KR20140091721A - 오버로드 및 용리 크로마토그래피 - Google Patents

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KR20140091721A
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conductivity
buffer
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KR1020147014357A
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디파 나다라자흐
아미트 메흐타
Original Assignee
제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 크로마토그래피 물질의 오버로딩 및 생성물의 용리에 의해 폴리펩티드 및 하나 이상의 오염물을 포함하는 조성물로부터 폴리펩티드를 정제하는 방법을 제공한다.

Description

오버로드 및 용리 크로마토그래피{OVERLOAD AND ELUTE CHROMATOGRAPHY}
관련 출원
본원은 2011년 11월 2일에 출원된 특허 가출원 미국 일련 번호 61/554,898을 우선권 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 생성물 및 하나 이상의 오염물을 포함하는 조성물로부터 생성물을 정제하는 방법 및 이러한 방법에 의해 정제된 생성물을 포함하는 제제를 제공한다.
음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피는 모노클로날 항체 (MAb)에 대한 플랫폼 연마 단계로서 통과 모드로 광범위하게 이용된다. 표준 통과 조건 하에 AEX 수지에 결합하는 특정 MAb는 플랜트 핏 도전이 제기될 수 있다. 질량 요구가 전형적으로 낮은 초기 임상 개발의 경우에, 이러한 비-플랫폼 MAb는 AEX 또는 혼합 모드 수지를 결합 및 용리 모드로 이용함으로써 정제된다. 그러나, 이러한 수지의 낮은 동적 결합 능력 (DBC)으로 인해, 후기 구현은 크기가 대략 1000 L인 칼럼 또는 보다 작은 칼럼 상에서 다중 사이클을 필요로 할 것이며, 이에 따라 플랜트 처리량이 제한된다.
MAb 정제는 전형적으로 결합 및 용리 크로마토그래피 (B/E) 또는 통과 (F/T) 크로마토그래피를 이용하여 수행된다. 최근에 약한 분배 크로마토그래피 (문헌 [Kelley, BD et al., 2008 Biotechnol Bioeng 101(3):553-566]; 미국 특허 출원 공개 번호 2007/ 0060741) 및 오버도르 크로마토그래피 (PCT/US2011/037977)가 각각 AEX 수지 및 양이온 교환 (CEX) 수지 상에 도입되어 MAb 정제를 증진시켰다. 각각의 이러한 크로마토그래피 모드의 일반적 메카니즘 및 제한은 하기에 강조된다.
결합 및 용리 크로마토그래피: B/E 크로마토그래피 하에 생성물은 통상적으로 DBC를 최대화하기 위해 크로마토그래피 물질에 로딩되고, 이어서 세척 및 용리 조건은 최대 생성물 순도가 용리액에서 달성되도록 확인된다. B/E 크로마토그래피의 제한은 실제 수지 DBC에 대한 로드 밀도의 제한이다.
통과 크로마토그래피: F/T 크로마토그래피를 이용하여, 불순물은 크로마토그래피 물질에 강하게 결합하는 반면 생성물은 통과하는 로드 조건이 확인된다. F/T 크로마토그래피는 표준 MAb에 대한 높은 로드 밀도를 허용하지만 비-플랫폼 MAb에 대해 구현가능하지 않을 수 있거나 또는 이러한 비-플랫폼 MAb에 대한 F/T 작동을 가능하게 하는 용액 조건이 이들을 기존의 제작 플랜트에서 구현가능하지 않도록 할 수 있다.
약한 분배 크로마토그래피: 이러한 작동 모드는 수지 (2 내지 20 g/L)에 대한 MAb의 약한 결합이 존재하는 용액 조건을 확인함으로써 F/T 모드를 증진시킨다. 이러한 조건 하에 불순물은 F/T 모드에서보다 더 강하게 결합하며, 이에 따라 증진된 정제가 달성된다. 그러나, 로드 조건은 0.1-20 범위의 낮은 생성물 분배 계수 (Kp)를 갖는 것을 목적으로 한다.
오버로드 크로마토그래피: 이러한 모드의 크로마토그래피에서, 관심 생성물은 생성물에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 능력을 초과하여 로딩되고, 이에 따라 오버로드로 지칭된다. 작동 모드는 양이온 교환 (CEX) 매질 및 특히 막을 사용하는 MAb 정제를 제공하는 것으로 입증되었다. 그러나, 이러한 접근법의 제한은 용리 단계가 없기 때문에 수지에 낮은 수율이 존재할 수 있다는 것이다.
인간 요법으로 사용하기 위한 충분한 순도로의 폴리펩티드의 대규모 비용-효율적 정제는 어려운 도전으로 남아있다.
특허 출원 및 공개를 포함하는 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그의 전문이 참조로 포함된다.
본 발명은 a) 폴리펩티드 및 하나 이상의 오염물을 포함하는 조성물을 크로마토그래피 물질 상에 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 능력을 초과하는 양으로 로딩하는 단계, b) 하나 이상의 오염물이 크로마토그래피 물질에 결합된 상태로 유지되는 조건 하에 크로마토그래피 물질로부터 폴리펩티드를 용리하는 단계, 및 c) 단계 a) 및 b)로부터의 크로마토그래피 용출액 중 폴리펩티드를 포함하는 분획을 모으는 단계를 포함하는, 폴리펩티드 및 하나 이상의 오염물을 포함하는 조성물로부터 폴리펩티드를 정제하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 또는 이뮤노어드헤신이다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체; 예를 들어 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체이나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 항체는 항원 결합 단편; 예를 들어 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv, 디-scFv, 비-scFv, 탠덤 (디, 트리)-scFv, Fv, sdAb, 삼관능성 항체, BiTE, 디아바디 및 트리아바디이나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 효소, 호르몬, 융합 단백질, Fc-함유 단백질, 면역접합체, 시토카인 또는 인터류킨이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 오염물; 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 단백질 (CHOP), 숙주 세포 단백질 (HCP), 침출된 단백질 A, 카르복시펩티다제 B, 핵산, DNA, 생성물 변이체, 응집된 단백질, 세포 배양 배지 성분, 겐타미신, 폴리펩티드 단편, 내독소, 및 바이러스 오염물을 포함하는 조성물로부터 정제된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 혼합 모드 물질, 음이온 교환 물질, 소수성 상호작용 물질 및 친화성 물질로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 크로마토그래피 물질 상에 하나 이상의 오염물에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 능력 정도로 로딩된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 분배 계수는 30 초과 또는 100 초과이다.
일부 실시양태에서, 방법은 용리 완충제가 로딩 완충제의 전도도보다 작은 전도도를 갖는 OEC를 제공한다. 다른 실시양태에서, 용리 완충제는 로딩 완충제의 전도도보다 큰 전도도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 방법은 용리 완충제가 로딩 완충제의 pH보다 작은 pH를 갖는 OEC를 제공한다. 다른 실시양태에서, 용리 완충제는 로딩 완충제의 pH보다 큰 pH를 갖는다.
일부 실시양태에서, 방법의 폴리펩티드는 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피로부터의 용리액에 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 단백질 A 크로마토그래피로부터의 용리액에 있다.
일부 실시양태에서, 방법의 폴리펩티드는 예를 들어 바이러스 여과, 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 추가로 정제된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 예를 들어 한외여과, 정용여과 또는 한외여과 및 정용여과의 조합에 의해 추가로 농축된다. 일부 실시양태에서, 방법의 폴리펩티드는 제약상 허용되는 담체와 추가로 조합된다.
도 1은 MAb 3에 대한 배치 결합 조건 하의 캅토 어드히어(Capto Adhere) 수지에 대한 고처리량 스크리닝 (HTS) 결과를 보여준다. 도 1A는 MAb 3에 대한 Kp의 일정한 값의 컨투어를 보여준다. 도 1B는 수지에 대한 80 g/L 생성물 도전에서 상청액 중 MAb 3의 실제 결합 능력을 보여준다. 도 1C는 수지에 대한 80 g/L 생성물 도전에서 상청액 중 불순물 (숙주 세포 단백질)의 실제 결합 능력을 보여준다. 모든 컨투어 플롯은 미가공 데이터로부터 유래된 반응 표면 모델을 사용하여 생성되었다.
도 2는 최적화된 OEC 작동 모드에 대한 크로마토그램을 보여준다. MAb 3은 이러한 수행에서 180 g/L의 로드 밀도로 사용된다.
도 3은 MAb 3을 사용하는 OEC 모드에 대한 로드 최적화를 보여준다.
도 4는 OEC 작동 모드에 대한 표적 로드 조건을 이용하는 크로마토그램을 보여준다. 유사한 로드 및 용리 조건은 테일링을 발생시키며, 이에 따라 풀 부피가 45% 감소한다. MAb 3은 이러한 수행에서 180 g/L의 로드 밀도로 사용된다.
도 5는 MAb 3을 사용하는 OEC 모드에 대한 용리 최적화를 보여준다.
도 6은 분획에서의 불순물 분석 및 불순물의 누적 분석을 보여준다.
도 7은 1000 g/L의 로딩 밀도에서의 OEC 모드 하에 캅토 어드히어 수지의 MAb 3 CHOP 파과 분석을 보여준다.
도 8은 70 g/L 내지 180 g/L의 광범위한 로드 밀도 상에서 파일럿 스케일 수행에 걸친 수율 분석을 보여준다.
도 9는 약한 분배 크로마토그래피 작동 모드 및 오버로드 및 용리 크로마토그래피 모드 작동의 비교를 보여준다. 생성물은 MAb 3이고, 크로마토그래피 물질은 캅토 어드히어 수지이다.
도 10은 150 g/L의 로드 밀도에서의 OEC 작동 모드 하에 QMA 수지에 대한 MAb 3 CHOP 분석을 보여준다.
도 11은 150 g/L의 로드 밀도에서의 OEC 작동 모드 하에 캅토 어드히어 수지에 대한 MAb 4 CHOP 분석을 보여준다.
도 12는 150 g/L의 로드 밀도에서의 OEC 작동 모드 하에 캅토 MMC 수지에 대한 MAb 4 CHOP 분석을 보여준다.
도 13은 200 g/L의 로딩 밀도에서의 OEC 모드 하에 캅토 어드히어 수지에 대한 MAb 3 CHOP 파과 분석을 보여준다. MAb 3 단백질 A 풀을 캅토 어드히어 수지 상에 200 g/L (그의 50 g/L 생성물 결합 능력을 초과함)로 로딩한다. CHOP 파과 분석은 CHOP가 200 g/L MAb 처리까지 파과되지 않는다는 것을 보여준다.
I. 정의
본원에 기재된 용어 "생성물"은 OEC에 의해 정제될 물질; 예를 들어 폴리펩티드이다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 본원에서 교환가능하게 사용되며, 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산이 개재될 수 있다. 또한 이 용어는 자연적으로, 또는 간섭, 예를 들어 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 또한 이러한 정의는, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함) 뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 특히 항체를 포함한다.
"정제된" 폴리펩티드 (예를 들어, 항체 또는 이뮤노어드헤신)는 폴립펩티드가 이들이 그의 천연 환경에서 존재하는 경우보다 더 순수한 형태로 존재하도록 및/또는 실험실 조건 하에 최초로 합성 및/또는 증폭되는 경우에 순도가 증가한 것을 의미한다. 순도는 상대적 용어이고, 반드시 절대 순도를 의미하지는 않는다.
용어 "에피토프 태그가 부착된"이 본원에 사용되는 경우에 이는 "태그 폴리펩티드"에 융합된 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 지칭한다. 태그 폴리펩티드는 항체가 생성될 수 있는 에피토프를 제공할 만큼 충분한 잔기를 갖지만 그와 융합될 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧다. 또한, 태그 폴리펩티드는 항체가 다른 에피토프와는 실질적으로 교차반응하지 않도록 매우 특징적인 것이 바람직하다. 일반적으로, 적합한 태그 폴리펩티드는 적어도 6개의 아미노산 잔기, 통상적으로는 약 8 내지 50개의 아미노산 잔기 (바람직하게는, 약 10 내지 20개의 아미노산 잔기)를 갖는다.
본원에서의 목적을 위한 "활성인" 또는 "활성"은 천연 또는 자연-발생 폴리펩티드의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 유지하는 폴리펩티드의 형태(들)를 지칭하고, 여기서 "생물학적" 활성은 천연 또는 자연-발생 폴리펩티드가 갖는 항원성 에피토프에 대한 항체의 생성을 유도하는 능력을 제외한, 천연 또는 자연-발생 폴리펩티드에 의해 발생된 생물학적 기능 (억제성 또는 자극성)을 지칭하고, "면역학적" 활성은 천연 또는 자연-발생 폴리펩티드가 갖는 항원성 에피토프에 대한 항체의 생성을 유도하는 능력을 나타낸다.
용어 "길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 천연 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화하는 임의의 분자를 포함한다. 유사한 방식으로, 용어 "효능제"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 천연 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 임의의 분자를 포함한다. 적합한 효능제 또는 길항제 분자는 구체적으로 효능제 또는 길항제 항체 또는 항체 단편, 천연 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체 등을 포함한다. 폴리펩티드의 효능제 또는 길항제를 확인하는 방법은 폴리펩티드를 후보 효능제 또는 길항제 분자와 접촉시키고, 폴리펩티드와 통상적으로 연관되는 하나 이상의 생물학적 활성의 검출가능한 변화를 측정하는 것을 포함할 수 있다.
"보체-의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적을 용해시키는 분자의 능력을 지칭한다. 보체 활성화 경로는 동족 항원과 복합체를 형성한 분자 (예를 들어, 폴리펩티드 (예를 들어, 항체))에 보체계의 제1 성분 (C1q)이 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다.
관심 항원, 예를 들어 종양-연관 폴리펩티드 항원 표적에 "결합하는" 결합 폴리펩티드는 폴리펩티드가 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 표적화하는 데에 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하기에 충분한 친화도로 항원에 결합하고, 다른 폴리펩티드와 유의하게 교차 반응하지 않는 것이다. 이러한 실시양태에서, "비-표적" 폴리펩티드에 대한 폴리펩티드의 결합 정도는 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석 또는 방사성면역침전법 (RIA)으로 결정할 때 그의 특정 표적 폴리펩티드에 대한 폴리펩티드 결합의 약 10％ 미만일 것이다.
표적 분자에 대한 폴리펩티드의 결합과 관련해서, 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프와의 "특이적 결합" 또는 이것과 "특이적으로 결합" 또는 이에 대해 "특이적"이라는 용어는 비-특이적 상호 작용과 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어 분자의 결합을 일반적으로 결합 활성을 보유하지 않는 유사한 구조의 분자인 대조군 분자의 결합과 비교하여 결정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자, 예를 들어 과량의 비표지 표적과의 경쟁에 의해 측정할 수 있다. 이 경우에, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 비표지 표적에 의해 경쟁적으로 억제된다면 특이적 결합이다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 무손상 항체로 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체) 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다. 용어 "이뮤노글로불린" (Ig)은 본원에서 항체와 교환가능하게 사용된다.
항체는 모두 이뮤노글로불린 폴드를 기준으로 하여 하는 다양한 구조를 갖는 자연 발생 이뮤노글로불린 분자이다. 예를 들어, IgG 항체는 디술피드-결합된 2개의 "중"쇄 및 2개의 "경"쇄를 가져 기능적 항체를 형성한다. 각각의 중쇄 및 경쇄 자체는 "불변" (C) 및 "가변" (V) 영역을 포함한다. V 영역은 항체의 항원 결합 특이성을 결정하고, C 영역은 구조 지지체를 제공하고, 면역 이펙터와 비-항원-특이적 상호작용에서 기능한다. 항체 또는 항체의 항원-결합 단편의 항원 결합 특이성은 특정한 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 능력이다.
항체의 항원 결합 특이성은 V 영역의 구조적인 특성에 의해 결정된다. 가변성이 가변 도메인의 110개 아미노산 범위에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 대신, V 영역은 "초가변 영역"이라 불리는 극단적인 가변성의 더 짧은 영역 (각각 9-12개 아미노산 길이)으로 분리된 프레임워크 영역 (FR) (15-30개 아미노산)이라 불리는 비교적 불변성의 스트레치로 이루어진다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 3개의 초가변 영역에 의해 연결되고 주로 β-시트 배위를 취하는 4개의 FR을 각각 포함하며, 이들 초가변 영역은 상기 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 그의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄로부터의 초가변 영역은 FR에 의해 서로 근접하게 위치하고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접 관여하지는 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)에 있어서의 항체의 참여를 나타낸다.
각각의 V 영역은 전형적으로 3개의 상보성 결정 영역 ("CDR", 이들은 각각 "초가변 루프"를 함유함) 및 4개의 프레임워크 영역을 포함한다. 따라서, 특정한 바람직한 항원에 실질적인 친화도로 결합하는데 요구되는 최소 구조 단위인 항체 결합 부위는 전형적으로 3개의 CDR, 및 CDR을 적절한 입체형태로 유지 및 존재하게 하는 이들 사이에 배치된 적어도 3개, 바람직하게는 4개의 프레임워크 영역을 포함할 것이다. 고전적인 4쇄 항체는 협력하여 VH 및 VL 도메인에 의해 정의되는 항원 결합 부위를 갖는다. 특정 항체, 예컨대 낙타 및 상어 항체는 경쇄가 결여되어 있고, 오직 중쇄에 의해 형성된 결합 부위에 의존한다. 결합 부위가 VH 및 VL 사이의 협력없이 중쇄 또는 경쇄만으로 형성된 단일 도메인 조작된 이뮤노글로불린을 제조할 수 있다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체마다 서열에서 광범위하게 상이하며, 각각의 특정한 항체의 그의 특정한 항원에 대한 결합 및 특이성에 이용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성이 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 이는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 둘 다 내에 초가변 영역이라 지칭되는 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 지칭된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 3개의 초가변 영역에 의해 연결되고 주로 β-시트 배위를 취하는 4개의 FR을 각각 포함하며, 이들 초가변 영역은 상기 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 그의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄로부터의 초가변 영역은 FR에 의해 서로 근접하게 위치하고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접 관여하지는 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)에 있어서의 항체의 참여를 나타낸다.
용어 "초가변 영역"은 본원에서 사용될 때, 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, VL에서는 대략적으로 약 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 VH에서는 대략적으로 약 31-35B (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, VL에서는 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 및 VH에서는 26-32 (H1), 52A-55 (H2) 및 96-101 (H3) (문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)])를 포함할 수 있다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
"항체 단편"은 바람직하게는 항원 결합 영역을 포함하는 무손상 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 탠덤 디아바디 (taDb), 선형 항체(예를 들어, 미국 특허 번호 5,641,870, 실시예 2; 문헌 [Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)]); 1-아암 항체, 단일 가변 도메인 항체, 미니바디, 단일-쇄 항체 분자; 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3, (scFV)4-Fc, 디-scFv, 비-scFv, 또는 탠덤 (디,트리)-scFv를 포함하나 이에 제한되지는 않음); 및 이중특이적 T-세포 인게이저 (BiTE)를 포함한다.
항체를 파파인으로 소화시키면 "Fab" 단편으로 지칭되는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 단편과, 나머지 "Fc" 단편이 생성되며, 이러한 명칭은 그의 용이하게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 긴밀하게 비-공유 회합된 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 이러한 배위에서는 각 가변 도메인의 3개의 초가변 영역이 상호작용하여 VH-VL 이량체 표면 상의 항원-결합 부위를 한정한다. 포괄적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 초가변 영역을 단지 3개만 포함하는 Fv의 절반)일지라도 전체 결합 부위보다 친화도가 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖고 있다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 본원에서, Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 적어도 1개의 유리 티올 기를 보유하는 Fab'의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 가운데에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생성된다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체 (이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 지칭되는 명백하게 상이한 2가지 유형 중의 하나로 지정될 수 있다.
이들 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 상이한 부류로 지정될 수 있다. 5가지 주요 부류의 무손상 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이중 몇 가지는 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배위는 널리 공지되어 있다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드에 존재하는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 문헌 [Plueckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하는데, 상기 단편은 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 동일 폴리펩티드 쇄 (VH - VL) 내에 포함한다. 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이에서 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하게 되어 2개의 항원-결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.
용어 "다중특이적 항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체를 포함한다. 이러한 다중특이적 항체는 VHVL 유닛이 다중에피토프 특이성을 갖는, 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체, 각각의 VHVL 유닛이 상이한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 VL 및 VH 도메인을 갖는 항체, 각각의 단일 가변 도메인이 상이한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 단일 가변 도메인을 갖는 항체, 전장 항체, 항체 단편, 예컨대 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디, 트리아바디, 삼중특이적 항체, 공유 또는 비-공유 연결된 항체 단편을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. "폴리에피토프 특이성"은 동일하거나 상이한 표적(들) 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다. "단일특이적"은 1개의 에피토프에만 결합하는 능력을 지칭한다. 한 실시양태에 따르면, 다중특이적 항체는 각 에피토프에 5 μM 내지 0.001 pM, 3 μM 내지 0.001 pM, 1 μM 내지 0.001 pM, 0.5 μM 내지 0.001 pM, 또는 0.1 μM 내지 0.001 pM의 친화도로 결합하는 IgG 항체이다.
표현 "단일 도메인 항체" (sdAb) 또는 "단일 가변 도메인 (SVD) 항체"는 일반적으로 단일 가변 도메인 (VH 또는 VL)이 항원 결합을 부여할 수 있는 항체를 지칭한다. 즉, 단일 가변 도메인은 표적 항원을 인식하기 위해 또 다른 가변 도메인과의 상호작용을 필요로 하지 않는다. 단일 도메인 항체의 예는 낙타류 (라마 및 낙타) 및 연골 어류 (예를 들어, 너스 상어)로부터 유래된 것 및 인간 및 마우스 항체로부터 재조합 방법으로 유래된 것을 포함한다 (문헌 [Nature (1989) 341:544-546; Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56; Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235; Trends Biotechnol (2003):21:484-490]; WO 2005/035572; WO 03/035694; [Febs Lett (1994) 339:285-290]; WO00/29004; WO 02/051870).
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단, 즉 집단을 차지하고 있는 개별 항체가 모노클로날 항체의 생성 동안 유발될 수 있는 가능한 변이체 (이러한 변이체는 일반적으로 미량으로 존재함)를 제외하고는 동일하고/거나 동일한 에피토프와 결합하는 집단으로부터 수득한 항체를 지칭한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 그의 특이성 뿐만 아니라, 모노클로날 항체는 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않은 점에서 유익하다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 특징이 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 것임을 나타내며, 임의의 특정한 방법을 통한 항체 생산이 필요하다는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 방법에 따라 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 최초로 기재되었던 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567)에 의해 제조될 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 쇄(들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 (이뮤노글로불린), 뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567; 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]). 본원에서 관심 키메라 항체는 비-인간 영장류 (예컨대, 구세계 원숭이, 예컨대 개코원숭이, 레서스 또는 시노몰구스 원숭이)로부터 유래한 가변 도메인 항원-결합 서열, 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화된" 항체를 포함한다 (미국 특허 번호 5,693,780).
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대다수의 경우에, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역의 잔기가 바람직한 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능이 추가로 개선되도록 한다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 상기 언급된 FR 치환(들)은 제외하고, 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역의 적어도 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
본원에서 목적을 위해, "무손상 항체"는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 뿐만 아니라 Fc 영역을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 무손상 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖는 것이 바람직하다.
"천연 항체"는 통상적으로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1개의 공유 디술피드 결합에 의해 중쇄에 연결되는 한편, 디술피드 연결의 수는 상이한 이뮤노글로불린 이소형의 중쇄마다 달라진다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 일정하게 이격된 쇄내 디술피드 가교를 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (VH)을 갖고, 그 뒤에는 수많은 불변 도메인이 존재한다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (VL)을 다른쪽 말단에 불변 도메인을 갖고; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되며, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정한 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 인터페이스를 형성한다고 여겨진다.
"네이키드 항체"는 세포독성 모이어티 또는 방사성표지와 같은 이종 분자에 접합되지 않은 항체 (본원에 정의된 바와 같음)이다.
일부 실시양태에서, 항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인한 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 이소형에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체의 하향 조절을 포함한다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식한 후에 이러한 표적 세포의 용해를 유발하는 세포-매개 반응을 지칭한다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 일부 실시양태에서, 이러한 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 자연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함하며, PBMC 및 NK 세포가 바람직하다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체에 결합하는 수용체 (감마 수용체)이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체를 포함하며, 이는 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 달리 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하며, 이들은 주로 그의 세포질 도메인에서 차이가 나는 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재의 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다. (문헌 [Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에서 검토된다. 추후로 확인될 것을 포함하여 다른 FcR이 본원에서의 용어 "FcR"에 포괄된다. 이 용어는 모 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 수용체 FcRn을 또한 포함한다 (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]).
크로마토그래피에 관련하여 본원에 사용된 용어 "순차적"은 제1 크로마토그래피에 이어 제2 크로마토그래피를 갖는 것을 지칭한다. 추가의 단계는 제1 크로마토그래피와 제2 크로마토그래피 사이에 포함될 수 있다.
크로마토그래피에 관련하여 본원에 사용된 용어 "연속적"은 직접 연결되거나 또는 2가지 크로마토그래피 물질 사이의 연속적 흐름을 허용하는 일부 다른 메카니즘의 제1 크로마토그래피 물질 및 제2 크로마토그래피 물질을 갖는 것을 지칭한다.
"오염물"은 바람직한 폴리펩티드 생성물과 상이한 물질을 지칭한다. 오염물은 비제한적으로 숙주 세포 물질, 예컨대 CHOP; 침출된 단백질 A; 핵산; 바람직한 폴리펩티드의 변이체, 단편, 응집체 또는 유도체; 또 다른 폴리펩티드; 내독소; 바이러스 오염물; 세포 배양 배지 성분 등을 포함한다. 일부 예에서, 오염물은 예를 들어 비제한적으로 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 세포, 곤충 세포, 원핵 세포, 진핵 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 조류 세포, 진균 세포로부터의 숙주 세포 단백질 (HCP)일 수 있다.
크로마토그래피 물질의 "동적 결합 능력"은 생성물, 예를 들어 폴리펩티드의 양이고, 물질은 결합되지 않은 생성물의 유의한 파과가 일어나지 전에 실제 흐름 조건 하에 결합할 것이다.
본원에 사용된 "분배 계수", Kp는 이동상에서 생성물의 몰 농도에 의해 나누어진 고정상에서의 생성물, 예를 들어 폴리펩티드의 몰 농도를 지칭한다.
"로딩 밀도"는 소정 부피의 크로마토그래피 물질 (예를 들어, 리터)과 접촉하여 제공된 조성물의 양 (예를 들어, 그램)을 지칭한다. 일부 예에서, 로딩 밀도는 g/L로 표현된다.
본원에서 값 또는 파라미터에 대해 언급되는 "약"은 해당 값 또는 파라미터 자체에 대해 지시된 변화를 포함 (및 기재)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
본원 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 단수형은 문맥상 달리 분명하게 언급되지 않은 한 복수 지시대상을 포함한다. 본원에서 기재된 본 발명의 측면 및 변동은 측면 및 변동으로 "로 이루어지는" 및/또는 "로 본질적으로 이루어지는" 것을 포함하는 것으로 이해된다.
II. 정제 방법
오버로드 및 용리 크로마토그래피 (OEC)를 이용하여 생성물 및 하나 이상의 오염물을 포함하는 조성물로부터 생성물, 예컨대 폴리펩티드를 정제하는 방법이 본원에 제공된다. OEC는 상이한 모드의 크로마토그래피에 의해 제공된 이익이 단일 크로마토그래피 모드 내에서 실현되는 작동 모드를 제공한다. OEC는 증진된 불순물 제거 및 유의한 제작 이점, 예컨대 보다 작은 칼럼, 보다 우수한 플랜트 핏 및 보다 적은 비용을 제공하면서 다중 수지 상에서 구현될 수 있다. OEC에서의 작동 모드는 3가지 상이한 성분으로 분류될 수 있다.
1. 오버로드 - 조성물을 생성물, 예를 들어 폴리펩티드가 생성물에 대한 물질의 동적 결합 능력 (DBC)을 초과하는 양으로 크로마토그래피 물질 상에 로딩되도록 크로마토그래피 물질 상에 로딩한다. 일부 실시양태에서, 불순물이 크로마토그래피 물질에 강하게 결합하는 로딩 조건, 예컨대 pH 및 전도도가 결정된다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 조건은 생성물이 결합 후에 파과하더라도 대부분의 (전부가 아니라도) 불순물은 그렇지 않도록 선택된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 오염물에 대한 물질의 DBC에서 또는 그 부근에서 로딩된다. 오버로드 모드는 크로마토그래피 물질이 생성물에 대한 물질의 전형적인 DBC 초과로 이용되도록 허용한다.
2. 풀링 - 용리액 중 생성물, 예를 들어 폴리펩티드의 풀링은 생성물 파과시에 시작한다. 로드 조건은 불순물이 파과 단계 동안 계속 결합하도록 하므로, 깨끗한 생성물 풀은 크로마토그래피의 로드 단계 동안 용리액에서 수득될 수 있다.
3. 용리 - 크로마토그래피 물질에 대한 조성물의 로딩 완료시에, 생성물, 예를 들어 폴리펩티드를 결합된 생성물이 대부분의 불순물은 크로마토그래피 물질에 결합된 상태로 유지되도록 하면서 용리되도록 확인된 용리 조건을 이용하여 크로마토그래피 물질로부터 용리한다.
일부 측면에서, OEC는 생성물에 대한 물질의 DBC를 유의하게 초과하는 크로마토그래피 물질 활용을 증가시켜 다른 크로마토그래피 방법과 비교하여 이익을 제공한다. 예를 들어, 10배 더 높은 크로마토그래피 물질 활용이 유의하게 보다 적은 비용을 발생시킬 수 있다.
크로마토그래피 물질의 로딩이 생성물, 예를 들어 폴리펩티드의 크로마토그래피 수지에 대한 결합을 최대화하기 위해 최적화된 종래의 결합 및 용리 크로마토그래피와 달리, OEC 로드 조건에서는 크로마토그래피 물질에 대한 오염물의 결합은 최대화하면서 크로마토그래피 물질에 대한 생성물의 결합은 그렇지 않도록 최적화될 수 있다. 일부 측면에서, 조성물은 생성물에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 능력을 초과하는 양으로 크로마토그래피 물질 상에 로딩된다. 크로마토그래피 물질의 로딩 과정에서, 생성물 중 일부는 세척시에 파과할 것이며, 생성물 중 일부는 크로마토그래피 물질에 결합된 상태로 유지될 것이다. 로드의 완료시에, 크로마토그래피 물질에 결합된 나머지 생성물은 크로마토그래피 물질로부터 용리할 수 있다. 상기 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 칼럼이다. 상기 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 막이다.
본 발명의 일부 측면에서, 조성물은 조성물 중 하나 이상의 오염물에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 능력 정도로 크로마토그래피 물질 상에 로딩된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 생성물에 대한 크로마토그래피 물질의 결합 능력을 초과하는 양으로 크로마토그래피 물질 상에 로딩된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 크로마토그래피 물질 상에 하나 이상의 오염물에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 능력 정도로 및 생성물에 대한 크로마토그래피 물질의 결합 능력 초과로 로딩된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 크로마토그래피 물질 상에 생성물에 대한 크로마토그래피 물질의 DBC의 20배로 로딩된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 크로마토그래피 물질 상에 생성물에 대한 크로마토그래피 물질의 DBC의 100배로 로딩된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 크로마토그래피 물질 상에 조성물 중 모든 오염물에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 능력 정도로 로딩된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 크로마토그래피 물질 상에 모든 오염물에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 능력 정도로 및 생성물에 대한 크로마토그래피 물질의 결합 능력 초과로 로딩된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 크로마토그래피 물질 상에 모든 오염물에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 능력 미만 및 생성물에 대한 크로마토그래피 물질의 결합 능력 초과로 로딩된다. 상기 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 칼럼에 있다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 칼럼은 산업적 스케일 크로마토그래피 칼럼이다. 상기 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 막이다.
생성물 및 하나 이상의 오염물에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 능력은 특정한 크로마토그래피 물질에 대한 pH 및 반대이온 농도의 함수로서 생성물 또는 오염물에 대한 분배 계수 (Kp)를 결정함으로써 추정될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질, 예를 들어 혼합 모드 수지의 동적 결합 능력이 결정될 수 있다. pH 및 반대이온 농도의 특정 조합에서 생성물 또는 오염물에 대한 크로마토그래피 물질의 실제 결합 능력은 과량의 생성물 및/또는 오염물로 결합에 도전함으로써 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 생성물, 예를 들어 폴리펩티드의 Kp가 약 30 초과인 OEC가 수행된다. 일부 실시양태에서, 생성물의 Kp가 약 50 초과인 OEC가 수행된다. 일부 실시양태에서, 생성물의 Kp가 약 75 초과인 OEC가 수행된다. 일부 실시양태에서, 생성물의 Kp가 약 100 초과인 OEC가 수행된다.
생성물, 예컨대 폴리펩티드, 및 오염물을 포함하는 특정한 조성물의 OEC를 위한 조건은 상이한 pH 및 반대이온 농도에서 특정한 크로마토그래피 물질의 Kp 및 동적 결합 능력을 측정함으로써 결정될 수 있다. 고처리량 스크리닝을 수행하여 오염물의 결합이 높고 생성물이 대부분 (전부는 아니더라도)의 오염물은 용리하지 않으면 용리될 수 있는 OEC 조건을 결정할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 고처리량 시스템 하에; 예를 들어 다중-웰 플레이트의 웰에서 다양한 pH 및 반대이온 농도의 완충제 중에 크로마토그래피 물질과 인큐베이션할 수 있다. 인큐베이션 기간 후에, 상청액을 크로마토그래피 물질로부터 분리하고, 상청액 중 생성물 또는 오염물의 양을 결정한다. 일부 실시양태에서, 낮은 농도의 조성물을 사용하여 Kp를 결정한다. 일부 실시양태에서, 높은 농도의 조성물을 사용하여 동적 결합 능력을 결정한다.
특정한 생성물 및 오염물에 대한 크로마토그래피 물질의 Kp 및 동적 결합 능력에 관한 정보를 제공하는 것 뿐만 아니라, 고처리량 스크리닝은 pH 및 반대이온 농도로 로드 및 용리 조건에 관한 지침을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 로드 완충제는 용리액 중 오염물, 예를 들어 숙주 세포 단백질의 양을 최소화하면서 크로마토그래피 물질에 대한 오염물 결합을 최대화할 뿐만 아니라 용리액 중 생성물, 예를 들어 폴리펩티드의 양을 최대하기 위해 pH 및 반대이온 농도에 대한 고처리량 스크리닝에 의해 선택된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 조성물 중 대략 모든 오염물이 크로마토그래피 물질에 결합하는 고처리량 스크리닝에 의해 결정된 pH 및 전도도에서 크로마토그래피 물질 상에 로딩된다. 일부 실시양태에서, 생성물은 대략 모든 생성물이 크로마토그래피 물질로부터 용리하고 대략 모든 오염물이 크로마토그래피 물질에 결합된 상태로 유지되는 고처리량 스크리닝에 의해 결정된 pH 및 전도도에서 크로마토그래피 물질로부터 용리된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 크로마토그래피 물질의 mL당 결합된 생성물의 양에 관계없이 최대량의 오염물이 크로마토그래피 물질에 결합하도록 하는 작동 조건을 확인하는 방법 (예를 들어, 고처리량 스크리닝 기술의 이용에 의함)을 제공한다. 스크리닝 단계를 이용하여 결합된 생성물이 크로마토그래피 물질로부터 용리되고 불순물은 크로마토그래피 물질에 단단하게 결합된 상태로 유지되도록 하는 용리 조건을 확인한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 다음의 기능 중 하나 이상이 가능한 관능기를 포함하는 혼합 모드 물질이다: 음이온 교환, 양이온 교환, 수소 결합 및 소수성 상호작용. 일부 실시양태에서, 혼합 모드 물질은 음이온 교환 및 소수성 상호작용을 가능하게 하는 관능기를 포함한다. 혼합 모드 물질은 리간드로서 N-벤질-N-메틸 에탄올 아민, 4-메르캅토-에틸-피리딘, 헥실아민 또는 페닐프로필아민을 함유하거나 가교 폴리알릴아민을 함유할 수 있다. 혼합 모드 물질의 예는 캅토 어드히어 수지, QMA 수지, 캅토 MMC 수지, MEP 하이퍼셀 수지, HEA 하이퍼셀 수지, PPA 하이퍼셀 수지 또는 크로마소르브 막 또는 사토바인드 STIC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 혼합 모드 물질은 캅토 어드히어 수지이다. 상기 일부 실시양태에서, 혼합 모드 물질은 혼합 모드 크로마토그래피 칼럼이다. 상기 일부 실시양태에서, 혼합 모드 물질은 혼합 모드 막이다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 이온 교환 크로마토그래피 물질; 예를 들어 음이온 교환 크로마토그래피 물질 또는 양이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 물질이다. 일부 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 양으로 하전되고 고체 상 위를 지나가거나 또는 이를 통과하는 수용액 중에서 음이온과의 교환을 위한 유리 음이온을 갖는 고체 상이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 음이온 교환 물질은 막, 모노리스, 또는 수지일 수 있다. 한 실시양태에서, 음이온 교환 물질은 수지일 수 있다. 일부 실시양태에서, 음이온 교환 물질은 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민 또는 4급 암모늄 이온 관능기, 폴리아민 관능기, 또는 디에틸아미노에틸 관능기를 포함할 수 있다. 상기 일부 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼이다. 상기 일부 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 막이다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 물질이다. 일부 실시양태에서, 양이온 교환 물질은 음으로 하전되고 고체 상 위를 지나가거나 또는 이를 통과하는 수용액 중에서 양이온과의 교환을 위한 유리 양이온을 갖는 고체 상이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 양이온 교환 물질은 막, 모노리스, 또는 수지일 수 있다. 일부 실시양태에서, 양이온 교환 물질은 수지일 수 있다. 양이온 교환 물질은 카르복실산 관능기 또는 술폰산 관능기, 예컨대 술포네이트, 카르복실산, 카르복시메틸 술폰산, 술포이소부틸, 술포에틸, 카르복실, 술포프로필, 술포닐, 술폭시에틸 또는 오르토포스페이트를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 상기 일부 실시양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼이다. 상기 일부 실시양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 막이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 물질이 아니다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 이온 교환 물질은 종래의 크로마토그래피 물질 또는 전달성 크로마토그래피 물질을 활용할 수 있다. 종래의 크로마토그래피 물질은 예를 들어 살포성 물질 (예를 들어, 폴리 (스티렌-디비닐벤젠) 수지) 및 확산성 물질 (예를 들어, 가교 아가로스 수지)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리 (스티렌-디비닐벤젠) 수지는 포로스 수지일 수 있다. 일부 실시양태에서, 가교 아가로스 수지 는 술포프로필-세파로스 패스트 플로우 ("SPSFF") 수지일 수 있다. 전달성 크로마토그래피 물질은 막 (예를 들어, 폴리에테르술폰) 또는 모노리스 물질 (예를 들어 가교 중합체)일 수 있다. 폴리에테르술폰 막은 무스탕일 수 있다. 가교 중합체 모노리스 물질은 가교 폴리(글리시딜 메타크릴레이트-코-에틸렌 디메타크릴레이트)일 수 있다.
음이온 교환 물질의 예는 당업계에 공지되어 있으며, 포로스 HQ 50, 포로스 PI 50, 포로스 D, 무스탕 Q, Q 세파로스 FF, 및 DEAE 세파로스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
양이온 교환 물질의 예는 당업계에 공지되어 있으며, 무스탕 S, 사토바인드 S, SO3 모노리스, S 세라믹 하이퍼D, 포로스 XS, 포로스 HS50, 포로스 HS20, SPSFF, SP-세파로스 XL (SPXL), CM 세파로스 패스트 플로우, 캅토 S, 프락토겔 Se 하이캡, 프락토겔 SO3, 또는 프락토겔 COO를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 양이온 교환 물질은 포로스 HS50이다. 일부 실시양태에서, 포로스 HS 수지는 포로스 HS 50 μm 또는 포로스 HS 20 μm 입자일 수 있다.
본 발명의 일부 측면에서, 크로마토그래피 물질은 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질이다. 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)는 소수성에 따라 생체분자를 분리하는 액체 크로마토그래피 기술이다. HIC 크로마토그래피 물질의 예는 토요피얼 헥실 650, 토요피얼 부틸 650, 토요피얼 페닐 650, 토요피얼 에테르 650, 소스, 리소스, 세파로스 하이-트랩, 옥틸 세파로스, 페닐 세파로스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 상기 일부 실시양태에서, HIC 크로마토그래피 물질은 HIC 크로마토그래피 칼럼이다. 상기 일부 실시양태에서, HIC 크로마토그래피 물질은 HIC 크로마토그래피 막이다.
본 발명의 일부 측면에서, 크로마토그래피 물질은 히드록시아파타이트 (HAP) 크로마토그래피 물질이다. 히드록시아파타이트 크로마토그래피 물질의 예는 HA 울트로겔 및 CHT 히드록시아파타이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 상기 일부 실시양태에서, HAP 크로마토그래피 물질은 HAP 크로마토그래피 칼럼이다. 상기 일부 실시양태에서, HAP 크로마토그래피 물질은 HAP 크로마토그래피 막이다.
본 발명의 일부 측면에서, 크로마토그래피 물질은 친화성 크로마토그래피 물질이다. 친화성 크로마토그래피 물질의 예는 단백질 A 또는 단백질 G로 유도체화된 크로마토그래피 물질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 친화성 크로마토그래피 물질의 예는 프로셉-VA, 프로셉-VA 울트라 플러스, 단백질 A 세파로스 패스트 플로우, 토요피얼 단백질 A, 맵셀렉트, 맵셀렉트 SuRe 및 맵셀렉트 SuRe LX를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 상기 일부 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 물질은 친화성 크로마토그래피 칼럼이다. 상기 일부 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 물질은 친화성 크로마토그래피 막이다.
크로마토그래피 물질 상의 조성물의 로딩은 OEC에 의한 오염물로부터의 생성물의 분리를 위해 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생성물은 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질 상으로의 조성물의 로딩은 크로마토그래피 물질에 대한 오염물의 결합을 위해 최적화된다. 예를 들어, 조성물은 다수의 상이한 pH에서의 로드 완충제 중에서 크로마토그래피 물질, 예를 들어 크로마토그래피 칼럼 상에 로딩될 수 있으며, 이 때 로드 완충제의 전도도는 일정하다. 대안적으로, 조성물은 다수의 상이한 전도도의 로드 완충제 중에서 크로마토그래피 물질 상에 로딩될 수 있으며, 이 때 로드 완충제의 pH는 일정하다. 크로마토그래피 물질 상의 조성물의 로딩 및 크로마토그래피 물질로부터 풀 분획으로의 생성물의 용리의 완료시에, 풀 분획 중 오염물의 양은 주어진 pH 또는 전도도에서 오염물로부터의 생성물의 단리에 관한 정보를 제공한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 조성물은 크로마토그래피 물질 상에 약 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 100 g/L, 110 g/L, 120 g/L, 130 g/L, 140 g/L, 150 g/L, 160 g/L, 170 g/L, 180 g/L, 190 g/L, 200 g/L, 300 g/L, 400 g/L, 500 g/L, 550 g/L, 600 g/L, 650 g/L, 700 g/L, 800 g/L, 900 g/L, 1000 g/L, 2000 g/L 또는 5000 g/L의 크로마토그래피 물질 초과의 폴리펩티드 로딩 밀도로 로딩된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 크로마토그래피 물질 상에 약 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 100 g/L, 110 g/L, 120 g/L, 130 g/L, 140 g/L, 150 g/L, 160 g/L, 170 g/L, 180 g/L, 190 g/L, 200 g/L, 300 g/L, 400 g/L, 500 g/L, 550 g/L, 600 g/L, 650 g/L, 700 g/L, 800 g/L, 900 g/L, 1000 g/L 또는 2000 g/L의 크로마토그래피 물질의 폴리펩티드 로딩 밀도로 로딩된다. 조성물은 크로마토그래피 물질 상에 약 30 g/L 내지 2000 g/L, 30 g/L 내지 1000 g/L, 30 g/L 내지 200 g/L, 30 g/L 내지 180 g/L, 50 g/L 내지 2000 g/L, 50 g/L 내지 1000 g/L, 50 g/L 내지 200 g/L, 50 g/L 내지 180 g/L, 150 g/L 내지 2000 g/L, 150 g/L 내지 1500 g/L, 150 g/L 내지 1000 g/L, 200 g/L 내지 1000 g/L, 200 g/L 내지 1500 g/L, 300 g/L 내지 1500 g/L, 400 g/L 내지 1000 g/L, 또는 500 g/L 내지 1000 g/L의 크로마토그래피 물질의 폴리펩티드 로딩 밀도로 로딩될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 조성물은 혼합 모드 크로마토그래피 물질 상에 약 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 100 g/L, 110 g/L, 120 g/L, 130 g/L, 140 g/L, 150 g/L, 160 g/L, 170 g/L, 180 g/L, 190 g/L, 200 g/L, 300 g/L, 400 g/L, 500 g/L, 550 g/L, 600 g/L, 650 g/L, 700 g/L, 800 g/L, 900 g/L, 1000 g/L, 2000 g/L 또는 5000 g/L의 혼합 모드 크로마토그래피 물질 초과의 폴리펩티드 로딩 밀도로 로딩된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 혼합 모드 크로마토그래피 물질 상에 약 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 100 g/L, 110 g/L, 120 g/L, 130 g/L, 140 g/L, 150 g/L, 160 g/L, 170 g/L, 180 g/L, 190 g/L, 200 g/L, 300 g/L, 400 g/L, 500 g/L, 550 g/L, 600 g/L, 650 g/L, 700 g/L, 800 g/L, 900 g/L, 1000 g/L 또는 2000 g/L의 혼합 모드 크로마토그래피 물질의 폴리펩티드 로딩 밀도로 로딩된다. 조성물은 혼합 모드 크로마토그래피 물질 상에 약 30 g/L 내지 2000 g/L, 30 g/L 내지 1000 g/L, 30 g/L 내지 200 g/L, 30 g/L 내지 180 g/L, 50 g/L 내지 2000 g/L, 50 g/L 내지 1000 g/L, 50 g/L 내지 200 g/L, 50 g/L 내지 180 g/L, 150 g/L 내지 2000 g/L, 150 g/L 내지 1500 g/L, 150 g/L 내지 1000 g/L, 200 g/L 내지 1000 g/L, 200 g/L 내지 1500 g/L, 300 g/L 내지 1500 g/L, 400 g/L 내지 1000 g/L, 또는 500 g/L 내지 1000 g/L의 혼합 모드 크로마토그래피 물질의 폴리펩티드 로딩 밀도로 로딩될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 크로마토그래피 물질 상에 70 g/L 내지 180 g/L의 밀도로 로딩된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 혼합 모드 크로마토그래피는 캅토 어드히어 수지이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 캅토 어드히어 크로마토그래피 물질 상에 70 g/L 내지 180 g/L의 밀도로 로딩된다. 상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 또는 그의 단편이다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 조성물은 음이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 약 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 100 g/L, 110 g/L, 120 g/L, 130 g/L, 140 g/L, 150 g/L, 160 g/L, 170 g/L, 180 g/L, 190 g/L, 200 g/L, 300 g/L, 400 g/L, 500 g/L, 550 g/L, 600 g/L, 650 g/L, 700 g/L, 800 g/L, 900 g/L, 1000 g/L, 2000 g/L 또는 5000 g/L의 음이온 교환 크로마토그래피 물질 초과의 폴리펩티드 로딩 밀도로 로딩된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 음이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 약 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 100 g/L, 110 g/L, 120 g/L, 130 g/L, 140 g/L, 150 g/L, 160 g/L, 170 g/L, 180 g/L, 190 g/L, 200 g/L, 300 g/L, 400 g/L, 500 g/L, 550 g/L, 600 g/L, 650 g/L, 700 g/L, 800 g/L, 900 g/L, 1000 g/L 또는 2000 g/L의 음이온 교환 크로마토그래피 물질의 폴리펩티드 로딩 밀도로 로딩된다. 조성물은 음이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 약 30 g/L 내지 2000 g/L, 30 g/L 내지 1000 g/L, 30 g/L 내지 200 g/L, 30 g/L 내지 180 g/L, 50 g/L 내지 2000 g/L, 50 g/L 내지 1000 g/L, 50 g/L 내지 200 g/L, 50 g/L 내지 180 g/L, 150 g/L 내지 2000 g/L, 150 g/L 내지 1500 g/L, 150 g/L 내지 1000 g/L, 200 g/L 내지 1000 g/L, 200 g/L 내지 1500 g/L, 300 g/L 내지 1500 g/L, 400 g/L 내지 1000 g/L, 또는 500 g/L 내지 1000 g/L의 음이온 교환 크로마토그래피 물질의 폴리펩티드 로딩 밀도로 로딩될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 조성물은 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 약 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 100 g/L, 110 g/L, 120 g/L, 130 g/L, 140 g/L, 150 g/L, 160 g/L, 170 g/L, 180 g/L, 190 g/L, 200 g/L, 300 g/L, 400 g/L, 500 g/L, 550 g/L, 600 g/L, 650 g/L, 700 g/L, 800 g/L, 900 g/L, 1000 g/L, 2000 g/L 또는 5000 g/L의 양이온 교환 크로마토그래피 물질 초과의 폴리펩티드 로딩 밀도로 로딩된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 약 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 100 g/L, 110 g/L, 120 g/L, 130 g/L, 140 g/L, 150 g/L, 160 g/L, 170 g/L, 180 g/L, 190 g/L, 200 g/L, 300 g/L, 400 g/L, 500 g/L, 550 g/L, 600 g/L, 650 g/L, 700 g/L, 800 g/L, 900 g/L, 1000 g/L 또는 2000 g/L의 양이온 교환 크로마토그래피 물질의 로딩 밀도로 로딩된다. 조성물은 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 약 30 g/L 내지 2000 g/L, 30 g/L 내지 1000 g/L, 30 g/L 내지 200 g/L, 30 g/L 내지 180 g/L, 50 g/L 내지 2000 g/L, 50 g/L 내지 1000 g/L, 50 g/L 내지 200 g/L, 50 g/L 내지 180 g/L, 150 g/L 내지 2000 g/L, 150 g/L 내지 1500 g/L, 150 g/L 내지 1000 g/L, 200 g/L 내지 1000 g/L, 200 g/L 내지 1500 g/L, 300 g/L 내지 1500 g/L, 400 g/L 내지 1000 g/L, 또는 500 g/L 내지 1000 g/L의 양이온 교환 크로마토그래피 물질의 폴리펩티드 로딩 밀도로 로딩될 수 있다.
상기 기재된 방법은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 물질 상으로의 로딩 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 생성물은 OEC 전에 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 먼저 정제된 항체 또는 그의 단편이다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피 물질 상으로의 로딩 단계는 일반적으로 다른 크로마토그래피 단계(들) 이전에 수행되지만 반드시 그렇지는 않다. 일부 실시양태에서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 물질 상으로의 로딩 단계는 오버로딩된 교환 및 용리 크로마토그래피의 순차적 단계와 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 순차적 단계는 연속적이다. 일부 실시양태에서, 연속 정제는 동일한 유량, 전도도 및/또는 pH를 이용한다.
OEC 모드 하의 크로마토그래피 물질로부터의 생성물, 예컨대 폴리펩티드의 용리는 최소 오염물 및 최소 풀 부피를 갖는 생성물의 수율을 위해 최적화될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 로드 완충제 중에서 크로마토그래피 물질, 예를 들어 크로마토그래피 칼럼 상에 로딩될 수 있다. 로드의 완료시에, 생성물은 다수의 상이한 pH를 갖는 완충제로 용리되며, 이 때 용리 완충제의 전도도는 일정하다. 대안적으로, 생성물은 다수의 상이한 전도도의 용리 완충제 중에서 크로마토그래피 물질로부터 용리될 수 있으며, 이 때 용리 완충제의 pH는 일정하다. 크로마토그래피 물질로부터의 생성물의 용리 완료시에, 풀 분획 중 오염물의 양은 주어진 pH 또는 전도도에서의 오염물로부터의 생성물의 분리에 관한 정보를 제공한다. 높은 수의 분획 (예를 들어, 8개의 칼럼 부피) 중 생성물의 용리는 용리 프로파일의 "테일링"을 나타낸다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 용리의 테일링이 최소화된다.
예를 들어 완충제의 바람직한 pH, 완충제의 바람직한 전도도, 관심 단백질의 특성 및 정제 방법에 따라 다양한 완충제가 사용될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 완충제를 사용하는 것을 포함한다. 완충제는 로딩 완충제, 평형 완충제 또는 세척 완충제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 로딩 완충제, 평형 완충제 및/또는 세척 완충제 중 하나 이상은 동일하다. 일부 실시양태에서, 로딩 완충제, 평형 완충제 및/또는 세척 완충제는 상이하다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 완충제는 염을 포함한다. 로딩 완충제는 염화나트륨, 아세트산나트륨 또는 그의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 로딩 완충제는 염화나트륨 완충제이다. 일부 실시양태에서, 로딩 완충제는 아세트산나트륨 완충제이다.
본원에 사용된 로드는 크로마토그래피 물질 상에 로딩된 조성물이다. 로딩 완충제는 크로마토그래피 물질 상에 관심 생성물을 포함하는 조성물을 로딩하는데 사용된 완충제이다. 크로마토그래피 물질은 정제될 조성물을 로딩하기 전에 평형 완충제로 평형화될 수 있다. 일부 예에서, 세척 완충제는 조성물을 크로마토그래피 물질 상에 로딩한 후에 고체 상으로부터 관심 폴리펩티드를 용리하기 전에 사용된다. 그러나, 관심 생성물, 예를 들어 폴리펩티드 중 일부는 세척 완충제에 의해 (예를 들어 통과 모드와 유사하게) 크로마토그래피 물질로부터 제거될 수 있다.
본원에 사용된 용리는 크로마토그래피 물질로부터의 생성물, 예를 들어 폴리펩티드의 제거이다. 용리 완충제는 크로마토그래피 물질로부터 폴리펩티드 또는 다른 관심 생성물을 용리하는데 사용된 완충제이다. 다수의 경우에, 용리 완충제는 로드 완충제와 상이한 물리적 특성을 갖는다. 예를 들어, 용리 완충제는 로드 완충제와 상이한 전도도 또는 로드 완충제와 상이한 pH를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제는 로드 완충제보다 작은 전도도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제는 로드 완충제보다 큰 전도도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제는 로드 완충제보다 작은 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제는 로드 완충제보다 큰 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서 용리 완충제는 로드 완충제와 상이한 전도도 및 상이한 pH를 갖는다. 용리 완충제는 보다 크거나 또는 보다 작은 전도도 및 보다 크거나 또는 보다 작은 pH의 임의의 조합을 가질 수 있다.
전도도는 2개의 전극 사이의 전류를 통하게 하는 수용액의 능력을 지칭한다. 용액 내에서는 이온 수송에 의해 전류가 흐른다. 따라서, 수용액 중에 존재하는 이온량을 증가시키면, 용액은 보다 큰 전도도를 갖게 될 것이다. 전도도의 기본 측정 단위는 지멘(Siemen) (또는 mho), mho (mS/cm)이며, 전도도 측정기, 예컨대 다양한 모델의 오리온(Orion) 전도도 측정기를 사용하여 측정할 수 있다. 전해질 전도도란 전류를 운반할 수 있는 용액 중의 이온의 능력이기 때문에 용액의 이온 농도를 변화시킴으로써 용액의 전도도를 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 바람직한 전도도를 얻기 위해 용액 중 완충제의 농도 및/또는 염 (예를 들어, 염화나트륨, 아세트산나트륨, 또는 염화칼륨)의 농도를 변화시킬 수 있다. 바람직하게는, 다양한 완충제의 염 농도를 변형시켜 바람직한 전도도를 달성한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 로드 완충제는 약 4.0 mS/cm, 4.5 mS/cm, 5.0 mS/cm, 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 7.0 mS/cm, 7.5 mS/cm, 8.0 mS/cm, 8.5 mS/cm, 9.0 mS/cm, 9.5 mS/cm, 또는 10 mS/cm 초과의 전도도를 갖는다. 전도도는 약 4 mS/cm 내지 17 mS/cm, 4 mS/cm 내지 10 mS/cm, 4 mS/cm 내지 7 mS/cm, 5 mS/cm 내지 17 mS/cm, 5 mS/cm 내지 10 mS/cm, 또는 5 mS/cm 내지 7 mS/cm일 수 있다. 일부 실시양태에서, 전도도는 약 4 mS/cm, 4.5 mS/cm, 5.0 mS/cm, 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 7.0 mS/cm, 7.5 mS/cm, 8.0 mS/cm, 8.5 mS/cm, 9.0 mS/cm, 9.5 mS/cm, 또는 10 mS/cm이다. 한 측면에서, 전도도는 로딩 완충제, 평형 완충제 및/또는 세척 완충제의 전도도다. 일부 실시양태에서, 로딩 완충제, 평형 완충제 및 세척 완충제 중 하나 이상의 전도도는 동일하다. 일부 실시양태에서, 로딩 완충제의 전도도는 세척 완충제 및/또는 평형 완충제의 전도도와 상이하다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 5.5 mS/cm의 전도도를 갖는 완충제 중에서 혼합 모드 크로마토그래피 물질 상에 로딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 또는 그의 단편이다.
일부 실시양태에서, 용리 완충제는 로드 완충제의 전도도보다 작은 전도도를 갖는다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 용리 완충제는 약 0.0 mS/cm, 0.5 mS/cm, 1.0 mS/cm, 1.5 mS/cm, 2.0 mS/cm, 2.5 mS/cm, 3.0 mS/cm, 3.5 mS/cm, 4.0 mS/cm, 4.5 mS/cm, 5.0 mS/cm, 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 또는 7.0 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다. 전도도는 약 0 mS/cm 내지 7 mS/cm, 1 mS/cm 내지 7 mS/cm, 2 mS/cm 내지 7 mS/cm, 3 mS/cm 내지 7 mS/cm, 또는 4 mS/cm 내지 7 mS/cm, 0 mS/cm 내지 5.0 mS/cm, 1 mS/cm 내지 5 mS/cm, 2 mS/cm 내지 5 mS/cm, 3 mS/cm 내지 5 mS/cm, 또는 4 mS/cm 내지 5 mS/cm일 수 있다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제의 전도도는 약 0.0 mS/cm, 0.5 mS/cm, 1.0 mS/cm, 1.5 mS/cm, 2.0 mS/cm, 2.5 mS/cm, 3.0 mS/cm, 3.5 mS/cm, 4 mS/cm, 4.5 mS/cm, 5.0 mS/cm, 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 또는 7.0 mS/cm이다. 일부 실시양태에서, 상기 기재된 용리 완충제는 혼합 모드 OEC, 음이온 교환 OEC, 양이온 교환 OEC, 친화성 OEC 또는 HIC OEC에 사용된다.
일부 실시양태에서, 용리 완충제는 로드 완충제의 전도도보다 큰 전도도를 갖는다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 용리 완충제는 약 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 7.0 mS/cm, 7.5 mS/cm, 8.0 mS/cm, 8.5 mS/cm, 9.0 mS/cm, 9.5 mS/cm, 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, 17.0 mS/cm, 18.0 mS/cm, 19.0 mS/cm, 20.0 mS/cm, 21.0 mS/cm, 22.0 mS/cm, 23.0 mS/cm, 24.0 mS/cm, 또는 25.0 mS/cm 초과의 전도도를 갖는다. 전도도는 약 5.5 mS/cm 내지 17 mS/cm, 6.0 mS/cm 내지 17 mS/cm, 7 mS/cm 내지 17 mS/cm, 8 mS/cm 내지 17 mS/cm, 9 mS/cm 내지 17 mS/cm, 또는 10 mS/cm 내지 17 mS/cm일 수 있다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제의 전도도는 약 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 7.0 mS/cm, 7.5 mS/cm, 8.0 mS/cm, 8.5 mS/cm, 9.0 mS/cm, 9.5 mS/cm, 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, 또는 17.0 mS/cm이다. 일부 실시양태에서, 상기 기재된 용리 완충제는 혼합 모드 OEC, 음이온 교환 OEC, 양이온 교환 OEC, 친화성 OEC, 또는 HIC OEC에 사용된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 4 내지 약 1 mS/cm의 전도도에서 혼합 모드 크로마토그래피로부터 용리된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 4 내지 약 1 mS/cm의 전도도에서 캅토 어드히어 크로마토그래피로부터 용리된다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 약 4 mS/cm 내지 약 1 mS/cm의 전도도에서 캅토 어드히어 크로마토그래피로부터 용리된다.
임의의 상기 실시양태의 일부 측면에서, 용리 완충제의 전도도는 로드 및/또는 세척 완충제로부터 단계 구배 또는 선형 구배에 의해 변화된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 약 5.5 mS/cm의 전도도를 갖는 완충제 중에서 크로마토그래피 물질 상에 로딩되고, 폴리펩티드는 약 4 mS/cm의 전도도를 갖는 용리 완충제 중에서 크로마토그래피 물질로부터 용리된다. 일부 실시양태에서, 로드 완충제는 약 5.5 mS/cm의 전도도를 갖고, 용리 완충제는 약 3 mS/cm의 전도도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 로드 완충제는 약 5.5 mS/cm의 전도도를 갖고, 용리 완충제는 약 2 mS/cm의 전도도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 로드 완충제는 약 5.5 mS/cm의 전도도를 갖고, 용리 완충제는 약 1 mS/cm의 전도도를 갖는다. 상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 캅토 어드히어 수지이다. 상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 또는 그의 단편이다.
임의의 상기 실시양태의 일부 측면에서, 용리 완충제의 전도도는 로드 및/또는 세척 완충제로부터 단계 구배 또는 선형 구배에 의해 변화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 캅토 어드히어 크로마토그래피 상에 약 5.5 mS/cm에서 로딩되고, 관심 폴리펩티드는 캅토 어드히어 크로마토그래피로부터 약 5 칼럼 부피 (CV) 상에서 약 5.5 mS/cm로부터 약 1 mS/cm로의 선형 전도도 구배에 의해 용리된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 캅토 어드히어 크로마토그래피 상에 약 5.5 mS/cm에서 로딩되고, 관심 폴리펩티드는 캅토 어드히어 크로마토그래피로부터 10.0 CV 상에서 약 5.5 mS/cm로부터 약 1mS/cm로의 선형 전도도 구배에 의해 용리된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 캅토 어드히어 크로마토그래피 상에 약 10 mS/cm에서 로딩되고, 관심 폴리펩티드는 캅토 어드히어 크로마토그래피로부터 약 5 CV 상에서 약 10.0 mS/cm로부터 약 1mS/cm로의 선형 전도도 구배에 의해 용리된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 캅토 어드히어 크로마토그래피 상에 약 10 mS/cm에서 로딩되고, 관심 폴리펩티드는 캅토 어드히어 크로마토그래피로부터 약 10 CV 상에서 약 10.0 mS/cm로부터 1 mS/cm로의 선형 전도도 구배에 의해 용리된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 캅토 어드히어 크로마토그래피 상에 약 10 mS/cm에서 로딩되고, 관심 폴리펩티드는 캅토 어드히어 크로마토그래피로부터 약 15 CV 상에서 약 10.0 mS/cm로부터 약 1mS/cm로의 선형 전도도 구배에 의해 용리된다.
임의의 상기 실시양태의 일부 측면에서, 용리 완충제의 전도도는 로드 및/또는 세척 완충제로부터 단계 구배 또는 선형 구배에 의해 변화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 크로마토그래피 물질 상에 약 5.5mS/cm에서 로딩되고, 관심 폴리펩티드는 크로마토그래피 물질로부터 5 칼럼 부피 상에서 5.5 mS/cm로부터 1mS/cm로, 10.0 칼럼 부피 상에서 5.5 mS/cm로부터 1mS/cm로의 선형 전도도 구배에 의해 용리된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 크로마토그래피 물질 상에 약 10 mS/cm에서 로딩되고, 관심 폴리펩티드는 크로마토그래피 물질로부터 5 칼럼 부피 상에서 10.0 mS/cm로부터 1mS/cm로, 10 칼럼 부피 상에서 10.0 mS/cm로부터 1 mS/cm로, 15 칼럼 부피 상에서 10.0 mS/cm로부터 1mS/cm로의 선형 전도도 구배에 의해 용리된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 로드 완충제는 약 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5 미만의 pH를 갖는다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 로드 완충제는 약 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 초과의 pH를 갖는다. 로드 완충제는 약 4 내지 9, 4 내지 8, 4 내지 7, 5 내지 9, 5 내지 8, 5 내지 7, 5 내지 6의 pH를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 로드 완충제의 pH는 약 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 또는 8이다. pH는 로딩 완충제, 평형 완충제, 또는 세척 완충제의 pH일 수 있다. 일부 실시양태에서, 로딩 완충제, 평형 완충제, 및/또는 세척 완충제 중 하나 이상의 pH가 동일하다. 일부 실시양태에서, 로딩 완충제의 pH는 평형 완충제 및/또는 세척 완충제의 pH와 상이하다.
일부 실시양태에서, 용리 완충제는 로드 완충제의 pH보다 작은 pH를 갖는다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 용리 완충제는 약 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2 미만의 pH를 갖는다. 용리 완충제의 pH는 약 4 내지 9, 4 내지 8, 4 내지 7, 4 내지 6, 4 내지 5, 5 내지 9, 5 내지 8, 5 내지 7, 5 내지 6, 6 내지 9, 6 내지 8, 6 내지 7일 수 있다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제의 pH는 약 4.0, 4.5, 5.0. 5.5, 6.0, 6.5, 7/0, 7.5, 8.0, 8.5 또는 9.0이다.
일부 실시양태에서, 용리 완충제는 로드 완충제의 pH보다 큰 pH를 갖는다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 용리 완충제는 약 5, 6, 7, 8, 또는 9 초과의 pH를 갖는다. 용리 완충제의 pH는 약 4 내지 9, 5 내지 9, 6 내지 9, 7 내지 9, 8 내지 9, 4 내지 8, 5 내지 8, 6 내지 8, 7 내지 8, 4 내지 7, 5 내지 7, 및 6 내지 7일 수 있다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제의 pH는 약 4.0, 4.5, 5.0. 5.5, 6.0, 6.5, 7/0, 7.5, 8.0, 8.5 또는 9.0이다.
임의의 상기 실시양태의 일부 측면에서, 용리 완충제의 pH는 로드 및/또는 세척 완충제로부터 단계 구배 또는 선형 구배에 의해 변화된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 유량은 약 50 CV/hr, 40 CV/hr, 또는 30 CV/hr 미만이다. 유량은 약 5 CV/hr 내지 50 CV/hr, 10 CV/hr 내지 40 CV/hr, 또는 18 CV/hr 내지 36 CV/hr일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유량은 약 9 CV/hr, 18 CV/hr, 25 CV/hr, 30 CV/hr, 36 CV/hr, 또는 40 CV/hr이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 유량은 약 100 cm/hr, 75 cm/hr, 또는 50 cm/hr 미만이다. 유량은 약 25 cm/hr 내지 150 cm/hr, 25 cm/hr 내지 100 cm/hr, 50 cm/hr 내지 100 cm/hr, 또는 65 cm/hr 내지 85 cm/hr일 수 있다.
베드 높이는 이용된 크로마토그래피 물질의 높이이다. 임의의 본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 베드 높이는 약 3 cm, 10 cm, 또는 15 cm 초과이다. 베드 높이는 사이에 약 3 cm 내지 35 cm, 5 cm 내지 15 cm, 3 cm 내지 10 cm, 또는 5 cm 내지 8 cm일 수 있다. 일부 실시양태에서, 베드 높이는 약 3 cm, 5 cm, 10 cm, 또는 15 cm이다. 일부 실시양태에서, 베드 높이는 로드에서 폴리펩티드 또는 오염물의 양에 기초하여 결정된다.
일부 실시양태에서, 크로마토그래피는 약 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 75 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL, 1 L, 2 L, 3 L, 4 L, 5 L, 6 L, 7 L, 8 L, 9 L, 10 L, 25 L, 50 L, 100 L, 200 L, 300 L, 400 L, 500 L, 600 L, 700 L, 800 L, 900 L 또는 100 L 초과의 부피를 갖는 용기의 칼럼에 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 분획은 크로마토그래피로부터 수집된다. 일부 실시양태에서, 수집된 분획은 약 0.01 CV, 0.02 CV, 0.03 CV, 0.04 CV, 0.05 CV, 0.06 CV, 0.07 CV, 0.08 CV, 0.09 CV, 0.1 CV, 0.2 CV, 0.3 CV, 0.4 CV, 0.5 CV, 0.6 CV, 0.7 CV, 0.8 CV, 0.9 CV, 1.0 CV, 2.0 CV, 3.0 CV, 4.0 CV, 5.0 CV, 6.0 CV, 7.0 CV, 8.0 CV, 9.0 CV, 또는 10.0 CV 초과이다. 일부 실시양태에서, 생성물, 예를 들어 폴리펩티드를 함유하는 분획을 모은다. 일부 실시양태에서, 로드 분획 및 용리 분획으로부터의 폴리펩티드를 함유하는 분획을 모은다. 분획 중 폴리펩티드의 양은 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 예를 들어 분획 중 폴리펩티드의 양은 UV 분광분석법에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 폴리펩티드 단편을 함유하는 분획을 모은다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 오염물은 숙주 세포 물질, 예컨대 CHOP; 침출된 단백질 A; 핵산; 변이체, 단편, 바람직한 폴리펩티드의 응집체 또는 유도체; 또 다른 폴리펩티드; 내독소; 바이러스 오염물; 세포 배양 배지 성분, 카르복시펩티다제 B, 겐타미신 등 중 어느 하나 이상이다. 일부 예에서, 오염물은, 예를 들어 비제한적으로 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포, 곤충 세포, 원핵 세포, 진핵 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 조류 세포, 진균 세포로부터의 숙주 세포 단백질 (HCP)일 수 있다.
숙주 세포 단백질 (HCP)은 폴리펩티드가 생산되는 세포로부터의 단백질이다. 예를 들어, CHOP는 숙주 세포로부터의 단백질, 즉 차이니즈 햄스터 난소 단백질이다. CHOP의 양은 효소-연결된 면역흡착 검정 ("ELISA") 또는 메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery) ("MSO")에 의해 측정될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, HCP (예를 들어, CHOP)의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 초과로 감소된다. HCP의 양은 약 10% 내지 99%, 30% 내지 95%, 30% 내지 99%, 50% 내지 95%, 50% 내지 99%, 75% 내지 99%, 또는 85% 내지 99% 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, HCP의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98% 감소된다. 일부 실시양태에서, 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 중의 HCP의 양을 정제 단계(들) 이전의 조성물 중의 HCP의 양과 비교하여 결정된다.
응집된 폴리펩티드는 고분자량 (HMW) 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 응집된 폴리펩티드는 관심 폴리펩티드의 다량체이다. HMW 단백질은 이량체, 8x까지의 단량체 또는 보다 큰 관심 폴리펩티드일 수 있다. 응집된 단백질 (예를 들어, HMW 단백질)을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 실시예 섹션에 기재되어 있다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 응집된 단백질의 양은 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 초과로 감소된다. 응집된 단백질의 양은 약 10% 내지 99%, 30% 내지 95%, 30% 내지 99%, 50% 내지 95%, 50% 내지 99%, 75% 내지 99%, 또는 85% 내지 99% 감소될 수 있다. 응집된 단백질의 양은 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 중의 응집된 단백질 (예를 들어, HMW 단백질)의 양을 정제 단계(들) 이전의 조성물 중의 응집된 단백질 (예를 들어, HMW 단백질)의 양과 비교하여 결정된다.
단편 폴리펩티드는 저분자량 (LMW) 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단편화된 폴리펩티드는 관심 폴리펩티드의 단편이다. LMW 단백질의 예는 Fab (단편 항원 결합), Fc (단편, 결정화가능) 영역 또는 둘 다의 조합, 또는 관심 항체의 임의의 무작위적인 단편화된 부분을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 단편화된 단백질 (예를 들어, LMW 단백질)을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 실시예 섹션에 기재되어 있다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, LMW 단백질의 양은 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 초과로 감소된다. LMW 단백질의 양은 약 10% 내지 99%, 30% 내지 95%, 30% 내지 99%, 50% 내지 95%, 50% 내지 99%, 75% 내지 99%, 또는 85% 내지 99% 감소될 수 있다. LMW 단백질의 양은 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 중의 단편화된 단백질 (예를 들어, LMW 단백질)의 양을 정제 단계(들) 이전의 조성물 중의 단편화된 단백질 (예를 들어, LMW 단백질)의 양과 비교하여 결정된다.
침출된 단백질 A는 그것이 결합된 고체 상으로부터 침출되거나 세척된 단백질 A이다. 예를 들어, 침출된 단백질 A는 단백질 A 크로마토그래피 칼럼으로부터 침출될 수 있다. 단백질 A의 양은, 예를 들어 ELISA에 의해 측정될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 침출된 단백질 A의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 초과로 감소된다. 침출된 단백질 A의 양은 약 10% 내지 99%, 30% 내지 95%, 30% 내지 99%, 50% 내지 95%, 50% 내지 99%, 75% 내지 99%, 또는 85% 내지 99% 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 침출된 단백질 A의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 감소된다. 일부 실시양태에서, 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 중의 침출된 단백질 A의 양을 정제 단계(들) 이전의 조성물 중의 침출된 단백질 A의 양과 비교하여 결정된다.
DNA, 예컨대 숙주 세포 DNA를 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 실시예 섹션에 기재되어 있다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, DNA의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 초과로 감소된다. DNA의 양은 약 10% 내지 99%, 30% 내지 95%, 30% 내지 99%, 50% 내지 95%, 50% 내지 99%, 75% 내지 99%, 또는 85% 내지 99% 감소될 수 있다. DNA의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 중의 DNA의 양을 정제 단계(들) 이전의 조성물 중의 DNA의 양과 비교하여 결정된다.
세포 배양 배지 성분은 세포 배양 배지에 존재하는 성분을 지칭한다. 세포 배양 배지는 세포를 수확하는 시점에서의 세포 배양 배지일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지 성분은 겐타미신이다. 겐타미신의 양은 ELISA에 의해 측정될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지 성분의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 초과로 감소된다. 세포 배양 배지 성분의 양은 약 10% 내지 99%, 30% 내지 95%, 30% 내지 99%, 50% 내지 95%, 50% 내지 99%, 75% 내지 99%, 또는 85% 내지 99% 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지 성분의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 98% 감소된다. 일부 실시양태에서, 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 중의 세포 배양 배지 성분의 양을 정제 단계(들) 이전의 조성물 중의 세포 배양 배지 성분의 양과 비교하여 결정된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 임의의 OEC 전에 또는 후에 하나 이상의 정제 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다른 정제 절차는 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피 예컨대 음이온 교환 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 예컨대 단백질 A 크로마토그래피 및 단백질 G 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피; 겔 여과 크로마토그래피; 친화성 크로마토그래피; 겔 전기영동; 투석; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 및 폴리펩티드의 에피토프-태그 부착된 형태에 결합하는 금속 킬레이트화 칼럼을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 정제된 폴리펩티드를 회수하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 정제된 폴리펩티드는 본원에 기재된 임의의 정제 단계로부터 회수된다. 크로마토그래피 단계는 양이온 교환 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피, 또는 단백질 A 크로마토그래피일 수 있다. 일부 실시양태에서, OEC 크로마토그래피는 혼합 모드 크로마토그래피이고, 추가의 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피이다. 일부 실시양태에서, OEC 크로마토그래피는 혼합 모드 크로마토그래피이고, 추가의 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피이다. 일부 실시양태에서, OEC 크로마토그래피는 혼합 모드 크로마토그래피이고, 추가의 크로마토그래피는 HIC 크로마토그래피이다. 일부 실시양태에서, OEC 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피이고, 추가의 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피이다. 일부 실시양태에서, OEC 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피이고, 추가의 크로마토그래피는 혼합 모드 크로마토그래피이다. 일부 실시양태에서, OEC 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피이고, 추가의 크로마토그래피는 HIC 크로마토그래피이다. 일부 실시양태에서, OEC 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피이고, 추가의 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피이다. 일부 실시양태에서, OEC 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피이고, 추가의 크로마토그래피는 혼합 모드 크로마토그래피이다. 일부 실시양태에서, OEC 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피이고, 추가의 크로마토그래피는 HIC 크로마토그래피이다. 일부 실시양태에서, OEC 크로마토그래피는 HIC 크로마토그래피이고, 추가의 크로마토그래피는 혼합 모드 크로마토그래피이다. 일부 실시양태에서, OEC 크로마토그래피는 HIC 크로마토그래피이고, 추가의 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피이다. 일부 실시양태에서, OEC 크로마토그래피는 HIC 크로마토그래피이고, 추가의 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 바이러스 여과에 의한 OEC에 따라 추가로 정제된다. 바이러스 여과는 폴리펩티드 정제 공급스트림 중의 바이러스 오염물의 제거이다. 바이러스 여과의 예는 한외여과 및 마이크로여과를 포함한다. 일부 실시양태에서 폴리펩티드는 파르보바이러스 필터를 사용하여 정제된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 OEC 모드에 의해 크로마토그래피 후에 농축된다. 농축 방법의 예는 당업계에 공지되어 있고, 한외여과 및 정용여과를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 정제 방법의 정제된 폴리펩티드를 제약상 허용되는 담체와 조합하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 항체를 포함하는 조성물을 캅토 어드히어 수지 상에 약 6.5의 pH 및 약 5.3 mS/cm 내지 약 5.6 mS/cm의 전도도를 갖는 로딩 완충제 중 캅토 어드히어 수지의 리터당 150 - 200 g 항체의 로드 밀도로 로딩하는 단계; b) 항체를 수지로부터 약 6.5의 pH 및 약 1 mS/cm의 전도도를 갖는 100 mM 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES)을 포함하는 용리 완충제로 용리하는 단계; 및 항체를 포함하는 풀을 수집하는 단계를 포함하는, 항체를 정제하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 항체를 포함하는 조성물을 1.6 - 10.8 L 칼럼의 캅토 어드히어 수지 상에 약 6.5의 pH 및 약 5.3 mS/cm 내지 약 5.6 mS/cm의 전도도를 갖는 로딩 완충제 중 캅토 어드히어 수지의 리터당 70-180 g 항체의 로드 밀도로 로딩하는 단계; b) 항체를 수지로부터 약 6.5의 pH 및 약 1 mS/cm의 전도도를 갖는 100 mM MES를 포함하는 용리 완충제로 용리하는 단계; 및 항체를 포함하는 풀을 수집하는 단계를 포함하는, 항체를 정제하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 항체를 포함하는 조성물을 캅토 어드히어 수지 상에 약 8.6의 pH 및 약 6 mS/cm 미만의 전도도를 갖는 로딩 완충제 중 캅토 어드히어 수지의 리터당 약 200 g 항체의 로드 밀도로 로딩하는 단계; b) 항체를 수지로부터 약 6.5의 pH 및 약 1 mS/cm의 전도도를 갖는 20 mM MES의 용리 완충제로 용리하는 단계; 및 항체를 포함하는 풀을 수집하는 단계를 포함하는, 항체를 정제하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 항체를 포함하는 조성물을 캅토 어드히어 수지 상에 약 6.1의 pH 및 약 6 mS/cm 미만의 전도도를 갖는 로딩 완충제 중 캅토 어드히어 수지의 리터당 약 200 g 항체의 로드 밀도로 로딩하는 단계; b) 항체를 수지로부터 약 6.0의 pH 및 약 0.65 mS/cm의 전도도를 갖는 20 mM MES의 용리 완충제로 용리하는 단계; 및 항체를 포함하는 풀을 수집하는 단계를 포함하는, 항체를 정제하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 항체를 포함하는 조성물을 캅토 어드히어 수지 상에 약 5.5의 pH 및 약 6 mS/cm 미만의 전도도를 갖는 로딩 완충제 중 캅토 어드히어 수지의 리터당 약 200 g 항체의 로드 밀도로 로딩하는 단계; b) 항체를 수지로부터 약 4.9의 pH 및 약 1.1 mS/cm의 전도도를 갖는 20 mM MES의 용리 완충제로 용리하는 단계; 및 항체를 포함하는 풀을 수집하는 단계를 포함하는, 항체를 정제하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 항체를 포함하는 조성물을 캅토 어드히어 수지 상에 약 6.5의 pH 및 약 6 mS/cm 미만의 전도도를 갖는 로딩 완충제 중 캅토 어드히어 수지의 리터당 약 200 g 항체의 로드 밀도로 로딩하는 단계; b) 항체를 수지로부터 약 6.5의 pH 및 약 1 mS/cm의 전도도를 갖는 20 mM MES의 용리 완충제로 용리하는 단계; 및 항체를 포함하는 풀을 수집하는 단계를 포함하는, 항체를 정제하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 항체를 포함하는 조성물을 QMA 수지 상에 약 6.5의 pH 및 약 5.5 mS/cm 미만의 전도도를 갖는 로딩 완충제 중 QMA 수지의 리터당 약 103 g 항체의 로드 밀도로 로딩하는 단계; b) 항체를 수지로부터 약 6.5의 pH 및 약 1 mS/cm의 전도도를 갖는 20 mM MES의 용리 완충제로 용리하는 단계; 및 항체를 포함하는 풀을 수집하는 단계를 포함하는, 항체를 정제하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 항체를 포함하는 조성물을 포로스 XS 수지 상에 약 5.5의 pH 및 약 6 mS/cm 미만의 전도도를 갖는 로딩 완충제 중 포로스 XS 수지의 리터당 약 200 g 항체의 로드 밀도로 로딩하는 단계; b) 항체를 수지로부터 약 5.5의 pH를 갖는 50-350 mM 아세테이트 용리 완충제로 용리하는 단계; 및 항체를 포함하는 풀을 수집하는 단계를 포함하는, 항체를 정제하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 항체를 포함하는 조성물을 캅토 MMC 수지 상에 약 7.0의 pH 및 약 6 mS/cm 미만의 전도도를 갖는 로딩 완충제 중 캅토 MMC 수지의 리터당 약 147 g 항체의 로드 밀도로 로딩하는 단계; b) 항체를 수지로부터 약 6.5의 pH 및 약 1 mS/cm의 전도도를 갖는 20 mM MES의 용리 완충제로 용리하는 단계; 및 항체를 포함하는 풀을 수집하는 단계를 포함하는, 항체를 정제하는 방법을 제공한다.
III. 폴리펩티드
폴리펩티드의 임의의 정제 방법 및 본원에 기재된 방법에 의해 정제된 폴리펩티드를 포함하는 제제에 사용하기 위한 폴리펩티드가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 오버로드 및 용리 크로마토그래피를 이용하여 폴리펩티드를 정제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 치료 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 길항제이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 효능제이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 에피토프 태그 부착된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 보유한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 길항제이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 보체 의존성 세포독성을 개시한다. 일부 실시양태에서 폴리펩티드는 항체 또는 이뮤노어드헤신이다. 상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 혼합 모드 크로마토그래피 매질을 사용하는 OEC에 의해 정제된다. 상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 음이온 교환 크로마토그래피 매질을 사용하는 OEC에 의해 정제된다. 상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 양이온 교환 크로마토그래피 매질을 이용하는 OEC에 의해 정제된다. 상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 HIC 크로마토그래피 매질을 사용하는 OEC에 의해 정제된다. 상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 HAP 크로마토그래피 매질을 사용하는 OEC에 의해 정제된다. 상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 친화성 크로마토그래피 매질을 사용하는 OEC에 의해 정제된다. 상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 양이온 교환 크로마토그래피가 아니거나 또는 이를 포함하지 않는 크로마토그래피 매질을 사용하는 OEC에 의해 정제된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 5,000 달톤, 10,000 달톤, 15,000 달톤, 25,000 달톤, 50,000 달톤, 75,000 달톤, 100,000 달톤, 125,000 달톤, 또는 150,000 달톤 초과의 분자량을 갖는다. 폴리펩티드는 약 50,000 달톤 내지 200,000 달톤 또는 100,000 달톤 내지 200,000 달톤의 분자량을 가질 수 있다. 대안적으로, 본원에 사용하기 위한 폴리펩티드는 약 120,000 달톤 또는 약 25,000 달톤의 분자량을 가질 수 있다.
pI는 등전점이고, 특정한 분자 또는 표면이 순수 전기적 전하를 운반하지 않는 pH이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 pI는 약 6 내지 10, 7 내지 9 또는 8 내지 9일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 6, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10의 pI를 갖는다.
본원에 기재된 방법을 이용하여 정제될 폴리펩티드는 일반적으로 재조합 기술을 이용하여 생산된다. 재조합 단백질의 생산 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 5,534,615 및 4,816,567 (구체적으로 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 관심 단백질은 CHO 세포에서 생산된다 (예를 들어, WO 94/11026 참조). 재조합 기술을 이용하는 경우, 폴리펩티드는 세포내에서 또는 주변세포질 공간 내에서 생산될 수 있거나, 또는 배지로 직접 분비될 수 있다.
배양 배지로부터 또는 숙주 세포 용해물로부터 폴리펩티드를 회수할 수 있다. 폴리펩티드의 발현에 사용되는 세포는 다양한 물리적 또는 화학적 수단, 예컨대 동결-해동 주기, 음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제에 의해 파괴할 수 있다. 폴리펩티드가 세포내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서 입자형 잔해인 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)]은 이. 콜라이의 주변세포질 공간에 분비되는 폴리펩티드를 단리하는 절차를 기재하고 있다. 간략하게, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 잔해물은 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 폴리펩티드가 배지로 분비되는 경우, 일반적으로는 우선 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 상업적으로 입수가능한 폴리펩티드 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용하여 농축시킨다. 단백질분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예컨대 PMSF를 임의의 이전 단계에 포함시킬 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제를 포함시킬 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 정제될 수 있는 폴리펩티드의 예는 이뮤노글로불린, 이뮤노어드헤신, 항체, 효소, 호르몬, 융합 단백질, Fc-함유 단백질, 면역접합체, 시토카인 및 인터류킨을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 폴리펩티드의 예는 포유동물 단백질, 예컨대 예를 들어 레닌; 호르몬; 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체화 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자 및 폰 빌레브란트 인자; 항-응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성인자, 예컨대 우로키나제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (활성화시에 조절, 정상 T-세포 발현 및 분비됨); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러-억제 물질; 렐락신 A-쇄; 렐락신 B-쇄; 프로렐락신; 마우스 고나도트로핀-연관 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 연관 항원 (CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스 인자; 신경영양 인자, 예컨대 골-유래의 신경영양 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-b; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유모세포 성장 인자, 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타, 예를 들어 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); 데스(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBP); 시토카인; CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 골유도 인자; 면역독소; 융합 폴리펩티드, 즉 2개 이상의 이종 폴리펩티드 또는 그의 단편 상에서 구성되고 재조합 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드; Fc-함유 폴리펩티드, 예를 들어 제2 폴리펩티드에 융합된 이뮤노글로불린 Fc을 포함하는 융합 단백질 또는 그의 단편; 면역접합체; 골 형성발생 단백질 (BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어, M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터류킨 (IL), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10; 슈퍼옥시드 디스무타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예컨대 예를 들어 AIDS 외피 일부; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 연관 항원, 예컨대 CA125 (난소암 항원) 또는 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 이뮤노어드헤신; 및 상기-열거된 단백질 중 임의의 것의 단편 및/또는 변이체, 뿐만 아니라 예를 들어 상기-열거된 단백질 중 임의의 것을 포함하는 단백질에 결합하는 항체, 예를 들어 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
(A) 항체
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 임의의 정제 방법 및 본원에 기재된 방법에 의해 정제된 폴리펩티드를 포함하는 제제에 사용하기 위한 폴리펩티드는 항체이다.
항체에 대한 분자 표적은 CD 단백질 및 그의 리간드, 예컨대: (i) CD3, CD4, CD8, CD19, CD11a, CD20, CD22, CD34, CD40, CD79α (CD79a), 및 CD79β (CD79b); (ii) ErbB 수용체 패밀리의 구성원, 예컨대 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; (iii) 세포 부착 분자, 예컨대 LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 αv/β3 인테그린 (그의 알파 또는 베타 서브유닛 포함) (예를 들어, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); (iv) 성장 인자, 예컨대 VEGF; IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C, BR3, c-met, 조직 인자, β7 등; 및 (v) 세포 표면 및 막횡단 종양-연관 항원 (TAA), 예컨대 미국 특허 번호 7,521,541에 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
다른 예시적인 항체는 비제한적으로 항-에스트로겐 수용체 항체, 항-프로게스테론 수용체 항체, 항-p53 항체, 항-HER-2/neu 항체, 항-EGFR 항체, 항-카텝신 D 항체, 항-Bcl-2 항체, 항-E-카드헤린 항체, 항-CA125 항체, 항-CA15-3 항체, 항-CA19-9 항체, 항-c-erbB-2 항체, 항-P-당단백질 항체, 항-CEA 항체, 항-망막모세포종 단백질 항체, 항-ras 종양단백질 항체, 항-루이스 X 항체, 항-Ki-67 항체, 항-PCNA 항체, 항-CD3 항체, 항-CD4 항체, 항-CD5 항체, 항-CD7 항체, 항-CD8 항체, 항-CD9/p24 항체, 항-CD10 항체, 항-CD11a 항체, 항-CD11c 항체, 항-CD13 항체, 항-CD14 항체, 항-CD15 항체, 항-CD19 항체, 항-CD20 항체, 항-CD22 항체, 항-CD23 항체, 항-CD30 항체, 항-CD31 항체, 항-CD33 항체, 항-CD34 항체, 항-CD35 항체, 항-CD38 항체, 항-CD41 항체, 항-LCA/CD45 항체, 항-CD45RO 항체, 항-CD45RA 항체, 항-CD39 항체, 항-CD100 항체, 항-CD95/Fas 항체, 항-CD99 항체, 항-CD106 항체, 항-유비퀴틴 항체, 항-CD71 항체, 항-c-myc 항체, 항-시토케라틴 항체, 항-비멘틴 항체, 항-HPV 단백질 항체, 항-카파 경쇄 항체, 항-람다 경쇄 항체, 항-멜라노솜 항체, 항-전립선 특이적 항원 항체, 항-S-100 항체, 항-타우 항원 항체, 항-피브린 항체, 항-케라틴 항체 및 항-Tn-항원 항체로부터 선택된 것을 포함한다.
(i) 폴리클로날 항체
일부 실시양태에서, 항체는 폴리클로날 항체이다. 폴리클로날 항체는 바람직하게는 관련 항원 및 아주반트의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 생성시킬 수 있다. 이관능성 또는 유도체화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통함), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기서, R 및 R1은 상이한 알킬 기임)을 사용하여, 면역화될 종에서 면역원성인 폴리펩티드, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다.
예를 들어 폴리펩티드 또는 접합체 100 μg 또는 5 μg (각각, 토끼 또는 마우스의 경우)을 3 부피의 프로인트 완전 아주반트와 합하고, 상기 용액을 다중 부위에 피내로 주사함으로써, 동물을 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화한다. 1개월 후에 프로인트 완전 아주반트 내의 펩티드 또는 접합체를 원래 양의 1/5 내지 1/10으로 다중 부위에 피하로 주사하여 동물을 부스팅한다. 7 내지 14일 후, 동물에서 채혈하여, 혈청을 항체 역가에 대해 검정한다. 역가가 정체기에 도달할 때까지 동물을 부스팅한다. 일부 실시양태에서, 동물을 동일 항원의 접합체로 부스팅하지만, 이것은 상이한 폴리펩티드에 접합되고/되거나 상이한 가교 시약을 통해 접합된 것이다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양에서 폴리펩티드 융합체로서 제조될 수도 있다. 또한, 명반과 같은 응집제를 적절하게 사용하여 면역 반응을 증진시킨다.
(ii) 모노클로날 항체
일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체는 실질적으로 균질한 항체 집단, 즉 이러한 집단을 구성하는 개별 항체는 모노클로날 항체의 생산 동안에 유발될 수 있는 가능한 변이체 (이러한 변이체는 일반적으로 미량으로 존재함)를 제외하고는 동일하고/거나 동일한 에피토프와 결합하는 집단으로부터 수득한다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 개별적인 또는 폴리클로날 항체의 혼합물이 아닌 것으로서의 항체의 특징을 나타낸다.
예를 들어, 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조할 수도 있고, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 번호 4,816,567)에 의해 제조할 수도 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터는 면역화에 사용된 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 도출하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 면역화된다. 대안적으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 이어서, 적합한 융제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]).
이와 같이 제조된 하이브리도마 세포를, 바람직하게는 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에 시딩하여 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우에, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 (HAT 배지), 이러한 물질들은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
일부 실시양태에서, 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생산을 지지하고, 배지 예컨대 HAT 배지에 민감한 세포이다. 이들 중에서, 일부 실시양태에서, 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center; 미국 캘리포니아주 샌 디에고)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; 미국 메릴랜드주 록빌)으로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포로부터 유래된 것이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주 역시 인간 모노클로날 항체 생산에 대해 기재되어 있다 (문헌 [Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))]).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체의 생산에 대해 검정한다. 일부 실시양태에서, 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전법 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사성면역검정 (RIA) 또는 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정한다.
모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem. 107:220 (1980)]의 스캐차드 분석에 의해 결정할 수 있다.
바람직한 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 클론을 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]). 이러한 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포가 동물에서 복수 종양으로서 생체내에서 성장될 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 예를 들어 폴리펩티드 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 이뮤노글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 절차 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 사용)를 이용하여 용이하게 단리 및 서열분석된다. 일부 실시양태에서, 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 공급원으로서 기능한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 이어서 이를 달리 이뮤노글로불린 폴리펩티드를 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서의 모노클로날 항체의 합성을 수득한다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아 내 재조합 발현에 대한 종설 논문은 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262 (1993) 및 Plueckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)]을 포함한다.
추가 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편을 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 이용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]에서는 파지 라이브러리를 사용한 뮤린 및 인간 항체의 단리를 각각 기재한다. 후속 간행물들에는 쇄 셔플링에 의한 고친화도 (nM 범위) 인간 항체의 생산 (문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)]), 뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서의 조합형 감염 및 생체내 재조합 (문헌 [Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)])이 기재되어 있다. 따라서, 이러한 기술은 모노클로날 항체의 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안이다.
DNA는 또한 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환시키거나 (미국 특허 번호 4,816,567; 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)]), 또는 이뮤노글로불린 코딩 서열에 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 공유 연결함으로써 변형시킬 수 있다.
전형적으로, 이러한 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인에 대해 치환되거나 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인에 대해 치환되어, 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 또 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG 모노클로날 항체이다.
(iii) 인간화 항체
일부 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 그 내로 도입되는 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기라 지칭되고, 전형적으로는 "유입" 가변 도메인으로부터의 것이다. 인간화는 본질적으로 상응하는 인간 항체의 서열을 초가변 영역 서열로 치환하는 것에 의하는 윈터(Winter) 및 동료들의 방법 (문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)])에 따라 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 부분이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체이다 (미국 특허 번호 4,816,567). 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체의 제조에 사용될 인간 가변 도메인 경쇄 및 중쇄 둘 다의 선택은 항원성 감소에 매우 중요하다. 소위 "최적-적합" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 공지의 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 서열이 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 영역 (FR)으로서 받아들여진다 (문헌 [Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987)]). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정한 프레임워크를 이용한다. 동일한 프레임워크를 여러 상이한 인간화 항체에 사용할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)]).
또한, 항체가 항원에 대해 높은 친화도를 보유하고 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화하는 것이 중요하다. 이를 달성하기 위해서, 방법의 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하는 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고, 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태적 구조를 설명하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이러한 디스플레이를 조사하면 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 이뮤노글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용자 서열 및 유입 서열로부터 선택 및 조합되어 원하는 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, 항원 결합에 대한 영향에는 초가변 영역 잔기가 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.
(v) 인간 항체
일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 인간화에 대한 대안으로서 인간 항체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 면역화시, 내인성 이뮤노글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체의 생산이 완전히 억제된다고 기재된 바 있다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 이러한 배선 돌연변이체 마우스에게 전달하면, 항원 접종시에 인간 항체가 생산될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993)]; 및 미국 특허 번호 5,591,669; 5,589,369; 및 5,545,807을 참조한다.
대안적으로, 파지 디스플레이 기술 (문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)])을 이용하여 면역화되지 않은 공여자로부터의 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관내에서 인간 항체 및 항체 단편을 생산할 수 있다. 이러한 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자를 필라멘트형 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 주요 또는 소수의 코트 폴리펩티드 유전자로 프레임에 맞게 클로닝하고, 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로서 디스플레이한다. 필라멘트형 입자는 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성을 기반으로 한 선택에 의해 이러한 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자도 선택된다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성의 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있고, 이에 대한 검토를 위해 예를 들어 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]을 참조한다. V-유전자 절편의 여러 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 소형 무작위 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이가 단리되었다. 본질적으로 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), 또는 Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기재된 기술에 따라, 면역화되지 않은 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 구축될 수 있고, 다양한 어레이의 항원 (자기-항원 포함)에 대한 항체가 단리될 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,565,332 및 5,573,905를 참조한다.
인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수도 있다 (미국 특허 5,567,610 및 5,229,275 참조).
(v) 항체 단편
일부 실시양태에서, 항체는 항체 단편이다. 항체 단편 생산을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해적 소화를 통해 유래되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) 및 Brennan et al., Science 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 현재 이러한 단편이 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. 예를 들어, 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 항체 단편이 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 또 다른 접근법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술이 숙련된 진료의에게 명백할 것이다. 다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894; 및 미국 특허 번호 5,587,458을 참조한다. 항체 단편은 또한 예를 들어 미국 특허 5,641,870에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 단편이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항체 단편은 항원 결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv, Fv 및 디아바디로 이루어진 군으로부터 선택된다.
(vi) 이중특이적 항체
일부 실시양태에서, 항체는 이중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이중특이적 항체는 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 대안적으로, 이중특이적 항체 결합 아암은 세포 방어 메카니즘을 세포에 집중시키도록 백혈구 상의 촉발 분자, 예컨대 T-세포 수용체 분자 (예를 들어, CD2 또는 CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR), 예컨대 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)에 결합하는 아암과 조합될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법이 당업계에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 통상적인 생산은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공발현을 기반으로 하며, 여기서 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌 [Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)]). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10가지 상이한 항체 분자들의 잠재적 혼합물을 생산하며, 이 중에서 오직 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 이루어지는 올바른 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생성물 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829, 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
다른 접근법에 따르면, 원하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인이 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 일부 실시양태에서, 융합은 적어도 힌지의 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인에 의한다. 일부 실시양태에서, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합체 중 적어도 하나에 존재한다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체 및 원하는 경우에 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 개별 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동-형질감염시킨다. 이것은 구축에 사용된 3종의 폴리펩티드 쇄의 동일하지 않은 비가 최적의 수율을 제공하는 실시양태에서 상기 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비를 조절하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비의 적어도 2종의 폴리펩티드 쇄의 발현으로 높은 수율이 수득되는 경우, 또는 비가 특정한 유의성을 갖지 않는 경우, 2종 또는 모든 3종의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 1개의 발현 벡터에 삽입할 수 있다.
이러한 접근법의 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암 내에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른쪽 아암 내의 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 절반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 존재하는 것이 용이한 분리 방법을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 바람직하지 않은 이뮤노글로불린 쇄 조합물로부터 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 접근법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생성하는 것에 관한 추가의 상세한 내용을 위해, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)]을 참조한다.
미국 특허 번호 5,731,168에 기재된 또 다른 접근법에 따라, 한 쌍의 항체 분자 사이의 인터페이스는 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화하도록 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인터페이스는 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 인터페이스로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써 큰 측쇄(들)에 대해 동일하거나 유사한 크기의 보상 "함몰부"가 제2 항체 분자의 인터페이스 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 바람직하지 않은 최종-생성물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 가교된 또는 "이종접합체" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체들은, 예를 들어 원치않는 세포에 대한 면역계 세포의 표적화 (미국 특허 번호 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료 (WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089)를 위해서 제안되었다. 이종접합체 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 다수의 가교 기술과 함께, 적합한 가교제가 당업계에 널리 공지되어 있고, 미국 특허 번호 4,676,980에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성시키는 기술이 또한 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science 229: 81 (1985)]은 무손상 항체를 단백질분해적으로 절단하여 F(ab')2 단편을 생성하는 절차를 기재한다. 이러한 단편을 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재 하에 환원시켜, 이웃자리 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 이어서 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서 Fab'-TNB 유도체 중 하나를 메르캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. 생산된 이중특이적 항체를 효소의 선택적 고정화를 위한 작용제로서 사용할 수 있다.
재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기재되었다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체가 생산된다. 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드가 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 유전자 융합체에 의해 연결된다. 항체 동종이량체가 힌지 영역에서 환원되어 단량체가 형성된 후에 재산화되어 항체 이종이량체가 형성된다. 이러한 방법은 항체 동종이량체의 생산에 또한 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편 제조를 위한 대안적인 메카니즘을 제공한다. 이 단편은 동일한 쇄 상의 2개의 도메인이 쌍을 이루게 하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인이 또 다른 단편의 상보적인 VL 및 VH 도메인과 쌍을 형성하여, 2개의 항원-결합 부위가 형성된다. 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되었다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)]을 참조한다.
2가 초과의 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991)].
(vii) 다가 항체
일부 실시양태에서, 항체는 다가 항체이다. 다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 신속하게 내재화 (및/또는 이화)될 수 있다. 본원에 제공된 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다가 항체 (IgM 부류 이외의 것)일 수 있고 (예를 들어, 4가 항체), 이는 항체의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 용이하게 생산될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 이러한 시나리오에서, 항체는 Fc 영역, 및 Fc 영역의 아미노 말단에 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 본원에서 바람직한 다가 항체는 3 내지 약 8개, 그러나 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 다가 항체는 1개 이상의 폴리펩티드 쇄 (바람직하게는 2개의 폴리펩티드 쇄)를 포함하고, 여기서 상기 폴리펩티드 쇄(들)는 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어 폴리펩티드 쇄(들)는 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc (여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 1개의 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1임)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄를 포함할 수 있다. 본원에서 다가 항체는 바람직하게는 적어도 2개 (바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본원에서 다가 항체는 예를 들어 약 2 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 다중특이적 항체이다. 이러한 다중특이적 항체는 VHVL 유닛이 폴리에피토프 특이성을 갖는, 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체, 각각의 VHVL 유닛이 상이한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 VL 및 VH 도메인을 갖는 항체, 각각의 단일 가변 도메인이 상이한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 단일 가변 도메인을 갖는 항체, 전장 항체, 항체 단편, 예컨대 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디, 트리아바디, 삼관능성 항체, 공유 또는 비-공유 연결된 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 폴리에피토프 특이성; 예를 들어 동일한 또는 상이한 표적(들) 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체는 단일특이적이고; 예를 들어 항체는 오직 1개의 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에 따르면, 다중특이적 항체는 각 에피토프에 5 μM 내지 0.001 pM, 3 μM 내지 0.001 pM, 1 μM 내지 0.001 pM, 0.5 μM 내지 0.001 pM, 또는 0.1 μM 내지 0.001 pM의 친화도로 결합하는 IgG 항체이다.
(viii) 기타 항체 변형
본원에서 제공되는 항체를 예를 들어 항체의 항원-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)이 증진되도록 이펙터 기능과 관련하여 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역 내에 도입하여, 이 영역 내에서의 쇄간 디술피드 결합 형성을 허용할 수 있다. 이와 같이 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다. 문헌 [Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes, B. J., Immunol. 148:2918-2922 (1992)]을 참조한다. 항종양 활성이 증진된 동종이량체 항체는 문헌 [Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같이 이종이관능성 가교제를 사용하여 제조할 수 있다. 대안적으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체가 조작될 수 있고, 이에 의해 증진된 보체 매개 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있다. 문헌 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)]을 참조한다.
항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, US 2006/0067930 (그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에서 기재된 바와 같이 항체에서 아미노산 변경을 수행할 수 있다.
(B) 폴리펩티드 변이체 및 변형
본원에 기재된 폴리펩티드 (항체 포함)의 아미노산 서열 변형(들)이 본원에 기재된 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)를 정제하는 방법에 사용될 수 있다.
(i) 변이체 폴리펩티드
"폴리펩티드 변이체"는 폴리펩티드의 전장 천연 서열, 신호 펩티드가 없는 폴리펩티드 서열, 신호 펩티드가 있거나 없는 폴리펩티드의 세포외 도메인과 약 80％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 본원에 정의된 바와 같은 폴리펩티드, 바람직하게는 활성 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 폴리펩티드 변이체는 예를 들어 1개 이상의 아미노산 잔기가 전장 천연 아미노산 서열의 N 또는 C-말단에서 부가되거나 결실된 폴리펩티드를 포함한다. 통상적으로, TAT 폴리펩티드 변이체는 전장 천연 서열 폴리펩티드 서열, 신호 펩티드가 없는 폴리펩티드 서열, 신호 펩티드가 있거나 없는 폴리펩티드의 세포외 도메인에 대해 적어도 약 80%의 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 임의로, 변이체 폴리펩티드는 천연 폴리펩티드 서열과 비교하여 1개 이하의 보존적 아미노산 치환, 대안적으로 천연 폴리펩티드 서열과 비교하여 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이하의 보존적 아미노산 치환을 가질 것이다.
변이체 폴리펩티드는 N-말단 또는 C-말단에서 말단절단될 수 있거나, 또는 예를 들어 전장 천연 폴리펩티드와 비교하여 내부 잔기가 결여될 수 있다. 특정 변이체 폴리펩티드는 바람직한 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결여될 수 있다. 말단절단, 결실 및 삽입을 갖는 이들 변이체 폴리펩티드는 임의의 다수의 통상의 기술에 의해 제조될 수 있다. 바람직한 변이체 폴리펩티드는 화학적으로 합성될 수 있다. 또 다른 적합한 기술은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의한, 바람직한 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 단편의 단리 및 증폭을 포함한다. 핵산 단편의 바람직한 말단을 정의하는 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머에서 사용된다. 바람직하게는, 변이체 폴리펩티드는 본원에 개시된 천연 폴리펩티드와 적어도 하나의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 공유한다.
아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기가 있는 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩티드가 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다.
예를 들어, 폴리펩티드의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 항체 핵산 내에 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변형은 예를 들어 폴리펩티드의 아미노산 서열 내 잔기로부터의 결실 및/또는 이들로의 삽입 및/또는 이들의 치환을 포함한다. 최종 구축물이 바람직한 특성을 갖는다는 조건 하에 결실, 삽입 및 치환의 임의 조합이 이루어져 최종 구축물에 도달된다. 아미노산 변화는 또한, 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)의 번역후 프로세싱을 변경시킬 수 있는데, 예컨대 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시킬 수 있다.
어느 아미노산 잔기가 바람직한 활성에 불리한 영향을 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는지를 결정할 때의 지침은 폴리펩티드의 서열을 공지의 상동성 폴리펩티드 분자의 서열과 비교하고, 높은 상동성 영역에서 이루어진 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 찾아볼 수 있다.
돌연변이유발에 대해 바람직한 위치인 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)의 특정 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기 군이 확인되고 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 Arg, Asp, His, Lys 및 Glu), 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체되어 아미노산과 항원과의 상호작용에 영향을 미친다. 이어서, 치환에 대해 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치가 치환 부위에 또는 치환 부위에 대해 추가의 또는 다른 변이체를 도입함으로써 개선된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 그 자체의 성질을 미리 결정할 필요는 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서의 돌연변이의 성능을 분석하기 위해, ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 표적 코돈 또는 영역에서 수행하고, 발현된 항체 변이체를 원하는 활성에 대해 스크리닝한다.
또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이러한 변이체에서는 항체 분자 내의 1개 이상의 아미노산 잔기가 상이한 잔기로 대체된다. 치환 돌연변이유발에 가장 흥미로운 부위에는 초가변 영역이 포함되지만, FR 변경 또한 고려된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"의 표제 하에 하기 표 1에 나타낸다. 이러한 치환이 생물학적 활성의 변화를 초래하면, 표 1에서 "예시적인 치환"으로 명명되거나, 아미노산 부류에 대해 하기 추가로 기재된 바와 같은 보다 실질적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝할 수 있다.
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폴리펩티드의 생물학적 특성에 있어서의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어 시트 또는 나선형 입체형태로서, 치환 영역 내의 폴리펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 부피를 유지하는 것에 대한 효과가 현저하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 아미노산은 그의 측쇄 특성의 유사성에 따라 하기 군으로 나뉠 수 있다 (문헌 [A. L. Lehninger, Biochemistry second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)]에서):
(1) 비-극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 비하전 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 산성: Asp (D), Glu (E)
(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H)
대안적으로, 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 하기 군으로 나뉠 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
또한, 항체의 적절한 입체형태 유지에 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기가 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화 안정성을 개선시키고 비정상적인 가교를 방지할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)이 폴리펩티드에 부가되어 그의 안정성이 개선될 수 있다 (특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).
특히 바람직한 유형의 치환 변이체는 모 항체 (예를 들어, 인간화 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가의 개발용으로 선택된 생성된 변이체(들)는 이들이 생성되는 모 항체에 비해 생물학적 특성이 개선될 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성하는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 사용한 친화도 성숙이다. 간략하게, 몇몇 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6-7개 부위)가 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노 치환이 생성되도록 돌연변이된다. 이로써 생성된 항체 변이체를 필라멘트형 파지 입자로부터 각 입자 내에 패키지된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합체로서 1가 방식으로 디스플레이시킨다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체를 본원에 개시된 바와 같이 그의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 표적 사이의 접촉점을 확인하기 위해서는 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 인접 잔기는 본원에서 상기 기재된 기술에 따른 치환을 위한 후보이다. 일단 이러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널을 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝하고, 하나 이상의 관련 검정에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가의 개발을 위해 선택할 수 있다.
폴리펩티드의 아미노산 변이체의 또 다른 유형은 항체의 원래의 글리코실화 패턴을 변경시킨다. 폴리펩티드는 비-아미노산 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 글리코실화될 수 있다. 이러한 글리코실화는 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 폴리펩티드가 발현되는 동안 자연적으로 발생할 수 있거나, 인간 개입에서 비롯되는 의도적 변형일 수 있다. 변경은 폴리펩티드에서 발견되는 1개 이상의 탄수화물 모이어티를 결실시키는 것 및/또는 폴리펩티드에 존재하지 않는 1개 이상의 글리코실화 부위를 부가하는 것을 의미한다.
폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결은 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 나타낸다. 트리펩티드 서열, 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)이 아스파라긴 측쇄로 탄수화물 모이어티를 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이러한 트리펩티드 서열 중 어느 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나가 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신 또한 사용될 수 있다.
폴리펩티드에 글리코실화 부위를 부가하는 것은 항체가 하나 이상의 상기 기술된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 변경은 원래의 항체의 서열에 대한 1개 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 또한 달성될 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
폴리펩티드 상에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로, 또는 글리코실화의 표적으로 기능하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이에 의한 치환에 의해 달성할 수 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 달성될 수 있다.
다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실 기의 인산화, 리신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노 기의 메틸화, N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카르복실 기의 아미드화를 포함한다.
(ii) 키메라 폴리펩티드
본원에 기재된 폴리펩티드는 또 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키메라 분자는 항-태그 항체가 그에 대해 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 폴리펩티드의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복실-말단에 위치한다. 이러한 에피토프-태그가 부착된 형태의 폴리펩티드의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 제공함으로써 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 또 다른 유형의 친화성 매트릭스를 사용한 친화도 정제에 의해 폴리펩티드를 용이하게 정제할 수 있다.
대안적 실시양태에서, 키메라 분자는 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린의 특정한 영역과 폴리펩티드의 융합체를 포함할 수 있다. 키메라 분자의 2가의 형태는 "이뮤노어드헤신"으로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "이뮤노어드헤신"은 이종 폴리펩티드의 결합 특이성을 이뮤노글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 조합시킨 항체-유사 분자를 지정한다. 구조적으로, 이뮤노어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 아닌 (즉, "이종") 바람직한 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열 및 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열의 융합체를 포함한다. 이뮤노어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 전형적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 이뮤노어드헤신 내의 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG-1, IgG-2, IgG-3 또는 IgG-4 하위유형, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다.
Ig 융합체는 바람직하게는 Ig 분자 내의 적어도 하나의 가변 영역 대신에 가용성 (막횡단 도메인이 결실된 또는 불활성화된) 형태의 폴리펩티드를 치환한 것을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 이뮤노글로불린 융합체는 힌지, CH2 및 CH3, 또는 IgG1 분자의 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다.
(iii) 폴리펩티드 접합체
폴리펩티드 제제에 사용하기 위한 폴리펩티드는 세포독성제, 예컨대 화학요법제, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합될 수 있다.
이러한 접합체의 생성에 유용한 화학요법제가 사용될 수 있다. 또한, 사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의) 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 다양한 방사성핵종은 방사성접합된 폴리펩티드의 생산에 이용가능하다. 그 예는 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 및 186Re를 포함한다. 폴리펩티드 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질-커플링 작용제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 이용하여 만들어진다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 폴리펩티드에 대한 방사성뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다.
또한, 폴리펩티드 및 하나 이상의 소분자 독소, 예컨대 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 트리코텐 및 CC1065, 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체의 접합체도 본원에서 고려된다.
메이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목 메이테누스 세라타(Maytenus serrata)로부터 처음 단리되었다. 이후에, 특정 미생물이 또한 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생산하는 것으로 발견되었다. 합성 메이탄시놀 및 그의 유도체 및 유사체가 또한 고려된다. 폴리펩티드-메이탄시노이드 접합체를 제조하는 것으로 당업계에 공지된 다수의 연결 기가 존재하며, 예를 들어 미국 특허 번호 5,208,020에 개시된 것이 포함된다. 이러한 연결 기는 상기-확인된 특허에 재시된 바와 같은, 디술피드 기, 티오에테르 기, 산 불안정성 기, 광불안정성 기, 펩티다제 불안정성 기 또는 에스테라제 불안정성 기를 포함하며, 디술피드 및 티오에테르 기가 바람직하다.
링커는 연결 유형에 따라 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 연결은 통상적인 커플링 기술을 이용하여 히드록실 기와의 반응으로 형성될 수 있다. 반응은 히드록실 기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실 기로 변형된 C-15 위치, 및 히드록실 기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 연결은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
또 다른 관심 접합체는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 접합된 폴리펩티드를 포함한다. 칼리케아미신 패밀리의 항생제는 피코몰 미만의 농도에서 이중-가닥 DNA 절단부를 생산할 수 있다. 칼리케아미신 패밀리의 접합체의 제조에 대해, 예를 들어 미국 특허 번호 5,712,374를 참조한다. 사용할 수 있는 칼리케아미신의 구조 유사체는 γ1 I, α2 I, α3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θ1 I를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 항체가 접합될 수 있는 또 다른 항종양 약물은 항폴레이트제인 QFA이다. 칼리케아미신 및 QFA는 둘 다 세포내 작용 부위를 갖고, 원형질막을 용이하게 통과하지 않는다. 따라서, 폴리펩티드 (예를 들어, 항체) 매개된 내재화를 통한 이들 작용제의 세포 흡수는 이들의 세포독성 효과를 크게 증진시킨다.
본원에 기재된 폴리펩티드에 접합될 수 있는 다른 항종양제는 BCNU, 스트렙토조신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 집합적으로 LL-E33288 복합체로 공지된 작용제의 패밀리 뿐만 아니라 에스페라미신을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드와 뉴클레오티드분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예컨대 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이의 접합체일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)를 종양 예비표적화에 활용하기 위해 "수용체" (상기 스트렙타비딘)에 접합시킬 수 있고, 여기서 폴리펩티드 수용체 접합체는 환자에게 투여한 후에, 제거제를 사용하여 결합되지 않은 접합체를 순환계로부터 제거하고, 이어서 세포독성제 (예를 들어, 방사성뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 전구약물 (예를 들어, 펩티딜 화학요법제)을 활성 항암 약물로 전환시키는 전구약물-활성화 효소에 접합될 수 있다. 면역접합체의 효소 성분은 이를 그의 보다 활성인 세포독성 형태로 전환시키도록 하는 방식으로 전구약물에 작용할 수 있는 임의의 효소를 포함한다.
유용한 효소의 예는 포스페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 알칼리성 포스파타제; 술페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 아릴술파타제; 비-독성 5-플루오로시토신을 항암 약물인 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 프로테아제, 예컨대 세라티아 프로테아제, 써모리신, 서브틸리신, 카르복시펩티다제 및 카텝신 (예컨대, 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환기를 함유하는 전구약물을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화된 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 탄수화물-절단 효소, 예컨대 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 β-락타마제; 및 아민 질소에서 각각 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 기로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 아미다제, 예컨대 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 효소적 활성을 갖는 항체 (또한, 당업계에 "아브자임"으로 공지됨)를 사용하여 전구약물을 유리 활성 약물로 전환시킬 수 있다.
(iv) 기타
폴리펩티드의 또 다른 유형의 공유 변형은 폴리펩티드를 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중 하나에 연결시키는 것을 포함한다. 폴리펩티드는 또한 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합으로 제조된 마이크로캡슐 (예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐) 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 내에 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Gennaro, A.R., Ed., (1990)]에 개시되어 있다.
IV . 제제 및 방법에 사용하기 위한 폴리펩티드 수득
본원에 기재된 정제 방법에 사용된 폴리펩티드는 재조합 방법을 포함하여 당업계에 널리 공지된 방법을 이용하여 수득할 수 있다. 하기 섹션은 이러한 방법에 대한 지침을 제공한다.
(A) 폴리뉴클레오티드
"폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 본원에서 교환가능하게 사용되며, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다.
폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드 mRNA를 보유하고 이를 검출가능한 수준에서 발현시키는 것으로 여겨지는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 편리하게는 인간 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 폴리펩티드-코딩 유전자는 또한 게놈 라이브러리로부터 또는 공지의 합성 절차 (예를 들어, 자동화 핵산 합성)에 의해 얻을 수 있다.
예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 전체 이뮤노글로불린 분자 쇄, 예컨대 경쇄 또는 중쇄를 코딩할 수 있다. 완전한 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH) 뿐만 아니라 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함하고, 이는 전형적으로 3개의 불변 도메인: CH1, CH2 및 CH3 및 "힌지" 영역을 포함할 것이다. 일부 상황에서, 불변 영역의 존재는 바람직할 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있는 다른 폴리펩티드는 항원-결합 항체 단편, 예컨대 단일 도메인 항체 ("dAb"), Fv, scFv, Fab' 및 F(ab')2 및 "미니바디"를 포함한다. 미니바디는 (전형적으로) CH1 및 CK 또는 CL 도메인을 절제한 2가 항체 단편이다. 미니바디는 통상적인 항체보다 작기 때문에 이들은 임상/진단 용도에서 보다 우수한 조직 침투를 달성하여야 하지만, 2가이므로 이들은 1가 항체 단편, 예컨대 dAb보다 높은 결합 친화도를 유지하여야 한다. 따라서, 문맥상 달리 표시되지 않는다면, 본원에 사용된 용어 "항체"는 전체 항체 분자 뿐만 아니라 상기 논의된 유형의 항원-결합 항체 단편을 포함한다. 바람직하게는 코딩된 폴리펩티드에 존재하는 각각의 프레임워크 영역은 상응하는 인간 수용자 프레임워크와 관련하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함할 것이다. 따라서, 예를 들어 프레임워크 영역은 수용자 프레임워크 영역과 관련하여 총 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
적합하게는, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 단리 및/또는 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 단리된 폴리뉴클레오티드이다.
용어 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 분자가 그의 정상 또는 천연 환경에서 제거 또는 분리되거나, 또는 그것이 그의 정상 또는 천연 환경에 존재하지 않는 방식으로 생산되는 것을 나타내도록 의도된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 정제된 폴리뉴클레오티드이다. 용어 정제된은 적어도 일부 오염 분자 또는 물질이 제거된 것을 나타낸다.
적합하게는, 폴리뉴클레오티드는 관련 폴리뉴클레오티드가 조성물에 존재하는 우세한 (즉, 가장 풍부한) 폴리뉴클레오티드를 구성하도록 실질적으로 정제된다.
(B) 폴리뉴클레오티드의 발현
하기 설명은 주로 폴리펩티드-코딩 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 폴리펩티드를 생산하는 것에 관한 것이다. 물론, 폴리펩티드를 제조하기 위해 당업계에 공지되어 있는 대안적 방법을 사용할 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 적절한 아미노산 서열 또는 그의 부분은 고체-상 기술을 이용한 직접 펩티드 합성 (예를 들어, 문헌 [Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis W.H. Freeman Co., San Francisco, Calif. (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)] 참조)에 의해 생산될 수 있다. 시험관내 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화 합성은 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 펩티드 합성기 (캘리포니아주 포스터 시티)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 달성될 수 있다. 폴리펩티드의 다양한 부분들은 개별적으로 화학적으로 합성되고, 원하는 폴리펩티드를 생성하기 위해 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 조합될 수 있다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드의 생산을 위한 발현 벡터(들)에 삽입된다. 용어 "제어 서열"은 특정한 숙주 유기체 내에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 제어 서열은 프로모터 (예를 들어, 천연-회합 또는 이종 프로모터), 신호 서열, 인핸서 요소 및 전사 종결 서열을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
폴리뉴클레오티드는 또 다른 폴리뉴클레오티드 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프리서열 또는 분비 리더에 대한 핵산은 폴리펩티드가 그의 분비에 관여하는 프리단백질로서 발현되는 경우에 폴리펩티드에 대한 핵산에 작동가능하게 연결되거나, 프로모터 또는 인핸서는 이것이 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나, 또는 리보솜 결합 부위는 이것이 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결될 핵산 서열이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우에는 인접하여 위치하고 리딩상 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에는 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 실시에 따라 사용한다.
항체의 경우, 경쇄 및 중쇄는 동일하거나 상이한 발현 벡터에 클로닝될 수 있다. 이뮤노글로불린 쇄를 코딩하는 핵산 절편은 이뮤노글로불린 폴리펩티드의 발현을 보장하는 발현 벡터(들)의 제어 서열에 작동가능하게 연결된다.
폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 코딩 서열 및 임의의 발현 제어 서열)를 함유하는 벡터는 세포 숙주의 유형에 따라 달라지는 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, 원핵 세포에 대해서는 흔히 염화칼슘 형질감염이 사용되고, 인산칼슘 처리, 전기천공, 리포펙션, 바이오리스틱스(biolistics) 또는 바이러스-기반 형질감염을 다른 세포 숙주에 사용할 수 있다. (일반적으로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989)] 참조). 포유동물 세포의 형질전환에 사용되는 다른 방법은 폴리브렌, 원형질체 융합, 리포솜, 전기천공 및 미세주사의 사용을 포함한다. 트랜스제닉 동물의 생산을 위해, 트랜스진은 수정란 내에 미세주사될 수 있거나, 또는 배아 줄기 세포의 게놈 내로 혼입될 수 있고, 상기 세포의 핵을 제핵 난모세포 내로 전달할 수 있다.
(C) 벡터
용어 "벡터"는 발현 벡터 및 형질전환 벡터 및 셔틀 벡터를 포함한다.
용어 "발현 벡터"는 생체내 또는 시험관내 발현이 가능한 구축물을 의미한다.
용어 "형질전환 벡터"는 하나의 엔티티에서 또 다른 엔티티로 전달될 수 있는 구축물을 의미하고 - 이는 해당 종의 것일 수 있거나 상이한 종의 것일 수 있다. 구축물이 하나의 종에서 다른 종으로 - 예컨대 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 플라스미드에서 박테리아, 예컨대 바실루스(Bacillus) 속으로 - 전달될 수 있는 경우, 형질전환 벡터는 때때로 "셔틀 벡터"로 지칭된다. 이는 심지어는 이. 콜라이 플라스미드로부터 아그로박테리움(Agrobacterium)까지 식물로 전달될 수 있는 구축물일 수 있다.
벡터는 폴리펩티드의 발현을 제공하기 위해 하기 기재된 바와 같은 적합한 숙주 세포로 형질전환될 수 있다. 다양한 벡터가 공개적으로 입수가능하다. 벡터는, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태일 수 있다. 적절한 핵산 서열을 다양한 절차를 통해 벡터에 삽입할 수 있다. 일반적으로, 당업계 공지의 기술을 이용하여, DNA를 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들)에 삽입한다. 이들 성분 중 하나 이상을 함유하는 적합한 벡터의 구축은 당업자에게 공지된 표준 라이게이션 기술을 이용한다.
벡터는, 복제 기점, 임의로는 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 프로모터 및 임의로는 프로모터의 조절제를 갖는 한, 예를 들어 플라스미드, 바이러스 또는 파지 벡터일 수 있다. 벡터는 당업계에 널리 공지된 하나 이상의 선택 마커 유전자를 함유할 수 있다.
이들 발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체 내에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 통합 부분으로서 복제가능하다.
(D) 숙주 세포
숙주 세포는 예를 들어 박테리아, 효모 또는 다른 진균 세포, 곤충 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포일 수 있다.
유전자 조작된 트랜스제닉 다세포 숙주 유기체는 폴리펩티드를 생산하는데 사용될 수 있다. 유기체는 예를 들어 트랜스제닉 포유동물 유기체 (예를 들어, 트랜스제닉 염소 또는 마우스 계통)일 수 있다.
적합한 원핵생물은 유박테리움, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예컨대 이. 콜라이를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다양한 이. 콜라이 균주, 예컨대 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446); 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537); 이. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)는 공개적으로 입수가능하다. 다른 적합한 원핵 숙주 세포는 엔테로박테리아세아에, 예컨대 에스케리키아 (예를 들어, 이. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella), 뿐만 아니라 바실루스, 예컨대 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스, 예컨대 피. 아에루기노사 및 스트렙토미세스(Streptomyces)를 포함한다. 이들 예는 제한적이기보다는 예시적이다. 균주 W3110은 재조합 폴리뉴클레오티드 생성물 발효를 위한 통상적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주 중 하나이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110은 숙주에 내인성인 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 유전자 돌연변이가 발생하도록 변형될 수 있고, 이러한 숙주의 예는 완전한 유전자형 tonA를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 1A2; 완전한 유전자형 tonA ptr3을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 9E4; 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 ( argF - lac )169 degP ompT kan'를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244); 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 ( argF - lac )169 degP ompT rbs7 ilvG kan'를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 37D6; 비-카나마이신 내성 degP 결실 돌연변이를 갖는 균주 37D6인 이. 콜라이 W3110 균주 40B4; 및 돌연변이체 주변세포질 프로테아제를 갖는 이. 콜라이 균주를 포함한다. 대안적으로, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어 PCR 또는 다른 핵산 폴리머라제 반응이 적합하다.
이러한 원핵 숙주에서, 전형적으로 숙주 세포와 상용가능한 발현 제어 서열 (예를 들어, 복제 기점)을 함유하는 발현 벡터를 제조할 수 있다. 또한, 임의의 수의 다양한 널리 공지된 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 전형적으로 임의로는 오퍼레이터 서열과 함께 발현을 제어하고, 전사 및 번역을 개시하고 완료하기 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 가질 것이다.
진핵 미생물이 발현에 사용될 수 있다. 진핵 미생물, 예컨대 사상 진균 또는 효모는 폴리펩티드-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)는 통상적으로 사용되는 보다 낮은 진핵 숙주 미생물이다. 다른 것은 스키조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 숙주, 예컨대, 예를 들어 케이. 락티스(K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574), 케이. 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미이(K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이(K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 써모톨레란스(K. thermotolerans), 및 케이. 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris); 칸디다(Candida); 트리코더마 레에시아(Trichoderma reesia); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈와니오미세스(Schwanniomyces), 예컨대 슈와니오미세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균, 예컨대, 예를 들어 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주, 예컨대 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 니거(A. niger)를 포함한다. 메탄올자화 효모가 본원에서 적합하고, 한세눌라(Hansenula), 칸디다, 클로에케라(Kloeckera), 피키아, 사카로미세스, 토룰롭시스(Torulopsis) 및 로도토룰라(Rhodotorula)로 이루어진 속으로부터 선택된, 메탄올에서 성장할 수 있는 효모를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 사카로미세스는 경우에 따라 발현 제어 서열 (예를 들어, 프로모터), 복제 기점, 종결 서열 등이 존재하는 적합한 벡터를 갖는 바람직한 효모 숙주이다. 전형적인 프로모터로는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 다른 당분해 효소가 포함된다. 유도가능한 효모 프로모터는 특히 알콜 데히드로게나제, 이소시토크롬 C, 및 말토스 및 갈락토스 사용을 담당하는 효소로부터의 프로모터를 포함한다.
미생물 뿐만 아니라, 또한 포유동물 조직 세포 배양물을 사용하여 본원에 기재된 폴리펩티드를 발현 및 생산할 수 있고, 이는 일부 경우에 바람직하다 (문헌 [Winnacker, From Genes to Clones VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)] 참조). 일부 실시양태의 경우, 이종 폴리펩티드 (예를 들어, 무손상 이뮤노글로불린)를 분비할 수 있는 수많은 적합한 숙주 세포주가 당업계에서 개발되었기 때문에, 진핵 세포가 바람직할 수 있고, 이는 CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 바람직하게는 골수종 세포주, 또는 형질전환된 B-세포 또는 하이브리도마를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포는 CHO 세포이다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 척추동물 숙주 세포이다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁액 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO 또는 CHO-DP-12 세포주); 마우스 세르톨리 세포; 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 세포주 (Hep G2)이다.
V. 제제 및 제제의 제조 방법
또한 본원에 기재된 방법에 의해 정제된 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)를 포함하는 제제 및 제제의 제조 방법이 본원에 제공된다. 예를 들어, 정제된 폴리펩티드는 제약상 허용되는 담체와 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서 폴리펩티드 제제는 바람직한 정도의 순도를 갖는 폴리펩티드를 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합함으로써 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 저장을 위해 제조될 수 있다.
본원에 사용된 "담체"는 사용되는 투여량 및 농도에서 그에 노출되는 세포 또는 포유동물에게 비독성인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 종종, 생리학상 허용되는 담체는 수성 pH 완충 용액이다.
허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드 제제 내의 폴리펩티드는 기능적 활성을 유지한다.
생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
본원의 제제는 또한 치료될 특정한 적응증에 필요한 경우에는 하나 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 뿐만 아니라, 하나의 제제에 추가의 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)를 포함하는 것은 바람직할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 조성물은 화학요법제, 세포독성제, 시토카인, 성장 억제제, 항호르몬제 및/또는 심장보호제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.
V. 제조품
본원에 기재된 방법에 의해 정제된 폴리펩티드 및/또는 본원에 기재된 방법에 의해 정제된 폴리펩티드를 포함하는 제제는 제조품 내에 함유될 수 있다. 제조품은 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 제제를 함유하는 용기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 제조품은 (a) 용기 내에 본원에 기재된 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 제제를 포함하는 조성물을 포함하는 용기; 및 (b) 제제를 대상체에게 투여하기 위한 설명서를 갖는 포장 삽입물을 포함한다.
제조품은 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 제제를 유지 또는 함유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물의 적어도 하나의 활성제는 폴리펩티드이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 제공되는 폴리펩티드 및 임의의 다른 약물의 투여량 및 간격에 대한 구체적 지침을 받은 대상체에서 조성물의 사용을 지시한다. 제조품은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 용기는 시린지이다. 일부 실시양태에서, 시린지는 추가로 주사 장치 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 주사 장치는 자동주사기이다.
"포장 삽입물"은, 적응증, 용법, 투여량, 투여, 금기, 포장된 제품과 조합되는 기타 치료 제품, 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 관한 경고에 관한 정보를 함유하는, 치료 제품의 상업용 패키지에 관례상 포함되는 지침서를 지칭하기 위해 사용된다.
VI . 예시적 실시양태
일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 폴리펩티드 및 하나 이상의 오염물을 포함하는 조성물을 크로마토그래피 물질 상에 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 능력을 초과하는 양으로 로딩하는 단계, b) 하나 이상의 오염물이 크로마토그래피 물질에 결합된 상태로 유지되는 조건 하에 크로마토그래피 물질로부터 폴리펩티드를 용리하는 단계, 및 c) 단계 a) 및 b)로부터의 크로마토그래피 용출액 중 폴리펩티드를 포함하는 분획을 모으는 단계를 포함하는, 폴리펩티드 및 하나 이상의 오염물을 포함하는 조성물로부터 폴리펩티드를 정제하는 방법을 제공한다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 또는 이뮤노어드헤신이다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 이뮤노어드헤신이다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체이다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 모노클로날 항체는 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체이다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 모노클로날 항체는 IgG 모노클로날 항체이다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 항체는 항원 결합 단편이다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv, 디-scFv, 비-scFv, 탠덤 (디, 트리)-scFv, Fv, sdAb, 삼관능성 항체, BiTE, 디아바디 및 트리아바디로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 효소, 호르몬, 융합 단백질, Fc-함유 단백질, 면역접합체, 시토카인 및 인터류킨으로부터 선택된다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 하나 이상의 오염물은 차이니즈 햄스터 난소 단백질 (CHOP), 숙주 세포 단백질 (HCP), 침출된 단백질 A, 카르복시펩티다제 B, 핵산, DNA, 생성물 변이체, 응집된 단백질, 세포 배양 배지 성분, 겐타미신, 폴리펩티드 단편, 내독소 및 바이러스 오염물 중 임의의 하나 이상이다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 혼합 모드 물질, 음이온 교환 물질, 양이온 교환 물질, 소수성 상호작용 물질 및 친화성 물질로부터 선택된다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 로딩 밀도는 약 50 g/L 내지 약 2000 g/L이다.
상기 실시양태의 아직 추가 실시양태에서; 로딩 밀도는 약 200 g/L 내지 약 1000 g/L이다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 조성물은 크로마토그래피 물질 상에 하나 이상의 오염물에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 능력 정도로 로딩된다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 조성물은 크로마토그래피 물질 상에 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 능력의 20배로 로딩된다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 분배 계수는 30 초과이다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 분배 계수는 100 초과이다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 방법은 로딩 완충제 및 용리 완충제의 사용을 추가로 포함한다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 용리 완충제는 로딩 완충제의 전도도보다 작은 전도도를 갖는다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 로딩 완충제는 약 4.0 mS 내지 약 7.0 mS의 전도도를 갖는다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 용리 완충제는 약 0.0 mS 내지 약 7.0 mS의 전도도를 갖는다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 용리 완충제는 로딩 완충제의 전도도보다 큰 전도도를 갖는다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 로딩 완충제는 약 4.0 mS 내지 약 7.0 mS의 전도도를 갖는다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 용리 완충제는 약 5.5 mS 내지 약 17.0 mS의 전도도를 갖는다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 용리 완충제의 전도도는 약 10 칼럼 부피 (CV) 상에 약 5.5 mS로부터의 약 1.0 mS로의 구배로 감소한다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 용리 완충제의 전도도는 약 15 CV 상에서 약 5.5 mS로부터 약 1.0 mS로의 구배로 감소한다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 용리 완충제의 전도도는 약 5 CV 상에서 약 10.0 mS로부터 약 1.0 mS로의 구배로 감소한다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 용리 완충제의 전도도는 약 10 CV 상에서 약 10.9 mS로부터 약 1.0 mS로의 구배로 감소한다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 용리 완충제는 로딩 완충제의 pH보다 작은 pH를 갖는다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 로딩 완충제는 약 4 내지 약 9의 pH를 갖는다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 용리 완충제는 약 4 내지 약 9의 pH를 갖는다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 용리 완충제는 로딩 완충제의 pH보다 큰 pH를 갖는다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 로드 완충제는 약 4 내지 약 9의 pH를 갖는다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 용리 완충제는 약 4 내지 약 9의 pH를 갖는다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 조성물은 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피로부터의 용리액이다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피이다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 추가로 정제된다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 바이러스 여과에 의해 추가로 정제된다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 중 하나 이상에 의해 추가로 정제된다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 추가로 농축된다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 한외여과, 정용여과 또는 한외여과 및 정용여과의 조합에 의해 농축된다.
상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 방법은 폴리펩티드를 제약상 허용되는 담체와 조합하는 것을 추가로 포함한다.
본 명세서에 개시된 모든 특성들은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특성은 동일하거나, 동등하거나, 또는 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특성으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 분명하게 언급되지 않는 한, 개시된 각각의 특성은 단지 동등하거나 유사한 특성의 포괄적 연속물의 예이다.
본 발명의 추가 상세내용은 하기의 비제한적 실시예에 의해 예시된다. 본 명세서 내의 모든 참고문헌의 개시내용은 본원에 명백히 참고로 포함된다.
실시예
하기 실시예는 순수하게 본 발명을 예시하기 위한 것이고, 따라서 본 발명을 임의의 방식으로 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 하기 실시예 및 상세한 설명은 예로서 비제한적 방식으로 제공된다.
물질 및 방법
모든 실시예를 위한 물질 및 방법은 실시예에서 달리 나타내지 않는 한 하기 지시된 바와 같이 수행하였다.
MAb 공급원료
모든 실시예를 위한 MAb 공급원료를 제넨테크 (미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)에서 산업적, 파일럿 또는 작은 스케일 세포 배양물 배치로부터 선택하였다. 세포 배양물 발효 기간 후에, 세포를 분리하고, 정화된 유액을 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정재하였다. 또한, 단백질 A 풀을 사용하여 불순물 제거의 메카니즘을 조사하였다. 표 2는 실시예에 사용된 각각의 mAb를 위한 공급원료 특성을 보여준다.
Figure pct00002
MAb 정량화
항체의 농도를 UV-가시 분광광도계 (8453 모델 G1103A; 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies); 미국 캘리포니아주 산타 클라라) 또는 나노드롭(NanoDrop) 1000 모델 ND-1000 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific); 미국 매사추세츠주 월섬)을 이용하여 280 및 320 nm에서의 흡광도를 통해 결정하였다. 항체 이외의 종 (즉, 불순물)은 UV 흡광도 상에 감지가능한 효과를 갖기에는 농도가 너무 낮았다. 필요에 따라, 샘플을 0.1-1.0 흡광도 유닛 범위의 적절한 비-간섭 희석제로 희석하였다. 샘플 제조 및 UV 측정을 이중으로 수행하고, 평균 값을 기록하였다. MAb 흡광 계수는 1.42 내지 1.645/mg·ml·cm 범위였다.
CHO 숙주 세포 단백질 (CHOP) 정량화
ELISA를 이용하여 CHOP로 불리는 숙주 세포 단백질의 수준을 정량화하였다. 항-CHOP 항체를 마이크로타이터 플레이트 웰 상에 고정화시켰다. CHOP, 표준물 및 대조군을 함유하는 샘플의 희석액을 웰에서 인큐베이션한 후에, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)와 접합된 항-CHOP 항체와 인큐베이션하였다. HRP 효소 활성을 o-페닐렌디아민으로 검출하고, CHOP를 마이크로타이터 플레이트 판독기에서 490 nm에서의 흡광도를 판독함으로써 정량화하였다. 샌드위치 ELISA의 원리에 기초하여, 퍼옥시다제의 농도는 CHOP 농도에 상응하였다. ELISA에 대한 검정 범위는 전형적으로 5-320 ng/ml이며 검정내 유용성 <10%를 갖는다. CHOP 값을 ng/ml의 단위로 보고하였다. 대안적으로, CHOP 값을 MAb 농도로 나누고, 결과를 PPM (백만분율; 예를 들어 ng의 CHOP/mg의 MAb)으로 보고하였다. CHOP ELISA를 이용하여 샘플 중 전에 전체 CHOP 수준을 정량화할 수 있으나 개별 단백질의 농도를 정량화할 수는 없다.
크로마토그래피 작동 조건
캅토 어드히어 및 캅토 MMC 캅토 어드히어 수지를 지이 헬스케어(GE Healthcare) (스웨덴 웁살라)로부터 수득하였다. 강한 양이온 교환 수지 (포로스 XS 및 포로스 50 HS)를 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) (어드레스)로부터 수득하였다. 모든 실험실 크로마토그래피 실험은 유니콘(UNICORN) 소프트웨어를 활용하는 지이 헬스케어 (스웨덴 웁살라)로부터의 AKTA FPLC 크로마토그래피 시스템을 이용하여 수행하였다. 실험실 칼럼은 직경이 0.66 cm 및 높이가 10-20 cm였다. 칼럼을 로딩 전에 pH 및 전도도의 특정 작동 조건으로 평형화하였다. 이어서, 단백질 A 풀을 칼럼 상에 로딩한 후에 필요에 따라 용리 완충제를 로딩하여 결합된 단백질을 용리하였다. 로드, 오버로드 및 용리 단계 동안 통과물 또는 용리액을 분획으로 수집한 후에 불순물에 대해 분석하였다. MAb 로드 밀도는 수지의 리터당 100 내지 1000 g로 변화하였다.
크로마토그래피 풀 분석
로드, 오버로드 및 용리 단계 동안 통과 풀을 분획에서 수집하고 (각각 1 칼럼 부피), MAb 농도, CHOP 농도, 응집체, 침출된 단백질 A, CHO DNA 및 수율에 대해 분석하였다. 누적 플롯을 용리 풀 분획의 함수로 생성하였다. 누적 수율을 식 1을 이용하여 수득하였다.
여기서, 분획 i의 경우에, Ci는 Mab 농도 (mg/ml)이고, Vi는 분획의 부피 (ml)이고, Mp는 로딩된 단백질의 질량 (mg)이다.
<식 1>
Figure pct00003
크기-배제 크로마토그래피
모노클로날 항체의 크기 불균질성을 고성능 크기 배제 크로마토그래피 검정에 의해 결정하였다. 도소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience) (도쿄, 일본)에 의해 제작된 TSK G3000SWXL SEC 칼럼 (직경=7.8 mm, 높이=300 mm; 파트 번호 08541)은 1200 시리즈 HPLC 기기 (애질런트 테크놀로지스) 상에서 주위 온도에서 작동하였고, 이를 사용하여 수집된 샘플에 대한 MAb 단량체의 상대 수준을 결정하였다. 칼럼은 200 mM 인산칼륨, 250 mM 염화칼륨 pH 6.2 이동상을 이용하여 0.3mL/분의 유량에서 작동하였다. 각각의 샘플에 대해 20 μg의 항체를 주사하였다. 280 nm에서의 UV 흡광도를 사용하여 단량체, LMW 단백질 및 HMW 단백질의 분리를 모니터링하였다. 단량체, LMW 단백질 및 HMW 단백질의 백분율은 켐스테이션(ChemStation) 소프트웨어 (애질런트 테크놀로지스)를 사용하여 수동으로 분석하였다.
CHO DNA 정량화
생성물 샘플 중 CHO DNA는 실시간 PCR (택맨(TaqMan) PCR)를 이용하여 정량화하였다. 샘플 및 대조군으로부터의 DNA를 우선 퀴아젠(Qiagen)의 바이러스 바이오로봇(Virus Biorobot) 키트를 이용하여 추출하였다. 추출된 샘플, 대조군 및 표준 DNA를 ABI의 서열 검출 시스템으로 96-웰 플레이트에서 PCR 프라이머 및 프로브를 사용하여 택맨 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 적용하였다. 프라이머는 크리세툴루스 그리세우스( Cricetulus griseus ) 게놈에서 반복 DNA 서열의 110개 염기 쌍 절편에 의해 정의된다. 프로브를 5' 말단에서 형광 리포터 염료로 및 3' 말단에서 켄처 염료로 표지하였다. 프로브가 무손상일 때, 리포터의 방사 스펙트럼은 켄처에 의해 저해된다. 폴리머라제의 5' 뉴클레아제 활성은 프로브를 가수분해하고 리포터를 방출하여 형광 방사를 증가시킨다. 서열 검출기는 DNA 증폭 동안 연속적으로 측정된 형광 방사의 증가에 정비례하여 증폭된 생성물을 정량화한다. DNA가 역치 (CT)를 지나 증폭된 사이클 수는 표준 곡선을 위해 계산된다. 1 pg/mL-10,000 pg/mL 범위의 표준 곡선이 생성되며, 이는 샘플에서 DNA를 정량화하는데 이용된다.
침출된 단백질 A 정량화
단백질 A 풀의 침출된 단백질-A의 수준은 샌드위치 단백질-A ELISA에 의해 결정하였다. 닭 항-스타필로코쿠스 단백질 A 항체를 마이크로타이터 플레이트 웰 상에 고정화하였다. 샘플 처리 절차는 샘플 희석, 이어서 샌드위치 ELISA 상에서 샘플을 수행하기 전에 전처리 단계로서 마이크로웨이브 보조 가열을 사용하는 단백질 A/IgG 복합체의 해리를 포함하였다. 단백질 A는 샘플 중에 존재하는 경우에 코팅된 항체에 결합된다. 결합된 단백질 A를 양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 항-단백질 항체를 사용하여 검출하였다. 양고추냉이 퍼옥시다제 효소적 활성을 비색 신호를 생산하는 2 성분 TMB 기질 용액으로 정량화하였다.
공급원료 조건화
본 연구에서 실험에 사용된 공급원료는 신선하거나 또는 냉각 저장 (2-8℃ 또는 -70℃)으로부터 가져오고, 실온으로의 평형화를 허용하였다. 이후에, 이들을 필요에 따라 적정 작용제 (1.5 M 트리스 염기 또는 1 M 아세트산) 또는 희석제 (정제수, 5 M 염화나트륨, 또는 5 M 아세트산나트륨)를 사용하여 pH 및/또는 전도도 조정하였다. 모든 공급원료를 밀리팩(Millipak) 20 (밀리포어(Millipore)), 아크로팩(AcroPak)TM 20 (폴 코포레이션(Pall Corporation)) 또는 진공 필터 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 미국 뉴욕주 로체스터)를 사용하여 0.2 μm 여과하였다.
고처리량 스크리닝
테칸 프리돔 에보(Tecan Freedom Evo) 200 로봇 (테칸 US(Tecan US), 노스캐롤라이나주 리서치 트라이앵글 파크)을 액체 및 수지 취급에 사용하였다. 96-웰 필터 플레이트 (해마 800 μL 폴리프로필렌 0.45μm 짧은 드립 필터 플레이트, E&K 사이언티픽(E&K Scientific) EK-2223)를 사용하여 수지를 단백질 및 완충제와 인큐베이션하였다. 단백질 용액을 수지와 인큐베이션한 후에, 필터 플레이트를 1200 x g에서 3분 동안 원심분리하여 수지로부터 용액을 분리하였다. 각각의 단계에서, 300 mL의 용액을 50 mL의 수지와 접촉시켜, 6:1의 단계 부피 비를 생성하였다. 각각의 웰을 적절한 pH 및 아세트산나트륨 농도로 평형화시켰다. pH는 0.5 pH 단위 간격으로 5.00 내지 7.5 범위였다 (아세테이트를 사용하여 pH 5.00 내지 5.5 조건을 완충시키고, MES를 사용하여 pH 6.00 내지 6.5 조건을 완충시키고, MOPS를 사용하여 7.00 내지 7.5 조건을 완충시킴). 모든 실험을 실온에서 수행하였다. 부분적으로 정제된 단백질 A 풀 (5 g/L 또는 97 mg/mL로 농축되고, 15 mM NaOAc로 완충제 교환됨)을 이러한 실험을 위한 로드로 사용하였다. 수지는 생성물 Kp 값을 결정하기 위한 실험에서 5 g/L로 도전하였다. 그러나, 실제 생성물 결합 능력을 위해 수지는 97 g/L로 도전하였다. 여과물 용액을 수집 플레이트에서 포획하고, 이어서 인피니트(Infinite) M200 플레이트 판독기를 이용하여 분석하였다. 이후에 결합된 단백질을 2 단계의 2 M NaCl 완충제를 사용하여 수지로부터 스트리핑하여 질량 균형을 완성하였다.
바이러스 제거 연구
본 연구의 목적은 2가지 모델 바이러스 (MMV 및 X-MuLV)에 대한 캅토 어드히어의 바이러스 제거 능력을 평가하는 것이다. 칼럼, 0.66 cm 직경을 나이브 수지와 20 cm 베드 높이로 패킹하였다. MAb 공급물을 1% 바이러스와 첨가하고, 이어서 캅토 어드히어 수지 상에서 처리하였다. 즉시 풀을 수집하고, 로드 및 용리 샘플을 바이러스 수에 대해 분석하였다. 풀의 완전 배지로의 다중 희석액 (1:10 및 1:100)을 만들어 완충제 성분 및 바이러스 사이의 임의의 잠재적 간섭을 결정하였다.
실시예 1. 고처리량 스크리닝
본 실시예는 크로마토그래피 물질의 결합 능력을 결정하기 위한 고처리량 스크리닝 방법을 기재한다. 고처리량 스크리닝은 모노클로날 항체 MAb3에 대한 배치 결합 조건 하에 캅토 어드히어 수지 상에서 수행하였다.
결합 조건의 고처리량 스크리닝의 결과를 도 1에 제시한다. 반응 표면 도면 (도 1A 및 1B)에서, 생성물-결합 영역은 적색으로 표시되고 (도 1A의 영역 8 및 도 1B에서의 영역 7) 및 생성물, 예를 들어 폴리펩티드, 비-결합 영역은 녹색으로 표시된다 (영역 1로 나타냄). 상청액 중 실제 숙주 세포 단백질 (HCP) 함량 (ng/mg)은 도 1C 컨투어 플롯에 나타낸다. MAb3에 대한 pH 및 반대이온 농도의 함수로서의 생성물 Kp는 도 1A에 나타낸다. 수지를 5 g/L로 로딩하고, 미가공 데이터를 반응 표면 모델을 이용하여 분석하였다. 이어서, 모델을 사용하여 실험적 공간에서 pH 및 반대이온 농도의 임의의 조합에서의 Kp를 추정하였다. 데이터는 pH가 증가함에 따라 그리고 전도도가 증가함에 따라, 로그 Kp가 증가한다는 것을 보여준다. 로그 Kp의 증가는 수지에 대한 생성물 결합의 증가를 반영한다. 수지 상의 실제 생성물 결합 능력을 발견하기 위해, 수지는 상이한 pH 및 반대이온 농도를 조합한 48가지 상이한 조건에서 80 g/L로 도전하였다 (도 1B). 동일한 실험 플레이트로부터의 상청액을 또한 HCP (ng/mg)에 대해 분석하고, 데이터를 컨투어의 형태로 플롯팅하였다 (도 1C). 수천 ppm의 CHOP를 함유하는 부분적으로 정제된 단백질 A 풀을 고처리량 스크리닝 실험을 위한 로드로서 사용하였다. 도면에서 녹색 영역 (영역 1)은 상청액 중 보다 적은 양의 CHOP를 나타내고, 적색 영역 (도 1B의 영역 8 및 도 1C의 영역 9)은 상청액 중 보다 많은 양의 CHOP를 나타낸다.
최적의 로딩 및 용리 조건을 위한 설계 공간을 CHOP 및 결합 데이터 컨투어 플롯으로부터 결정하였다. 이러한 플롯은 통과 작동 모드 또는 결합 및 용리 작동 모드의 설계를 가능하게 한다. 완전 통과 크로마토그래피를 위한 로딩 조건은 일반적으로 생성물 결합, 예를 들어 폴리펩티드 결합이 최소화되고, 불순물 (CHOP) 결합이 최대화되는 조건이다. 도 1B 및 1C 사이의 완전 오버랩핑 녹색 영역 (영역 1)은 F/T 모드가 가능함을 시사한다. 그러나, 이러한 플롯에서 녹색 영역 (영역 1)은 전도도가 실제로 낮은 ~1mS인 영역이다. 이러한 조건은 단백질 A 풀의 약 4배 희석을 필요로 하여 스케일에서 잠재적 플랜트 핏 도전을 발생시킨다.
적색 영역 (도 1B에서의 영역 7 및 도 1C에서의 영역 8)은 MAb 및 CHOP 둘 다에 대한 결합 영역을 나타낸다. 양쪽 플롯에서 일부 오버랩핑 적색 영역이 존재한다. 그러나, 도 1B는 작동가능한 pH 및 반대이온 농도 내에서, 55 g/L의 최대 결합 능력이 가능하다는 것을 보여준다. ~3.5 g/L의 세포 배양물 역가를 갖는 높은 역가 공정에서, 1000 L 칼럼이 모든 생성물, 예컨대 폴리펩티드를 회수하기 위해 필요할 것이며, 하나의 사이클 또는 다중 사이클이 보다 작은 칼럼 상에서 수행되어야 할 것이다.
OEC 모드에서, 로딩 조건은 칼럼 상의 불순물 (예를 들어, CHOP) 거동에 기초하여 선택될 수 있다. 칼럼에 결합하는 MAb의 양은 결합된 MAb가 용리 단계에 의해 회수될 수 있기 때문에 관심이 적다. 따라서, 수지의 생성물 결합 능력에 의해 제한되지 않으면서 최대 불순물 제거가 달성되도록 로딩 조건을 설계하기 위한 전체 실험 공간이 존재한다. 결합 및 용리 모드는 55 g/L 로드 밀도를 허용하면 한편, OEC는 약 10배 더 높은 로딩 능력을 가능하게 하여 보다 작은 칼럼의 구현을 허용하며, 이는 다시 생성물의 그램당 수지 가격을 낮출 수 있고 우수한 플랜트 핏을 제공한다.
실시예 2. 최적화된 OEC 모드
HTS 데이터는 OEC 모드로 작동하기 위한 파라미터 결정에 사용될 수 있다. 로드 밀도 요구사항, 플랜트 핏 및 불순물 제거에 기초하여, MAb 3에 대한 로드 조건을 pH 6.5 및 5.5 mS/cm이 되도록 선택하였다. 도 2에 나타낸 최적화된 크로마토그리패 수행을 위한 로드 밀도는 180 g/L이었다. 약 50 g/L 폴리펩티드 생성물은 로드 단계 동안 수지에 결합한다. 생성물 풀을 약 0.5 OD에서 출발하여 수집하고, 생성물을 최대 180 g/L로 수지 상에 오버로딩하였다. 로드 단계의 완료 후에, 1 mS/cm의 낮은 전도도 완충제 (용리 완충제: 20 mM MES pH 6.5)를 사용하는 용리 단계를 이용하여 결합된 단백질을 용리하여, 통과 크로마토그래피와 비교하여 10-15% 풀 부피 감소를 발생시켰다. 이러한 크로마토그래피 수행에서의 수율 및 불순물 제거를 도 3에 나타낸다.
실시예 3. 로드 최적화
본 연구는 OEC 작동 모드에서 HTS 데이터 및 실제 칼럼 수행 데이터를 비교하기 위해 수행하였다. 칼럼을 3가지 상이한 pH에서 로딩하였다. 초기 CHOP 제거 및 수율 데이터에 기초하여 가장 우수한 조건이 되도록 pH 6.5를 선택하였다. 풀에서 CHOP의 농도는 로드 pH의 함수로서 900 내지 50 내지 400 ppm의 범위였다. 본 연구로부터, pH 6.5가 조성물을 로드하기에 가장 우수한 조건인 것으로 결정되었다. 또한, 수율이 최적화되지는 않았으나 pH 6.5가 또한 최대 수율을 제공하였다 (도 3, 표 3).
Figure pct00004
실시예 4. 용리 최적화
본 연구는 OEC에 대한 용리 조건을 최적화하기 위해 수행하였다. 로드 단계 동안 결합된 생성물 (MAb 3, ~50 g/L)을 회수하기 위해, 몇 칼럼 부피의 세척 완충제 (50 mM MES, 30 mM Na아세테이트, pH 6.5, ~5.5 mS/cm)를 로드 단계의 완료 후에 칼럼을 통과시켰다. 로드 단계의 종점에 풀 부피가 증가시키는 다량의 테일링이 관찰되었다. 풀 부피의 증가는 로드 완충제와 유사한 pH 및 전도도를 갖는 세척 완충제를 사용하여 약 45%였다. 풀 부피의 이러한 증가는 플랜트 핏 도전을 발생시킬 수 있다 (도 4).
용리 최적화 연구의 목적은 최소 CHOP 및 최대 풀 부피 감소와 함께 최대 수율을 수득하는 것이다. 용리 단계는 칼럼으로부터 50 g/L의 결합된 생성물을 용리하기 위해 개발되었다. 도 5는 크로마토그램의 용리 단계를 보여준다. 보다 작은 전도도 완충제는 2 칼럼 부피 내에서 칼럼에서 생성물을 용리하여 보다 높은 수율 및 보다 작은 풀 부피를 생성한다 (표 4). 다른 한편으로는 보다 큰 전도도 용리 완충제가 8 칼럼 부피 초과의 테일링을 발생시켰다. 표 4에 나타난 바와 같이, 풀 CHOP는 모든 용리 완충제가 시도될 때까지 20 ppm 미만이었다. 따라서, 수율을 증가시키고 테일링을 최소화하기 위한 용리 완충제로서 20 mM MES가 선택되었다.
Figure pct00005
실시예 5. OEC의 불순물 분석
OEC로부터의 분획을 불순물에 대해 분석하였다. 도 6A는 로드 단계 동안 및 용리 단계 동안 수집된 분획 중의 MAb 농도 및 CHOP 수준을 보여준다. 로딩 단계 동안, CHOP는 20-25 ppm에서 유지되었고, 오직 결합된 MAb만 용리되는 용리 단계 동안 분획 CHOP 수준은 감소하였다. 누적 분석은 CHOP 및 다른 불순물이 전체 로드 및 용리 단계에 걸쳐 매우 일정하게 유지된다는 것을 입증한다 (도 6B). 이러한 수행에서 로드 밀도는 180 g/L였다. 모델 바이러스로서 X-MuLV 및 MMV를 사용한 바이러스 제거를 또한 동일한 로드 밀도에서 연구하였다 (표 5). 이러한 실험에서, 로드 pH는 6.5였고, 로드 전도도는 5.5 mS/cm였다. 용리 조건은 20 mM MES pH 6.5 및 ~1 mS/cm의 전도도였다.
Figure pct00006
실시예 6. 최대 불순물 결합 능력 결정
OEC 모드에 의해 MAb3으로 로딩된 수지 상의 최대 불순물 결합 능력을 발견하기 위해, 캅토 어드히어 수지는 단백질 A 풀과 1000 g/L로 도전하였다. 로딩 완충제는 pH 6.5, ~5.5 mS/cm였고; 용리 완충제는 20 mM MES pH 6.5, ~1 mS/cm였다. 풀 샘플을 50 g/L마다 수집하고, CHOP 및 단백질 농도에 대해 분석하였다 (도 7). 최대 800 g/L의 로딩 밀도에서, CHOP는 파과되지 않았으며, 용리액 중의 CHOP는 20 ng/mg 미만이었다.
실시예 7. 파일럿 스케일의 구현
OEC 작동 모드는 크기가 1.6 L 내지 10.8 L 범위인 파일럿 스케일 칼럼 상에서 구현되었다. 칼럼 직경은 10 cm 내지 25 cm 범위이며 베드 높이는 20 - 22 cm 범위였다 (표 6). 샘플을 pH 6.5, ~5.5 mS/cm으로 로딩하고, 20 mM MES pH 6.5, ~ 1 mS/cm으로 용리한다. 파일럿 스케일 수행에 걸친 수율은 도 8에 나타낸다. 파일럿 스케일 수행에서의 로드 밀도는 70 내지 180 g/L의 로드 밀도 범위를 포괄하였다. 모든 로드 밀도에 걸쳐, 94%의 평균 수율이 달성되었다. 시험된 로드 밀도의 범위 상에서 수율에 대한 영향은 없었다. 모든 파일럿 스케일 수행에 걸쳐, OEC 모드 풀 CHOP는 25 ppm 미만이었으며, 이는 최종 폴리펩티드 생성물 (UFDF 풀)에서 <2 ppm CHOP로 하류 제거되었다 (표 7). 평균적으로, 모든 파일럿 스케일 수행에 걸쳐 HMW 단백질의 약 1.1% 감소 (표 8) 및 모든 파일럿 스케일 수행에 걸쳐 LMW 단백질의 0.19% 감소가 있었다 (표 9).
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
CHO DNA 및 침출된 단백질 A는 OEC 후에 풀에서 검출가능한 양 미만이었다.
실시예 8. 스케일 제작의 구현
OEC 작동 모드는 157 L의 크기 (100 cm 직경 x 20 cm 높이)를 갖는 제작 스케일 칼럼 상에서 구현되었다. 제작 스케일에서, 칼럼을 ~96 g/L로 로딩하였다. 제작 스케일에서의 2회 수행에 걸친% 수율은 양쪽 수행에서 ≥95%였다. 모든 제작 스케일 수행에 걸쳐, OEC 모드 풀 CHOP는 17 ppm 미만이었으며 (표 10), 이는 CHOP의 검출가능한 수준 미만으로 하류 제거되었다. 평균적으로, 2회 제작 스케일 수행에 걸쳐 HMW의 약 1.1% 감소, LMW의 0.1% 감소 및 산성에서 1.65% 감소가 존재한다.
Figure pct00011
CHO DNA 및 침출된 단백질 A는 OEC 모드 후에 풀에서 검출가능한 양 미만이었다.
실시예 9. 다른 MAb에 대한 OEC 적용성
단백질 A 풀을 이러한 수행을 위한 로드로서 사용하였다. OEC 모드를 가능하게 하는 로드 및 용리 조건을 선택하였다. 로드 밀도,% 수율, 수지에 결합된 MAb (g/L), 로드 및 풀 중의 불순물은 하기 표에 나타낸다 (표 11, 12, 13 및 14).
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
실시예 10. K p 값에 기초한 AEX 크로마토그래피 작업의 모드
완전 통과 (F/T) 크로마토그래피엥서, Kp는 <0.1이고, 수지에 대한 단백질 결합이 존재하지 않는다. 약한 분배 크로마토그래피 (WPC)에서, Kp는 0.1 내지 20이고, 생성물 및 크로마토그래피 매질 사이에 약한 분배가 존재한다. 결합 및 용리 모드에서, 생성물은 수지에 단단하고 결합하고, Kp는 >100이지만, 로드 밀도는 생성물 결합 능력으로 제한된다. 그러나, 오버로드 및 용리 모드의 크로마토그래피 (MAb 3)에서, 로드 조건은 생성물 및 불순물 Kp가 >100이 되도록 하는 것으로 밝혀졌으며, 생성물은 그의 결합 능력에 도달한 후에 통과하였으나, 불순물은 수지에 대한 결합을 유지하였고 이들이 생성물 결합 능력보다 더 높을 수 있는 그의 결합 능력에 도달할 때까지 파과되지 않았다.
용리 조건은 폴리펩티드 생성물 Kp < 2가 되도록 하는 것을 밝혀졌다. 결합된 생성물은 회수되지만 대부분의 불순물은 결합된 상태로 유지되는다 (불순물 Kp > 100). 이에 따라, 이러한 모드는 매우 높은 수율 (예를 들어, ~95%)을 제공하면서 우수한 불순물 제거를 가능하게 한다 (표 15).
Figure pct00016
약한 분배 조건 (Kp = 2.4) 및 오버로드 및 용리 조건 (Kp >100) 하의 칼럼 수행으로부터의 크로마토그램은 크로마토그램의 생성물 파과 영역에 대한 증가하는 mAb Kp의 효과를 나타낸다 (도 9). WPC 로드 조건: pH 5.5, 4.4 mS/cm; WPC 세척 조건: 20 mM 아세테이트 pH 5, 4.4 mS/cm. OEC 로드 조건: pH 6.5, 5.5 mS/cm; OEC 용리 조건: 20 mM MES pH 6.5, ~1 mS/cm.
Figure pct00017
실시예 11. 다양한 수지에 대한 OEC 적용성
분자의 pI에 따라, OEC는 다음 다중 모드 수지 (캅토 어드히어, QMA, MEP 하이퍼셀, HEA 하이퍼셀, PPA 하이퍼셀, 캅토 MMC)에 적용될 수 있다. 캅토 어드히어 수지 상의 폴리펩티드 생성물 결합은 자연에서 보다 더 소수성이고, 결합된 생성물은 용리 완충제의 전도도를 낮춤으로써 칼럼으로부터 용리될 수 있다 (도 5). 그러나, 수지 상의 생성물 결합 및 수지로부터의 생성물 용리 모드는 소수성 상호작용으로 제한되지 않으며, 이에 따라 OEC 작동 모드는 방식은 또한 다른 크로마토그래피 물질에서도 광범위하게 이용될 수 있다. 표 17은 OEC가 다른 CEX 수지 및 IEX 수지에 적용될 수 있다는 것을 입증한다. 용리 완충제는 달리 나타내지 않는 한 20 mM MES였다. OEC의 잠재성은 상기 수지로 제한되지 않으며, 현재 평가 중이다. QMA 수지 상의 MAb 3의 파과 분석은 도 10에서 보여준다. 캅토 어드히어 수지 상의 MAb 4의 파과 분석은 도 11에서 보여준다. 캅토 MMC 수지 상의 MAb 4의 파과 분석은 도 12에서 보여준다. 캅토 어드히어 수지 상의 MAb 3의 파과 분석은 도 13에서 보여준다.
Figure pct00018
실시예 12. OEC의 구배 용리
용리 최적화 연구의 또 다른 목적은 캅토 어드히어 수지 상의 OEC 모드에 대한 구배 용리 조건의 효과를 평가하는 것이다. 용리 단계는 결합된 생성물을 용리하기 위해 개발되었다 (표 18). 구배 용리 수행에서, 이동상의 이온 강도, pH, 조성 및 농도는 요구사항에 기초하여 변경될 수 있다. 표 18은 수행 조건: 로드 (pH 및 전도도) 및 용리 (pH 및 전도도 구배) 조건 둘 다를 보여준다. 표에 나타낸 모든 데이터는 MAb 3을 사용하여 150 g/L 로드 밀도로 로딩된 크로마토그래피 수행으로부터 수득하였다. 이러한 수행은 구배 용리가 크로마토그래피의 OEC 모드 상에서 수행될 수 있고 경사 기울기 (염의 농도 (mM)/칼럼 부피)가 최적화될 수 있다는 것을 입증하는 개념의 증거로서 행해졌다. %HMWS가 로드와 비교시에 평균 38% 감소하였음을 알 수 있었다 (표 18). CHOP는 5.5 mS/cm 전도도 수행에서 <20 ppm으로 감소하였고, 10 mS/cm에서의 보다 큰 전도도 수행은 ~150 ppm의 풀 CHOP를 생성하였다 (표 19).
Figure pct00019
Figure pct00020

Claims (44)

  1. a) 폴리펩티드 및 하나 이상의 오염물을 포함하는 조성물을 크로마토그래피 물질 상에 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 능력을 초과하는 양으로 로딩하는 단계,
    b) 하나 이상의 오염물이 크로마토그래피 물질에 결합된 상태로 유지되는 조건 하에 크로마토그래피 물질로부터 폴리펩티드를 용리하는 단계, 및
    c) 단계 a) 및 b)로부터의 크로마토그래피 용출액 중 폴리펩티드를 포함하는 분획을 모으는 단계
    를 포함하는, 폴리펩티드 및 하나 이상의 오염물을 포함하는 조성물로부터 폴리펩티드를 정제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 항체 또는 이뮤노어드헤신인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 폴리펩티드가 이뮤노어드헤신인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 폴리펩티드가 항체인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 모노클로날 항체가 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 모노클로날 항체가 IgG 모노클로날 항체인 방법.
  8. 제4항에 있어서, 항체가 항원 결합 단편인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 항원 결합 단편이 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv, 디-scFv, 비-scFv, 탠덤 (디, 트리)-scFv, Fv, sdAb, 삼관능성 항체, BiTE, 디아바디 또는 트리아바디인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 효소, 호르몬, 융합 단백질, Fc-함유 단백질, 면역접합체, 시토카인 또는 인터류킨인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 오염물이 차이니즈 햄스터 난소 단백질 (CHOP), 숙주 세포 단백질 (HCP), 침출된 단백질 A, 카르복시펩티다제 B, 핵산, DNA, 생성물 변이체, 응집된 단백질, 세포 배양 배지 성분, 겐타미신, 폴리펩티드 단편, 내독소 및 바이러스 오염물 중 어느 하나 이상인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 물질이 혼합 모드 물질, 음이온 교환 물질, 소수성 상호작용 물질 또는 친화성 물질인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 밀도가 약 50 g/L 내지 약 2000 g/L인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 로딩 밀도가 약 200 g/L 내지 약 1000 g/L인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물을 크로마토그래피 물질 상에 하나 이상의 오염물에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 능력 정도로 로딩하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물을 크로마토그래피 물질 상에 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 능력의 20배로 로딩하는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 분배 계수가 30 초과인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 분배 계수가 100 초과인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 완충제 및 용리 완충제의 사용을 추가로 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 용리 완충제가 로딩 완충제의 전도도보다 작은 전도도를 갖는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 로딩 완충제가 약 4.0 mS 내지 약 7.0 mS의 전도도를 갖는 것인 방법.
  22. 제20항에 있어서, 용리 완충제가 약 0.0 mS 내지 약 7.0 mS의 전도도를 갖는 것인 방법.
  23. 제19항에 있어서, 용리 완충제가 로딩 완충제의 전도도보다 큰 전도도를 갖는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 로딩 완충제가 약 4.0 mS 내지 약 10.0 mS의 전도도를 갖는 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 로딩 완충제가 약 4.0 mS 내지 약 7.0 mS의 전도도를 갖는 것인 방법.
  26. 제23항에 있어서, 용리 완충제가 약 5.5 mS 내지 약 17.0 mS의 전도도를 갖는 것인 방법.
  27. 제19항에 있어서, 용리 완충제의 전도도가 약 10 칼럼 부피 (CV) 상에서 약 5.5 mS로부터 약 1.0 mS로의 구배로 감소하는 것인 방법.
  28. 제19항에 있어서, 용리 완충제의 전도도가 약 15 CV 상에서 약 5.5 mS로부터 약 1.0 mS로의 구배로 감소하는 것인 방법.
  29. 제19항에 있어서, 용리 완충제의 전도도가 약 5 CV 상에서 약 10.0 mS로부터 약 1.0 mS로의 구배로 감소하는 것인 방법.
  30. 제19항에 있어서, 용리 완충제의 전도도가 약 10 CV 상에서 약 10.9 mS로부터 약 1.0 mS로의 구배로 감소하는 것인 방법.
  31. 제19항에 있어서, 용리 완충제가 로딩 완충제의 pH보다 작은 pH를 갖는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 로드 완충제가 약 4 내지 약 9의 pH를 갖는 것인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 용리 완충제가 약 4 내지 약 9의 pH를 갖는 것인 방법.
  34. 제19항에 있어서, 용리 완충제가 로딩 완충제의 pH보다 큰 pH를 갖는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 로드 완충제가 약 4 내지 약 9의 pH를 갖는 것인 방법.
  36. 제34항에 있어서, 용리 완충제가 약 4 내지 약 9의 pH를 갖는 것인 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피로부터의 용리액인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 친화성 크로마토그래피가 단백질 A 크로마토그래피인 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드를 추가로 정제하는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 폴리펩티드를 바이러스 여과에 의해 추가로 정제하는 것인 방법.
  41. 제39항에 있어서, 폴리펩티드를 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 중 하나 이상에 의해 추가로 정제하는 것인 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드를 추가로 농축하는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 폴리펩티드를 한외여과, 정용여과 또는 한외여과 및 정용여과의 조합에 의해 농축하는 것인 방법.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드를 제약상 허용되는 담체와 조합하는 것을 추가로 포함하는 방법.
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