 75% i 99%, ili 85%. % i 99%. U nekim primerima izvođenja, količina medijske komponente ćelijske kulture je smanjena za oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili 98%. U nekim primerima izvođenja, redukcija se određuje upoređivanjem količine medijske komponente ćelijske kulture u kompoziciji koja je dobijena iz koraka prečišćavanja sa količinom medijske komponente ćelijske kulture u kompoziciji pre koraka prečišćavanja.
U nekim primerima izvođenja, bilo kog od ovdeopisanih postupaka, postupci mogu dalje da sadrže jedan ili više koraka prečišćavanja pre ili poslije bilo kog OEC ovde opisanog. Druge procedure prečišćavanja uključuju, na primer, jonoizmenjivačku hromatografiju, kao što je hromatografija anjonske razmene i hromatografija razmene katjona, afinitetna hromatografija kao što je proteinska A hromatografija i proteinska G hromatografija, hromatografija mešanog načina rada, hidroksilapatitna hromatografija; gel-filtraciona hromatografija; afinitetna hromatografija; gel-elektroforeza; dijaliza; taloženje etanola; HPLC reverzne faze; hromatografija na silicijum-dioksidu; hromatofokusiranje; SDS-PAGE; taloženje amonijum-sulfata; i kolone za helatiranje metala za vezivanje epitop-označenih oblika polipeptida.
U nekim primerima izvođenja, bilo kojih ovdeopisanih postupaka, postupci dalje obuhvataju oporavak prečišćenog polipeptida. U nekim primerima izvođenja, prečišćeni polipeptid je izolovan iz bilo kog od koraka prečišćavanja koji su ovde opisani. Korak hromatografije može biti hromatografija sa katjonskom izmenom, hromatografija sa mešovitim načinom ili hromatografija Proteina A. U nekim primerima izvođenja, OEC hromatografija je hromatografija sa mešovitim načinom, a dalja hromatografija je hromatografija anjonske razmene. U nekim primerima izvođenja, OEC hromatografija je hromatografija sa mešovitim načinom, a dalja hromatografija je hromatografija katjonske razmene. U nekim primerima izvođenja, OEC hromatografija je hromatografija sa mešovitim načinom, a dalja hromatografija je HIC hromatografija.
U nekim primerima izvođenja, polipeptid se dalje prečišćava sledeći OEC pomoću viralne filtracije. Viralna filtracija je uklanjanje viralnih kontaminata u polipeptidnom pročišćivaču. Primeri viralne filtracije uključuju ultrafiltraciju i mikrofiltraciju. U nekim primerima izvođenja polipeptid se prečišćava pomoću parvovirusnog filtera.
U nekim primerima izvođenja, polipeptid je koncentrovan nakon hromatografije po OEC modu. Primeri postupaka koncentracije su poznati u struci i uključuju, ali nisu ograničeni na ultrafiltraciju i diafiltraciju.
U nekim primerima izvođenja, bilo kojih ovdeopisanih postupaka, postupci dalje obuhvataju kombinovanje prečišćenog polipeptida postupaka prečišćavanja sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.
U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupke za prečišćavanje antitela koji obuhvata a) punjenje kompozicije koja sadrži antitelo na „Capto Adhere” smoli pri gustini punjenja od 150 - 200 g antitela po litri „Capto Adhere” smole u puferu za punjenje sa pH od oko 6,5 i provodljivosti od oko 5,3 mS/cm do oko 5,6 mS/cm; b) eluiranje antitela iz smole puferom za eluiranje koji sadrži 100 mM 2-(N-morfolino) etansulfonske kiseline (MES) sa pH od oko 6,5 i provodljivost od oko 1 mS/cm; i sakupljanje bazena koje sadrži antitelo.
U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupke za prečišćavanje antitela koji obuhvata a) punjenje kompozicije koja sadrži antitelo na „Capto Adhere” smoli u koloni od 1,6 - 10,8 L pri gustini punjenja od 70-180 g antitela po litri „Capto Adhere” smole u puferu za punjenje sa pH od oko 6,5 i provodljivosti od oko 5,3 mS/cm do oko 5,6 mS/cm; b) eluiranje antitela iz smole puferom za eluiranje koji sadrži 100 mM MES sa pH od oko 6,5 i provodljivost od oko 1 mS/cm; i sakupljanje bazena koje sadrži antitelo.
U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupke za prečišćavanje antitela koji obuhvata a) punjenje kompozicije koja sadrži antitelo na „Capto Adhere” smoli pri gustini punjenja od oko 200 g antitela po litri „Capto Adhere” smole u puferu za punjenje sa pH od oko 8,6 i provodljivosti manje od 6 mS/cm; b) eluiranje antitela iz smole puferom za eluiranje od 20 mM MES sa pH od oko 6,5 i provodljivosti od oko 1 mS/cm; i sakupljanje bazena koje sadrži antitelo.
U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupke za prečišćavanje antitela koji obuhvata a) punjenje kompozicije koja sadrži antitelo na „Capto Adhere” smoli pri gustini punjenja od oko 200 g antitela po litri „Capto Adhere” smole u puferu za punjenje sa pH od oko 6,1 i provodljivosti manje od 6 mS/cm; b) eluiranje antitela iz smole puferom za eluiranje od 20 mM MES sa pH od oko 6,0 i provodljivosti od oko 0,65 mS/cm; i sakupljanje bazena koje sadrži antitelo.
U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupke za prečišćavanje antitela koji obuhvata a) punjenje kompozicije koja sadrži antitelo na „Capto Adhere” smoli pri gustini punjenja od oko 200 g antitela po litri „Capto Adhere” smole u puferu za punjenje sa pH od oko 5,5 i provodljivosti manje od 6 mS/cm; b) eluiranje antitela iz smole puferom za eluiranje od 20 mM MES sa pH od oko 4,9 i provodljivosti od oko 1,1 mS/cm; i sakupljanje bazena koje sadrži antitelo.
U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupke za prečišćavanje antitela koji obuhvata a) punjenje kompozicije koja sadrži antitelo na „Capto Adhere” smoli pri gustini punjenja od oko 200 g antitela po litri „Capto Adhere” smole u puferu za punjenje sa pH od oko 6,5 i provodljivosti manje od 6 mS/cm; b) eluiranje antitela iz smole puferom za eluiranje od 20 mM MES sa pH od oko 6,5 i provodljivosti od oko 1 mS/cm; i sakupljanje bazena koje sadrži antitelo.
U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupke za prečišćavanje antitela koji obuhvata a) punjenje kompozicije koja sadrži antitelo na „Capto MMC” smoli pri gustini punjenja od oko 147 g antitela po litri „Capto MMC” smole u puferu za punjenje sa pH od oko 7,0 i provodljivosti manje od 6 mS/cm; b) eluiranje antitela iz smole puferom za eluiranje od 20 mM MES sa pH od oko 6,5 i provodljivosti od oko 1 mS/cm; i sakupljanje bazena koje sadrži antitelo.
III. Polipeptidi
Polipeptidi su predviđeni za upotrebu u bilo kom postupku za prečišćavanja polipeptida i formulacija koje sadrže polipeptide prečišćene ovdeopisanim postupcima.
U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupke za prečišćavanje polipeptida korišćenjem hromatografije preopterećenja i eluata. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je terapeutski polipeptid. U nekim primerima izvođenja otkrića, polipeptid je antagonist. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je agonist. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je antitelo. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je označen epitopom. U nekim primerima izvođenja, polipeptid zadržava biološku i/ili imunološku aktivnost. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je antagonist. U nekim primerima izvođenja, polipeptid pokreće citotoksičnost zavisnu od komplementa. U nekim primerima izvođenja, polipeptid je antitelo ili imunoadhezin. U daljem primeru izvođenja, gorenavedenih realizacija, polipeptid se prečišćava sa OEC korišćenjem hromatografskog medija sa mešovitim načinom.
U nekim primerima izvođenja, polipeptid ima molekulsku masu veću od bilo koje od 5.000 daltona, 10.000 daltona, 15.000 daltona, 25.000 daltona, 50.000 daltona, 75.000 daltona, 100.000 daltona, 125.000 daltona ili 150.000 daltona. Polipeptid može imati molekulsku masu između oko 50.000 daltona do 200.000 daltona ili 100.000 daltona do 200.000 daltona. Alternativno, polipeptid za upotrebu ovde može imati molekulsku masu od oko 120.000 daltona ili oko 25.000 daltona.
pI je izoelektrična tačka i pH je kod kojeg određeni molekul ili površina nosi neto električni naboj. U nekim primerima izvođenja, bilo kog od ovde-opisanih postupaka, pl polipeptida može biti između bilo kog od 6 do 10, 7 do 9, ili 8 do 9. U nekim primerima izvođenja, polipeptid ima pl od oko bilo koje od 6, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 ili 10.
Polipeptidi koji će se prečistiti korišćenjem ovde-opisanih načina se uopšteno proizvode korišćenjem rekombinantnih tehnika. Postupci za proizvodnju rekombinantnih proteina su opisane, npr. u US Patentima br. 5,534,615 i 4,816,567. U nekim primerima izvođenja, protein od interesa se proizvodi u CHO ćeliji (vidi, npr. WO 94/11026). Kada se koriste rekombinantne tehnike, polipeptidi se mogu proizvesti intracelularno, u periplazmičkom prostoru ili direktno izlučiti u medij.
Polipeptidi se mogu izolovati iz medija za kulturu ili iz lizata ćelije domaćina. Ćelije korišćene u ekspresiji polipeptida mogu biti poremećene različitim fizičkim ili hemijskim sredstvima, kao što je ciklus zamrzavanja i otapanja, dejstvo ultrazvuka, mehaničko razaranje ili sredstva za liziranje ćelija. Ako se polipeptid proizvodi intracelularno, kao prvi korak, ostaci čestica, bilo ćelije domaćini ili lizirani fragmenti, uklanjaju se, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Carter i dr. Bio/ Technology 10: 163-167 (1992) opisuju proceduru za izolaciju polipeptida koji se luče u periplazmički prostor E. coli. Ukratko, ćelijska pasta se odmrzava u prisustvu natrijum-acetata (pH 3,5), EDTA i fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF) tokom oko 30 min. Ostaci ćelija se mogu ukloniti centrifugiranjem. Tamo gde se polipeptid izlučuje u medij, supernatanti iz takvih sistema ekspresije se uopšteno prvo koncentrišu korišćenjem komercijalno dostupnog filtera koncentracije polipeptida, na primer, „Amicon” ili „Millipore Pellicon” ultrafiltracijske jedinice. Inhibitor proteaze, kao što je PMSF, može biti uključen u bilo koji od prethodnih koraka da bi se inhibirala proteoliza i mogu biti uključeni antibiotici kako bi se sprečio rast adventnih kontaminata.
Primeri polipeptida koji se mogu prečistiti postupcima iz otkrića uključuju, bez ograničenja, imunoglobuline, imunoadhezine, antitela, enzime, hormone, fuzione proteine, proteine koji sadrže Fc, imunokonjugate, citokine i interleukine. Primeri polipeptida uključuju, bez ograničenja, proteine sisara, kao što su npr. Renin; hormon; hormon rasta, uključujući humani hormon rasta i goveđi hormon rasta; faktor oslobađanja hormona rasta; paratiroidni hormon; tiroidni stimulišući hormon; lipoproteini; alfa-1-antitripsin; A-lanac insulina; B-lanac insulina; proinsulin; folikula stimulirajući hormon; kalcitonin; luteinizirajući hormon; glukagon; faktori zgrušavanja kao što su faktor VIIIC, faktor IX, tkivni faktor i Fon Vilebrandov faktor; faktori protiv zgrušavanja kao što je protein C; atrijalni natriuretski faktor; plućni surfaktant; aktivator plazminogena, kao što je urokinaza ili humani urin ili tkivni tip plazminogen aktivatora (t-PA); bombezin; trombin; hemopoetski faktor rasta; faktor tumorske nekroze-alfa i -beta; enkefalinaza; RANTES (regulisano na aktivaciju normalno eksprimirane i izlučene T-ćelije); inflamatorni protein humanog makrofaga (MIP-1-alfa); serumski albumin kao što je humani serumski albumin; Muelerianska inhibirajuća supstanca; A-lanac relaksina; B-lanac relaksina; prorelaksin; peptid vezan za mišji gonadotropinom; enzim; mikrobni protein, kao što je beta-laktamaza; DNaza; IgE; citotoksični T-limfocitni antigen (CTLA), kao što je CTLA-4; inhibin; aktivin; faktor rasta vaskularnog endotela (VEGF); receptori za hormone ili faktore rasta; protein A ili D; reumatoidni faktori; neurotrofni faktor kao što je neurotrofni faktor iz kosti (BDNF), neurotrofin-3, -4, -5 ili -6 (NT-3, NT-4, NT-5 ili NT-6), ili faktor rast živaca kao što je NGF-b; faktor rasta izveden iz trombocita (PDGF); faktor rasta fibroblasta kao što su aFGF i bFGF; epidermalni faktor rasta (EGF); transformirajući faktor rasta (TGF) kao što je TGF-alfa i TGF-beta, uključujući TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 ili TGF-β5; insulinu sličan faktor rasta-I i -II (IGF-I i IGF-II); des(1-3)-IGF-I (moždani IGF-I), proteini za vezivanje faktora rasta slični insulinu (IGFBP); citokin; CD proteini kao što su CD3, CD4, CD8, CD19 i CD20; eritropoetin; osteoinduktivni faktori; imunotoksini; fuzioni polipeptid, tj. polipeptid koji se sastoji od dva ili više heterolognih polipeptida ili njihovih fragmenata i koji su kodirani rekombinantnom nukleinskom kiselinom; polipeptid koji sadrži Fc, na primer, fuzioni protein koji sadrži Fc region imunoglobulina, ili njegov fragment, spojen na drugi polipeptid; imunokonjugat; koštani morfogenetski protein (BMP); interferon kao što je interferon-alfa, -beta i -gama; faktori stimulacije kolonija (CSF), npr. M-CSF, GM-CSF i G-CSF; interleukini (IL), npr., IL-1 do IL-10; superoksid-dismutaza; T-ćelijski receptori; proteini površinske membrane; faktor ubrzanja propadanja; virusni antigen kao što je, na primer, dio omotača AIDS-a; transportni proteini; povratni receptori; adresovani; regulatorni proteini; integrine kao što su CD11a, CD11b, CD11c, CD18 i ICAM, VLA-4 i VCAM; antigen povezan sa tumorom kao što je CA125 (antigen karcinoma jajnika) ili HER2, HER3 ili HER4 receptor; imunoadhezini; i fragmenti i/ili varijante bilo kojeg od gorenavedenih proteina, kao i antitela, uključujući fragmente antitela, koji se vežu za protein, uključujući, na primer, bilo koji od gorenavedenih proteina.
(A) Antitela
U nekim primerima izvođenja bilo kojih ovdeopisanih postupaka, polipeptid za upotrebu u bilo kom postupku za prečišćavanje polipeptida i formulacija koje sadrže polipeptide pročišćene ovde opisanim postupcima je antitelo.
Molekularne mete za antitela uključuju CD proteine i njihove ligande, kao što su, bez ograničenja,: (i) CD3, CD4, CD8, CD19, CD11a, CD20, CD22, CD34, CD40, CD79α (CD79a) i CD79P (CD79b); (ii) članovi porodice receptora ErbB kao što su EGF receptor, HER2, HER3 ili HER4 receptor; (iii) molekuli ćelijske adhezije, kao što su LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM i αv/β3 integrin, uključujući alfa ili beta podjedinice od toga (npr. anti-CD11a, anti-CD18 ili anti-CD11b antitela); (iv) faktori rasta kao što je VEGF; IgE; antigeni krvnih grupa; flk2/flt3 receptor; receptora za gojaznost (OB); mpl receptor; CTLA-4; protein C, BR3, c-met, tkivni faktor, β7 itd; i (v) površinski ćelijski i transmembranski antigeni povezani sa tumorom (TAA), kao što su oni opisani u US Patentu br. 7,521,541.
Drugi primeri antitela obuhvataju ona koja su izabrana od sledećih, ali bez ograničenja, anti-estrogen receptora antitelo, anti-progestrogen receptora antitelo, anti-p53 antitelo, anti-HER-2/neu antitelo, anti-EGFR antitelo, anti-katepsin D antitelo, anti-Bcl-2 antitelo, anti-E-kadherin antitelo, anti-CA125 antitelo, anti-CA15-3 antitelo, anti-CA19-9 antitelo, anti-cerbB-2 antitelo, anti-P-glikoprotein antitelo, anti-CEA antitelo, anti-retinoblastoma protein antitelo, anti-ras onkoprotein antitelo, anti-Levis X antitelo, anti-Ki-67 antitelo, anti-PCNA antitelo, anti-CD3 antitelo, anti-CD4 antitelo, anti-CD5 antitelo, anti-CD7 antitelo, anti-CD8 antitelo, anti-CD9/p24 antitelo, anti-CD10 antitelo, anti-CD11a antitelo, anti-CD11c antitelo, anti-CD13 antitelo, anti-CD14 antitelo, anti-CD15 antitelo, anti-CD19 antitelo, anti-CD20 antitelo, anti-CD22 antitelo, anti-CD23 antitelo, anti-CD30 antitelo, anti-CD31 antitelo, anti-CD33 antitelo, anti-CD34 antitelo, anti-CD35 antitelo, anti-CD38 antitelo, anti-CD41 antitelo, anti-LCA/CD45 antitelo, anti-CD45RO antitelo, anti-CD45RA antitelo, anti-CD39 antitelo, anti-CD100 antitelo, anti-CD95/Fas antitelo, anti-CD99 antitelo, anti-CD106 antitelo, antiubikvitin antitelo, anti-CD71 antitelo, anti-c-mic antitelo, anti-citokeratin antitelo, antivimentin antitelo, anti-HPV proteinsko antitelo, anti-kapa lakog lanca antitelo, anti-lambda lakog lanca antitelo, anti-melanosomsko antitelo, anti-prostatno specifično antigen antitelo, anti-S-100 antitelo, anti-tau antigen antitelo, anti-fibrin antitelo, anti-keratin antitelo i anti-Tnantigen antitelo.
(i) Poliklonska antitela.
U nekim primerima izvođenja, antitela su poliklonska antitela. Poliklonska antitela se poželjno uzgajaju u životinjama, putem višestrukih supkutanih (sc) ili intraperitonealnih (ip) injekcija relevantnog antigena i adjuvansa. Može biti korisno da se relevantni antigen konjuguje sa polipeptidom koji je imunogen u vrstama koje se imunizuju, npr. ključnom prilepaku hemocijaninu, serumskom albuminu, goveđem tiroglobulinu ili inhibitoru sojinog tripsina pomoću bifunkcionalnog ili derivatizujućeg agensa, na primer, maleimidobenzoil sulfosukcinimid ester (konjugacija preko cisteinskih ostataka), N-hidroksisukcinimid (preko lizinskih ostataka), glutaraldehid, sukcinantni anhidrid, SOCl2, ili R<1>N=C=NR, pri čemu su R i R<1>različite alkilne grupe.
Životinje se imunizuju protiv antigena, imunogenih konjugata ili derivata kombiniranjem, npr. 100 µg ili 5 µg polipeptida ili konjugata (za zečeve ili miševe) sa 3 zapremina Freundovog kompletnog adjuvanta i injektiranjem rastvora intradermalno na više mjesta. Mesec dana kasnije, životinjama se daje još 1/5 do 1/10 originalne količine peptida ili konjugata u Frojndovom kompletnom adjuvansu, supkutanom injekcijom na više mesta. Nakon sedam do 14 dana, životinjama se pusti krv, a serum se ispituje na titar antitelima. Životinjama se dodaju nove doze dok titar ne dostigne vodoravnu liniju. U nekim primerima izvođenja, životinji se daju nove doze konjugata istog antigena, ali koji je konjugovan sa različitim polipeptidom i/ili preko drugog reagensa za unakrsno vezivanje. Konjugati se takođe mogu napraviti u rekombinantnoj kulturi ćelija kao fuzije polipeptida. Takođe, agregacioni agensi, kao što je stipsa, pogodno se koriste za povećanje imunog odgovora.
(ii) Monoklonska antitela
U nekim primerima izvođenja, antitela su monoklonska antitela. Monoklonska antitela se dobijaju iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačnih antitela, koja čine populaciju sa identičnim i/ili se vezuju za isti epitop, osim za moguće varijante koje nastaju tokom proizvodnje monoklonskog antitela, a takve su varijante obično prisutne u manjim količinama. Stoga „monoklonsko” označava karakter antitela, koje nije mešavina diskretnih ili poliklonskih antitela.
Na primer, monoklonska antitela mogu biti napravljena pomoću postupka hibridoma, koji su prvi opisali Kohler i dr., Nature 256:495 (1975), ili mogu da se naprave postupcima rekombinantne DNK (U.S. Patent No.4,816,567).
U postupku hibridoma, miš ili druga životinja domaćin, kao što je hrčak, imunizovana je kao što je goreopisano, kako bi se izazvali limfociti koji proizvode, ili su sposobni da proizvode antitela koja će se specifično vezati za polipeptid koji se koristi za imunizaciju. Alternativno, limfociti mogu biti imunizovani in vitro. Limfociti se onda spajaju sa ćelijama mijeloma pomoću odgovarajućeg agensa za fuziju, kao što je polietilen glikol, dajući ćelije hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).
Tako pripremljene ćelije hibridoma se stoga zasejavaju i uzgajaju u pogodnom mediju za uzgajanje, koji poželjno sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju rast ili preživljavanje nefuzionisanih, matičnih ćelija mijeloma. Na primer, ako matične ćelije mijeloma nemaju enzim hipoksantin guanin fosforibozil transferazu (HGPRT ili HPRT), medij za uzgajanje hibridoma tipično će sadržati hipoksantin, aminopterin i timidin (HAT medij), jer te supstance sprečavaju rast HGPRT-deficijentnih ćelija.
U nekim primerima izvođenja, ćelije mijeloma su one koje mogu efikasno da se fuzionišu, da podrže stabilnu proizvodnju velike koncentracije antitela od strane odabranih ćelija koje proizvode antitela, i osetljive su na medij, kao što je HAT medij. Među njima, U nekim primerima izvođenja, ćelije linije mijeloma su linije mišjeg mijeloma, kao one dobijene od mišjih tumora MOPC-21 i MPC-11, koje se mogu nabaviti od Distribucionog centra za ćelije Salkovog instituta (Salk Institute Cell Distribution Center), San Diego, California SAD, i SP-2 ili X63-Ag8-653 ćelije koje se mogu nabaviti od American Type Culture Collection, Rockville, Maryland SAD. Ćelijske linije humanog mijeloma i mišjehumanog heteromijeloma takođe su opisane za proizvodnju humanih monoklonskih antitela (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur i dr., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
Medij za uzgajanje u kome se uzgajaju ćelije hibridoma testira se na proizvodnju monoklonskih antitela usmerenih protiv antigena. U nekim primerima izvođenja, specifičnost vezivanja monoklonskih antitela koje proizvode ćelije hibridoma određuje se imunoprecipitacijom ili in vitro testom vezivanja, kao što je radioimunotest (RIA) ili test sa imunoadsorbentom vezanim za enzim (ELISA).
Afinitet vezivanja monoklonskog antitela može, na primer, da se odredi Skačardovom analizom, koju su dali Munson i dr. Anal. Biochem.107:220 (1980).
Pošto se identifikuju ćelije hibridoma koje proizvode antitela željene specifičnosti, afiniteta, i/ili aktivnosti, klonovi mogu biti potklonirani postupcima ograničavanja razblaženja, i uzgajeni standardnim postupcima (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Pogodni mediji za ćelijske kulture za ovu namenu uključuju, na primer, medije D-MEM ili RPMI-1640. Pored toga, ćelije hibridoma mogu se uzgajati in vivo kao ascites tumori u životinji.
Monoklonska antitela koja izlučuju potklonovi su pogodno odvojena od medija za uzgajanje, tečnosti ascitesa ili seruma klasičnim postupcima prečišćavanja imunoglobulina, kao što je, na primer, protein A sefaroza, hidroksilapatitna hromatografija, gel-elektroforeza, dijaliza ili afinitetna hromatografija.
DNK koja kodira monoklonska antitela može biti lako izolovana i sekvencirana korišćenjem klasičnih postupaka (npr. korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje mogu specifično da se vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance mišjih antitela). U nekim primerima izvođenja, ćelije hibridoma su poželjni izvor takve DNK. Kada se izoluje, DNK se može ubaciti u ekspresione vektore, koji se zatim transfektuju u ćeliju domaćina, kao što su ćelije E. coli, majmunske COS ćelije, jajne ćelije kineskog hrčka (CHO) ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode imunoglobulin polipeptid, da bi se dobila sinteza monoklonskih antitela u rekombinantnim ćelijama domaćina. Revijski članci o rekombinantnoj ekspresiji DNK koja kodira antitelo u bakterijama uključuju Skerra i dr. Curr. Opinion in Immunol.
5:256-262 (1993) i Plückthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).
U daljem primeru izvođenja, antitela ili fragmenti antitela se mogu izolovati iz biblioteka faga antitela nastalih pomoću tehnika koju su opisali McCafferty i dr., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson i dr. Nature 352: 624-628 (1991) i Marks i dr. J. Mol. Biol.
222: 581-597 (1991) opisuju izolaciju mišjih i humanih antitela, respektivno, koristeći biblioteke faga. Sledeće publikacije opisuju proizvodnju humanih antitela velikog afiniteta (opsega nM) putem mešanja lanaca (Marks i dr., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), kao i kombinatorne infekcije i in vivo rekombinacije kao strategije za konstrukciju veoma velikih biblioteka faga (Waterhouse i dr., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). Stoga ove tehnike predstavljaju održivu alternativu tradicionalnim tehnikama hibridoma monoklonskih antitela za izolovanje monoklonskih antitela.
DNK se takođe može modifikovati, na primer, zamenom kodirajuće sekvence za konstantne domene humanog teškog i lakog lanaca umesto homolognih mišjih sekvenci (US Patent No. 4,816,567; Morrison i dr., Proc. Natl Acad. Sci. USA 81: 6851 (1984)) ili kovalentnim spajanjem sa kodirajućom sekvencom imunoglobulina sve ili dio kodirajuće sekvence za neimunoglobulinski polipeptid.
Tipično, takvi polipeptidi koji nisu imunoglobulin su supstituisani konstantnim domenima antitela, ili su supstituisani varijabilnim domenima jednog antigen-kombinujućeg mesta antitela, dajući himerno dvovalentno antitelo koje sadrži jedno antigen-kombinujuće mesto koje je specifično za antigen, i drugo antigen-kombinujuće mesto koje je specifično za različit antigen.
U nekim primerima izvođenja bilo kojeg ovde opisanog postupka, antitelo je IgA, IgD, IgE, IgG ili IgM. U nekim primerima izvođenja, antitelo je IgG monoklonsko antitelo.
(iii) Humanizovana antitela
U nekim primerima izvođenja, antitelo je humanizovano antitelo. Postupci za humanizovanje nehumanih antitela su opisane u struci. U nekim primerima izvođenja, humanizovano antitelo ima jedan ili više ostataka aminokiseline uvedenih iz izvora koji nije ljudskog porekla. Ovi nehumani aminokiselinski ostaci se često nazivaju „uvoznim” ostacima, koji se tipično uzimaju iz „uvoznog” varijabilnog domena. Humanizacija može da se na kraju obavi postupkom Vintera i saradnika (Jones i dr., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann i dr., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen i dr., Science, 239:1534-1536 (1988)), supstitucijom niza hipervarijabilne oblasti za odgovarajuće nizove humanog antitela. Prema tome, takva „humanizovana” antitela su himerna antitela (U.S. Patent br. 4,816,567), naznačena time što se u značajno manjoj meri netaknuti humani varijabilni domen zamenjuje odgovarajućom sekvencom vrsta koje nisu ljudskog porekla. U praksi, humanizovana antitela su tipično humana antitela u kojima su neki ostaci hipervarijabilne regije i eventualno neki FR ostaci supstituisani ostacima sa analognih mesta u antitelima glodavaca.
Izbor humanih varijabilnih domena, i lakih i teških, koji će se koristiti za dobijanje humanizovanih antitela, veoma je važan za smanjivanje antigenosti. U skladu sa takozvanom postupkom „najboljeg poklapanja”, sekvenca varijabilnog domena antitela glodara upoređuje se sa celom bibliotekom poznatih sekvenci humanih varijabilnih domena. Humana sekvenca koji je najbliža nizu glodara se zatim prihvata kao humani okvirni region (FR) za humanizovano antitelo (Sims i dr., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia idr., J. Mol. Biol.
196:901 (1987)). Drugi postupak koristi određeni okvirni region dobijen iz sekvence konsenzusa svih humanih antitela određene podgrupe regiona lakog ili teškog lanca. Isti okvir se može koristiti za nekoliko različitih humanizovanih antitela (Carter i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta i dr., J. Immunol.151:2623 (1993)).
Nadalje, važno je da antitela budu humanizovana uz zadržavanje velikog afiniteta prema antigenu, i drugih povoljnih bioloških osobina. Da bi se to postiglo, U nekim primerima izvođenja postupka, humanizovana antitela se pripremaju postupkom analize matičnih sekvenci i različitih konceptualnih humanizovanih proizvoda pomoću trodimenzionalnih modela matičnih i humanizovanih sekvenci. Trodimenzionalni imunoglobulinski modeli obično su dostupni, i poznati su stručnjacima u ovoj oblasti. Dostupni su računarski programi koji ilustruju i prikazuju verovatne trodimenzionalne konformacijske strukture odabranih kandidatskih imunoglobulinskih sekvenci. Pregled ovih prikaza omogućava analizu verovatne uloge ostataka u funkcionisanju kandidata za imunoglobulinsku sekvencu, tj. analizu ostataka koji utiču na sposobnost kandidata imunoglobulina da veže svoj antigen. Na ovaj način, FR ostaci se mogu izabrati i kombinovati iz recipijenta i sekvenci uvoza tako da se postigne željena karakteristika antitela, kao što je povećani afinitet za ciljni antigen(e). Uopšteno, ostaci hipervarijabilnog regiona direktno i najneposrednije utiču na vezivanje antigena.
(iv) Humana antitela
U nekim primerima izvođenja, antitelo je humano antitelo. Kao alternativa humanizaciji, mogu se generisati humana antitela. Na primer, sada je moguće proizvesti transgene životinje (npr. miševe) koje mogu, po imunizaciji, da proizvode pun repertoar humanih antitela u odsustvu endogene imunoglobulinske produkcije. Na primer, opisano je da homozigotno izbacivanje gena spojnog regiona teškog lanca antitela (JH) kod himernih miševa i miševa sa germinalnim mutacijama dovodi do potpune inhibicije endogene proizvodnje antitela. Transfer čipa humanog gena imunoglobulina germinalne linije u takve miševe sa germinalnim mutacijama dovešće do proizvodnje humanih antitela izazvane antigenom. Videti, npr., Jakobovits i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits i dr., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann i dr., Year in Immuno. 7:33 (1993); i US Patent Nos.5,591,669; 5,589,369; i 5,545,807.
Alternativno, tehnologija prikazivanja faga (McCafferty i dr., Nature 348: 552-553 (1990)) se može koristiti za proizvodnju humanih antitela i fragmenata antitela in vitro, iz repertoara gena imunoglobulin varijabilne (V) domene od neimunizovanih donora. Prema ovoj tehnici, geni antitela V domena su klonirani u okviru ili u glavni ili manji gen polipeptida omotača filamentoznog bakteriofaga, kao što je M13 ili fd, i prikazani kao funkcionalni fragmenti antitela na površini čestice faga. Budući da vlaknasta čestica sadrži kopiju DNK genskog faga s jednom lancem, selekcije zasnovane na funkcionalnim svojstvima antitela takođe dovode do selekcije gena koji kodira antitelo koje pokazuje ta svojstva. Stoga, fag oponaša neke od svojstava B-ćelije. Prikaz faga može biti izveden u različitim formatima; za njihov pregled videti npr. Johnson, Kevin S. i Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Za prikaz faga može se koristiti nekoliko izvora segmenata V-gena. Clackson i dr. Nature 352: 624-628 (1991) izolovali su raznovrsnu grupu anti-oksazolonskih antitela iz male nasumične kombinatorne biblioteke V-gena izvedenih iz slezine imunizovanih miševa. Repertoar V-gena iz neimunizovanih humanih donora može biti konstruisan i antitela na raznovrsni niz antigena (uključujući i samoantigene) mogu da se izoluju u suštini prateći tehnike koje su opisali Marks i dr. J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), ili Griffith idr., EMBO J. 12:725-734 (1993). Takođe videti, US Patent Nos.5,565,332 i 5,573,905.
Humana antitela se takođe mogu generisati in vitro aktiviranim B -ćelijama (videti US Patente 5,567,610 i 5,229,275).
(v) Fragmenti antitela
U nekim primerima izvođenja, antitelo je fragment antitela. Razvijene su različite tehnike za proizvodnju fragmenata antitela. Tradicionalno, ovi fragmenti su izvedeni proteolitičkom digestijom intaktnih antitela (videti , npr. Morimoto i dr., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) i Brennan i dr., Science 229:81 (1985)) . Međutim, ovi fragmenti se sada mogu proizvesti direktno pomoću rekombinantnih ćelija domaćina. Na primer, fragmenti antitela mogu biti izolovani iz fag biblioteka antitela koja su gore razmotrena. Alternativno, Fab'-SH fragmenti se mogu direktno dobiti iz E. coli i hemijski vezati da bi se formirali F(ab')2fragmenti (Carter i dr., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Prema drugom pristupu, F(ab')2fragmenti mogu da se izoluju direktno iz rekombinantne kulture ćelija domaćina. Druge tehnike za proizvodnju fragmenata antitela će biti očigledne stručnjaku. U drugim primerima izvođenja, antitelo po izboru je jednolančani Fv fragment (scFv). Videti WO 93/16185; US Patent No. 5,571,894; i US Patent No.
5,587,458. Fragment antitela može takođe biti „linearno antitelo”, npr. kao što je opisano, na primer, u US Patentu 5,641,870. Takvi linearni fragmenti antitela mogu biti monospecifični ili bispecifični.
U nekim primerima izvođenja, obezbeđeni su fragmenti ovde opisanih antitela. U nekim primerima izvođenja, fragment antitela je antigen vezujući fragment. U nekim primerima izvođenja, antigen vezujući fragment je izabran iz grupe koja se sastoji od Fab fragmenta, Fab’ fragmenta, F(ab')2fragmenta, scFv, Fv i diatela.
(vi) Bispecifična antitela
U nekim primerima izvođenja, antitelo je bispecifično antitelo. Bispecifična antitela su antitela koja imaju sposobnost specifičnog vezivanja za najmanje dva različita epitopa. Primeri bispecifičnih antitela mogu da se vežu za dva različita epitopa. Alternativno, bispecifično antitelo se može kombinovati sa krakom koji se vezuje sa aktivirajućim molekulom na leukocitu, kao što je molekul receptora T-ćelije (npr. CD2 ili CD3), ili Fc receptori za IgG (FcγR), kao što je FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) i FcγRIII (CD16), tako da se mehanizmi ćelijske odbrane usredsrede na ćeliju. Bispecifična antitela se mogu pripremiti kao antitela pune dužine ili kao fragmenti antitela (npr. F(ab’)2bispecifična antitela).
Postupci za dobijanje bispecifičnih antitela su poznate u struci. Tradicionalna proizvodnja kompletnih bispecifičnih antitela je na bazi koekspresije dva para teški lanac – laki lanac imunoglobulina, gde dva lanca imaju različite specifičnosti (Millstein i dr., Nature 305:537-539 (1983)). Zbog nasumičnog rasporeda teških i lakih lanaca imunoglobulina, ti hibridomi (kvadromi) proizvode potencijalnu smešu od 10 različitih molekula antitela, od kojih samo jedan ima pravilnu bispecifičnu strukturu. Prečišćavanje ispravnog molekula, što se obično radi afinitetnom hromatografijom, prilično je teško, i prinosi proizvoda su mali. Slični postupci su objavljeni u WO 93/08829 i u Traunecker i dr., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).
Prema različitom pristupu, varijabilni domeni antitela sa željenim specifičnostima vezivanja (mesta sa kombinacijom antitelo-antigen) spajaju se sa sekvencama konstantnog domena imunoglobulina. U nekim primerima izvođenja, fuzija je sa konstantnim domenom teškog lanca imunoglobulina i sadrži najmanje jedan deo regiona šarke, CH2 i CH3 regione. U nekim primerima izvođenja, prvi konstantni region teškog lanca (CH1) koji sadrži mesto potrebno za vezivanje lakog lanca prisutno najmanje u jednoj fuziji. DNK koje kodiraju fuzije teškog lanca imunoglobulina, i, po želji, lakog lanca imunoglobulina, ubacuju se u odvojene ekspresione vektore i kotransficiraju se u pogodni organizam domaćina. To obezbeđuje veliku fleksibilnost u podešavanju uzajamnih proporcija tri polipeptidna fragmenta u izvođenjima kada nejednaki udeli tri polipeptidna lanca upotrebljena za konstrukciju obezbeđuju optimalne prinose. Međutim, moguće je ubaciti kodirajuće sekvence za dva ili sva tri polipeptidna lanca u jedan ekspresioni vektor, kada ekspresija najmanje dva polipeptidna lanca u istim udelima dovodi do većeg prinosa, ili kada prinosi nisu naročito značajni.
U nekim primerima izvođenja ovog pristupa, bispecifična antitela se sastoje od teškog lanca hibridnog imunoglobulina sa prvom specifičnošću vezivanja na jednom kraku, i para teški lanac-laki lanac hibridnog imunoglobulina (što obezbeđuje drugu specifičnost vezivanja ) na drugom kraku. Nađeno je da ova asimetrična struktura olakšava separaciju željenog bispecifičnog jedinjenja od neželjenih kombinacija lanca imunoglobulina, jer prisustvo lakog lanca imunoglobulina kod samo jedne polovine bispecifičnih molekula obezbeđuje lake načine separacije. Ovaj pristup je objavljen u WO 94/04690. Za više detalja za dobijanje bispecifičnih antitela videti, na primer, Suresh i dr., Methods in Enzymology 121:210 (1986).
Prema drugom pristupu koji opisuje US Patent No. 5,731,168, interfejs između para molekula antitela može se konstruisati radi dobijanja maksimalnog procenta heterodimera koji su izolovani iz rekombinantne ćelijske kulture. U nekim primerima izvođenja, interfejs sadrži najmanje deo CH3 domena konstantnog domena antitela. U ovom postupku, jedan ili više malih bočnih lanaca aminokiselina sa interfejsa prvog molekula antitela zamenjeni su dužim bočnim lancima (npr. tirozin ili triptofan). Kompenzujuće „šupljine” iste ili slične veličine kao dugački bočni lanac(i) stvaraju se na interfejsu drugog molekula antitela, zamenom dugačkih bočnih lanaca aminokiselina kraćima (npr. alanin ili treonin). To obezbeđuje mehanizam za povećanje prinosa heterodimera u odnosu na druge neželjene krajnje proizvode, kao što su homodimeri.
Bispecifična antitela uključuju unakrsno vezana ili „heterokonjugatna” antitela. Na primer, jedno od antitela u heterokonjugatu može biti kuplovano sa avidinom, a drugo sa biotinom. Za takva antitela je, na primer, predloženo da se koriste za ciljanje ćelija imunskog sistema na neželjene ćelije (US Patent br. 4,676,980), i za lečenje HIV infekcija (WO 91/00360, WO 92/200373 i EP 03089). Heterokonjugatna antitela se mogu napraviti korišćenjem bilo kog pogodnog postupka unakrsnog povezivanja. Pogodni agensi za umrežavanje su dobro poznati u struci, i objavljeni su u US Patentu br. 4,676,980, uz druge tehnike umrežavanja.
Tehnike za stvaranje bispecifičnih antitela od fragmenata antitela takođe su opisane u literaturi. Na primer, bispecifična antitela mogu se pripremiti primenom hemijskog vezivanja. Brennan i dr., Science 229: 81 (1985) opisuju postupak pri čemu se netaknuta antitela proteolitički cepaju, dajući F(ab’)2fragmente. Ovi fragmenti su redukovani u prisustvu ditiol kompleksirajućeg agensa natrijum arsenita da bi se stabilizovali vicinalni ditioli i sprečilo stvaranje intermolekularnih disulfida. Nastali Fab’ fragmenti se zatim prevode u derivate tionitrobenzoata (TNB). Jedan od Fab'-TNB derivata se zatim ponovo konvertuje u Fab'-tiol redukcijom sa merkaptoetilaminom i meša se sa ekvimolarnom količinom drugog Fab'-TNB derivata da bi se formiralo bispecifično antitelo. Proizvedena bispecifična antitela mogu se koristiti kao agensi za selektivnu imobilizaciju enzima.
Takođe su opisane različite tehnike za pripremu i izolovanje bispecifičnih fragmenata antitela direktno iz rekombinantne ćelijske kulture. Na primer, bispecifična antitela su proizvedena primenom leucinskih zatvarača. Kostelny i dr., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992). Peptidi leucinskog zatvarača iz Fos i Jun proteina vezani su za Fab' delove dva različita antitela putem fuzije gena. Homodimeri antitela su redukovani u regionu zgloba, dajući monomere, i ponovo oksidisani, formirajući heterodimere antitela. Ovaj postupak se takođe može koristiti za proizvodnju homodimera antitela. Tehnologija „diatelo” koju su opisali Hollinger i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) je obezbedila alternativni mehanizam za dobijanje fragmenata bispecifičnih antitela. Fragmenti obuhvataju varijabilni domen teškog lanca (VH) vezan za varijabilni domen lakog lanca (VL) preko linkera koji je prekratak da omogući sparivanje dva domena na istom lancu. Prema tome, VHi VLdomeni jednog fragmenta su prisiljeni da se spare sa komplementarnim VLi VHdomenima drugog fragmenta, tako formirajući dva antigen-vezujuća mesta. Druga strategija za dobijanje bispecifičnih fragmenata antitela upotrbom jednolančanih Fv (sFv) dimera takođe je objavljena. Videti Gruber i dr., J. Immunol. 152:5368 (1994).
Razmatrana su antitela sa više od dve valence. Na primer, mogu se pripremiti trispecifična antitela. Tutt i dr., J. Immunol.147: 60 (1991).
(vii) Multivalentna antitela
U nekim primerima izvođenja, antitela su multivalentna antitela. Multivalentno antitelo može biti internalizovano (i/ili katabolizirano) brže od bivalentnog antitela pomoću ćelije koja eksprimira antigen na koji se vezuju antitela. Ovde obezbeđena antitela mogu biti multivalentna antitela (koja nisu klase IgM) sa tri ili više mesta vezivanja antigena (npr., tetravalentna antitela), koja se lako mogu proizvesti rekombinantnom ekspresijom nukleinske kiseline koja kodira polipeptidne lance antitela. Multivalentno antitelo može da obuhvata domen dimerizacije i tri ili više mesta za vezivanje antigena. Poželjni domen dimerizacije sadrži (ili se sastoji od) Fc regioni ili zglobni region. U ovom scenariju, antitelo će obuhvatati Fc region i tri ili više antigen vezujućih mesta amino-terminal za Fc region. Poželjno multivalentno antitelo ovde sadrži (ili se sastoji od) tri do oko osam, ali poželjno četiri, mesta za vezivanje antigena. Multivalentno antitelo sadrži najmanje jedan polipeptidni lanac (i poželjno dva polipeptidna lanca), pri čemu polipeptidni lanac(i) sadrži dva ili više varijabilnih domena. Na primer, polipeptidni lanac (lanci) može da sadrži VD1-(X1)n-VD2-(X2) n-Fc, pri čemu je VD1 prvi varijabilni domen, VD2 je drugi varijabilni domen, Fc je jedan polipeptidni lanac Fc regiona, X1 i X2 predstavljaju aminokiselinu ili polipeptid, a n je 0 ili 1. Na primer, polipeptidni lanac(i) može sadržati: VH-CH1-fleksibilni linker-VH-CH1-Fc region lanca; ili VH-CH1-VH-CH1-Fc region lanca. Multivalentno antitelo ovde poželjno dalje sadrži najmanje dva (a poželjno četiri) polipeptida variabilnog domena lakog lanca. Multivalentno antitelo ovde može, na primer, da obuhvati od oko dva do oko osam polipeptida varijabilnog domena lakog lanca. Polipeptidi varijabilnog domena lakog lanca koji se ovde razmatraju obuhvataju varijabilni domen lakog lanca i, opciono, dalje obuhvata CL domen.
U nekim primerima izvođenja, antitelo je multispecifično antitelo. Primeri multispecifičnih antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, antitelo koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH)i varijabilni domen lakog lanca (VL),gde VHVLjedinica ima poliepitopsku specifičnost, antitela koji imaju dva ili više VLi VHdomena sa svakom VHVLjedinicom koja se vezuje na različit epitop, antitela koji imaju dva ili više pojedinačnih varijabilnih domena sa svakim pojedinačnim varijabilnim domenom koji se vezuje za razlićit epitop, antitela pune dužine, fragmenti antitela kao što su Fab, Fv, dsFv, scFv, dijatela, bispecifična dijatela, trijatela, trifunkcionalna antitela, fragmenti antitela koji su kovalentno ili nekovalentno vezani. U nekim primerima izvođenja, antitelo ima poliepitopsku specifičnost; na primer, sposobnost da se specifično veže na dva ili više različitih epitopa na istim ili različitim ciljevima. U nekim primerima izvođenja, antitela su monospecifična; na primer, antitelo koje vezuje samo jedan epitop. U skladu sa jednim primerom izvođenja, multispecifično antitelo je IgG antitelo koje se vezuje za svaki epitop sa afinitetom od 5 µM do 0,001 pM, 3 µM do 0,001 pM, 1 µM do 0,001 pM, 0,5 µM do 0,001 pM, ili 0,1 µM do 0,001 pM.
(viii) Ostale modifikacije antitela
Može biti poželjno da se modifikuje antitelo obezbeđeno ovde u odnosu na efektorsku funkciju, npr., da bi se povećala antigen-zavisna ćelijski posredovana citotoksičnost (ADCC) i/ili zavisna od komplementa citotoksičnost (CDC) antitela. Ovo se može postići uvođenjem jedne ili više aminokiselinskih supstitucija u Fc regionu antitela. Alternativno ili dodatno, cisteinski ostatak(aci) može biti uveden u Fc region, čime se omogućava formiranje međulančane disulfidne veze u ovom regionu. Tako generisano homodimerno antitelo stoga može imati poboljšanu sposobnost internalizacije i/ili povećano komplementom posredovano ubijanje ćelija i ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). Videti Caron i dr., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) i Shopes, B. J., Immunol. 148:2918-2922 (1992). Homodimerna antitela sa pojačanom anti-tumorskom aktivnošću mogu takođe biti pripremljana korišćenjem heterobifunkcionalnih unakrsnih linkera kao što je opisano u Wolff i dr, Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativno, antitelo može biti konstruisano tako da ima dva Fc regiona i na taj način može imati poboljšanu lizu i ADCC sposobnosti. Videti Stevenson i dr., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).
Za povećanje polovine poluživota antitela u serumu, mogu se napraviti aminokiselinske promene u antitelu kao što je opisano u US 2006/0067930.
(B) Varijante i modifikacije polipeptida
Modifikacija (modifikacije) aminokiselinske sekvence polipeptida, uključujući ovde opisana antitela, može se koristiti u postupcima prečišćavanja polipeptida (npr. antitela) koji su ovde opisani.
(i) Variante polipeptida
„Polipeptidna varijanta” označava polipeptid, poželjno aktivni polipeptid, kako je ovde definisan, koji ima najmanje oko 80% identičnosti aminokiselinske sekvence sa prirodnom sekvencom pune dužine polipeptida, polipeptidna sekvenca kojoj nedostaje signalni peptid, vanćelijski domen polipeptida, sa signalnim peptidom ili bez signalnog peptida. Takve polipeptidne varijante uključuju, na primer, polipeptide naznačene time što se dodaje jedna ili više aminokiselinskih ostataka, ili se brišu, na N ili C-terminalnom kraju nativne aminokiselinske sekvence pune dužine. Obično, TAT polipeptidna varijanta će imati najmanje oko 80% identičnosti aminokiselinske sekvence, alternativno barem oko bilo kojeg od 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti aminokiselinske sekvence, polipeptidne sekvence prirodne sekvence pune dužine, polipeptidna sekvenca kojoj nedostaje signalni peptid, ekstracelularni domen polipeptida, sa signalnim peptidom ili bez signalnog peptida. Opciono, varijantni polipeptidi neće imati više od jedne konzervativne aminokiselinske supstitucije u poređenju sa nativnom polipeptidnom sekvencom, alternativno ne više od bilo koje od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 konzervativnih aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa nativnom polipeptidnom sekvencom.
Varijantni polipeptid može biti skraćen na N-terminusu ili C-terminusu, ili možda nedostaju interni ostaci, na primer, kada se uporedi sa prirodnim polipeptidom pune dužine. Određene varijante polipeptida mogu imati nedostatak aminokiselinskih ostataka koji nisu neophodni za željenu biološku aktivnost. Ove varijante polipeptida sa skraćivanjem, delecijama i insercijama mogu biti pripremljeni bilo kojom od brojnih konvencionalnih tehnika. Željene varijante polipeptida mogu biti hemijski sintetizovane. Druga pogodna tehnika uključuje izolovanje i amplifikaciju fragmenta nukleinske kiseline koja kodira željeni varijantni polipeptid, lančanom reakcijom polimeraze (PCR). Oligonukleotidi koji definiraju željene krajeve fragmenta nukleinske kiseline se koriste na prajmerima 5’ i 3' u PCR.
Poželjno, varijantni polipeptidi imaju najmanje jednu biološku i/ili imunološku aktivnost sa nativnim polipeptidom koji je ovde opisan.
Ubacivanja aminokiselinskih sekvenci uključuju fuzije amino- i/ili karboksi-kraja, pri čemu se dužina kreće od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotine ostataka ili više, kao i ubacivanja u sekvencu jednog ostatka aminokiselina, ili većeg broja. Primeri terminalnih insercija uključuju antitelo sa N-terminalnim metionilnim ostatkom ili antitelo spojeno sa citotoksičnim polipeptidom. Druge varijante ubacivanja kod molekula antitela uključuju fuziju sa N- ili C- krajem antitela sa enzimom ili polipeptidom, što povećava poluživot antitela u serumu.
Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druge biološke osobine polipeptida. Varijante aminokiselinske sekvence polipeptida se pripremaju uvođenjem odgovarajućih nukleotidnih promena u nukleinsku kiselinu antitela, ili sintezom peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, izbacivanja, i/ili ubacivanja, i/ili supstitucije ostataka u aminokiselinskim sekvencama polipeptida. Svaka kombinacija izbacivanja, ubacivanja i supstitucije je napravljena da se dođe do konačnog konstrukta, pod uslovom da konačni konstrukt poseduje željene karakteristike. Promene aminokiselina takođe mogu da promene post-translacione procese polipeptida (npr. antitela), kao što je promena broja ili položaja mesta glikozilacije.
Smernice za određivanje koji aminokiselinski ostatak može biti ubačen, supstituisan ili izbrisan bez negativnog uticaja na željenu aktivnost može se naći upoređivanjem sekvence polipeptida sa homologno poznatim polipeptidnim molekulima i minimalizovanjem broja promena aminokiselinskih sekvenci napravljenih u regionima visoke homologije.
Korisni postupak za identifikovanje određenih ostataka ili regiona polipeptida (npr., antitela) koji su poželjne lokacije za mutagenezu se naziva „ciljana mutageneza sa alaninom”, i opisali su je Cunningham i Wells, Science 244:1081-1085 (1989). Ovde su identifikovani ostatak ili grupa ciljanih ostataka (npr. naelektrisani ostaci, kao Arg, Asp, His, Lys i Glu) i zamenjeni su neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (najpoželjnije alaninom ili polialaninom) da utiču na interakciju aminokiselina sa antigenom. Te aminokiselinske lokacije koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na supstitucije su zatim prečišćene uvođenjem daljih ili drugih varijanti na mestima supstituije ili za mesta supstitucije. Stoga, dok je mesto za uvođenje varijacije aminokiselinske sekvence unapred određeno, priroda mutacije sama po sebi ne mora biti unapred određena. Na primer, za analizu performansi mutacije na datom mestu, ala skeniranje ili nasumična mutageneza se sprovode na ciljnom kodonu ili regionu, a varijante eksprimiranog antitela se skeniraju za željenu aktivnost.
Drugi tip varijante je varijanta supstitucije aminokiseline. Ove varijante imaju najmanje jedan aminokiselinski ostatak u molekulu antitela zamenjen različitim ostatkom. Mesta od najvećeg interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju hipervarijabilne regione, ali FR promene su takođe razmatrane. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 1 pod naslovom „poželjne supstitucije”. Ako takve supstitucije dovode do promene u biološkoj aktivnosti, onda se mogu uvesti značajnije promene, nazvane „primeri supstitucija” u Tabeli 1, ili kao što je dalje opisano u tekstu, u vezi sa klasama aminokiselina, i skenirati proizvode.
Tabela 1.
Značajne modifikacije bioloških svojstava polipeptida ostvaruju se izborom supstitucija koje se značajno razlikuju u njihovom naporu za održavanje (a) strukture polipeptidne osnove u oblasti supstitucije, na primer, kao list ili spiralne konformacije, (b) napon ili hidrofobnost molekula na ciljanoj lokaciji ili (c) grupa na bočnom lancu. Aminokiseline se mogu grupisati prema sličnostima u svojstvima njihovih bočnih lanaca (u A. L. Lehninger, Biochemistry second ed., pp.73-75, Worth Publishers, New York (1975)):
(1) nepolarni: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M) (2) nenapunjen polarni: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) kisele: Asp (D), Glu (E)
(4) bazne: Lys (K), Arg (R), His (H)
Alternativno, ostaci koji se prirodno pojavljuju mogu se podeliti u grupe na osnovu zajedničkih osobina bočnog lanca:
(1) hidrofobne: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) kisele: Asp, Glu;
(4) bazne: His, Lys, Arg;
(5) ostaci koji utiču na orijentaciju niza: Gly, Pro;
(6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.
Nekonzervativne supstitucije zahtevaju izmenu člana jedne od ovih klasa drugom klasom.
Bilo koji cisteinski ostatak koji nije uključen u održavanje odgovarajuće konformacije antitela može takođe biti supstituisan, uopšteno sa serinom, da se poboljša oksidativna stabilnost molekula i da se spreči nenormalno umrežavanje. Suprotno tome, polipeptidu se može dodati cisteinska veza (veze) da bi se poboljšala njegova stabilnost (posebno kada je antitelo fragment antitela kao što je Fv fragment).
Posebno poželjan tip supstitucione varijante uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona matičnog antitela (npr. humanizovanog antitela). Uopšteno, dobijena varijanta (varijante) odabrana za dalji razvoj će imati poboljšana biološka svojstva u odnosu na roditeljsko antitelo iz kojeg je generisana. Pogodan način za stvaranje takvih supstitucionih varijanti uključuje sazrevanje afiniteta pomoću prikaza faga. Ukratko, nekoliko lokacija hipervarijabilnog regiona (npr.6–7 mesta) je mutirano kako bi se dobile sve moguće amino supstitucije na svakom mestu. Tako nastale varijante antitela na monovalentan način se izlažu na česticama sa filamentnim fagom kao fuzije sa gen III proizvodom M13 koji se nalazi u svakoj čestici. Varijante izložene fagima se onda ispituju da se odredi njihova biološka aktivnost (npr. afinitet vezivanja) kao što je ovde opisano. Da bi se odredili kandidati za mesta hipervarijabilnog regiona koja će se modifikovati, može da se izvrši alanin skenirajuća mutageneza, kako bi se identifikovali ostaci hipervarijabilnih regiona koji znatno doprinose vezivanju antigena. Alternativno, ili dodatno, može biti od koristi da se analizira kristalna struktura kompleksa antigen-antitelo, kako bi se identifikovale tačke kontakta između antitela i cilja. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci predstavljaju kandidate za supstituciju, prema tehnikama koje su ovde detaljno izložene. Kada se takve varijante generišu, tabla varijanti se podvrgava skriningu kao što je ovde opisano i antitela sa superiornijim svojstvima, u jednom ili više relevantnih testova, mogu biti izabrana za dalji razvoj.
Drugi tip aminokiselinske varijante polipeptida menja originalni glikozilacioni obrazac antitela. Polipeptid može da sadrži delove koji nisu aminokiseline. Na primer, polipeptid može biti glikozilovan. Takva glikozilacija se može javiti prirodno tokom ekspresije polipeptida u ćeliji domaćina ili organizmu domaćina, ili može biti namerna modifikacija koja je rezultat ljudske intervencije. Promenom se podrazumeva brisanje jednog ili više ugljenohidratnih grupa pronađenih u polipeptidu i/ili dodavanje jednog ili više glikozilacionih mesta koja nisu prisutna u polipeptidu.
Glikozilacija polipeptida je tipično N-povezana ili O-povezana. N-vezan se odnosi na vezivanje ugljenohidratne grupe na bočni lanac ostatka asparagina. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina, sekvence su prepoznavanja za enzimatsko vezivanje ugljenohidratne grupe u bočni lanac asparagina. Stoga, prisustvo bilo koje od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije. O-vezana glikozilacija se odnosi na vezivanje jednog od šećera N-acilgalaktozamina, galaktoze ili ksiloze na hidroksiaminokiselinu, najčešće serin ili treonin, mada se mogu koristiti i 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin.
Dodavanje mesta glikozilacije polipeptidu je pogodno izvršeno promenom aminokiselinske sekvence tako da ona sadrži jednu ili više goreopisanih tripeptidnih sekvenci (za N-vezana mesta glikozilacije). Promena se takođe može napraviti i dodavanjem ili supstitucijom sa jednim ili više ostataka serina ili treonina u sekvenci originalnog antitela (za O-vezana mesta glikozilacije).
Uklanjanje ugljenohidratnih delova prisutnih na polipeptidu se može postići hemijski ili enzimatski ili mutacijskom supstitucijom kodona koji kodiraju za aminokiselinske ostatke koji služe kao ciljevi za glikozilaciju. Enzimsko cepanje ugljenohidratnih delova u polipeptidima se može postići upotrebom različitih endo i egzo glikozidaza.
Druge modifikacije uključuju deamidaciju glutaminilnih i asparaginilnih ostataka do odgovarajućih glutamilnih i aspartilnih ostataka, odnosno, hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksilnih grupa seril ili treonil ostataka, metilaciju α-amino grupa lizina, arginina i histidina lancima, acetilacijom N-terminalnog amina i amidacijom bilo koje C-terminalne karboksilne grupe.
(ii) Himerički polipeptidi
Ovde opisani polipeptid može biti modifikovan na način da formira himerne molekule koji sadrže polipeptid spojen na drugi, heterologni polipeptid ili aminokiselinsku sekvencu. U nekim primerima izvođenja, himerni molekul sadrži fuziju polipeptida sa označenim polipeptidom koji obezbeđuje epitop na koji neoznačeno antitelo može selektivno da se veže. Oznaka epitopa se uopšteno nalazi na aminskom ili karboksilnom kraju polipeptida. Prisustvo takvih oblika polipeptida označenih epitopom se može detektovati upotrebom antitela protiv označenog polipeptida. Takođe, obezbeđivanje epitopne oznake omogućava da se polipeptid lako prečisti afinitetnim prečišćavanjem koristeći neoznačeno antitelo ili drugi tip matrice afiniteta koji se vezuje za epitopnu oznaku.
U alternativnom izvođenju, himerni molekul može sadržati fuziju polipeptida sa imunoglobulinom ili određenim regionom imunoglobulina. Bivalentni oblik himernog molekula se naziva „imunoadhezin”.
Kako se ovde koristi, termin „imunoadhezin” označava molekule slične antitelima koji kombinuju specifičnost vezivanja heterolognog polipeptida sa efektorskim funkcijama konstantnih domena imunoglobulina. Strukturno, imunoadhezini obuhvataju fuzije neke aminokiselinske sekvence sa željenom specifičnošću vezivanja koja je drugačija od mesta prepoznavanja i vezivanja antigena antitela (tj. „heterologni”) i sekvence konstantnog domena imunoglobulina. Adhezinski deo imunoadhezinskog molekula tipično je susedna aminokiselinska sekvenca koja sadrži najmanje mesto vezivanja receptora ili liganda. Sekvenca konstantnog domena imunoglobulina u imunoadhezinu može se dobiti iz bilo kog imunoglobulina, kao što su IgG-1, IgG-2, IgG-3 ili IgG-4 podtipovi, IgA (uključujući IgA-1 i IgA-2), IgE, IgD ili IgM.
Ig fuzije poželjno uključuju supstituciju rastvorljive (transmembranske domene izbrisane ili deaktivirane) forme polipeptida umesto najmanje jednog varijabilnog regiona unutar Ig molekula. U posebno poželjnom izvođenju, fuzija imunoglobulina uključuje zglob, CH2i CH3ili zglob, CH1,CH2i CH3regione IgG1 molekula.
(iii) Polipeptidni konjugati
Polipeptid za upotrebu u polipeptidnim formulacijama može biti konjugovan sa citotoksičnim agensom kao što je hemoterapijsko sredstvo, sredstvo za inhibiranje rasta, toksin (npr. enzimski aktivni toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porijekla ili fragmenti od toga) ili radioaktivni izotop (tj. radiokonjugat).
Mogu se koristiti hemoterapijski agensi koji su korisni u stvaranju takvih konjugata. Pored toga, enzimatski aktivni toksini i fragmenti od toga koji se mogu koristiti uključuju lanac difterije A, nevezane aktivne fragmente difterijskog toksina, lanac egzotoksina A (iz Pseudomonas aeruginosa), ricin A lanac, abrin A lanac, modecin A lanac, alfa-sarcin, Aleurites fordii proteine, diantin proteine, Phitolaca americana proteine (PAPI, PAPII i PAP-S), momordica charantia inhibitor, curcin, crotin, sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i trikotecene. Dostupni su razni radionuklidi za proizvodnju radiokonjugiranih polipeptida. Primeri uključuju<212>Bi,<131>I,<131>In,<90>Y, i<186>Re. Konjugati polipeptida i citotoksičnog agensa se dobijaju pomoću različitih agenasa za vezivanje bifunkcionalnih proteina, kao što je N-sukcinimidil-3-(2-piridilditiol) propionat (SPDP), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCL), aktivni estri (kao što je disukcinimidil-suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bisazido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao što je bis-(p-diazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat), i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, imunotoksin ricina može se dobiti kao što je opisano u Vitetta i dr., Science 238: 1098 (1987). Ugljenikom-14 obeležena 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) je primer helatnog agensa za vezivanje radionukleotida za polipeptid.
Konjugati polipeptida i jednog ili više malih molekula toksina, kao što su kaliheamicin, majtanzinoidi, trihoten i CC1065, kao i derivati ovih toksina koji imaju toksinsku aktivnost, takođe su razmatrani ovde.
Maitansinoidi su mitotski inhibitori koji deluju inhibiranjem polimerizacije tubulina. Maitansin je prvi put izolovan od istočno-afričkog grmlja Maitenus serrata. Kasnije je otkriveno da određeni mikrobi takođe proizvode maitansinoide, kao što su maitansinol i C-3 maitansinol estri. Razmatrani su i sintetički maitansinol i derivati od toga i analozi. Postoje mnoge grupe za povezivanje poznate u struci za dobijanje konjugata polipeptid-maitansinoida, uključujući, na primer, one objavljene u U.S. Pat. No. 5,208,020. Povezujuće grupe obuhvataju disulfidne grupe, tioeterske grupe, labilne grupe kiselina, fotolabilne grupe, grupacije peptidaznih labilnih grupa ili labilnih grupa na esteraze, kao što je opisano u prethodno identifikovanim patentima, poželjne su disulfidne i tioeterske grupe.
Veznik može da se poveže sa molekulom maitansinoida na različitim položajima, zavisno od vrste veze. Na primer, estarska veza može da se formira reakcijom sa hidroksilnom grupom koristeći konvencionalne tehnike spajanja. Reakcija može nastati na položaju C-3 koji ima hidroksilnu grupu, položaju C-14 modifikovanom sa hidroksimetilom, položaju C-15 modifikovanom hidroksil grupom, i položaju C-20 koji ima hidroksilnu grupu. U poželjnom izvođenju, veza se formira na položaju C-3 maitansinola ili analogu maitansinola.
Drugi konjugat od interesa obuhvata polipeptid konjugovan sa jedanim ili više molekula kaliheamicina. Porodica antibiotika kaliheamicina je sposobna da proizvede dvostruke prekide DNK u pod-pikomolarnim koncentracijama. Za dobijanje konjugata familije kaliheamicina pogledajte videti, npr, U.S. Pat. No. 5,712,374. Strukturni analozi kaliheamicina koji se mogu koristiti obuhvataju, ali nisu ograničeni na, γ1<I>, α2<I>, α3<I>, N-acetilγ1<I>, PSAG i θ1<I>. Drugi lek protiv tumora na koji se antitelo može konjugovati je KFA, koji je antifolat. I kaliheamicin i KFA imaju intracelularna mesta delovanja i ne prelaze membranu plazme. Zbog toga, ćelijsko iskorišćavanje ovih agenasa preko polipeptidne (npr., antitelo) posredovane internalizacije značajno povećava njihove citotoksične efekte.
Drugi antitumorski agensi koji se mogu konjugovani na polipeptide koji su ovde opisani, uključuju BCNU, streptozoicin, vinkristin i 5-fluorouracil, familiju agenasa poznatih kolektivno kao kompleks LL-E33288, kao i espermacine.
U nekim primerima izvođenja, polipeptid može biti konjugat između polipeptida i jedinjenja sa nukleolitičkom aktivnošću (npr. ribonukleaza ili DNK endonukleaza kao što je deoksiribonukleaza; DNaza).
U narednom primeru izvođenja, polipeptid (npr. antitelo) može biti konjugovan sa „receptorom” (kao streptavidin) za upotrebu u pre-targetiranju tumora pri čemu je konjugat polipeptidnog receptora dat pacijentu, nakon čega sledi uklanjanje nevezanog konjugata iz cirkulacije upotrebom sredstva za čišćenje, a zatim davanje „liganda” (npr. avidina) koji je konjugovan sa citotoksičnim agensom (npr. radionukleotidom).
U nekim primerima izvođenja, polipeptid može biti konjugovan sa enzimom koji aktivira prolek koji pretvara prolek (npr. peptidil hemoterapeutski agens) u aktivni lek protiv raka. Enzimska komponenta imunokonjugata uključuje svaki enzim sposoban da deluje na prolek na takav način da ga prikriva u njegov aktivniji, citotoksični oblik.
Enzimi koji su korisni uključuju, bez ograničenja, alkalnu fosfatazu koja je korisna za pretvaranje prolekova koji sadrže fosfat u slobodne lekove; arilsulfatazu, koja je korisna za pretvaranje prolekova koji sadrže sulfat u slobodne lekove; citozin deaminazu, koja je korisna za pretvaranje netoksičnog 5-fluorocitozina u lek protiv raka, 5-fluorouracil; proteaze, kao što su serratia proteaza, termolizin, suptilizin, karboksipeptidaze i katepsine (kao što su katepsini B i L), koji su korisni za pretvaranje prolekova koji sadrže peptide u slobodne lekove; D-alanilkarboksipeptidaze, koje su korisne za pretvaranje prolekova koji sadrže supstituente D-aminokiselina; enzime za cepanje ugljenih hidrata, kao što su β-galaktozidaza i neuraminidaza, koji su korisni za pretvaranje glikozilovanih prolekova u slobodne lekove; βlaktamazu, koja je korisna za pretvaranje lekova derivatizovanih β-laktamima u slobodne lekove; i penicilin amidaze, kao što je penicilin V amidaza ili penicilin G amidaza, koje su korisne za pretvaranje lekova derivatizovanih na azotu amino grupe fenoksiacetil, odnosno fenilacetil grupama, u slobodne lekove. Alternativno, antitela sa enzimskom aktivnošću, takođe u struci poznata kao „abzimi”, mogu se koristiti za pretvaranje prolekova u slobodne aktivne lekove.
(iv) Drugo
Drugi tip kovalentne modifikacije polipeptida obuhvata vezivanje polipeptida sa jednim od niza neproteinskih polimera, npr. polietilen-glikol, polipropilen-glikol, polioksialkileni ili kopolimeri polietilen-glikola i polipropilen-glikola. Polipeptid takođe može biti zarobljeni u mikrokapsulama, pripremljenim, na primer, tehnikama koacervacije ili interfacijalne polimerizacije (na primer, mikrokapsule od hidroksimetilceluloze, odnosno želatinske mikrokapsule, i mikrokapsule od poli-(metilmetakrilata)), u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nano-čestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Gennaro, A.R., Ed., (1990).
IV. Dobijanje polipeptida za upotrebu u formulacijama i postupcima
Polipeptidi koji se koriste u ovde opisanim postupcima prečišćavanja mogu se dobiti primenom postupaka koji su dobro poznati u struci, uključujući rekombinacione postupke. Sledeći odeljci obezbeđuju uputstva za ove postupke.
(A) Polinukleotidi
„Polinukleotid”, ili „nukleinska kiselina”, kako se ovde koriste, odnose se na polimere nukleotida bilo koje dužine, i obuhvataju DNK i RNK.
Polinukleotidi koji kodiraju polipeptide mogu se dobiti iz bilo kojeg izvora, uključujući, bez ograničenja, cDNA biblioteku pripremljenu iz tkiva za koje se veruje da poseduje polipeptidnu mRNK i da je eksprimiraju na detektabilnom nivou. Prema tome, polinukleotidi koji kodiraju polipeptid mogu se pogodno dobiti iz cDNA biblioteke pripremljene iz ljudskog tkiva. Gen koji kodira polipeptid može se takođe dobiti iz genomske biblioteke ili poznatim sintetičkim procedurama (npr. automatska sinteza nukleinske kiseline).
Na primer, polinukleotid može da kodira ceo lanac molekula imunoglobulina, kao što je lak lanac ili teški lanac. Kompletan teški lanac obuhvata ne samo varijabilni region teškog lanca (VH) već i konstantni region teškog lanca (CH) koji tipično obuhvataju tri konstantna domena: CH1, CH2 and CH3; i region „zgloba”. U nekim situacijama, prisustvo konstantnog regiona je poželjno.
Drugi polipeptidi koji mogu biti kodirani od strane polinukleotida uključuju fragmente antitela koji se vezuju za antigen, kao što su antitela jednog domena („dAbs”), Fv, scFv, Fab’ i F(ab')2i „minitela”. Minitela su (tipično) bivalentni fragmenti antitela iz kojih je izrezan CH1 i CKili CLdomen. S obzirom da su minitela manja od konvencionalnih antitela, ona bi trebalo da postignu bolju penetraciju tkiva u kliničkoj/dijagnostičkoj upotrebi, ali bi kao bivalentni trebalo da zadrže veći afinitet vezivanja nego monovalentni fragmenti antitela, kao što su dAbs. Prema tome, osim ako kontekst diktira drugačije, termin „antitelo”, kako se ovde koristi, obuhvata ne samo molekule celih antitela već i fragmente antitela koji se vezuju za antigen gorepomenutog tipa. Poželjno je da svaka okvirna regija prisutna u kodiranom polipeptidu obuhvata najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na odgovarajući humani akceptorski okvir. Stoga, na primer, okvirni regioni mogu da sadrže, ukupno, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, ili petnaest aminokiselinskih supstitucija u odnosu na akceptorske okvirne regione.
Pogodno, ovdeopisani polinukleotidi mogu biti izolovani i/ili prečišćeni. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidi su izolovani polinukleotidi.
Termin „izolovani polinukleotid” treba da označi da je molekul uklonjen ili odvojen od svog normalnog ili prirodnog okruženja ili je proizveden na takav način da nije prisutan u svom normalnom ili prirodnom okruženju. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidi su prečišćeni polinukleotidi. Termin prečišćen je da pokaže da su barem neki kontaminirajući molekuli ili supstance uklonjeni.
Pogodno, polinukleotidi su suštinski prečišćeni, tako da relevantni polinukleotidi čine dominantne (tj. najobilnije) polinukleotide prisutne u kompoziciji.
(B) Ekspresija polinukleotida
Opis u nastavku se prvenstveno odnosi na proizvodnju polipeptida uzgojem ćelija transformisanih ili transfektovanih sa vektorom koji sadrži polinukleotide koji kodiraju polipeptid. Naravno, smatra se da se alternativni postupci, koje su dobro poznati u struci, mogu koristiti za dobijanje polipeptida. Na primer, odgovarajuća aminokiselinska sekvenca, ili njeni delovi, mogu biti proizvedeni direktnom sintezom peptida korišćenjem tehnike čvrste faze (videti, npr., Stewart i dr., Solid-Phase Peptide Synthesis W.H. Freeman Co., San Francisco, Calif. (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc.85:2149-2154 (1963)). In vitro sinteza proteina može se izvesti ručnim tehnikama ili automatizacijom. Automatizovana sinteza se može postići, na primer, korišćenjem „Applied Biosystems Peptide Synthesizer”(Foster City, CA) koristeći instrukcije proizvođača. Različiti delovi polipeptida mogu biti hemijski sintetizovani odvojeno i kombinovani upotrebom hemijskih ili enzimskih postupaka da bi se proizveo željeni polipeptid.
Polinukleotidi kao što je ovde opisano su ubačeni u ekspresioni vektor (vektore) za proizvodnju polipeptida. Termin „kontrolne sekvence” se odnosi na DNK sekvence neophodne za ekspresiju operativno povezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu domaćina. Kontrolne sekvence uključuju, bez ograničenja, promotere (npr. prirodno povezane ili heterologne promotere), signalne sekvence, elemente pojačivača i sekvence za terminaciju transkripcije.
Polinukleotid je „operativno povezan” kada se stavi u funkcionalni odnos sa drugom polinukleotidnom sekvencom. Na primer, nukleinske kiseline za predsekvenciju ili sekretorni lider su operativno povezane sa nukleinskim kiselinama za polipeptid ako se eksprimira kao preprotein koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promoter ili pojačivač operabilno je povezan sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju sekvence; ili je mesto vezivanja ribozoma operativno povezano sa kodirajućom sekvencom ako je pozicionirano tako da olakšava translaciju. Uopšteno, „operativno povezan” znači da su sekvence nukleinskih kiselina koje su povezane susedne, i, u slučaju sekretornog lidera, susedne i u fazi čitanja. Međutim, pojačivači ne moraju biti susedni. Povezivanje se postiže ligacijom na pogodnim restrikcionim mestima. Ako takva mesta ne postoje, koriste se sintetički oligonukleotidni adaptori ili linkeri u skladu sa konvencionalnom praksom.
Za antitela, laki i teški lanci mogu biti klonirani u istim ili različitim ekspresionim vektorima. Segmenti nukleinske kiseline koji kodiraju imunoglobulinske lance su operativno povezani sa kontrolnim sekvencama u ekspresionom vektoru (vektorima) koji obezbeđuju ekspresiju imunoglobulinskih polipeptida.
Vektori koji sadrže polinukleotidne sekvence (npr. varijabilne sekvence za kodiranje teškog i/ili varijabilnog lakog lanca i opcione sekvence za kontrolu ekspresije) mogu se preneti u ćeliju domaćina dobro poznatim postupcima, koji variraju u zavisnosti od tipa ćelijskog domaćina. Na primer, transfekcija kalcijum hlorida se obično koristi za prokariotske ćelije, dok se tretman kalcijum fosfatom, elektroporacija, lipofekcija, biolistika ili viralna transfekcija mogu koristiti za druge ćelijske domaćine. (Videti uopšteno Sambrook i dr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989). Drugi postupci koji se koriste za transformaciju ćelija sisara uključuju upotrebu polibrena, fuziju protoplasta, liposoma, elektroporacije i mikroinjekcije. Za proizvodnju transgenih životinja, transgeni se mogu mikroinjektovati u oplođene jajne ćelije, ili se mogu ugraditi u genom embrionalnih matičnih ćelija, a jezgro takvih ćelija se prenosi u jajne ćelije.
(C) Vektori
Izraz „vektor” uključuje vektore ekspresije i vektore transformacije i vektore šatla. Izraz „vektor ekspresije” označava konstrukt sposoban za in vivo ili in vitro ekspresiju. Izraz „vektor transformacije” označava konstrukt koji se može preneti iz jednog entiteta u drugi entitet - koji može biti iste ili od različite vrste. Ako je konstrukt sposoban da se prenese iz jedne vrste u drugu - kao što je iz Escherichia coli plazmida u bakteriju, kao što je rod Bacillus, onda se transformacioni vektor ponekad naziva „šatl vektor”. Može čak biti i konstrukt koji se može prenijeti iz E. coli plazmida u Agrobacterium do biljke.
Vektori se mogu transformisati u odgovarajuću ćeliju domaćina kako je opisano u nastavku kako bi se obezbedila ekspresija polipeptida. Različiti vektori su javno dostupni. Vektor može, na primer, biti u obliku plazmida, kosmida, viralne čestice ili faga. Odgovarajuća sekvenca nukleinske kiseline može se ubaciti u vektor raznovrsnim postupcima. Generalno, DNK se ubacuje u jedno ili više odgovarajućih restrikcionih mesta endonukleaze pomoću tehnika poznatih u struci. U konstrukciji pogodnih vektora koji sadrže jednu ili više od ovih komponenti koriste se standardne tehnike ligacije, koje su poznate stručnjaku za ovu oblast.
Vektori mogu biti, na primer, plazmid, virus ili vektor faga opremljen sa poreklom replikacije, opciono promoter za ekspresiju navedenog polinukleotida i opciono regulator promotera. Vektori mogu sadržati jedan ili više selektivnih markerskih gena koji su dobro poznati u struci.
Ovi ekspresioni vektori se tipično repliciraju u organizmima domaćina bilo kao epizomi ili kao integralni deo hromozomske DNK domaćina.
(D) Ćelije domaćina
Ćelija domaćin može biti bakterija, kvasac ili druga gljivična ćelija, ćelija insekta, biljna ćelija ili ćelija sisara, na primer.
Za proizvodnju polipeptida može se koristiti genetski manipulisan transgeni višestanični organizam domaćina. Organizam može biti, na primer, transgeni organizam sisara ( npr. transgena linija koze ili miša).
Pogodni prokarioti uključuju, ali nisu ograničeni na eubakterije, kao što su Gramnegativni ili Gram-pozitivni organizmi, na primer, Enterobacteriaceae kao što je E. coli. Različiti sojevi E. koli su javno dostupni, kao što je E. coli K12 soj MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E. coli soj W3110 (ATCC 27.325) i K5772 (ATCC 53.635). Ostale pogodne prokariotske ćelije domaćina uključuju Enterobacteriaceae kao što je Escherichia, npr., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, npr., Salmonella typhimurium, Serratia, npr., Serratia marcescans, i Shigella, kao i Bacilli kao što su B. subtilis i B. licheniformis (npr., B. licheniformis 41P), Pseudomonas kao što su P. aeruginosa, i Streptomyces. Ovi primeri su više ilustrativni nego ograničavajući. Soj W3110 je jedan posebno poželjan domaćin ili roditelj domaćin, jer je to zajednički soj domaćina za fermentaciju rekombinantnog polinukleotidnog proizvoda. Poželjno, ćelija domaćina izlučuje minimalne količine proteolitičkih enzima. Na primer, soj W3110 može biti modifikovan da bi se izvršila genetska mutacija u genima koji kodiraju polipeptide endogene za domaćina, sa primerima takvih domaćina uključujući E. coli W3110 soj 1A2, koji ima kompletan genotip tonA; E. coli W3110 soj 9E4, koji ima kompletan genotip tonA ptr3; E. coli W3110 soj 27C7 (ATCC 55.244), koji ima kompletan genotip tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kan'; E. coli W3110 soj 37D6, koji ima kompletan genotip tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kan'; E. coli W3110 soj 40B4, koji je soj 37D6 sa mutacijom koja nije otporna na kanamicin degP; i soj E. coli koji ima mutantnu periplazmičnu proteazu. Alternativno, in vitro postupci kloniranja, npr. PCR ili druge reakcije polimeraze nukleinske kiseline, su pogodne.
U ovim prokariotskim domaćinima, mogu se napraviti ekspresioni vektori, koji će tipično sadržati kontrolne sekvence ekspresije kompatibilne sa ćelijom domaćina ( npr. poreklo replikacije). Pored toga, biće prisutan bilo koji broj različitih dobro poznatih promotera, kao što je sistem promotera laktoze, sistem promotera triptofana (trp), sistem promotera beta-laktamaze ili sistem promotera iz fag lambda. Promoteri će tipično kontrolisati ekspresiju, opciono sa sekvencom operatora, i imati sekvence vezujućeg mesta ribozoma i slično, za iniciranje i kompletiranje transkripcije i translacije.
Eukariotski mikrobi se mogu koristiti za ekspresiju. Eukariotski mikroorganizmi kao što su filamentozne gljivice ili kvasci su pogodni domaćini za kloniranje ili ekspresiju za vektore koji kodiraju polipeptid. Saccharomyces cerevisiae je najčešće korišćeni donji eukariotski mikroorganizam domaćina. Ostali uključuju Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces hostskao što su, npr., K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans, i K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris; Candida; Trichoderma reesia; Neurospora crassa; Schwanniomyces kao što su Schwanniomyces occidentalis; i filamentozne gljive kao što su,, npr., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, i Aspergillus domaćini kao što su A. nidulans, i A. niger. Ovde su pogodni metilotropni kvasci, i uključuju, ali nisu ograničeni na, kvasac koji je sposoban da raste na metanolu koji je izabran iz roda koji sadrži Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis i Rhodotorula. Saccharomyces je poželjan domaćin kvasca, sa pogodnim vektorima koji imaju ekspresione kontrolne sekvence ( npr. promotere), poreklo replikacije, završne sekvence i slično po želji. Tipični promoteri uključuju 3-fosfoglicerat kinazu i druge glikolitičke enzime. Inducibilni promoteri kvasca uključuju, između ostalog, promotere iz alkoholne dehidrogenaze, izocitohroma C i enzima odgovornih za korišćenje maltoze i galaktoze.
Pored mikroorganizama, ćelijske kulture tkiva sisara mogu se takođe koristiti za ekspresiju i proizvodnju polipeptida kao što je ovde opisano i u nekim slučajevima poželjno (Videti Winnacker, From Genes to Clones VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987). Za neke realizacije, eukariotske ćelije mogu biti poželjne, zato što je u struci razvijen niz pogodnih ćelijskih linija domaćina sposobnih za sekreciju heterolognih polipeptida (npr. intaktni imunoglobulini), i uključuje CHO ćelijske linije, različite Cos ćelijske linije, HeLa ćelije, poželjno, ćelijske linije mijeloma, ili transformisane B-ćelije ili hibridome. U nekim primerima izvođenja, ćelija domaćina sisara je CHO ćelija.
U nekim primerima izvođenja, ćelija domaćina je ćelija domaćin kičmenjaka. Primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara su CV1 linija majmunskog bubrega transformisana sa SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linija bubrega ljudskog embriona (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u kulturi suspenzije); ćelije bubrega dečijeg hrčka (BHK, ATCC CCL 10); ćelije jajnika kineskog hrčka/- DHFR (linija CHO ili CHO-DP-12); ćelije sertolija miša; ćelije bubrega majmuna (CV1 ATCC CCL 70); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587); ćelije humanog karcinoma grlića maternice (HELA, ATCC CCL 2); ćelije bubrega pasa (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre bufalo pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ljudske ćelije pluća (W138, ATCC CCL 75); ćelije ljudske jetre (Hep G2, HB 8065); tumor dojke miša (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ćelije; MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i linija ljudskog hepatoma (Hep G2).
V. Formulacije i postupci izrade formulacija
Ovde su takođe obezbeđene formulacije i postupci za dobijanje formulacije koja sadrži polipeptide (npr. antitela), prečišćena postupcima koji su ovde opisani. Na primer, prečišćeni polipeptid se može kombinovati sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.
Farmaceutske formulacije u nekim realizacijama mogu biti pripremljene za čuvanje mešanjem polipeptida koji ima željen stepen čistoće sa opcionim farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijentima ili stabilizatorima (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofiliziranih formulacija ili vodenih rastvora.
„Nosioci”, kako se ovde koristi, obuhvataju farmaceutski prihvatljive nosače, ekscipijente ili stabilizatore koji su netoksični za ćelije ili sisare koji su izloženi tome pri upotrebljenim dozama i koncentracijama. Često je fiziološki prihvatljiv nosač vodeni pH puferovani rastvor.
Prihvatljivi nosači, ekscipijensi ili stabilizatori su netoksični za primaoca u primenjenim dozama i koncentracijama, i uključuju pufere, kao što je fosfatni, citratni, i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od 10 ostataka); proteine, kao što je serum albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-jone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je TWEEN™, PLURONICS™ ili polietilen glikol (PEG).
U nekim primerima izvođenja, polipeptid u formulaciji polipeptida održava funkcionalnu aktivnost.
Formulacije za primenu in vivo moraju biti sterilne. To se lako postiže filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.
Formulacije ovde mogu takođe da sadrže više od jednog aktivnog jedinjenja, kao što je neophodno za naročitu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. Na primer, pored polipeptida, može biti poželjno uključiti u jednu formulaciju dodatni polipeptid (npr. antitelo). Alternativno, ili dodatno, kompozicija može dalje da sadrži hemoterapeutsko sredstvo, citotoksično sredstvo, citokin, agens za inhibiciju rasta, anti-hormonsko sredstvo i/ili kardioprotektant. Takvi molekuli su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe.
VI. Proizvodi
Polipeptidi prečišćeni ovde opisanim postupcima i/ili formulacije koje sadrže polipeptide prečišćene ovde opisanim postupcima mogu biti sadržani u proizvodnom artiklu. Proizvodni artikl može sadržati kontejner koji sadrži polipeptid i/ili formulaciju polipeptida. Poželjno, proizvodni artikl sadrži: (a) kontejner koji sadrži kompoziciju koja sadrži polipeptid i/ili polipeptidnu formulaciju opisanu ovde u okviru kontejnera; i (b) uputstvo za upotrebu sa upustvom za davanje formulacije subjektu.
Proizvod sadrži ambalažu i etiketu ili uputstvo u pakovanju, na ambalaži ili povezano sa njom. Pogodna ambalaža uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, itd. Ambalaža može biti izrađena od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Kontejner ima ili sadrži formulaciju i može imati sterilan priključak za pristup (na primer, kontejner može da bude vrećica za intravenski rastvor ili bočica koja ima čep koji se može probiti pomoću potkožne injekcione igle). Najmanje jedan aktivni agens u kompoziciji je polipeptid. Oznaka ili uputstvo u pakovanju ukazuje na to da se preparat koristi kod subjekta sa specifičnim uputstvima u vezi sa količinama doziranja i intervalima polipeptida i bilo kojeg drugog leka. Proizvodni artikl može dalje da obuhvati druge materijale poželjne sa komercijalnog i aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve. U nekim primerima izvođenja, kontejner je špric. U nekim primerima izvođenja, špric je dalje sadržan u injekcionom uređaju. U nekim primerima izvođenja, injekcioni uređaj je autoinjektor.
„Uputstvo za upotrebu” koristi se da se ukaže na uputstvo koje se uobičajeno nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kontraindikacijama, drugim terapeutskim proizvodima koji se kombinuju sa upakovanim proizvodom i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvih terapeutskih proizvoda.
VII. Primeri izvođenja
U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupke za prečišćavanje antitela iz kompozicije koja sadrži antitelo i jedan ili više kontaminata, a navedeni postupak sadrži a) punjenje kompozicije u mešoviti način, materijal za hromatografiju u količini od viška dinamičkog kapaciteta vezivanja hromatografskog materijala za antitelo korišćenjem pufera za punjenje, pri čemu je koeficijent raspodele hromatografskog materijala za antitelo veći od 100, b) eluiranje antitela iz hromatografskog materijala pod uslovima u kojima jedan ili više kontaminata ostaju vezani za hromatografski materijal upotrebom pufera za eluiranje, pri čemu pufer za eluiranje ima provodljivost manju od provodljivosti pufera za punjenje i c) objedinjavanje frakcija koje sadrže antitelo u hromatografskom efluentu iz koraka a) i b).
U daljem primeru izvođenja, otkrića, polipeptid je antitelo ili imunoadhezin.
U nekim primerima izvođenja otkrića, polipeptid je imunoadhezin.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, polipeptid je antitelo.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, antitelo je monoklonsko antitelo.
U narednom primeru izvođenja gorenavedenog izvođenja, monoklonsko antitelo je himerno antitelo, humanizovano antitelo ili humano antitelo.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, monoklonsko antitelo je IgG monoklonsko antitelo.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, polipeptid je antitelo je antigen vezujući fragment.
U narednom primeru izvođenja gorenavedenog izvođenja, antigen vezujući fragment je izabran iz grupe koja se sastoji od Fab fragmenta, Fab’ fragmenta, F(ab')2 fragmenta, scFv, di-scFv, bi-scFv, tandem (di,tri)-scFv, Fv, sdAb, trifunkcionalnog antitela, BiTE, diatela i triatela.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, polipeptid je izabran od enzima, hormona, fuzionog proteina, proteina koji sadrži Fc, imunokonjugata, citokina i interleukina.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, najmanje jedan kontaminat je bilo koji ili više proteina jajne ćelije kineskog hrčka (CHOP), protein ćelije domaćina (HCP), izlučeni protein A, nukleinska kiselina, DNK, varijante proizvoda, agregirani protein, komponenta medija za kulturu ćelija, gentamicin, fragment polipeptida, endotoksin i virusni kontaminat.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, gustina punjenja je između oko 50 g/L do oko 2000 g/L.
U narednom primeru izvođenja gorenavedenog izvođenja; gustina punjenja je između oko 200 g/L do oko 1000 g/L.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, kompozicija se nanosi na hromatografski materijal pri dinamičkim kapacitetima vezivanja hromatografskog materijala za jedan ili više kontaminata.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, kompozicija se nanosi na hromatografski materijal 20 puta dinamičke sposobnosti vezivanja hromatografskog materijala za polipeptid.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, postupak dalje obuhvata upotrebu pufera za punjenje i pufera za eluiranje.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, pufer za eluiranje ima provodljivost manju od provodljivosti pufera za punjenje.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, pufer za punjenje ima provodljivost od oko 4,0 mS do oko 7,0 mS.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, pufer za eluiranje ima provodljivost od oko 0,0 mS do oko 7,0 mS.
U daljem primeru izvođenja, otkrića, pufer za eluiranje ima provodljivost veću od provodljivosti pufera za punjenje.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, pufer za punjenje ima provodljivost od oko 4,0 mS do oko 7,0 mS.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, pufer za eluiranje ima provodljivost od oko 5,5 mS do oko 17,0 mS.
U daljem primeru izvođenja, otkrića, provodljivost pufera za eluiranje se smanjuje u gradijentu od oko 5,5 mS do oko 1,0 mS preko oko 10 zapremina kolone (CVs).
U daljem primeru izvođenja, otkrića, provodljivost pufera za eluiranje se smanjuje u gradijentu od oko 5,5 mS do oko 1,0 mS preko oko 15 CVs.
U daljem primeru izvođenja, otkrića, provodljivost pufera za eluiranje se smanjuje u gradijentu od oko 10,0 mS do oko 1,0 mS preko oko 5 CVs.
U daljem primeru izvođenja, otkrića, provodljivost pufera za eluiranje se smanjuje u gradijentu od oko 10,9 mS do oko 1,0 mS preko oko 10 CVs.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, pufer za eluiranje ima pH manji od pH pufera za punjenje.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, pufer za punjenje ima pH od oko 4 do oko 9.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, pufer za eluiranje ima pH od oko 4 do oko 9.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, pufer za eluiranje ima pH veći od pH pufera za punjenje.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, pufer za punjenje ima pH od oko 4 do oko 9.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, pufer za eluiranje ima pH od oko 4 do oko 9.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, kompozicija je eluent iz afinitetne hromatografije, hromatografije sa katjonskom razmenom, hromatografije anjonske razmene, hromatografije mešanog načina i hromatografije hidrofobne interakcije.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, afinitetna hromatografija je hromatografija proteina A.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, polipeptid je dalje prečišćen. U narednom primeru izvođenja gorenavedenog izvođenja, polipeptid se dalje prečišćava filtracijom virusa.
U narednom primeru izvođenja gorenavedenog izvođenja, polipeptid se dalje prečišćava sa jednom ili više afinitetnih hromatografija, hromatografijom katjonske razmene, anjonskom izmjenjivačkom hromatografijom, mešanom hromatografijom ili hidrofobnom hromatografijom.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, polipeptid je dalje koncentrisan.
U narednom primeru izvođenja gorenavedenog izvođenja, polipeptid je koncentrisan ultrafiltracijom, diafilteracijom ili kombinacijom ultrafiltracije i diafilteracije.
U daljem primeru izvođenja, gorenavedenog izvođenja, postupci dalje obuhvataju kombinovanje polipeptida sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.
Sve karakteristike otkrivene u ovoj specifikaciji mogu se kombinovati u bilo kojoj kombinaciji. Svaka karakteristika opisana u ovoj specifikaciji može biti zamenjena alternativnom karakteristikom koja služi istoj, ekvivalentnoj ili sličnoj svrsi. Stoga, ukoliko nije izričito navedeno drugačije, svaka objavljena karakteristika je samo primer generičkog niza ekvivalentnih ili sličnih karakteristika.
Dalji detalji pronalaska su ilustrovani sledećim neograničavajućim primerima.
PRIMERI
Dole navedeni primeri imaju za cilj da budu čisto primeri za pronalazak i zbog toga ne treba smatrati da ograničavaju pronalazak na bilo koji način. Sledeći primeri i detaljan opis su dati kao ilustracija, a ne kao ograničenje.
Materijali i postupci
Materijali i postupci za sve primere su izvedeni kao što je navedeno ispod, osim ako nije drugačije naznačeno u primeru.
MAb sirovine
MAb sirovine za sve primere su izabrane iz industrijskih, probnih ili malih serija ćelijskih kultura u „Genentech”-u (Južni San Francisko, Kalifornija, SAD). Posle perioda fermentacije ćelijske kulture, ćelije su razdvojene i pročišćena tečnost je prečišćena pomoću Proteinske A hromatografije. Bazen proteina A je korišćen za istraživanje mehanizma klirensa nečistoće. Tabela 2 prikazuje karakteristike sirovine za svaki mAb koji se koristi u primerima.
Tabela 2. Karakteristike MAb sirovina.
Kvantifikacija MAb
Koncentracija antitela je određena putem apsorbancije na 280 i 320 nm korišćenjem UV-vidljivog spektrofotometra (model 8453 G1103A; „Agilent Technologies”; Santa Klara, Kalifornija, SAD) ili NanoDrop 1000 model ND-1000 („Thermo Fisher Scientific”; Voltam, Masačusets, SAD). Vrste koje nisu antitela (tj. nečistoće) bile su suviše niske koncentracije da bi imale značajan efekat na UV apsorbanciju. Po potrebi, uzorci su razblaženi odgovarajućim ne-interferirajućim razblaživačem u opsegu od 0,1-1,0 jedinica apsorbancije. Priprema uzoraka i UV merenja izvršena su u duplikatu i zabeležena je srednja vrednost. Koeficijenti apsorpcije MAb su se kretali od 1,42 do 1,645/mg·ml·cm.
Kvantifikacija CHO proteina ćelije domaćina (CHOP)
ELISA je korišćena za kvantifikaciju nivoa proteina ćelije domaćina zvanog CHOP. Anti-CHOP antitela su imobilisana u bunarčićima mikrotitarske ploče. Rastvor uzoraka koji sadrže CHOP, standarda i kontrola su inkubirana u bunarčićima, praćena inkubacijom sa anti-CHOP antitelima konjugovanim sa peroksidazom rena (HRP). HRP enzimska aktivnost je detektovana sa o-fenilendiaminom, a CHOP je kvantifikovan očitavanjem apsorbancije na 490 nm u čitaču mikrotitarskih ploča. Na osnovu principa sendvič ELISA, koncentracija peroksidaze je odgovarala CHOP koncentraciji. Opseg analize za ELISA test je tipično bio 5-320 ng/ml sa varijabilnošću unutar testa <10%. CHOP vrednosti su prikazane u jedinicama ng/ml. Alternativno, CHOP vrednosti su podeljene sa koncentracijom MAb, a rezultati su prikazani u PPM (delovi na milijun; npr. ng CHOP/mg MAb). CHOP ELISA se može koristiti za kvantifikaciju ukupnih CHOP nivoa u uzorku, ali ne kvantifikuje koncentraciju pojedinačnih proteina.
Operativni uslovi za hromatografiju
”Capto Adhere” i „Capto MMC Capto Adhere” smole su dobijene od „GE Healthcare” (Upsala, Švedska). Snažne katjonske izmenjivačke smole („Poros XS” i „Poros 50 HS”) su dobijene od tvrtke „Applied Biosystems” (adresa). Svi laboratorijski hromatografski eksperimenti su izvedeni pomoću AKTA FPLC hromatografskog sistema od „GE Healthcare” (Upsala, Švedska) koristeći softver „UNICORN”. Laboratorijske kolone su bile prečnika 0,66 cm i visine 10-20 cm. Kolone su ekvilibrirane do specificiranih radnih uslova pH i provodljivosti pre opterećenja. Bazeni proteina A su zatim napunjeni u kolonu praćeni puferom za eluiranje kako bi se eluirao vezani protein. Protok ili eluat tokom faze punjenja, preopterećenja i elucije su sakupljeni kao frakcije a zatim analizirani na nečistoće. Gustina MAb opterećenja je varirala od 100 do 1000 g po litri smole.
Analiza hromatografskog bazena
Protočni bazeni tokom punjenja, preopterećenja i faza eluiranja su sakupljeni u frakcijama (1 volumen svake kolone) i analizirani za koncentraciju MAb, CHOP koncentraciju, agregate, iscrpljeni protein A, CHO DNK i prinos. Kumulativni grafički podaci su generisani kao funkcija frakcija eluiranja bazena. Kumulativni prinos je dobijen korišćenjem jednačine 1.
gde je, za frakciju i, Ci koncentracija Mab (mg/ml), Vi je zapremina frakcije (ml), Mp je masa proteina koji je napunjen (mg).
Jednačina 1
Ekskluziona hromatografija
Veličina heterogenosti monoklonskih antitela je određena pomoću testa za ekskluzionu hromatografiju visokih performansi. TSK G3000SWXL SEC kolona (prečnik = 7,8 mm, visina = 300 mm; broj dela 08541) proizvođača „Tosoh Bioscience” (Tokio, Japan) je radila na temperaturi okoline na HPLC instrumentu serije 1200 („Agilent Technologies”) i koristila se za određivanje relativnih nivoa MAb monomera za prikupljene uzorke. Kolona je radila pri brzini protoka od 0,3 mL/min koristeći 200 mM kalijum fosfat, 250 mM kalijum hlorid pH 6,2 mobilne faze. Za svaki uzorak je ubrizgano 20 µg antitela. UV apsorbancija na 280 nm je korišćena za praćenje razdvajanja monomera, LMW proteina i HMW proteina. Procenat monomera, LMW proteina i HMW proteina analiziran je ručno pomoću softvera „ChemStation” („Agilent Technologies”).
CHO DNK kvantifikacija
CHO DNA u uzorcima proizvoda je kvantifikovana pomoću PCR u realnom vremenu („TaqMan PCR”). DNA iz uzoraka i kontrola je prvo ekstrahovana pomoću Qiagen-ovog kompleta Virus Biorobot. Ekstrahovani uzorci, kontrole i standardna DNK, su bili podvrgnuti TaqMan polimeraznoj lančanoj reakciji (PCR) u realnom vremenu upotrebom PCR prajmera i probe na ploči sa 96 bunarčića sa ABI sistemom detekcije sekvence. Prajmeri su definisani segmentom od 110 baznih parova repetitivne DNK sekvence u genomu Cricetulus griseus. Sonda je obeležena fluorescentnom reporterskom bojom na 5’ kraju i bojom za gašenje na 3' kraju. Kada je sonda netaknuta, emisioni spektar reportera je potisnut od strane gasioca. 5’ nukleazna aktivnost polimeraze hidrolizuje sondu i oslobađa izveštaj, što rezultira povećanjem emisije fluorescencije. Detektor sekvence je kvantifikovao amplifikovani proizvod u direktnoj proporciji sa povećanjem emisije fluorescencije koja je merena kontinuirano tokom amplifikacije DNA. Brojevi ciklusa na kojima se DNK proširila iznad praga (CT) izračunati su za standardnu krivu. Stvorena je standardna kriva u rasponu od 1 pg/mL-10.000 pg/mL, koja je korišćena za kvantifikovanje DNK u uzorcima.
Kvantifikovanje izlučenog proteina A
Nivo izlučenog proteina-A u bazenima proteina A određen je sendvič ELISA testom proteina-A. Antitela pilećeg anti-stafilokoknog proteina A imobilisana su u bunarčićima mikrotitarske ploče. Postupak tretmana uzorka uključivao je razblaživanje uzorka, a zatim disocijaciju kompleksa Protein A/IgG koristeći mikrotalasno zagrevanje kao korak predtestiranja pre prepokretanja uzoraka na sendvič ELISA testu. Protein A, ako je prisutan u uzorku, vezan za obloženo antitelo. Vezani protein A je detektovan upotrebom antiproteinskih antitela konjugovanih peroksidazom iz rena. Enzimska aktivnost peroksidaze iz rena je kvantifikovana sa 2-komponentnim TMB supstratnim rastvorom koji proizvodi kolorimetrijski signal.
Uslovljavanje sirovina
Sirovine korišćene za eksperimente u ovoj studiji bile su ili sveže ili uzete iz hladnog skladištenja (2-8 °C ili -70 °C) i ostavljene da se uravnoteže do sobne temperature. Zatim su pH i/ili provodljivost podešeni po potrebi upotrebom agensa za titriranje (1,5 M Tris baza ili 1 M sirćetnu kiselinu) ili diluent (prečišćena voda, 5 M natrijum hlorid ili 5 M natrijum acetat). Sve sirovine su bile 0,2 µM filtrirane upotrebom „Millipak 20” (Millipore), „AcroPakTM 20” („”Pall Corporation) ili vakuum filtera („Thermo Fisher Scientific”, Ročester, Njujork, SAD).
Visokopropusni skrining
Robot „Tecan Freedom Evo 200” („Tecan US”, Research Triangle Park, Severna Karolina) je korišćen za rukovanje tečnošću i smolama. Filterska ploča sa 96 bunarčića („Seahorse” 800 µL polipropilenska 0,45 µM filtera kratkog kapanja, „E&K Scientific EK-2223”) je korišćena za inkubaciju smole sa proteinom i puferom. Posle inkubacije rastvora proteina sa smolom, filter ploča je centrifugirana na 1200 x g 3 minuta da bi se rastvor odvojio od smole. Za svaku fazu, 300 mL rastvora je dovedeno u kontakt sa 50 mL smole, što je rezultovalo u odnosu zapremine faze 6:1. Svaki bunarčić je uravnotežen do odgovarajuće pH i koncentracije natrijum acetata. pH je bio u rasponu od 5,00 do 7,5 u intervalima od 0,5 pH (korišćen je acetat za puferisanje pH 5,00 do 5,5 uslova, MES je korišćen za puferisanje pH 6,00 do 6,5 uslova, a MOPS je korišćen za puferisanje 7,00 do 7,5 uslova). Svi eksperimenti su izvedeni na sobnoj temperaturi. Delimično prečišćeni bazen proteina A, koncentrovan do 5 g/L ili 97 mg/mL, a pufer razmenjen u 15 mM NaOAc je korišćen kao punjenje za ove eksperimente. Smola je izazvana do 5 g/L za eksperimente da bi se odredile vrednosti Kpproizvoda. Međutim, za stvarni kapacitet vezivanja smola je izazivana na 97 g/L. Rastvor filtrata je uhvaćen u ploču za sakupljanje i zatim analiziran pomoću čitača ploča „Infinite M200”. Vezani protein je zatim uklonjen iz smole upotrebom dve faze 2 M NaCl pufera da bi se zatvorio balans mase.
Studije o uklanjanju virusa
Cilj ove studije je bio da se proceni sposobnost uklanjanja virusa „Capto Adhere” za 2 modela virusa (MMV i X-MuLV). Kolone, prečnika 0,66 cm, upakovane su naivnim smolama na visinu od 20 cm. Hrana za MAb je obogaćena sa 1% virusa, a zatim obrađena preko „Capto Adhere” smole. Bazeni su odmah sakupljeni, a uzorci za opterećenje i eluiranje su analizirani na broj virusa. Višestruka razblaženja bazena sa kompletnim medijom (1:10 i 1:100) su napravljena kako bi se odredila svaka potencijalna interferencija između komponenti pufera i virusa.
Primer 1. Visokopropusni skrining
Ovaj primer opisuje načine visokopropusnog skrininga za određivanje kapaciteta vezivanja hromatografskog materijala. Visokopropusni skrining je izveden na „Capto Adhere” smoli pod uslovima vezivanja za monoklonsko antitelo MAb3.
Rezultati uslova vezivanja visokopropusnog skrininga su prikazani na slici 1. U odgovoru površinske reakcije (slike 1A i 1B), regioni za vezivanje proizvoda su označeni crvenom bojom (region 8 na slici 1A i region 7 na slici 1B) i proizvod, npr. polipeptid, nevezujući regioni su zeleni (označeni kao region 1). Sadržaj stvarnog proteina ćelije domaćina (HCP) (ng/mg) u supernatantu je prikazan na konturnoj slici Slika 1C. Proizvod Kpkao funkcija pH i koncentracije kontrjona za MAb3 prikazan je na slici 1A. Smola je napunjena do 5 g/L, a neobrađeni podaci su analizirani pomoću modela površinske reakcije. Model je zatim korišćen za procenu Kpza bilo koju kombinaciju koncentracije pH i antijona u eksperimentalnom prostoru. Podaci pokazuju da kako se pH povećava i kako se povećava provodljivosti, povećava se i log Kp. Povećanje log Kpodražava povećanje vezivanja proizvoda za smolu. Da bi se utvrdio stvarni kapacitet vezivanja proizvoda na smolu, smola je izazvana do 80 g/L na 48 različitih uslova, kombinujući različite pH i koncentracije kontrajona (slika 1B). Supernatant iz iste eksperimentalne ploče je takođe analiziran na HCP (ng/mg) i podaci su iscrtani u obliku konture (slika 1C). Delimično prečišćeni bazen proteina A koji sadrži nekoliko hiljada ppm CHOP je korišćen kao punjenje za eksperimente visokopropusnog skrininga. Zelene regije (regija 1) na slici ukazuju na manju količinu CHOP u supernatantu i crvene regije (regija 8 na slici 1B i regija 9 na slici 1C) ukazuju na veću količinu CHOP u supernatantu.
Prostor dizajna za optimalne uslove punjenja i elucije može se odrediti iz CHOP i veznih podataka konturne slike. Ovi grafički podaci omogućuju dizajn protoka kroz način rada ili način rada vezivanja i eluiranja. Uslovi opterećenja za kompletnu protočnu hromatografiju su uopšteno uslovi u kojima je vezivanje proizvoda minimizirano, npr. vezivanje polipeptida, a vezivanje nečistoće (CHOP) je maksimizirano. Kompletna preklapajuća zelena područja (regija 1) između slika 1B i 1C ukazuju na zo da je moguć F/T mod. Međutim, zelena regija (regija 1) u ovoj parceli je regija u kojoj je provodljivost zaista niska ~1mS. Takvi uslovi zahtevaju oko 4-struko razblaživanje bazena proteina A, što dovodi do potencijalnih izazova na skali postrojenja.
Crvena regije (regija 7 na slici 1B i regija 8 na slici 1C) ukazuju na regije vezivanja za MAb i CHOP. U obe parcele postoje crvene regije koje se preklapaju. Međutim, Slika 1B pokazuje da je, u okviru operativnih pH i koncentracija kontrajona moguć maksimalni kapacitet vezivanja od 55 g/L. Za proces visokog titra sa titrom ćelijske kulture od ~3,5 g/L, potrebna je 1000 L kolona da se oporavi sav proizvod, kao što je polipeptid, u jednom ciklusu ili više ciklusa bi trebalo izvršiti na manjoj koloni.
U OEC načinu, stanje punjenja se može izabrati na osnovu ponašanja nečistoće (npr. CHOP) na koloni. Količina MAb koja se vezuje za kolonu je manje zabrinjavajuća, jer se vezani MAb može povratiti fazom eluiranja. Stoga, postoji čitav eksperimentalni prostor za dizajniranje stanja punjenja, tako da se dobije maksimalni klirens nečistoća bez ograničavanja kapaciteta vezivanja proizvoda od smole. Dok režim vezanja i eluiranja dozvoljava gustinu opterećenja od 55 g/L, OEC omogućava oko 10 puta veći kapacitet punjenja, što omogućava implementaciju manje kolone koja može smanjiti troškove smole po gramu proizvoda i nudi dobro uklapanje u postrojenju.
Primer 2. Način optimizovanja OEC
HTS podaci su korišćeni za određivanje parametara za rad u OEC modu. Na osnovu zaheva za gustoću punjenja, klirens i nečistoća postrojenja, uslovi opterećenja za MAb 3 su odabrani da budu pH 6,5 i 5,5 mS/cm. Gustina punjenja za optimizovani hromatografski rad prikazan na slici 2 je bio 180 g/L. Oko 50 g/L polipeptidnog proizvoda se vezuje za smolu tokom faze opterećenja. Bazen proizvoda je sakupljen počevši od oko 0,5 OD, a proizvod je preopterećen na smoli do 180 g/L. Nakon završetka faze punjenja, faza elucije sa baferom niske provodljivosti od 1 mS/cm (pufer za eluiranje: koristi se 20 mM MES pH 6,5) za eluiranje vezanog proteina što dovodi do smanjenja zapremine bazena od 10-15% u odnosu na protočnu hromatografiju. Klasifikacija prinosa i nečistoća za ovu hromatografiju prikazana je na slici 3.
Primer 3. Optimizacija punjenja
Ova studija je sprovedena da bi se uporedili HTS podaci i stvarni podaci o performansama kolone u OEC načinu rada. Kolone su bile napunjene u tri različite pH vrednosti. pH 6,5 je izabran da bude najbolje stanje na osnovu početnog CHOP klirensa i podataka o prinosu. Koncentracije CHOP u bazenima kretale su se u rasponu od 900 do 50 do 400 ppm kao funkcija pH punjenja. Iz ove studije je određeno da je pH 6,5 najbolji uslov za punjenje kompozicije. Pored toga, iako prinos nije optimizovan, pH 6,5 je takođe obezbedio maksimalni prinos (Slika 3, Tabela 3).
Tabela 3. Optimizacija stanja opterećenja za OEC način
Primer 4. Optimizacija elucije
Ova studija je sprovedena kako bi se optimizovali uslovi elucije za OEC. Da bi se dobio proizvod (Mab 3, ~50 g/L), koji je bio vezan tokom faze punjenja, nekoliko kolona zapremine pufera za ispiranje (50 mM MES, 30 mM NaAcetate, pH 6,5, ~5,5 mS/cm) su prolazile kroz kolonu nakon završetka faze punjenja. Uočena je velika količina repa što je rezultiralo povećanjem zapremina bazena na kraju faze punjenja. Povećanje zapremina bazena je bilo oko 45% uz upotrebu pufera za ispiranje sa sličnom pH i provodljivosti kao i pufer za punjenje. Ovo povećanje zapremina bazena može dovesti do izazova u postrojenju (slika 4).
Cilj studije optimizacije elucije bio je da se dobije maksimalni prinos uz minimalni CHOP i maksimalno smanjenje zapremine bazena. Faza elucije je razvijena za eluiranje 50 g/L vezanog proizvoda iz kolone. Slika 5 prikazuje fazu eluiranja hromatograma. Niži pufer za provodljivost eluira proizvod iz kolone unutar 2 zapremine kolone što rezultira većim prinosom i nižim volumenom bazena (Tabela 4). Puferi za eluiranje veće provodljivosti, sa druge strane, rezultirali su repom većim od 8 zapremina kolone. Kao što je prikazano u Tabeli 4, bazen CHOP bio je manji od 20 ppm u svim isprobanim puferima za eluiranje. Zbog toga je 20 mM MES izabran kao pufer za eluiranje da bi se povećao prinos i kako bi se smanjila količina repa.
Tabela 4. Optimizacija elucije za OEC
Primer 5. Analiza nečistoća na OEC-u
Frakcije iz OECsu analizirane na nečistoće. Slika 6A prikazuje koncentracije MAb i CHOP nivoe u frakcijama sakupljenim tokom faze opterećenja i tokom faze elucije. Tokom faze opterećenja, CHOP je ostao između 20-25 ppm i tokom faze eluiranja gde se eluira samo vezani MAb, frakcioni CHOP nivo se smanjuje. Kumulativna analiza pokazuje da CHOP i ostale nečistoće ostaju prilično konzistentne kroz cijelu fazu opterećenja i eluiranja (slika 6B). Gustina punjenja za ovo izvođenje je bila 180 g/L. Klirens virusa, koristeći X-MuLV i MMV kao model virusa, takođe je proučavano za istu gustinu opterećenja (Tabela 5). Za ovaj eksperiment, pH opterećenja je bio 6,5, a provodljivost punjenja 5,5 mS/cm. Uslovi eluiranja su bili 20 mM MES pH 6,5 i provodljivost ~1 mS/cm.
Tabela 5. Klarens virusa za OEC hromatografiju.
Primer 6. Određivanje maksimalnog kapaciteta vezivanja nečistoća
Da bi se pronašao maksimalni kapacitet vezivanja nečistoće na smoli napunjenoj sa MAb3 OEC načinom, „Capto Adhere” smola je izazvana do 1000 g/L sa bazenom proteina A. Pufer za punjenje je pH 6,5, ~ 5,5 mS/cm; pufer za eluiranje je 20 mM MES pH 6,5, ~1 mS / cm. Uzorak bazena je sakupljan na svakih 50 g/L i analiziran na CHOP i koncentraciju proteina (Slika 7). Za gustine opterećenja do 800 g/L, CHOP se nije probio i CHOP u eluatu je bio manji od 20 ng/mg.
Primer 7. Implementacija na probnoj skali
Način rada OEC je implementiran na probnim stubovima veličine od 1,6 L do 10,8 L. Prečnici stubova su se kretali u rasponu od 10 cm do 25 cm sa visinama sloja od 20 - 22 cm (Tabela 6). Uzorci su napunjeni na pH 6,5, ~5,5 mS/cm i eluirani sa 20 mM MES pH 6,5, ~ 1 mS/cm. Prinos preko probne skale je prikazan na slici 8. Gustine punjenja u probnim skalama pokrivaju opseg gustine punjenja od 70 do 180 g/L. U svim gustinama punjenja postignut je prosečni prinos od 94%. Nije bilo uticaja na prinos u opsegu testiranih gustina punjenja. U svim probnim skalama, CHOP bazena u OEC načinu je bio manji od 25 ppm, koji je zatim uklonjen nizvodno do <2 ppm CHOP u konačnom polipeptidnom proizvodu (UFDF bazen) (Tabela 7). U proseku, bilo je oko 1,1% smanjenja HMW proteina u svim probnim serijama (Tabela 8) i 0,19% smanjenja LMW proteina u svim probnim serijama (Tabela 9).
Tabela 6. Veličina kolone „Capto Adhere” za probne skale
Tabela 7. CHOP podaci probne skale
* CHOP nakon dubinske filtracije pri pH 6,5
HCCF je sakupljen iz tečnosti za kulturu ćelija
Tabela 8. Prosečno % smanjenje HMW proteina kroz 12 probnih skala.
Tabela 9. Prosečno % smanjenje LMW proteina kroz 12 probnih skala.
CHO DNK i izlučeni protein A bili su manji nego što se može detektovati u bazenu nakon OEC.
Primer 8. Implementacija na proizvodnoj skali
OEC način rada je implementiran na koloni za proizvodnju skale veličini od 157 L (prečnika 100 cm × 20 cm visine). Na proizvodnoj skali, kolona je napunjena do ~96 g/L. % prinosa u dve serije na proizvodnoj skali je bio ≥95% za oba ciklusa. U svim proizvodnim skalama, CHOP bazena u OEC režimu je bio manji od 17 ppm (Tabela 10) koji je bio raščišćen nizvodno do manjeg od detektabilnog CHOP nivoa. U proseku, došlo je do smanjenja HMW za oko 1,1%, smanjenja LMW za 0,1%, i smanjenja kiselosti za 1,65% u dve proizvodne skale.
Tabela 10. Podaci o proizvodnoj skali CHOP (ppm)
CHO DNK i izlučeni protein A bili su manji nego što se može detektovati u bazenu nakon OEC načina.
Primer 9. OEC primenjivost za druge MAb
Bazeni proteina A su korišćeni kao punjenje za ove probe. Uslovi punjenja i elucije su odabrani tako da omoguće OEC način. Gustine punjenja, % prinosa, MAb vezani za smolu (g/L), nečistoće u punjenju i bazenima prikazani su u sledećim tabelama (Tabela 11, 12, 13 i 14).
Tabela 11. OEC primenjivost na druge MAb: CHOP
Tabela 12. OEC primenjivost na druge MAb: % HMW proteina
Tabela 13. OEC primenjivost na druge MAb: % ispranog proteina A
* Manje od detektabilnog
Tabela 14. OEC primenjivost na druge MAb: CHO DNA
Primer 10. Načini AEX hromatografskih operacija bazirani na Kpvrednostima U potpunom protoku kroz (F/T) hromatografiju, Kpje <0,1 i ne postoji vezivanje proteina za smolu. U hromatografiji slabog particionisanja (WPC), Kpje 0,1 do 20 i postoji slaba podela između proizvoda i hromatografskih medija. U načinu vezivanja i eluiranja, proizvod je čvrsto vezan za smolu, a Kp>je >100, ali gustina punjenja je ograničena na kapacitet vezivanja proizvoda. Međutim, u hromatografiji sa preopterećenjem i elucijom (MAb 3), uslovi punjenja su nađeni tako da proizvod i nečistoće Kpsu >100, i iako proizvod protiče kroz dostizanje njegovog kapaciteta vezivanja, nečistoće zadržavaju vezivanje za smolu i ne probijaju se sve dok ne dostignu svoj vezujući kapacitet, koji može biti veći od kapaciteta vezivanja proizvoda.
Uslovi eluiranja su nađeni tako da je polipeptidni produkt Kp<2. Vezani proizvod se oporavlja, ali većina nečistoća ostaje vezana (nečistoća Kp> 100). Kao takav, ovaj režim omogućava dobro odstranjivanje nečistoća, dok pruža veoma visok prinos (npr. ∼95%) (Tabela 15).
Tabela 15. MAb 3 kao model antitela na „Capto Adhere” smoli
Hromatogrami iz kolone rade pod slabim uslovima raspodele (Kp= 2,4) i uslovi preopterećenja i eluata (Kp>100) pokazuju efekte povećanja mAb Kpna regione probijanja proizvoda hromatograma (Slika 9). WPC uslovi punjenja: pH 5,5, 4,4 mS/cm; WPC uslovi ispiranja: 20 mM acetat pH 5, 4,4 mS/cm. OEC uslovi punjenja: pH 6,5, 5,5 mS/cm; OEC uslovi elucije: 20 mM MES pH 6,5, ~1 mS/cm.
Tabela 16. Analiza AEX koraka poliranja za MAb koji se vezuje za AEX smolu pri tipičnom protoku kroz uslove procesa
Model antitela: MAb 3
* Uzeti 12.500 L sakupljeno na 3,5 g/L titra.
** CA smole na $ 3500/L
Primer 11. OEC primenjivost na različite smole (Referentni primer u odnosu na navedene CEX i IEX smole)
U zavisnosti od pI molekula, OEC se može primeniti na sledeće višestruke smole („Capto Adhere”, „QMA”, „MEP Hypercel”, „HEA Hypercel”, „PPA Hypercel”, „Capto MMC”). Vezanje polipeptidnog proizvoda na „Capto Adhere” smoli je bilo više hidrofobne prirode i vezani proizvod se može eluirati iz kolone smanjenjem provodljivosti pufera za eluiranje (Slika 5). Međutim, način vezanja proizvoda na smolu i eluiranje proizvoda iz smole nije ograničen na hidrofobne interakcije i stoga se OEC način rada može široko koristiti i u drugim hromatografskim materijalima. Tabela 17 pokazuje da se OEC može primeniti na druge CEX smole i IEX smole. Puferi za eluiranje su bili 20 mM MES, ako nije drugačije naznačeno. Potencijal OEC nije ograničen na gorenavedene smole i trenutno se ocenjuje. Analiza probijanja MAb 3 na QMA smoli je prikazana na slici 10. Analiza probijanja MAb 4 na „Capto Adhere” smoli je prikazana na slici 11. Analiza probijanja MAb 4 na „Capto MMC” smoli je prikazana na slici 12. Analiza probijanja MAb 3 na „Capto Adhere” smoli je prikazana na slici 13.
Tabela 17. OEC primenjivost na različite smole.
**„Poros XS” MAb 3 uslovi punjenja: pH 5,5, <6 mS/cm; Uslovi ispiranja: Pufer A – 50 mM acetat pH 5,5, ~3 mS/cm, pufer B- 350 mM acetat pH 5,5, ~24 mS/cm, gradijent: 20-85% preko 10 CV, udruživanje: 1-8 CV.
Primer 12. Gradijent eluiranja na OEC
Drugi cilj studije optimizacije elaucije je bio da se proceni efekat uslova elucije gradijenta na OEC režim na „Capto Adhere” smolu. Razvijena je faza eluiranja za eluiranje vezanog proizvoda (Tabela 18). U toku gradiranja eluata, jonska snaga, pH, sastav i koncentracija mobilne faze mogu varirati na osnovu zahteva. Tabela 18 pokazuje uslove rada: i punjenja (pH i provodljivost) i uslova elucije (pH i gradijent provodljivosti). Svi podaci prikazani u tabeli su dobijeni iz hromatografskih testova sa gustinom punjenja od 150 g/L sa MAb 3. Ovi postupci su izvedeni kao dokaz koncepta za demonstriranje da se gradijentna elucija može izvesti na OEC način hromatografije i nagiba gradijenta (koncentracija soli (mM)/volumen kolone) može biti optimizovan. Može se videti da je %HMWS smanjen za 38% u proseku u poređenju sa opterećenjem (Tabela 18). CHOP je redukovan na <20 ppm u 5,5 mS/cm provodljivosti, a veća provodljivost na 10 mS/cm, rezultovala je bazenom CHOP od ~150 ppm (Tabela 19).
Tabela 18. Gradijent eluiranja radi na OEC: %HMW podataka
Tabela 19. Gradijent eluiranja radi na OEC: CHOP podaci

Claims (14)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Postupak za prečišćavanje antitela iz kompozicije koja sadrži antitelo i jedan ili više kontaminata, pri čemu navedeni postupak sadrži
a) punjenje kompozicije na hromatografski materijal mešanog načina u količini koja je veća od dinamičkog kapaciteta vezivanja hromatografskog materijala za antitelo korišćenjem pufera za punjenje, pri čemu je koeficijent raspodele hromatografskog materijala za antitelo veći od 100,
b) eluiranje antitela iz hromatografskog materijala u uslovima u kojima jedan ili više kontaminata ostaju vezani za hromatografski materijal koristeći pufer za eluiranje, pri čemu pufer za eluiranje ima provodljivost manju od provodljivosti pufera za punjenje, i c) udruživanje frakcija koje sadrže antitelo u hromatografskom efluentu iz koraka a) i b).
2. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu je antitelo monoklonsko antitelo.
3. Postupak prema zahtevu 2, pri čemu je monoklonsko antitelo himerno antitelo, humanizovano antitelo ili humano antitelo.
4. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu je antitelo antigen vezujući fragment ; pri čemu je, izborni antigen vezujući fragment Fab fragment, Fab’ fragment, F(ab')2fragment, scFv, di-scFv, bi-scFv, tandem (di,tri)-scFv, Fv, sdAb, trifunkcionalno antitelo, BiTE, diatelo ili triatelo.
5. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu je najmanje jedan kontaminat jedan ili više ovarijskih proteina kineskog hrčka (CHOP), protein ćelije domaćina (HCP), izlučeni protein A, nukleinske kiseline, DNK, varijante proizvoda, agregirani protein, komponenta medija za kulturu ćelija, gentamicin, fragment polipeptida, endotoksin i viralni kontaminat.
6. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu je gustina punjenja veća od 200 g/L.
7. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu se kompozicija nanosi na hromatografski materijal pri približno dinamičkim kapacitetima vezivanja hromatografskog materijala za jedan ili više kontaminata.
8. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu pufer za punjenje ima provodljivost od oko 4,0 mS do oko 7,0 mS i pufer za eluiranje ima provodljivost od oko 0,0 mS do oko 7,0 mS.
9. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 8, pri čemu pufer za eluiranje ima pH manji od pH pufera za punjenje.
10. Postupak prema zahtevu 9, pri čemu pufer za punjenje ima pH od oko 4 do oko 9, a pufer za eluiranje ima pH od oko 4 do oko 9.
11. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 8, pri čemu pufer za eluiranje ima pH veći od pH pufera za punjenje.
12. Postupak prema zahtevu 11, pri čemu pufer za punjenje ima pH od oko 4 do oko 9, a pufer za eluiranje ima pH od oko 4 do oko 9.
13. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 12, pri čemu je kompozicija eluent iz afinitetne hromatografije, hromatografije sa katjonskom razmenom, hromatografije anjonske razmene, hromatografije mešanog načina ili hromatografije hidrofobne interakcije.
14. Postupak prema zahtevu 13, pri čemu je afinitetna hromatografija hromatografija proteina A.
RS20190358A 2011-11-02 2012-11-02 Hromatografija preopterećenja i eluata RS58472B2 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161554898P 2011-11-02 2011-11-02
EP17157670.5A EP3257564B2 (en) 2011-11-02 2012-11-02 Overload and elute chromatography

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RS58472B1 RS58472B1 (sr) 2019-04-30
RS58472B2 true RS58472B2 (sr) 2024-10-31

Family

ID=48192803

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190358A RS58472B2 (sr) 2011-11-02 2012-11-02 Hromatografija preopterećenja i eluata

Country Status (25)

Country Link
US (3) US20140301977A1 (sr)
EP (3) EP3257564B2 (sr)
JP (4) JP6356607B2 (sr)
KR (1) KR20140091721A (sr)
CN (2) CN104023804B (sr)
AU (1) AU2012323995B2 (sr)
BR (1) BR112014010406A2 (sr)
CA (1) CA2854330A1 (sr)
DK (2) DK2773438T4 (sr)
ES (2) ES2717536T5 (sr)
FI (1) FI3257564T4 (sr)
HR (1) HRP20190485T4 (sr)
HU (2) HUE035685T2 (sr)
IL (1) IL232146A0 (sr)
LT (1) LT3257564T (sr)
MX (1) MX2014005330A (sr)
PL (2) PL2773438T5 (sr)
PT (1) PT3257564T (sr)
RS (1) RS58472B2 (sr)
RU (1) RU2014121884A (sr)
SG (1) SG11201402019TA (sr)
SI (2) SI2773438T2 (sr)
TR (1) TR201903707T4 (sr)
WO (1) WO2013067301A1 (sr)
ZA (1) ZA201402932B (sr)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101997543B1 (ko) 2010-07-30 2019-07-09 이엠디 밀리포어 코포레이션 크로마토그래피 매질 및 방법
EP2702077A2 (en) 2011-04-27 2014-03-05 AbbVie Inc. Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
RS58472B2 (sr) 2011-11-02 2024-10-31 Hoffmann La Roche Hromatografija preopterećenja i eluata
US9150645B2 (en) 2012-04-20 2015-10-06 Abbvie, Inc. Cell culture methods to reduce acidic species
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
WO2013158273A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution
US9249182B2 (en) * 2012-05-24 2016-02-02 Abbvie, Inc. Purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
CA2888824C (en) * 2012-10-24 2021-02-02 Genzyme Corporation Elution of biomolecules from multi-modal resins using mes as mobile phase modifier
EP2830651A4 (en) 2013-03-12 2015-09-02 Abbvie Inc HUMAN ANTIBODIES THAT BIND TNF-ALPHA AND PREPARATION METHODS
US10023608B1 (en) 2013-03-13 2018-07-17 Amgen Inc. Protein purification methods to remove impurities
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
US9499614B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides
EP3052640A2 (en) 2013-10-04 2016-08-10 AbbVie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US20150139988A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
EP3698870A1 (en) 2013-12-12 2020-08-26 EMD Millipore Corporation Protein separations using an acrylamide containing filter
ES2869309T3 (es) * 2013-12-13 2021-10-25 Novo Nordisk Healthcare Ag Método para la conjugación de proteínas con tioéter
KR20150083689A (ko) * 2014-01-10 2015-07-20 삼성전자주식회사 항 c-Met 항체 정제 방법
EP3674310A1 (en) 2014-03-10 2020-07-01 Richter Gedeon Nyrt. Immunoglobulin purification using pre-cleaning steps
WO2015146487A1 (ja) * 2014-03-24 2015-10-01 日東紡績株式会社 新規カチオン性グラフト重合体を用いた標的物分離濃縮方法
KR20170004966A (ko) * 2014-05-28 2017-01-11 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 바이러스 감소 방법
JP2017519838A (ja) * 2014-06-25 2017-07-20 ジェイエイチエル バイオテック インコーポレイテッド タンパク質の精製のための方法及び試薬
CN104208719B (zh) * 2014-09-24 2017-05-03 北京天广实生物技术股份有限公司 一种抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法
CA2966515C (en) 2014-12-08 2021-04-27 Emd Millipore Corporation Mixed bed ion exchange adsorber
CN107531749A (zh) * 2015-03-06 2018-01-02 豪夫迈·罗氏有限公司 超纯化DsbA和DsbC及其制备和使用方法
CN106290591B (zh) * 2015-05-14 2019-07-26 上海医药工业研究院 一种庆大霉素C1a的检测方法
GB2539420B (en) * 2015-06-16 2021-01-13 Cytiva Sweden Ab Determination of chromatography conditions
JP7084301B2 (ja) * 2015-08-21 2022-06-14 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 低伝導率洗浄緩衝液を用いたアフィニティークロマトグラフィー精製方法
ES3034020T3 (en) * 2016-08-15 2025-08-12 Hoffmann La Roche Chromatography method for quantifying a non-ionic surfactant in a composition comprising the non-ionic surfactant and a polypeptide
GB201702856D0 (en) * 2017-02-22 2017-04-05 Ge Healthcare Bio Sciences Ab Method in continuous chromatography
CN111527202B (zh) * 2017-11-08 2024-03-29 蓝天免疫疗法有限责任公司 So3色谱在病毒纯化方法中的应用
CN112384615A (zh) * 2018-07-04 2021-02-19 普罗拜奥根股份公司 用于纯化包膜病毒的方法
EP3899526B1 (en) * 2018-12-21 2024-05-01 Solventum Intellectual Properties Company Method for testing a chromatography device used for ion exchange
US20220135619A1 (en) 2019-02-24 2022-05-05 Bristol-Myers Squibb Company Methods of isolating a protein
AR119264A1 (es) * 2019-06-05 2021-12-09 Genentech Inc Método para reutilización de cromatografía
CN111351876A (zh) * 2020-04-01 2020-06-30 上海中科新生命生物科技有限公司 一种抗体药中宿主细胞蛋白半绝对定量检测方法
US11379651B1 (en) * 2020-07-06 2022-07-05 Turtl Surf & Immerse Limited Methods and systems for interactive content creation
EP4217383A1 (en) * 2020-09-22 2023-08-02 Bristol-Myers Squibb Company Methods for producing therapeutic proteins
JP7620456B2 (ja) * 2021-03-15 2025-01-23 株式会社カネカ κ鎖を含む抗体の製造方法
EP4408856A4 (en) * 2021-09-28 2025-11-12 Kashiv Biosciences Llc IMPROVED PROCESS FOR PROTEIN PURIFICATION
US12037360B2 (en) * 2021-10-27 2024-07-16 Plasma Technologies, Llc Compositions and methods for isolating proteins

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
DE69029036T2 (de) 1989-06-29 1997-05-22 Medarex Inc Bispezifische reagenzien für die aids-therapie
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
EP0547065B1 (en) 1990-06-29 2001-08-29 Large Scale Biology Corporation Melanin production by transformed microorganisms
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
JPH06507398A (ja) 1991-05-14 1994-08-25 リプリジェン　コーポレーション Ｈｉｖ感染治療のための異種複合抗体
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
EP1136556B1 (en) 1991-11-25 2005-06-08 Enzon, Inc. Method of producing multivalent antigen-binding proteins
EP1997894B1 (en) 1992-02-06 2011-03-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
JP3571337B2 (ja) 1992-02-11 2004-09-29 セル ジェネシス，インコーポレーテッド 遺伝子標的現象による同型遺伝子接合
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
CA2140280A1 (en) 1992-08-17 1994-03-03 Avi J. Ashkenazi Bispecific immunoadhesins
PT752248E (pt) 1992-11-13 2001-01-31 Idec Pharma Corp Aplicacao terapeutica de anticorpos quimericos e marcados radioactivamente contra antigenios de diferenciacao restrita de linfocitos b humanos para o tratamento do linfoma de celulas b
CA2106612C (en) * 1993-09-21 2001-02-06 Diana Pliura Displacement chromatography process
US5534615A (en) 1994-04-25 1996-07-09 Genentech, Inc. Cardiac hypertrophy factor and uses therefor
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
CA2265464C (en) * 1996-09-13 2007-06-26 Transkaryotic Therapies, Inc. Therapy for .alpha.-galactosidase a deficiency
ES2335365T3 (es) * 1996-11-27 2010-03-25 Genentech, Inc. Purificacion por afinidad de polipeptido en una matriz de proteina a.
KR100960211B1 (ko) * 1998-05-06 2010-05-27 제넨테크, 인크. 이온 교환 크로마토그래피에 의한 단백질 정제 방법
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
WO2002051870A2 (en) 2000-12-22 2002-07-04 GRAD, Carole Legal Representative of KAPLAN, Howard Phage display libraries of human vh fragments
SK288123B6 (sk) * 2001-02-01 2013-09-03 Biogen Idec Ma Inc. Polymer conjugates of neublastin and methods of using same
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
US20070261962A1 (en) * 2002-04-02 2007-11-15 Ryszard Gajek Separation Systems with Charge Mosaic Membrane
CA2502577C (en) * 2002-10-18 2008-11-04 Asahi Kasei Pharma Corporation Hydrophilic microporous membrane
CA2529819A1 (en) 2003-06-30 2004-09-23 Domantis Limited Pegylated single domain antibodies
KR20070057839A (ko) 2004-08-19 2007-06-07 제넨테크, 인크. 변경된 이펙터 기능을 갖는 폴리펩티드 변이체
EP3088004B1 (en) 2004-09-23 2018-03-28 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
MX2007011129A (es) 2005-03-11 2007-11-06 Wyeth Corp Un metodo de cromatografia de particion debil.
WO2006116064A2 (en) 2005-04-22 2006-11-02 Waters Investments Limited Apparatus and methods for mass-spectrometric directed purification of biopolymers
NZ574626A (en) * 2006-08-28 2011-12-22 Ares Trading Sa Process for removing free Fc-moieties from fluids comprising Fc-containing proteins using ion exchange chromatography
EP2061802A1 (en) * 2006-08-28 2009-05-27 Ares Trading S.A. Process for the purification of fc-fusion proteins
AU2008256411B2 (en) 2007-06-01 2013-08-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunoglobulin purification
DE102009005479A1 (de) * 2009-01-21 2010-07-22 Sartorius Stedim Biotech Gmbh Vorrichtung und Verfahren für die Stofftrennung
JP5614936B2 (ja) * 2009-02-19 2014-10-29 旭化成ケミカルズ株式会社 アニオン交換基が固定された多孔膜を用いた核酸の精製方法
WO2011017514A1 (en) * 2009-08-07 2011-02-10 Millipore Corporation Methods for purifying a target protein from one or more impurities in a sample
WO2011035282A1 (en) * 2009-09-21 2011-03-24 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Dual capture separation
CN102094034A (zh) * 2009-12-09 2011-06-15 泰州新生源生物医药有限公司 一种重组人Fc融合长效干扰素的纯化工艺
WO2012030512A1 (en) * 2010-09-03 2012-03-08 Percivia Llc. Flow-through protein purification process
WO2012068134A1 (en) * 2010-11-15 2012-05-24 Biogen Idec Inc. Enrichment and concentration of select product isoforms by overloaded bind and elute chromatography
RS58472B2 (sr) 2011-11-02 2024-10-31 Hoffmann La Roche Hromatografija preopterećenja i eluata

Also Published As

Publication number Publication date
EP2773438A4 (en) 2015-06-03
DK3257564T3 (en) 2019-04-15
TR201903707T4 (tr) 2019-04-22
EP3257564B2 (en) 2024-05-29
JP2018184405A (ja) 2018-11-22
HK1201489A1 (zh) 2015-09-04
EP3527274A1 (en) 2019-08-21
BR112014010406A2 (pt) 2017-04-25
JP2022033774A (ja) 2022-03-02
DK3257564T4 (da) 2024-09-02
EP3527274B1 (en) 2025-12-24
JP2014532718A (ja) 2014-12-08
LT3257564T (lt) 2019-04-10
CN104023804B (zh) 2017-05-24
ES2717536T5 (en) 2025-02-04
PL2773438T3 (pl) 2017-11-30
PT3257564T (pt) 2019-03-22
EP3257564B1 (en) 2019-01-23
CN107163101B (zh) 2021-08-17
AU2012323995B2 (en) 2016-06-09
EP3257564A1 (en) 2017-12-20
EP2773438B1 (en) 2017-06-14
EP2773438B2 (en) 2021-10-20
SI3257564T1 (sl) 2019-04-30
ZA201402932B (en) 2016-08-31
HUE043755T2 (hu) 2019-09-30
HUE035685T2 (en) 2018-05-28
PL2773438T5 (pl) 2022-01-17
SI2773438T2 (sl) 2022-05-31
JP2020059718A (ja) 2020-04-16
JP6356607B2 (ja) 2018-07-11
ES2637423T5 (es) 2022-03-17
MX2014005330A (es) 2014-09-08
CA2854330A1 (en) 2013-05-10
SI3257564T2 (sl) 2024-10-30
HRP20190485T4 (hr) 2024-09-27
WO2013067301A1 (en) 2013-05-10
US20190023768A1 (en) 2019-01-24
US20140301977A1 (en) 2014-10-09
SI2773438T1 (sl) 2017-10-30
PL3257564T3 (pl) 2019-06-28
JP6979442B2 (ja) 2021-12-15
ES2637423T3 (es) 2017-10-13
JP7203928B2 (ja) 2023-01-13
NZ624317A (en) 2016-06-24
ES2717536T3 (es) 2019-06-21
CN104023804A (zh) 2014-09-03
CN107163101A (zh) 2017-09-15
US20210206836A1 (en) 2021-07-08
DK2773438T4 (da) 2022-01-03
RU2014121884A (ru) 2015-12-10
AU2012323995A1 (en) 2013-05-16
HRP20190485T1 (hr) 2019-04-19
DK2773438T3 (en) 2017-08-21
IL232146A0 (en) 2014-05-28
RS58472B1 (sr) 2019-04-30
KR20140091721A (ko) 2014-07-22
PL3257564T5 (pl) 2024-10-07
SG11201402019TA (en) 2014-09-26
EP2773438A1 (en) 2014-09-10
FI3257564T4 (fi) 2024-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7203928B2 (ja) オーバーロード／溶出クロマトグラフィー
US20220203347A1 (en) Method for regeneration of an overload chromatography column
HK1240254B (zh) 超载和洗脱层析
HK40061242A (en) A method for regeneration of an overload chromatography column
NZ624317B2 (en) Overload and elute chromatography
HK1240254A1 (en) Overload and elute chromatography
HK1201489B (en) Overload and elute chromatography