ES2637423T3 - Cromatografía de sobrecarga y elución - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para purificar un polipéptido a partir de una composición que comprende el polipéptido 5 y uno o más contaminantes, comprendiendo dicho procedimiento a) cargar la composición en un modo mixto, un intercambio aniónico, una interacción hidrófoba, o un material de cromatografía de afinidad en 20 veces la capacidad de unión dinámica del material de cromatografía para el polipéptido usando un tampón de carga, en donde el coeficiente de reparto del material de cromatografía para el polipéptido es mayor que 30, b) eluir el polipéptido del material de cromatografía en condiciones en las que el uno o más contaminantes permanecen unidos al material de cromatografía utilizando un tampón de elución, en el que el tampón de elución tiene una conductividad menor que la conductividad del tampón de carga y c) agrupación de fracciones que comprenden el polipéptido en el efluente de cromatografía de las etapas a) y b).

Description

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DESCRIPCION
Cromatografia de sobrecarga y elucion Campo de la invencion
La presente invencion proporciona procedimientos para purificar un producto a partir de una composicion que comprende el producto y al menos un contaminante y formulaciones que comprenden el producto purificado con los procedimientos.
Antecedentes de la invencion
La cromatografia de intercambio anionico (AEX) se usa ampliamente en un modo de flujo continuo como una etapa de refinado de plataforma para anticuerpos monoclonales (MAb). Ciertos MAb que se unen a la resina AEX en condiciones normales de flujo pueden plantear retos de ajuste de la planta. Para el desarrollo clinico en etapa temprana en la que el requerimiento de masa es tipicamente bajo, estos MAb no de plataforma se han purificado usando AEX o resina de modo mixto en un modo de union y elucion. Sin embargo, debido a la baja capacidad de union dinamica (DBC) de estas resinas, la etapa tardia de implementacion requeriria columnas que tienen aproximadamente 1000 l de tamano o multiples ciclos en una columna mas pequena limitando asi el rendimiento de la planta.
La purificacion de MAb se realiza tipicamente usando cromatografia de union y elucion (B/E) o cromatografia de flujo continuo (F/T). Se han introducido recientemente cromatografia de reparto debil (Kelley, BD et al., 2008 Biotechnol Bioeng l0l (3): 553-566; publicacion de solicitud de patente de eE. UU. n.° 2007/0060741) y cromatografia de sobrecarga WO2011150110 sobre resinas AEX y resinas de intercambio cationico (CEX) respectivamente para mejorar la purificacion de MAb. El mecanismo general y las limitaciones de cada uno de estos modos de cromatografia se destacan a continuacion.
Cromatografia de union y elucion: Con cromatografia B/E, el producto se carga usualmente para maximizar DBC para el material de cromatografia y luego se identifican las condiciones de lavado y elucion de tal manera que se alcanza la maxima pureza del producto en el eluido. Una limitacion de la cromatografia B/E es la restriccion de la densidad de carga a la resina real DBC
Cromatografia de flujo: Usando la cromatografia F/T, las condiciones de carga se identifican cuando las impurezas se unen fuertemente al material de cromatografia mientras el producto fluye. La cromatografia F/T permite una alta densidad de carga para MAb convencionales pero no puede ser implementable para MAb sin plataforma o las condiciones de solucion que permiten el funcionamiento F/T para estos MAb sin plataforma pueden ser tales que no son implementables en plantas de produccion existentes.
Cromatografia de reparto debil: Este modo de funcionamiento mejora el modo F/T identificando condiciones de solucion en las que hay una union debil de MAb a la resina (2 a 20 g/l). En estas condiciones, las impurezas se unen mas fuerte que en el modo F/T y se obtiene asi una purificacion mejorada. Sin embargo, las condiciones de carga se dirigen a tener un bajo coeficiente de reparto del producto (Kp) en el intervalo de 0,1-20.
Cromatografia de sobrecarga: En este modo de cromatografia, el producto de interes se carga mas alla de la capacidad de union dinamica del material de cromatografia para el producto, por lo que se denomina sobrecarga. Se ha demostrado que el modo de funcionamiento proporciona la purificacion de MAb con medios de intercambio cationico (CEX) y particularmente con membranas. Sin embargo, una limitacion de este enfoque es que podria haber rendimientos bajos con resina ya que no hay fase de elucion.
La purificacion a gran escala y rentable de un polipeptido hasta una pureza suficiente para su uso como un agente terapeutico humano sigue siendo un desafio formidable.
Todas las referencias citadas en el presente documento, incluidas solicitudes de patente y publicaciones, se incorporan como referencia en su totalidad. El documento WO2012068134A1 se refiere al enriquecimiento y concentracion de determinadas isoformas del producto por union con sobrecarga y cromatografia de elucion. El documento WO2006116064A2 se refiere a un aparato y a procedimientos para la purificacion dirigida por espectrometria de masas de biopolimeros. Liu, HF et al., 2011 J Chrom A 1218(39):6943-6952 se refiere a la exploracion de la cromatografia de intercambio cationico con sobrecarga para la purificacion de anticuerpos monoclonales. El documento WO9508574A1 se refiere al procedimiento de cromatografia de desplazamiento y producto de hemoglobina purificada. El documento WO2011035282A1 se refiere a la separacion por captura doble. El documento US2011065901A1 se refiere a procedimientos para purificar una proteina diana a partir de una o mas impurezas en una muestra.
Breve resumen
La invencion proporciona procedimientos para purificar un polipeptido a partir de una composicion que comprende el polipeptido y uno o mas contaminantes, comprendiendo dicho procedimiento a) cargar la composicion en un modo
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mixto, un intercambio anionico, una interaccion hidrofoba o un material de cromatografia de afinidad a 20 veces la capacidad de union dinamica del material de cromatografia para el polipeptido usando un tampon de carga, en donde el coeficiente de reparto del material de cromatografia para el polipeptido es mayor que 30, b) eluyendo el polipeptido del material de cromatografia en condiciones en las que el uno o mas contaminantes permanecen unidos al material de cromatografia utilizando un tampon de elucion, en el que el tampon de elucion tiene una conductividad menor que la conductividad del tampon de carga y c) agrupacion de fracciones que comprenden el polipeptido en el efluente de cromatografia de las etapas a) y b).
En algunos modos de realizacion, el polipeptido es un anticuerpo o inmunoadhesina. En algunos modos de realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal; por ejemplo, pero sin limitarse a un anticuerpo quimerico, anticuerpo humanizado o anticuerpo humano.
En algunos modos de realizacion, el anticuerpo es un fragmento de union al antigeno; por ejemplo pero sin limitarse a estos, un fragmento Fab ', un fragmento F(ab') 2, un scFv, un di-scFv, un bi-scFv, un tandem (di, tri)-scFv, un Fv, un sdAb, un anticuerpo trifuncional, un BiTE, un diacuerpo y un triacuerpo.
En algunos modos de realizacion, el polipeptido es una enzima, una hormona, una proteina de fusion, una proteina que contiene Fc, un inmunoconjugado, una citocina o una interleucina.
En algunos modos de realizacion, el polipeptido se purifica a partir de una composicion que comprende uno o mas contaminantes; por ejemplo, la proteina de ovario de hamster chino (CHOP), una proteina de celula huesped (HCP), proteina A lixiviada, carboxipeptidasa B, acido nucleico, ADN, variantes de producto, proteina agregada, componente de medio de cultivo celular, gentamicina, fragmentos polipeptidicos, endotoxinas y contaminante viral.
En algunos modos de realizacion de la invencion, el material de cromatografia se selecciona de un material de modo mixto, un material de intercambio anionico, un material de interaccion hidrofobico y un material de afinidad.
En algunos modos de realizacion, la composicion se carga sobre el material de cromatografia a aproximadamente las capacidades de union dinamica de los materiales de cromatografia para el o los varios contaminantes.
En algunos modos de realizacion, el coeficiente de reparto del material de cromatografia para el polipeptido es mayor que 30 o mayor que 100
En algunos modos de realizacion, los procedimientos proporcionan OEC en el que el tampon de elucion tiene una conductividad menor que la conductividad del tampon de carga. En otros modos de realizacion, el tampon de elucion tiene una conductividad mayor que la conductividad del tampon de carga. En algunos modos de realizacion, los procedimientos proporcionan OEC en donde el tampon de elucion tiene un pH menor que el pH del tampon de carga. En otros modos de realizacion, el tampon de elucion tiene un pH mayor que el pH del tampon de carga.
En algunos modos de realizacion, el polipeptido de los procedimientos esta en un eluyente de una cromatografia de afinidad, una cromatografia de intercambio cationico, una cromatografia de intercambio anionico, una cromatografia de modo mixto y una cromatografia de interaccion hidrofoba. En algunos modos de realizacion, el polipeptido esta en un eluyente de una cromatografia de Proteina A.
En algunos modos de realizacion, el polipeptido de los procedimientos se purifica adicionalmente; por ejemplo, por filtracion de virus, cromatografia de afinidad, cromatografia de intercambio cationico, cromatografia de intercambio anionico, cromatografia en modo mixto y/o cromatografia de interaccion hidrofoba. En algunos modos de realizacion, el polipeptido se concentra adicionalmente; por ejemplo por ultrafiltracion, diafiltracion o una combinacion de ultrafiltracion y diafiltracion. En algunos modos de realizacion, el polipeptido de los procedimientos se combina adicionalmente con un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 muestra resultados de cribado de alto rendimiento (HTS) sobre la resina Capto Adhere en condiciones de union por lotes para MAb3. La figura 1A muestra contornos de valores constantes de Kppara MAb3. La figura 1B muestra la capacidad de union real del MAb 3 en el sobrenadante a 80 g/l de exposicion del producto a la resina. La figura 1C muestra la capacidad de union real de la impureza (proteina de la celula huesped) en el sobrenadante a 80 g/l de exposicion de producto a la resina. Todas las graficas de contorno se generaron usando un modelo de superficie de respuesta derivado de los datos brutos.
La figura 2 muestra un cromatograma para un modo de funcionamiento OEC optimizado. El MAb 3 se uso para este ensayo con una densidad de carga de 180 g/l.
La figura 3 muestra la optimizacion de carga para un modo OEC usando MAb 3.
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La figura 4 muestra un cromatograma con condiciones de carga objetivo para un modo de funcionamiento OEC. Condiciones similares de carga y elucion dan lugar a la cola y, por lo tanto, un aumento del 45 % en el volumen de la piscina. El MAb 3 se uso para este ensayo con una densidad de carga de 180 g/l.
La figura 5 muestra la optimizacion de la elucion para el modo OEC usando MAb3.
La figura 6 muestra el analisis de impurezas en fracciones y el analisis acumulativo de impurezas.
La figura 7 muestra el analisis de avance de MAb 3 CHOP de la resina Capto Adhere en el modo OEC a una densidad de carga de 1000 g/l.
La figura 8 muestra el analisis del rendimiento en practicas a escala piloto en un amplio intervalo de densidades de carga de 70 g/l a 180 g/l.
La figura 9 muestra una comparacion del modo de funcionamiento de la cromatografia de repato debil y el modo de funcionamiento de la cromatografia de sobrecarga y elucion. El producto era MAb3 y el material de cromatografia era una resina Capto Adhere.
La figura 10 muestra el analisis de MAb 3 CHOP en resina QMA bajo el modo de funcionamiento OEC a una densidad de carga de 150 g/l.
La figura 11 muestra el analisis MAb 4 CHOP en resina Capto Adhere en el modo de funcionamiento OEC a una densidad de carga de 150 g/l.
La figura 12 muestra el analisis MAb 4 CHOP en resina Capto MMC en el modo de funcionamiento OEC con una densidad de carga de 150 g/l.
La figura 13 muestra el analisis de avance de MAb 3 CHOP en la resina Capto Adhere en el modo OEC a una densidad de carga de 200 g/l. Se cargo un conjunto de MAb3 proteina A en resina de Capto Adhere a 200 g/l (que esta mas alla de su capacidad de union al producto de 50 g/l). El analisis de avance de CHOP demostro que la CHOP no avanzaba hasta el procesamiento a 200 g/l de MAb.
Descripcion detallada de la invencion
I. Definiciones
El termino «producto» como se describe en el presente documento es la sustancia a purificar por OEC; por ejemplo, un polipeptido.
El termino «polipeptido»» o «proteina se usan indistintamente en el presente documento para referirse a polimeros de aminoacidos de cualquier longitud. El polimero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoacidos modificados, y puede estar interrumpido no por aminoacidos. Los terminos incluyen tambien un polimero de aminoacidos que ha sido modificado naturalmente o por intervencion; por ejemplo, formacion de enlaces disulfuro, glicosilacion, lipidacion, acetilacion, fosforilacion, o cualquier otra manipulacion o modificacion, tal como conjugacion con un componente de marcado. Tambien se incluyen dentro de la definicion, por ejemplo, polipeptidos que contienen uno o mas analogos de un aminoacido (incluyendo, por ejemplo, aminoacidos no naturales, etc.), asi como otras modificaciones conocidas en la tecnica. Los terminos «polipeptido» y «protefna» como se usan aqui, incluyen especificamente anticuerpos.
El polipeptido «purificado" (por ejemplo, anticuerpo o inmunoadhesina) significa que el polipeptido se ha incrementado en pureza, de tal manera que existe en una forma mas pura que en su entorno natural y/o cuando inicialmente se sintetiza y/o se amplifica en condiciones de laboratorio. La pureza es un termino relativo y no significa necesariamente pureza absoluta.
El termino «epitopo marcado» cuando se usa en el presente documento se refiere a un polipeptido quimerico que comprende un polipeptido fusionado con un «polipeptido marcador». El polipeptido marcador tiene suficientes residuos para proporcionar un epitopo contra el que puede hacerse un anticuerpo, pero es suficientemente corto para que no interfiera con la actividad del polipeptido al que esta fusionado. El polipeptido marcador preferentemente tambien es bastante unico de manera que el anticuerpo no reacciona de forma cruzada sustancialmente con otros epitopos. Los polipeptidos marcados adecuados generalmente tienen al menos seis residuos de aminoacidos y usualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos de aminoacidos (preferentemente, entre aproximadamente 10 y 20 residuos de aminoacidos).
«Activo» o «actividad» para los propositos en el presente documento se refiere a la forma o formas de un polipeptido que retienen una actividad biologica y/o inmunologica de un polipeptido nativo o de origen natural, en el que la actividad «biologica» se refiere a una funcion biologica (bien inhibidora o estimuladora) causada por un polipeptido nativo o natural que no sea la capacidad de inducir la produccion de un anticuerpo frente a un epitopo antigenico poseido por un
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polipeptido nativo o de origen natural y una actividad «inmunol6gica» se refiere a la capacidad para inducir la produccion de un anticuerpo contra un epitopo antigenico poseido por un polipeptido nativo o de origen natural.
El termino «antagonista» se usa en el sentido mas amplio e incluye cualquier molecula que bloquea, inhibe o neutraliza parcial o totalmente una actividad biologica de un polipeptido nativo. De una manera similar, el termino «agonista» se usa en el sentido mas amplio e incluye cualquier molecula que imite una actividad biologica de un polipeptido nativo. Las moleculas agonistas o antagonistas adecuadas incluyen especificamente anticuerpos agonistas o antagonistas o fragmentos de anticuerpos, fragmentos o variantes de secuencia de aminoacidos de polipeptidos nativos, etc. Los procedimientos para identificar agonistas o antagonistas de un polipeptido pueden comprender poner en contacto un polipeptido con una molecula de agonista o antagonista candidata y medir un cambio detectable en una o mas actividades biologicas normalmente asociadas con el polipeptido.
«Citotoxicidad dependiente del complemento» o «CDC» se refiere a la capacidad de una molecula para efectuar la lisis de una diana en presencia del complemento. La via de activacion del complemento se inicia por la union del primer componente del sistema del complemento (C1q) a una molecula (por ejemplo, un polipeptido (por ejemplo, un anticuerpo)) complejado con un antigeno afin. Para evaluar la activacion del complemento, se puede realizar un ensayo CDC, por ejemplo, segun se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).
Un polipeptido «que se une a» un antigeno de interes, por ejemplo, una diana polipeptido-antigeno asociada a tumor, es uno que se une al antigeno con suficiente afinidad, tal que el polipeptido es util como un agente diagnostico y/o terapeutico en el direccionamiento de una celula o tejido que expresa el antigeno, y no reacciona significativamente de forma cruzada con otros polipeptidos. En dichos modos de realizacion, el grado de union del polipeptido a un polipeptido "no diana" sera inferior a aproximadamente un 10 % de la union del polipeptido a su polipeptido diana particular, determinado mediante analisis de clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitacion (RIA).
Con respecto a la union de un polipeptido a una molecula diana, el termino «union especifica a» o «se une especificamente a» o «es especifico para» un polipeptido particular o un epitopo en un polipeptido diana particular significa que la union es cuantificablemente diferente de una interaccion no especifica. La union especifica puede medirse, por ejemplo, determinando la union de una molecula en comparacion con la union de una molecula de control, que generalmente es una molecula de estructura similar que no tiene actividad de union. Por ejemplo, la union especifica se puede determinar mediante competicion con una molecula de control que es similar a la diana, por ejemplo, un exceso de diana no marcada. En este caso, la union especifica se indica si la union de la diana marcada a una sonda se inhibe competitivamente con un exceso de diana no marcada.
El termino «anticuerpo» en el presente documento se usa en el sentido mas amplio y abarca especificamente anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, anticuerpos biespecificos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpo, siempre que muestren la actividad biologica deseada. El termino «inmunoglobulina» (Ig) se utiliza intercambiable con el anticuerpo del presente documento.
Los anticuerpos son moleculas de inmunoglobulina de origen natural que tienen estructuras variables, todas basadas en el pliegue de inmunoglobulina. Por ejemplo, los anticuerpos IgG tienen dos cadenas «pesadas» y dos cadenas «ligeras» que estan unidas por puentes disulfuro para formar un anticuerpo funcional. Cada cadena pesada y ligera comprende una region «constante» (C) y una region «variable» (V). Las regiones V determinan la especificidad de union al antigeno del anticuerpo, mientras que las regiones C proporcionan soporte estructural y funcion en interacciones no especificas de antigeno con efectores inmunes. La especificidad de union al antigeno de un anticuerpo o fragmento de union a antigeno de un anticuerpo es la capacidad de un anticuerpo para unirse especificamente a un antigeno particular.
La especificidad de union al antigeno de un anticuerpo se determina por las caracteristicas estructurales de la region V. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente entre los 110 aminoacidos de los dominios variables. En cambio, las regiones V consisten en tramos relativamente invariables denominados regiones estructurales (FR) de 1530 aminoacidos separados por regiones mas cortas de variabilidad extrema denominadas «regiones hipervariables» que tienen cada una 9-12 aminoacidos de longitud. Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro FR, adoptando en gran medida una configuracion de lamina p, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que se conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de lamina p. Las regiones hipervariables de cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por medio de las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formacion del sitio de union a antigeno de los anticuerpos (vease Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no estan implicados directamente en la union de un anticuerpo a un antigeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, como la participacion del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
Cada region V comprende tipicamente tres regiones determinantes de complementariedad («CDR», cada una de las cuales contiene un «bucle hipervariable»), y cuatro regiones estructurales. Un sitio de union de anticuerpo, la unidad estructural minima requerida para unirse con afinidad sustancial a un antigeno deseado particular, por lo tanto, incluira
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tfpicamente las tres CDR, y al menos tres, preferentemente cuatro regiones de armazon entremezcladas entre ellas para mantener y presentar las CDR en el conformacion apropiada. Los anticuerpos clasicos de cuatro cadenas tienen sitios de union al antigeno que estan definidos por los dominios Vh y Vl en cooperacion. Ciertos anticuerpos, tales como anticuerpos de camello y tiburon, carecen de cadenas ligeras y dependen de sitios de union formados unicamente por cadenas pesadas. Pueden prepararse inmunoglobulinas dirigidas de dominio unico en las que los sitios de union se forman por cadenas pesadas o cadenas ligeras solas, en ausencia de cooperacion entre Vh y Vl.
El termino «variable» se refiere al hecho de que ciertas partes de los dominios variables difieren ampliamente en secuencia entre anticuerpos y se usan en la union y especificidad de cada anticuerpo particular para su antigeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de los dominios variables de anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones hipervariables, tanto en la cadena ligera como en los dominios variables de la cadena pesada. Las partes mas altamente conservadas de los dominios variables se llaman las regiones estructurales (FR). Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro FR, adoptando en gran medida una configuracion de lamina p, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que se conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de lamina p. Las regiones hipervariables de cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por medio de las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formacion del sitio de union a antigeno de los anticuerpos (vease Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (l991)). Los dominios constantes no estan implicados directamente en la union de un anticuerpo a un antigeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, como la participacion del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
El termino «region hipervariable», cuando se usa en el presente documento, se refiere a los restos de aminoacido de un anticuerpo que son responsables de la union al antigeno. La region hipervariable comprende generalmente residuos de aminoacidos de una «region determinante de complementariedad» o «CDR» (por ejemplo, alrededor de aproximadamente los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el Vl y alrededor de aproximadamente los residuos 31-35B (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) del Vh (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o los residuos de un «bucle hipervariable» (por ejemplo, los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio Vl y los residuos 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio Vh; Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 -917 (1987)).
Los restos «estructurales» o «FR» son los restos del dominio variable diferentes de los residuos de la region hipervariable, como se define en el presente documento.
Los «fragmentos de anticuerpo» comprenden una parte de un anticuerpo intacto, que comprende preferentemente la region de union al antigeno. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab ', F (ab') 2 y Fv; diacuerpos; diacuerpos tandem (taDb), anticuerpos lineales (por ejemplo, Patente de EEUU n.° 5.641.870, ejemplo 2, Zapata et al., Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 (1995)); anticuerpos de un solo brazo, anticuerpos de dominio variable unico, minicuerpos, moleculas de anticuerpo de cadena sencilla; anticuerpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, incluyendo pero sin limitarse a, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3, (scFV)4-Fc, di-scFv, bi-scFv o (di,tri)-scFv) tandem; y acopladores de celulas T biespecificos (BiTE).
La digestion con papaina de los anticuerpos produce dos fragmentos identicos de union al antigeno, llamados fragmentos «Fab», cada uno con un sitio de union al antigeno unico, y un fragmento «Fc» residual, una designacion que refleja la capacidad de cristalizar facilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de union al antigeno y es todavia capaz de reticular el antigeno.
Un fragmento «Fv» es un fragmento de anticuerpo minimo que contiene un sitio de union a y reconocimiento de antigeno completo. Esta region consiste en un dimero de un dominio de region variable de una cadena pesada y una cadena ligera en estrecha asociacion no covalente. Es en esta configuracion en la que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de union a antigeno en la superficie del dimero Vh-Vl. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de union a antigeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un unico dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres regiones hipervariables especificas para un antigeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antigeno, aunque a menudo con una afinidad menor que el sitio de union completo.
El fragmento Fab contiene tambien el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adicion de unos pocos residuos en el extremo carboxi terminal del dominio CH1 de cadena pesada que incluyen una o mas cisteinas de la region bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designacion en el presente documento para un Fab' en el que el o los residuos de cisteina de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteinas bisagra entre ellos. Tambien se conocen otros acoplamientos quimicos de fragmentos de anticuerpos.
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Las «cadena ligeras» de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie vertebrada se puede asignar a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa (k) and lambda (X), basandose en las secuencias de aminoacidos de sus dominios constantes.
Dependiendo de la secuencia de aminoacidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos se pueden asignar a diferentes clases. Hay cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas se pueden dividir, ademas, en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden con las diferentes clases de anticuerpos se denominan a, 8, e, y y P, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.
Los fragmentos de anticuerpos «Fv monocatenario» o «scFv» comprenden los dominios Vh y Vl del anticuerpo, en los que estos dominios estan presentes en una unica cadena polipeptidica. En algunos modos de realizacion el polipeptido de Fv comprende adicionalmente un conector polipeptidico entre los dominios Vh y Vl, que posibilita que scFv forme la estructura deseada para la union al antigeno. Para una revision de los scFv, vease Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, paginas 269-315 (1994).
El termino «diacuerpos» se refiere a pequenos fragmentos de anticuerpos con dos sitios de union a antigeno, comprendiendo los fragmentos un dominio variable de la cadena pesada (Vh) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (Vl) en la misma cadena polipeptidica (Vh - Vl). Al usar un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se fuerza a que los dominios se emparejen con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de union a antigeno. Los diacuerpos se describen mas en detalle, por ejemplo, en los documentos EP 404.097; WO 93/11161 y en Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)).
El termino «anticuerpo multiespecffico» se utiliza en el sentido mas amplio y cubre especificamente un anticuerpo que tiene especificidad poliepitopica. Dichos anticuerpos multiespecificos incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (Vh y un dominio variable de cadena ligera (Vl), donde la unidad VhVl tiene especificidad poliepitopica, anticuerpos que tienen dos o mas dominios Vl y Vh con cada unidad VhVl que se une a un epitopo diferente, anticuerpos que tienen dos o mas dominios variables unicos con cada dominio variable unico que se une a un epitopo diferente, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpo tales como Fab, Fv, DsFv, scFv, diacuerpos, diacuerpos biespecificos, triacuerpos, anticuerpos trifuncionales, fragmentos de anticuerpos que se han unido covalentemente o no covalentemente. «Especificidad poliepitopica» se refiere a la capacidad de unirse especificamente a dos o mas epitopos diferentes de la misma diana o de diferentes dianas. «Monoespecffico» se refiere a la capacidad de unirse solo a un epitopo. De acuerdo con un modo de realizacion, el anticuerpo multiespecifico es un anticuerpo de IgG1 que se une a cada epitopo con una afinidad de 5 pM a 0,001 pM, de 3 pM a 0,001 pM, de 1 pM a 0,001 pM, de 0,5 pM a 0,001 pM o de 0,1 pM a 0,001 pM.
La expresion «anticuerpos de dominio unico» (sdAb) o «anticuerpos de dominio variable unico (SVD)» se refiere generalmente a anticuerpos en los que un unico dominio variable (Vh o VL) puede conferir union a antigeno. En otras palabras, el dominio variable unico no necesita interactuar con otro dominio variable para reconocer el antigeno diana. Ejemplos de anticuerpos de dominio unico incluyen los derivados de camelidos (lamas y camellos) y peces cartilaginosos (por ejemplo, tiburones nodriza) y los derivados de procedimientos recombinantes de anticuerpos de humanos y de raton (Nature (1989) 341:544-546; Dev Comp Immunol Trends Biochem Sci (2001) 26:230-235, Trends Biotechnol (2003): 21:484-490, WO 2005/035572, WO 03/035694, Febs Lett (1994) 339:285-290; WO 00/29004, WO 02/051870).
El termino «anticuerpo monoclonal” como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la poblacion son identicos y/o se unen al mismo epitopo, a excepcion de posibles variantes que pueden surgir durante la produccion del anticuerpo monoclonal, estando presentes dichas variantes, en general, en cantidades menores. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que tipicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un unico determinante del antigeno. Ademas de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos al no estar contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador «monoclonal» indica el caracter del anticuerpo como obtenido de una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos, y no se debe interpretar como que requiere la produccion del anticuerpo mediante cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con los procedimientos proporcionados en la presente invencion se pueden preparar por el procedimiento de hibridoma descrito inicialmente por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o se pueden preparar por procedimientos de ADN recombinante (vease, p.ej., la patente de EE. UU. n.° 4.816.567). Los «anticuerpos monoclonales” tambien se pueden aislar de colecciones de anticuerpos en fagos usando las tecnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por ejemplo.
Los anticuerpos monoclonales del presente documento incluyen especificamente anticuerpos (inmunoglobulinas) «quimericos» en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es identica u homologa a las secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de
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anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es(son) identica(s) u hom6loga(s) a las secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, asi como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biol6gica deseada (patente de EE. UU. n.° 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851 -6855 (1984)). Los anticuerpos quimericos de interes en el presente documento incluyen anticuerpos «primatizados» que comprenden secuencias de uni6n a antigeno del dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, mono del viejo mundo, tales como babuino, macaco de la India o macado de Java) y secuencias de regiones constantes humanas (patente de EE. UU n.° 5.693.780).
Las formas «humanizadas» de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quimericos que contienen una secuencia minima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una regi6n hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una regi6n hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como rat6n, rata, conejo o primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la regi6n estructural (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes residuos no humanos. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente la totalidad de al menos uno, y tipicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones hipervariables se corresponden con las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana, a excepci6n de la(s) sustituci6n(es) de FR senaladas anteriormente. El anticuerpo humanizado opcionalmente tambien comprendera al menos una parte de una regi6n constante de inmunoglobulina, tipicamente la de una inmunoglobulina humana. Para mas detalles, vease Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
Para los prop6sitos de la presente invenci6n, un «anticuerpo intacto» es uno que comprende dominios variables pesados y ligeros asi como una regi6n Fc. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o variantes de secuencia de aminoacidos de los mismos. Preferentemente, el anticuerpo intacto tiene una o mas funciones efectoras.
Los «anticuerpos nativos» son normalmente glicoproteinas heterotetramericas de aproximadamente 150 000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras identicas (L) y dos cadenas pesadas (H) identicas. Cada cadena ligera esta unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el numero de enlaces disulfuro varia entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tambien tienen puentes disulfuro intracatenarios regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (Vh) seguido por un numero de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (Vl) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera esta alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera esta alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoacidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada.
Un «anticuerpo desnudo» es un anticuerpo (como se define en el presente documento) que no esta conjugado a una molecula heter6loga, tal como un resto citot6xico, polimero o radiomarcador.
En algunos modos de realizaci6n, las «funciones efectoras» del anticuerpo se refieren a las actividades biol6gicas atribuibles a la regi6n Fc (una regi6n Fc de secuencia nativa o una regi6n Fc de variante de secuencia de aminoacidos) de un anticuerpo, o que varian con el isotipo de anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras del anticuerpo incluyen: la uni6n a C1q y la citotoxicidad dependiente del complemento; la uni6n al receptor Fc; la citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCC); la fagocitosis; la regulaci6n a la baja de receptores de superficie celular.
«Citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos» y «ADCC» se refieren a una reacci6n mediada por celulas en la que celulas citot6xicas inespecificas que expresan receptores Fc (FcR) (por ejemplo, celulas citoliticas naturales (NK), neutr6filos y macr6fagos) reconocen el anticuerpo unido en una celula diana y posteriormente provocan la lisis de la celula diana. Las celulas primarias para mediar la ADCC, las celulas NK, expresan Fcy RIII solamente, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresi6n de FcR en celulas hematopoyeticas se resume en la tabla 3 en la pagina 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molecula de interes, se puede realizar un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362 o 5.821.337. Las celulas efectoras utiles para dichos ensayos incluyen celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) y celulas citoliticas naturales (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molecula de interes se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998).
Las «celulas efectoras humanas» son leucocitos que expresan uno o mas FcR y realizan funciones efectoras. En algunos modos de realizaci6n, las celulas expresan al menos FcyRIII y realizan la funci6n efectora de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median en la ADCC incluyen celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC), celulas citoliticas naturales (NK), monocitos, linfocitos T citot6xicos y neutr6filos; siendo preferentes las PBMC y las celulas NK.
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Los terminos «receptor Fc» o «FcR» se usan para describir un receptor que se une a la region Fc de un anticuerpo. En algunos modos de realizacion, el FcR es un FcR humano de secuencia nativa. Ademas, un FcR preferente es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluyendo variantes alelicas y formas empalmadas alternativamente de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un «receptor de activacion») y FcyRIIB (un «receptor de inhibicion»), que tienen secuencias de aminoacidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmaticos de los mismos. El receptor de activacion FcyRIIA contiene un motivo de activacion del inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM) en su dominio citoplasmico. El receptor de inhibicion FcyRIIB contiene un motivo de inhibicion del inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM) en su dominio citoplasmatico (vease Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al, Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et a/., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo los que se identifiquen en el futuro, estan cubiertos por el termino «FcR» del presente documento. El termino tambien incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).
El termino «secuencial» como se usa en el presente documento con respecto a la cromatografia se refiere a que presenta una primera cromatografia seguida por una segunda cromatografia. Pueden incluirse etapas adicionales entre la primera cromatografia y la segunda cromatografia.
El termino «continuo» como se usa en el presente documento con respecto a la cromatografia se refiere a que presenta un primer material de cromatografia y un segundo material de cromatografia directamente conectado o algun otro mecanismo que permita un flujo continuo entre los dos materiales de cromatografia.
«Contaminantes» se refieren a materiales que son diferentes del producto polipeptidico deseado. El contaminante incluye, sin limitacion: materiales de la celula huesped, tales como CHOP; proteina A lixiviada; acido nucleico; una variante, fragmento, agregado o derivado del polipeptido deseado; otro polipeptido; endotoxina; contaminante viral; el componente de medio de cultivo de celulas, etc. En algunos ejemplos, el contaminante puede ser una proteina de celula huesped (HCP), por ejemplo, pero no limitada a, una celula bacteriana tal como una celula de E. coli, una celula de insecto, una celula procariota, una celula eucariota, una celula de levadura, una celula de mamifero, una celula aviar, una celula fungica.
La «capacidad de union dinamica» de un material de cromatografia es la cantidad de producto, por ejemplo, polipeptido, el material se unira en condiciones de flujo real antes de que se produzca una ruptura significativa del producto no unido.
El «coeficiente de reparto», Kp, tal como se utiliza en el presente documento se refiere a la concentracion molar del producto, por ejemplo, polipeptido, en la fase estacionaria dividida por la concentracion molar del producto en la fase movil.
«Densidad de carga» se refiere a la cantidad, por ejemplo, gramos, de composicion puesta en contacto con un volumen de material de cromatografia, por ejemplo, litros En algunos ejemplos, la densidad de carga se expresa en g/l.
La referencia a «aproximadamente» de un valor o parametro en el presente documento incluye (y describe) variaciones que estan dirigidas a ese valor o parametro per se. Por ejemplo, la descripcion que hace referencia a «aproximadamente X» incluye la descripcion de «X».
Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares «un», «una», «el» y «ella» incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Se entiende que los aspectos y variaciones de la invencion descritos en el presente documento incluyen aspectos y variaciones «consistentes» y/o «que consisten esencialmente en».
II Metodos de purificacion
Se proporcionan en el presente documento procedimientos para purificar un producto, tal como un polipeptido, a partir de una composicion que comprende el producto y al menos un contaminante usando cromatografia de sobrecarga y elucion (OEC). OEC proporciona un modo de funcionamiento en el que las ventajas proporcionadas por diferentes modos de cromatografia se realizan en un modo de cromatografia unica. OEC se puede implementar en multiples resinas, a la vez que proporciona una mayor eliminacion de impurezas y ventajas significativas de produccion, como columnas mas pequenas, mejor ajuste de planta y menor costo. El modo de funcionamiento con OEC puede dividirse en tres componentes diferentes.
1. Sobrecarga - La composicion se carga sobre el material de cromatografia tal que el producto, por ejemplo, un polipeptido, se carga sobre el material de cromatografia en una cantidad que excede la capacidad de union dinamica (DBC) del material para el producto. En algunos modos de realizacion, se determinan condiciones de carga, tales como pH y conductividad, donde las impurezas se unen fuertemente al material de cromatografia. En algunos modos de
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realizacion, las condiciones de cromatografia se eligen de tal manera que, incluso si el producto penetra despues de unirse, la mayor parte de las impurezas, si no todas, no lo hacen. En algunos modos de realizacion la composicion se carga en o cerca del DBC del material para uno o mas contaminantes. El modo de sobrecarga permite utilizar el material de cromatografia mas alla del DBC tipico del material para el producto.
2. Agrupacion - La agrupacion del producto, por ejemplo, un polipeptido, en el eluyente comienza en la penetracion del producto. Puesto que las condiciones de carga son tales que las impurezas continuan uniendose durante la fase de penetracion, se puede obtener una reserva de producto limpia en el eluyente durante la fase de carga de la cromatografia.
3. Elucion - Una vez completada la carga de la composicion sobre el material de cromatografia, el producto, por ejemplo, polipeptido, se eluye del material de cromatografia usando condiciones de elucion que se identifican de tal manera que el producto unido se eluye mientras que la mayoria de las impurezas permanecen unidas al material de cromatografia.
En algunos aspectos, OEC incrementa la utilizacion de material de cromatografia significativamente mas alla del DBC del material para el producto, proporcionando asi una ventaja en comparacion con otros procedimientos de cromatografia. Por ejemplo, una utilizacion del material de cromatografia 10 veces mas alta puede dar como resultado un coste significativamente menor.
A diferencia de la cromatografia de union y elucion tradicional en la que la carga del material de cromatografia se optimiza para maximizar la union al producto, por ejemplo, polipeptido, para la resina de cromatografia, con condiciones de carga de OEC, puede optimizarse para maximizar la union de contaminantes al material de cromatografia y no la union del producto al material de cromatografia. En algunos aspectos, la composicion se carga sobre un material de cromatografia en una cantidad que excede la capacidad de union dinamica del material de cromatografia para el producto. En el proceso de carga del material de cromatografia, parte del producto se arrastrara en el lavado y parte del producto permanecera unido al material de cromatografia. Una vez completada la carga, el producto restante unido al material de cromatografia se puede eluir del material de cromatografia. En algunos modos de realizacion de lo anterior, el material de cromatografia es una columna de cromatografia. En algunos modos de realizacion de lo anterior, el material de cromatografia es una membrana cromatografica.
En algunos aspectos de la invencion, se carga una composicion sobre un material de cromatografia a aproximadamente la capacidad de union dinamica del material de cromatografia para uno o mas de los contaminantes en la composicion. En algunos modos de realizacion, se carga una composicion sobre un material de cromatografia en una cantidad que excede la capacidad de union del material de cromatografia para el producto. En algunos modos de realizacion, se carga una composicion sobre un material de cromatografia a aproximadamente la capacidad de union dinamica del material de cromatografia para uno o mas de los contaminantes y se supera la capacidad de union del material de cromatografia para el producto. En algunos modos de realizacion, la composicion se carga sobre el material de cromatografia a 20 veces el DBC del material de cromatografia para el producto. En algunos modos de realizacion, la composicion se carga sobre el material de cromatografia a 100 veces el DBC del material de cromatografia para el producto. En algunos modos de realizacion, la composicion se carga sobre un material de cromatografia a aproximadamente la capacidad de union dinamica del material de cromatografia para todos los contaminantes en la composicion. En algunos modos de realizacion, se carga una composicion sobre un material de cromatografia a aproximadamente la capacidad de union dinamica del material de cromatografia para todos los contaminantes y superando la capacidad de union del material de cromatografia para el producto. En algunos modos de realizacion, se carga una composicion sobre un material de cromatografia a menos de la capacidad de union dinamica del material de cromatografia para todos los contaminantes y superando la capacidad de union del material de cromatografia para el producto. En algunos modos de realizacion de lo anterior, el material de cromatografia esta en una columna de cromatografia. En algunos modos de realizacion, la columna de cromatografia es una columna de cromatografia a escala industrial. En algunos modos de realizacion de lo anterior, el material de cromatografia es una membrana cromatografica.
La capacidad de union dinamica de un material de cromatografia para un producto y para uno o mas contaminantes se puede estimar determinando el coeficiente de reparto (Kp) para el producto o contaminantes en funcion del pH y la concentracion de contraion para un material de cromatografia particular. Por ejemplo, la capacidad de union dinamica de un material de cromatografia, por ejemplo, una resina en modo mixto, se puede determinar para un polipeptido. Las capacidades de union reales de un material de cromatografia para un producto o contaminante en una combinacion especifica de pH y concentracion de contraion se pueden determinar desafiando la union con un exceso del producto y/o contaminante.
En algunos modos de realizacion, la OEC se lleva a cabo cuando el Kp del producto, por ejemplo, polipeptido, es mayor
que aproximadamente 30. En algunos modos de realizacion, la OEC se lleva a cabo cuando el Kp del producto es mayor
que aproximadamente 50. En algunos modos de realizacion, la OEC se lleva a cabo cuando el Kp del producto es mayor
que aproximadamente 75. En algunos modos de realizacion, la OEC se lleva a cabo cuando el Kp del producto es mayor
que aproximadamente 100.
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Las condiciones para OEC de una composicion particular que comprende un producto, tal como un polipeptido, y un contaminante pueden determinarse midiendo el Kp y la capacidad de union dinamica de un material cromatografico particular a diferentes pH y concentracion de contraion. Se puede llevar a cabo un cribado de alto rendimiento para determinar las condiciones de la OEC en las que la union de contaminantes es alta y donde el producto puede eluirse sin eluir la mayor parte, si no todos, los contaminantes. Por ejemplo, la composicion se puede incubar con un material de cromatografia en tampon a varios pH y concentraciones de contraion bajo un sistema de alto rendimiento; por ejemplo, en pocillos de una placa de pocillos multiples. Despues de un periodo de incubacion, el sobrenadante se separa del material de cromatografia y se determina la cantidad de producto o contaminante en el sobrenadante. En algunos modos de realizacion, se usan concentraciones bajas de composicion para determinar Kp. En algunos modos de realizacion, se utilizan altas concentraciones de la composicion para determinar las capacidades de union dinamicas.
Ademas de proporcionar informacion sobre Kp y la capacidad de union dinamica de un material de cromatografia para productos y contaminantes particulares, el cribado de alto rendimiento proporciona una guia para condiciones de carga y elucion en terminos de pH y concentracion de contraion. Por ejemplo, en algunos modos de realizacion, el tampon de carga se selecciona mediante un cribado de alto rendimiento para un pH y concentracion de contraion para maximizar la union del contaminante al material de cromatografia, pero tambien para maximizar la cantidad de producto, por ejemplo, polipeptido, en el eluyente mientras se minimiza la cantidad de contaminante, por ejemplo, proteina de la celula huesped, en el eluyente. En algunos modos de realizacion, la composicion se carga sobre un material de cromatografia a un pH y conductividad determinados mediante cribado de alto rendimiento en el que aproximadamente todos los contaminantes en la composicion se unen al material de cromatografia. En algunos modos de realizacion, el producto se eluye del material de cromatografia a un pH y una conductividad determinados mediante un cribado de alto rendimiento, en el que aproximadamente todo el producto eluye del material de cromatografia y todos los contaminantes permanecen unidos al material de cromatografia.
En algunos modos de realizacion, la invencion proporciona procedimientos para identificar las condiciones operativas (por ejemplo, utilizando tecnicas de cribado de alto rendimiento) que hacen que el material de cromatografia se una a una cantidad maxima de contaminantes con independencia de la cantidad de producto unido por ml de material de cromatografia. La etapa de cribado se utiliza para identificar las condiciones de elucion de tal manera que el producto unido eluye del material de cromatografia y las impurezas permanecen estrechamente unidas al material de cromatografia.
En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el material de cromatografia es un material de modo mixto que comprende grupos funcionales capaces de una o mas de las siguientes funcionalidades: intercambio anionico, intercambio cationico, enlace de hidrogeno e interacciones hidrofobas. En algunos modos de realizacion, el material de modo mixto comprende grupos funcionales capaces de intercambio anionico e interacciones hidrofobas. El material de modo mixto puede contener N-bencil-N-metiletanolamina, 4- mercapto-etil-piridina, hexilamina o fenilpropilamina como ligando o contener polialilamina reticulada. Ejemplos de los materiales de modo mixto incluyen resina Capto Adhere, resina QMA, resina Capto MMC, resina MEP HyperCel, resina HEA HyperCel, resina PPA HyperCel o membrana ChromaSorb o Sartobind STIC. En algunos modos de realizacion, el material de modo mixto es la resina Capto Adhere. En algunos modos de realizacion de lo anterior, el material de modo mixto es una columna de cromatografia de modo mixto. En algunos modos de realizacion de lo anterior, el material de modo mixto es una membrana de modo mixto.
En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria, el material de cromatografia es un material de cromatografia de intercambio ionico; por ejemplo, un material de cromatografia de intercambio anionico o un material de cromatografia de intercambio cationico. En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria, el material de cromatografia es un material de intercambio anionico. En algunos modos de realizacion, el material de cromatografia de intercambio anionico es una fase solida que esta cargada positivamente y tiene aniones libres para el intercambio con aniones en una solucion acuosa pasaba por o a traves de la fase solida. En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria, el material de intercambio anionico puede ser una membrana, un monolito o resina. En un modo de realizacion, el material de intercambio anionico puede ser una resina. En algunos modos de realizacion, el material de intercambio anionico puede comprender una amina primaria, una amina secundaria, una amina terciaria o un grupo funcional de ion amonio cuaternario, un grupo funcional poliamina o un grupo funcional dietilaminoetilo. En algunos modos de realizacion de lo anterior, el material de cromatografia de intercambio anionico es una columna de cromatografia de intercambio anionico. En algunos modos de realizacion de lo anterior, el material de cromatografia de intercambio anionico es una membrana de cromatografia de intercambio anionico.
En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el material de cromatografia es un material de intercambio cationico. En algunos modos de realizacion, el material de intercambio cationico es una fase solida que esta cargada negativamente y tiene cationes libres para el intercambio con cationes en una solucion acuosa que pasa por o a traves de la fase solida. En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el material de intercambio cationico puede ser una membrana, un monolito o resina. En algunos modos de realizacion, el material de intercambio cationico puede ser una resina. El material de intercambio cationico puede comprender un grupo funcional acido carboxilico o un grupo funcional acido sulfonico tal como, pero sin limitarse a, sulfonato, carboxilico, acido carboximetilsulfonico, sulfoisobutilo, sulfoetilo,
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carboxilo, sulfopropilo, sulfonilo, sulfoxietilo u ortofosfato. En algunos modos de realizacion de lo anterior, el material de cromatografia de intercambio cationico es una columna de cromatografia de intercambio cationico. En algunos modos de realizacion de lo anterior, el material de cromatografia de intercambio cationico es una membrana de cromatografia de intercambio cationico. En algunos modos de realizacion de la invencion, el material de cromatografia no es un material de cromatografia de intercambio cationico.
En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el material de intercambio ionico puede utilizar un material de cromatografia convencional o un material de cromatografia convectivo. Los materiales de cromatografia convencionales incluyen, por ejemplo, materiales perfusivos (por ejemplo, resina de poli(estireno-divinilbenceno) y materiales difusivos (por ejemplo, resina de agarosa reticulada). En algunos modos de realizacion, la resina de poli(estireno-divinilbenceno) puede ser resina Poros. En algunos modos de realizacion, la resina de agarosa reticulada puede ser resina sulfopropil-Sepharose Fast Flow («SPSFF»). El material de cromatografia convectiva puede ser un material de membrana (por ejemplo, polietersulfona) o monolitico (por ejemplo, polimero reticulado). La membrana de polietersulfona puede ser Mustang. El material monolitico de polimero reticulado puede ser poli(metacrilato de glicidilo-co-dimetacrilato de etileno) reticulado.
Ejemplos de materiales de intercambio anionico son conocidos en la tecnica e incluyen, pero sin limitacion, Poros HQ 50, Poros PI 50, Poros D, Mustang Q, Q Sepharose FF y DEAE Sepharose.
Ejemplos de materiales de intercambio cationico son conocidos en la tecnica incluyen, pero no se limitan a, Mustang S, Sartobind S, S03 Monolith, S. Ceramic HyperD, Poros XS, Poros HS50, Poros hS20, SPSFF, SP-Sepharose XL (SPXL), CM Sepharose Fast Flow, Capto S, Fractogel Se HiCap, Fractogel S03 o Fractogel COO. En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el material de intercambio cationico es Poros HS50. En algunos modos de realizacion, la resina Poros HS puede ser particulas Poros HS 50 pm o Poros HS 20 pm.
En algunos aspectos de la invencion, el material de cromatografia es un material de cromatografia de interaccion hidrofoba. La cromatografia de interaccion hidrofoba (HIC) es una tecnica de cromatografia liquida que separa las biomoleculas segun la hidrofobicidad. Ejemplos de materiales de cromatografia HIC incluyen, pero no se limitan a, Toyopearl hexil 650, Toyopear butyl 650, Toyopearl phenyl 650, Toyopearl ether 650, Source, Resource, Sepharose Hi- Trap, Octyl sepharose, Phenyl sepharose. En algunos modos de realizacion de lo anterior, el material de cromatografia HIC es una columna de cromatografia HIC. En algunos modos de realizacion de lo anterior, el material de cromatografia HIC es una membrana de cromatografia HIC.
En algunos aspectos de la invencion, el material de cromatografia es un material de cromatografia de hidroxiapatita (HAP). Ejemplos de material de cromatografia de hidroxiapatita incluyen pero estan limitados a HA Ultrogel, y hidroxiapatita CHT. En algunos modos de realizacion de lo anterior, el material de cromatografia HAP es una columna de cromatografia HAP. En algunos modos de realizacion de lo anterior, el material de cromatografia HAP es una membrana de cromatografia HAP.
En algunos aspectos de la invencion, el material de cromatografia es un material de cromatografia de afinidad. Ejemplos de materiales de cromatografia de afinidad incluyen, pero no se limitan a materiales de cromatografia derivatizados con proteina A o proteina G. Ejemplos de material de cromatografia de afinidad incluyen, pero no se limitan a, Prosep-VA, Prosep-VA Ultra Plus, Proteina A sepharose fast flow, Tyopearl Protein A, MAbSelect, MAbSelect SuRe y MAbSelect SuRe LX. En algunos modos de realizacion de lo anterior, el material de cromatografia de afinidad es una columna de cromatografia de afinidad. En algunos modos de realizacion de lo anterior, el material de cromatografia de afinidad es una membrana de cromatografia de afinidad.
La carga de la composicion sobre el material de cromatografia puede optimizarse para la separacion del producto de los contaminantes por OEC. En algunos modos de realizacion, el producto es un polipeptido. En algunos modos de realizacion, la carga sobre la composicion sobre el material de cromatografia se optimiza para la union de los contaminantes al material de cromatografia. Por ejemplo, la composicion puede cargarse sobre el material de cromatografia, por ejemplo, una columna de cromatografia, en un tampon de carga a una pluralidad de pH diferentes mientras que la conductividad del tampon de carga es constante. De forma alternativa, la composicion puede cargarse sobre el material de cromatografia en un tampon de carga en un numero de conductividades diferentes mientras que el pH del tampon de carga es constante. Una vez completada la carga de la composicion sobre el material de cromatografia y la elucion del producto del material de cromatografia en una fraccion de la piscina, la agrupacion, la cantidad de contaminante en la fraccion de la agrupacion proporciona informacion relativa a la separacion del producto de los contaminantes para un pH o conductividad dado. En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la composicion se carga sobre un material de cromatografia a una densidad de carga del polipeptido de mas de aproximadamente cualquiera de 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l, 60 g/l, 100 g/l,
110 g/l, 120 g/l, 130 g/l, 140 g/l, 150 g/l, 160 g/l, 200 g/l, 300 g/l, 400 g/l, 500 g/l, 550 g/l, 600 g/l, 650 g/l, 700 g/l, 800 g/l,
900 g/l, 1000 g/l, 2000 g/l o 5000 g/l del material de cromatografia. En algunos modos de realizacion, la composicion se carga sobre un material de cromatografia a una densidad de carga del polipeptido de aproximadamente cualquiera de aproximadamente cualquiera de 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l, 60 g/l, 70 g/l, 80 g/l, 90 g/l, 100 g/l, 110 g/l, 120 g/l, 130 g/l, 140 g/l,
150 g/l, 160 g/l, 170 g/l, 180 g/l, 200 g/l, 200 g/l, 300 g/l, 400 g/l, 500 g/l, 550 g/l, 600 g/l, 650 g/l, 700 g/l, 800 g/l, 900 g/l,
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1000 g/l o 2000 g/l del material de cromatografia. La composicion puede cargarse en un material de cromatografia a una densidad de carga del polipeptido de entre aproximadamente cualquiera de 30 g/l y 2000 g/l, 30 g/l y 1000 g/l, 30 g/l y 200 g/l, 30 g/l y 180 g/l, 50 g/l y 2000 g/l, 50 g/l y 1000 g/l, 50 g/l y 200 g/l, 50 g/l y 180 g/l, 150 g/l y 1500 g/l, 150 g/l y 1000 g/l, 200 g/l y 1000 g/l, 200 g/l y 1500 g/l, 300 g/l y 1500 g/l, 400 g/l y 1000 g/l, o 500 g/l y 1000 g/l de material de cromatografia.
En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la composicion se carga sobre un material de cromatografia de modo mixto a una densidad de carga del polipeptido de mas de aproximadamente cualquiera de 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l, 60 g/l, 70 g/l, 80 g/l, 90 g/l, 100 g/l, 110 g/l, 120 g/l, 130 g/l, 140 g/l, 150 g/l, 160 g/l, 170 g/l, 180 g/l, 190 g/l, 200 g/l, 300 g/l, 400 g/l, 500 g/l, 550 g/l, 600 g/l, 650 g/l, 700 g/l, 800 g/l, 900 g/l, 1000 g/l, 2000 g/l o 5000 g/l del material de cromatografia de modo mixto. En algunos modos de realizacion, la composicion se carga sobre un material de cromatografia de modo mixto a una densidad de carga del polipeptido de aproximadamente cualquiera de aproximadamente cualquiera de 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l, 60 g/l, 70 g/l, 80 g/l, 90 g/l, 100 g/l, 110 g/l, 120 g/l, 130 g/l, 140 g/l, 150 g/l, 160 g/l, 170 g/l, 180 g/l, 200 g/l, 300 g/l, 400 g/l, 500 g/l, 550 g/l, 600 g/l, 650 g/l, 700 g/l, 800 g/l, 900 g/l, 1000 g/l o 2000 g/l del material cromatografico de modo mixto. La composicion puede cargarse en un material de cromatografia de modo mixto a una densidad de carga del polipeptido de entre aproximadamente cualquiera de 30 g/l y 2000 g/l, 30 g/l y 1000 g/l, 30 g/l y 200 g/l, 30 g/l y 180 g/l, 50 g/l y 2000 g/l, 50 g/l y 1000 g/l, 50 g/l y 200 g/l, 50 g/l y 180 g/l, 150 g/l y 1500 g/l, 150 g/l y 1000 g/l, 200 g/l y 1000 g/l, 200 g/l y 1500 g/l, 300 g/l y 1500 g/l, 400 g/l y 1000 g/l, o 500 g/l y 1000 g/l de material de cromatografia de modo mixto. En algunos modos de realizacion, el polipeptido se carga sobre un material de cromatografia a una densidad de 70 g/l a 180 g/l. En algunos modos de realizacion de la invencion, la cromatografia en modo mixto es una resina Capto Adhere. En algunos modos de realizacion, el polipeptido se carga sobre un material de cromatografia Capto Adhere a una densidad de 70 g/l a 180 g/l. En otros modos de realizacion de las modos de realizacion anteriores, el polipeptido es un anticuerpo de un fragmento del mismo.
En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la composicion se carga sobre un material de cromatografia de intercambio anionico a una densidad de carga del polipeptido de mas de aproximadamente cualquiera de 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l, 60 g/l, 70 g/l, 80 g/l, 90 g/l, 100 g/l, 110 g/l, 120 g/l, 130 g/l, 140 g/l, 150 g/l, 160 g/l, 170 g/l, 180 g/l, 190 g/l, 200 g/l, 300 g/l, 400 g/l, 500 g/l, 550 g/l, 600 g/l, 650 g/l, 700 g/l, 800 g/l, 900 g/l, 1000 g/l, 2000 g/l o 5000 g/l del material de cromatografia de intercambio anionico. En algunos modos de realizacion, la composicion se carga sobre un material de cromatografia de intercambio anionico a una densidad de carga del polipeptido de aproximadamente cualquiera de aproximadamente cualquiera de 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l, 60 g/l, 70 g/l, 80 g/l, 90 g/l, 100 g/l, 110 g/l, 120 g/l, 130 g/l, 140 g/l, 150 g/l, 160 g/l, 170 g/l, 180 g/l, 200 g/l, 300 g/l, 400 g/l, 500 g/l, 550 g/l, 600 g/l, 650 g/l, 700 g/l, 800 g/l, 900 g/l, 1000 g/l o 2000 g/l del material de cromatografia de intercambio anionico. La composicion puede cargarse sobre un material de cromatografia de intercambio anionico a una densidad de carga del polipeptido entre aproximadamente cualquiera de 30 g/l y 2000 g/l, 30 g/l y 1000 g/l, 30 g/l y 200 g/l, 30 g/l y 180 g/l, 50 g/l y 2000 g/l, 50 g/l y 1000 g/l, 50 g/l y 200 g/l, 50 g/l y 180 g/l, 150 g/l y 1500 g/l, 150 g/l y 1000 g/l, 200 g/l y 1000 g/l, 200 g/l y 1500 g/l, 300 g/l y 1500 g/l, 400 g/l y 1000 g/l, o 500 g/l y 1000 g/l del material de cromatografia de intercambio anionico.
En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la composicion se carga sobre un material de cromatografia de intercambio cationico a una densidad de carga del polipeptido de mas de aproximadamente cualquiera de 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l, 60 g/l, 70 g/l, 80 g/l, 90 g/l, 100 g/l, 110 g/l, 120 g/l, 130 g/l, 140 g/l, 150 g/l, 160 g/l, 170 g/l, 180 g/l, 190 g/l, 200 g/l, 300 g/l, 400 g/l, 500 g/l, 550 g/l, 600 g/l, 650 g/l, 700 g/l, 800 g/l, 900 g/l, 1000 g/l, 2000 g/l o 5000 g/l del material de cromatografia de intercambio cationico. En algunos modos de realizacion, la composicion se carga sobre un material de cromatografia de intercambio cationico a una densidad de carga de aproximadamente cualquiera de aproximadamente cualquiera de 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l, 60 g/l, 70 g/l, 130 g/l, 160 g/l, 170 g/l, 100 g/l, 110 g/l, 120 g/l, 130 g/l, 700 g/l, 650 g/l, 700 g/l, 200 g/l, 300 g/l, 400 g/l, 500 g/l, 550 g/l, 800 g/l, 900 g/l, 1000 g/l o 2000 g/l del material de cromatografia de intercambio cationico. La composicion puede cargarse sobre un material de cromatografia de intercambio cationico a una densidad de carga del polipeptido de entre aproximadamente cualquiera de 30 g/l y 2000 g/l, 30 g/l y 1000 g/l, 30 g/l y 200 g/l, 30 g/l y 180 g/l, 50 g/l y 2000 g/l, 50 g/l y 1000 g/l, 50 g/l y 200 g/l, 50 g/l y 180 g/l, 150 g/l y 1500 g/l, 150 g/l y 1000 g/l, 200 g/l y 1000 g/l, 200 g/l y 1500 g/l, 300 g/l y 1500 g/l, 400 g/l y 1000 g/l, o 500 g/l y 1000 g/l del material de cromatografia de intercambio cationico.
Los procedimientos descritos anteriormente pueden comprender ademas la etapa de carga sobre un material de cromatografia de afinidad de Proteina A. En algunos modos de realizacion, el producto polipeptidico es un anticuerpo o fragmento del mismo que se purifica primeramente mediante cromatografia de afinidad de Proteina A antes que por OEC. La etapa de carga sobre un material de cromatografia de afinidad de Proteina A se realiza generalmente, pero no necesariamente, antes de la(s) otra(s) etapa(s) de cromatografia. En algunos modos de realizacion, la etapa de carga sobre un material de cromatografia de afinidad de Proteina A puede combinarse con las etapas secuenciales de intercambio con sobrecarga y cromatografia de elucion. En algunos modos de realizacion, las etapas secuenciales son continuas. En algunos modos de realizacion, la purificacion continua utiliza el mismo caudal, conductividad y/o pH.
La elucion del producto tal como un polipeptido del material de cromatografia en modo OEC puede optimizarse para el rendimiento del producto con contaminantes minimos y con un volumen de agrupacion minimo. Por ejemplo, la
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composicion puede cargarse sobre el material de cromatografia, por ejemplo, una columna de cromatografia, en un tampon de carga. Una vez completada la carga, el producto se eluye con tampones a una pluralidad de pH diferentes mientras que la conductividad del tampon de elucion es constante. De forma alternativa, el producto puede eluirse del material de cromatografia en un tampon de elucion en una pluralidad de conductividades diferentes mientras que el pH del tampon de elucion es constante. Una vez completada la elucion del producto a partir del material de cromatografia, la cantidad de contaminante en la fraccion de la agrupacion proporciona informacion relativa a la separacion del producto de los contaminantes para un pH o conductividad dado. La elucion del producto en un numero elevado de fracciones (por ejemplo, ocho volumenes de columna) indica «cola» del perfil de elucion. En algunos modos de realizacion de la invencion, la reduccion de la elucion se minimiza.
Varios tampones que pueden emplearse dependiendo, por ejemplo, del pH deseado del tampon, de la conductividad deseada del tampon, de las caracteristicas de la proteina de interes y del procedimiento de purificacion. En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria, los procedimientos comprenden el uso de un tampon. El tampon puede ser un tampon de carga, un tampon de equilibrado o un tampon de lavado. En algunos modos de realizacion, uno o mas del tampon de carga, el tampon de equilibrado y/o el tampon de lavado son los mismos. En algunos modos de realizacion, el tampon de carga, el tampon de equilibrado y/o el tampon de lavado son diferentes. En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el tampon comprende una sal. El tampon de carga puede comprender cloruro de sodio, acetato de sodio o una mezcla de los mismos. En algunos modos de realizacion, el tampon de carga es un tampon de cloruro de sodio. En algunos modos de realizacion, el tampon de carga es un tampon de acetato de sodio.
La carga, tal como se usa en el presente documento, es la composicion cargada sobre un material de cromatografia. El tampon de carga es el tampon usado para cargar la composicion que comprende el producto de interes sobre un material de cromatografia. El material de cromatografia se puede equilibrar con un tampon de equilibrado antes de cargar la composicion que se va a purificar. En algunos ejemplos, el tampon de lavado se usa despues de cargar la composicion sobre un material de cromatografia y antes de la elucion del polipeptido de interes de la fase solida. Sin embargo, parte del producto de interes, por ejemplo, un polipeptido, se puede eliminar del material de cromatografia mediante el tampon de lavado (por ejemplo, similar a un modo de flujo continuo).
La elucion, tal como se usa en el presente documento, es la eliminacion del producto, por ejemplo, polipeptido, a partir del material de cromatografia. El tampon de elucion es el tampon usado para eluir el polipeptido u otro producto de interes a partir de un material de cromatografia. En muchos casos, un tampon de elucion tiene una caracteristica fisica diferente que el tampon de carga. Por ejemplo, el tampon de elucion puede tener una conductividad diferente que el tampon de carga o un pH diferente del tampon de carga. En algunos modos de realizacion, el tampon de elucion tiene una conductividad mas baja que el tampon de carga. En algunos modos de realizacion, el tampon de elucion tiene una conductividad mas alta que el tampon de carga. En algunos modos de realizacion, el tampon de elucion tiene un pH menor que el tampon de carga. En algunos modos de realizacion, el tampon de elucion tiene un pH mas alto que el tampon de carga. En algunos modos de realizacion, el tampon de elucion tiene una conductividad diferente y un pH diferente del tampon de carga. El tampon de elucion puede tener cualquier combinacion de conductividad superior o inferior y pH mas alto o mas bajo.
La conductividad se refiere a la capacidad de una solucion acuosa para conducir una corriente electrica entre dos electrodos. En solucion, la corriente fluye por transporte ionico. Por lo tanto, con una cantidad creciente de iones presentes en la solucion acuosa, la solucion tendra una mayor conductividad. La unidad basica de medida para la conductividad es el Siemen (o mho), mho (mS/cm), y se puede medir usando un medidor de conductividad, como varios modelos de medidores de conductividad Orion. Puesto que la conductividad electrolitica es la capacidad de los iones en una solucion para transportar corriente electrica, la conductividad de una solucion se puede ver alterada cambiando la concentracion de iones en ella. Por ejemplo, la concentracion de un agente tamponante y/o la concentracion de una sal (por ejemplo, cloruro de sodio, acetato de sodio o cloruro de potasio) en la solucion pueden alterarse para conseguir la conductividad deseada. Preferentemente, la concentracion de sal de los diversos tampones se modifica para conseguir la conductividad deseada.
En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el tampon de carga tiene una conductividad superior a aproximadamente cualquiera de 4,0 mS/cm, 4,5 mS/cm, 5,0 mS/cm,
5,5 mS/cm, 6,0 mS/cm, 6,5 mS/cm, 7,0 mS/cm, 7,5 mS/cm, 8,0 mS/cm, 8,5 mS/cm, 9,0 mS/cm, 9,5 mS/cm, o 10 mS/cm. La conductividad puede estar entre aproximadamente 4 mS/cm y 17 mS/cm, 4 mS/cm y 10 mS/cm, 4 mS/cm y 7 mS/cm, 5 mS/cm y 17 mS/cm, 5 mS/cm y 10 mS/cm, o 5 mS/cm y 7 mS/cm. En algunos modos de realizacion, la conductividad es de aproximadamente 4 mS/cm, 4,5 mS/cm, 5,0 mS/cm, 5,5 mS/cm, 6,0 mS/cm, 6,5 mS/cm,
7,0 mS/cm, 7,5 mS/cm, 8,0 mS/cm, 8,5 mS/cm, 9,0 mS/cm, 9,5 mS/cm, o 10 mS/cm. En un aspecto, la conductividad es la conductividad del tampon de carga, el tampon de equilibrado y/o el tampon de lavado. En algunos modos de realizacion, la conductividad de uno o mas del tampon de carga, el tampon de equilibrado y el tampon de lavado es la misma. En algunos modos de realizacion, la conductividad del tampon de carga es diferente de la conductividad del tampon de lavado y/o del tampon de equilibrado. En algunos modos de realizacion, la composicion se carga sobre un material de cromatografia de modo mixto en un tampon con una conductividad de aproximadamente 5,5 mS/cm. En algunos modos de realizacion, el polipeptido es un anticuerpo o fragmento del mismo.
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En algunos modos de realizacion, el tampon de elucion tiene una conductividad menor que la conductividad del tampon de carga. En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el tampon de elucion tiene una conductividad inferior a aproximadamente cualquiera de 0,0 mS/cm, 0,5 mS/cm,
1.0 mS/cm, 1,5 mS/cm, 2,0 mS/cm, 2,5 mS/cm, 3,0 mS/cm, 3,5 mS/cm, 4,5 mS/cm, 5,0 mS/cm, 5,5 mS/cm, 6,0 mS/cm,
6.5 mS/cm, o 7,0 mS/cm. La conductividad puede estar entre aproximadamente cualquiera de 0 mS/cm y 7 mS/cm,
I mS/cm y 7 mS/cm, 2 mS/cm y 7 mS/cm, 3 mS/cm y 7 mS/cm, o 4 mS/cm y 7 mS/cm, 0 mS/cm y 5,0 mS/cm, 1 mS/cm y 5 mS/cm, 2 mS/cm y 5 mS/cm, 3 mS/cm y 5 mS/cm, o 4 mS/cm y 5 mS/cm. En algunos modos de realizacion, la conductividad del tampon de elucion es aproximadamente cualquiera de 0,0 mS/cm, 0,5 mS/cm, 1,0 mS/cm, 1,5 mS/cm,
2.0 mS/cm, 2,5 mS/cm, 3,0 mS/cm, 3,5 mS/cm, 4 mS/cm, 4,5 mS/cm, 5,0 mS/cm, 5,5 mS/cm, 6,0 mS/cm, 6,5 mS/cm, o
7.0 mS/cm. En algunos modos de realizacion, los tampones de elucion descritos anteriormente se usan en OEC de modo mixto, OEC de intercambio de aniones, OEC de intercambio de cationes, OEC de afinidad u OEC HIC.
En algunos modos de realizacion, el tampon de elucion tiene una conductividad mayor que la conductividad del tampon de carga. En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el tampon de elucion tiene una conductividad mayor que aproximadamente cualquiera de 5,5 mS/cm, 6,0 mS/cm,
6.5 mS/cm, 7,0 mS/cm, 7,5 mS/cm, 8,0 mS/cm, 8,5 mS/cm, 9 mS/cm, 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, 17,0 mS/cm, 18,0 mS/cm, 19,0 mS/cm, 20,0 mS/cm, 21,0 mS/cm, 22,0 mS/cm,
23.0 mS/cm, 24,0 mS/cm, o 25,0 mS/cm. La conductividad puede estar entre aproximadamente 5,5 mS/cm y 17 mS/cm,
6.0 mS/cm y 17 mS/cm, 7 mS/cm y 17 mS/cm, 8 mS/cm y 17 mS/cm, 9 mS/cm y 17 mS/cm, o 10 mS/cm y 17 mS/cm. En algunos modos de realizacion, la conductividad del tampon de elucion es de aproximadamente cualquiera de
5.5 mS/cm, 6,0 mS/cm, 6,5 mS/cm, 7,0 mS/cm, 7,5 mS/cm, 8,0 mS/cm, 8,5 mS/cm, 9,0 mS/cm, 9 mS/cm, 10 mS/cm,
II mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, o 17,0 mS/cm. En algunos modos de realizacion, los tampones de elucion descritos anteriormente se usan en OEC de modo mixto, OEC de intercambio anionico, OEC de intercambio de cationes, OEC de afinidad, o OEC HIC. En algunos modos de realizacion, el polipeptido se eluye de una cromatografia de modo mixto con una conductividad de aproximadamente 4 a aproximadamente 1 mS/cm. En algunos modos de realizacion, el polipeptido se eluye de una cromatografia Capto Adhere a una conductividad de aproximadamente 4 a aproximadamente 1 mS/cm. En algunos modos de realizacion, se eluye un anticuerpo o fragmento del mismo a partir de una cromatografia Capto Adhere con una conductividad de aproximadamente 4 mS/cm a aproximadamente 1 mS/cm.
En algunos aspectos de cualquiera de las modos de realizacion anteriores, la conductividad del tampon de elucion cambiaba del tampon de carga y/o tampon de lavado por gradiente escalonado o por gradiente lineal.
En algunos modos de realizacion de la invencion, la composicion que comprende un polipeptido se carga sobre el material de cromatografia en un tampon con una conductividad de aproximadamente 5,5 mS/cm y el polipeptido se eluye del material de cromatografia en un tampon de elucion con una conductividad de aproximadamente 4 mS/cm. En algunos modos de realizacion, el tampon de carga tiene una conductividad de aproximadamente 5,5 mS/cm y el tampon de elucion tiene una conductividad de aproximadamente 3 mS/cm. En algunos modos de realizacion, el tampon de carga tiene una conductividad de aproximadamente 5,5 mS/cm y el tampon de elucion tiene una conductividad de aproximadamente 2 mS/cm. En algunos modos de realizacion, el tampon de carga tiene una conductividad de aproximadamente 5,5 mS/cm y el tampon de elucion tiene una conductividad de aproximadamente 1 mS/cm. En modos de realizacion adicionales de los modos de realizacion anteriores, el material de cromatografia es una resina Capto Adhere. En modos de realizacion adicionales de los modos de realizacion anteriores, el polipeptido es un anticuerpo de su fragmento.
En algunos aspectos de cualquiera de los modos de realizacion anteriores, la conductividad del tampon de elucion cambiaba del tampon de carga y/o tampon de lavado por gradiente escalonado o por gradiente lineal. En algunos modos de realizacion, la composicion que comprende un polipeptido se carga en una cromatografia Capto Adhere a aproximadamente 5,5 mS/cm y el polipeptido de interes se eluye de una cromatografia Capto Adhere mediante un gradiente de conductividad lineal de aproximadamente 5,5 mS/cm a aproximadamente 1 mS/cm sobre unos 5 volumenes de columna (VC). En algunos modos de realizacion, la composicion que comprende un polipeptido se carga en una cromatografia Capto Adhere a aproximadamente 5,5 mS/cm y el polipeptido de interes se eluye de una cromatografia Capto Adhere por un gradiente de conductividad lineal de aproximadamente 5,5 mS/cm a aproximadamente 1 mS/cm mas de 10,0 VC. En algunos modos de realizacion, la composicion que comprende un polipeptido se carga en una cromatografia Capto Adhere a aproximadamente 10 mS/cm y el polipeptido de interes se eluye de una cromatografia Capto Adhere mediante un gradiente lineal de conductividad de aproximadamente
10.0 mS/cm a aproximadamente 1 mS/cm sobre aproximadamente 5 VC. En algunos modos de realizacion, la composicion que comprende un polipeptido se carga en una cromatografia Capto Adhere a aproximadamente 10 mS/cm y el polipeptido de interes se eluye de una cromatografia Capto Adhere mediante un gradiente de conductividad lineal de aproximadamente 10,0 mS/cm a 1 mS/cm sobre aproximadamente 10 VC. En algunos modos de realizacion, la composicion que comprende un polipeptido se carga en una cromatografia Capto Adhere a aproximadamente 10 mS/cm y el polipeptido de interes se eluye de una cromatografia Capto Adhere mediante un gradiente de conductividad lineal de aproximadamente 10,0 mS/cm hasta 1 mS/cm sobre unos 15 VC.
En algunos aspectos de cualquiera de los modos de realizacion anteriores, la conductividad del tampon de elucion cambiaba del tampon de carga y/o tampon de lavado por gradiente escalonado o por gradiente lineal. En algunos
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modos de realizacion, la composicion que comprende un polipeptido se carga sobre un material de cromatografia a aproximadamente 5,5 mS/cmy el polipeptido de interes se eluye de un material de cromatografia mediante un gradiente de conductividad lineal entre 5,5 mS/cm a 1 mS/cm sobre 5 Columnas Volumenes, 5,5 mS/cm a 1 mS/cm sobre 10,0 volumenes de columna. En algunos modos de realizacion, la composicion que comprende un polipeptido se carga sobre un material de cromatografia a aproximadamente 10 mS/cm y el polipeptido de interes se eluye de un material de cromatografia mediante un gradiente lineal de conductividad entre 10,0 mS/cm a 1 mS/cm sobre 5 volumenes de columna, de 10,0 mS/cm a 1 mS/cm sobre 10 volumenes de columna, de 10,0 mS/cm a 1 mS/cm sobre 15 volumenes de columna.
En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria, el tampon de carga tiene un pH menor que aproximadamente cualquiera de 10, 9, 8, 7, 6 o 5. En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el tampon de carga tiene un pH mayor que aproximadamente cualquiera de 4, 5, 6, 7, 8, o 9. El tampon de carga puede tener un pH de entre aproximadamente 4 y 9, 4 y 8, 4 y 7, 5 y 9, 5 y 8, 5 y 7, 5 y 6. En algunos modos de realizacion, el pH del tampon de carga es aproximadamente cualquiera de 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 u 8. El pH puede ser el pH del tampon de carga, el tampon de equilibrado o el tampon de lavado. En algunos modos de realizacion, el pH de uno o mas del tampon de carga, el tampon de equilibrado y/o el tampon de lavado es el mismo. En algunos modos de realizacion, el pH del tampon de carga es diferente del pH del tampon de equilibrado y/o del tampon de lavado.
En algunos modos de realizacion, el tampon de elucion tiene un pH menor que el pH del tampon de carga. En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el tampon de elucion tiene un pH menor que aproximadamente cualquiera de 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2. El pH del tampon de elucion puede estar entre aproximadamente 4 y 9, 4 y 8, 4 y 7, 4 y 6, 4 y 5, 5 y 9, 5 y 8, 5 y 7, 5 y 6, 6 y 9, 6 y 8, 6 y 7. En algunos modos de realizacion, el pH del tampon de elucion es aproximadamente cualquiera de 4,0, 4,5, 5,0. 5,5, 6,0, 6,5, 7, 0,7, 5, 8,0, 8,5 o 9,0).
En algunos modos de realizacion, el tampon de elucion tiene un pH mayor que el pH del tampon de carga. En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el tampon de elucion tiene un pH mayor que aproximadamente cualquiera de 5, 6, 7, 8, o 9. El pH del tampon de elucion puede estar entre aproximadamente 4 y 9, 5 y 9, 6 y 9, 7 y 9, 8 y 9, 4 y 8, 5 y 8, 6 y 8, 7 y 8, 4 y 7, 5 y 7, y 6 y 7. En algunos modos de realizacion, el pH del tampon de elucion es aproximadamente cualquiera de 4,0, 4,5, 5,0. 5,5, 6,0, 6,5, 7, 0, 7,5, 8,0, 8,5 o 9,0).
En algunos aspectos de cualquiera de los modos de realizacion anteriores, el pH del tampon de elucion cambiaba del tampon de carga y/o tampon de lavado por gradiente escalonado o por gradiente lineal.
En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria, el caudal es menor que aproximadamente 50 VC/h, 40 Vc/h, o 30 VC/h. El caudal puede estar entre aproximadamente cualquiera de 5 VC/h y 50 VC/h, 10 VC/hora y 40 VC/h, o 18 VC/hora y 36 VC/h. En algunos modos de realizacion, el caudal es de aproximadamente cualquiera de 9 VC/h, 18 VC/h, 25 VC/h, 30 VC/h, 36 VC/h, o 40 VC/h. En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el caudal es menor que aproximadamente cualquiera de 100 cm/h, 75 cm/h, o 50 cm/h. El caudal puede estar entre aproximadamente
cualquiera de 25 cm/h y 150 cm/h, 25 cm/h y 100 cm/h, 50 cm/hy 100 cm/h, o 65 cm/h y 85 cm/h.
La altura del lecho es la altura del material de cromatografia usado. En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la altura del lecho es mayor que aproximadamente cualquiera de 3 cm, 10 cm o 15 cm. La altura del lecho puede estar entre aproximadamente cualquiera de 3 cm y 35 cm, 5 cm y 15 cm, 3 cm y 10 cm, o 5 cm y 8 cm. En algunos modos de realizacion, la altura del lecho es de aproximadamente cualquiera de 3 cm, 5 cm, 10 cm o 15 cm. En algunos modos de realizacion, la altura del lecho se determina en base a la cantidad de polipeptido o contaminantes en la carga.
En algunos modos de realizacion, la cromatografia es en una columna de recipiente con un volumen de mas de aproximadamente 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml, 20 ml, 25 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml,
75 ml, 100 ml, 200 ml, 300 ml, 400 ml, 500 ml, 600 ml, 700 ml, 800 ml, 900 ml, 1 l, 2 l, 3 l, 4 l, 5 l, 6 l, 7 l, 8 l, 9 l, 10 l,
25 l, 50 l, 100 l, 200 l, 300 l, 400 l, 500 l, 600 l, 700 l, 800 l, 900 l o 100 l.
En algunos modos de realizacion de la invencion, las fracciones se recogen de la cromatografia. En algunos modos de realizacion, las fracciones recogidas son mayores de aproximadamente 0,01 VC, 0,02 VC, 0,03 VC, 0,04 VC, 0,05 VC, 0,06 VC, 0,07 VC, 0,08 VC, 0,09 VC, 0,1 VC, 0,2 VC, 0,3 VC, 0,4 VC, 0,5 VC, 0,6 VC, 0,7 VC, 0,8 VC, 0,9 VC, 1,0 VC,
2,0 VC, 3,0 VC, 4,0 VC, 5,0 VC, 6,0 VC, 7,0 Vc, 8,0 VC, 9,0 VC o 10,0 vC. En algunos modos de realizacion se combinan las fracciones que contienen el producto, por ejemplo, polipeptido. En algunos modos de realizacion, las fracciones que contienen el polipeptido de las fracciones de carga y de las fracciones de elucion se combinan. La cantidad de polipeptido en una fraccion puede ser determinada por un experto en la tecnica; por ejemplo, la cantidad de polipeptido en una fraccion se puede determinar por espectroscopia UV. En algunos modos de realizacion, las fracciones que contienen fragmento de polipeptido detectable se combinan.
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En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el al menos un contaminante es uno o mas de los materiales de la celula huesped, tales como CHOP; proteina A lixiviada; acido nucleico; una variante, fragmento, agregado o derivado del polipeptido deseado; otro polipeptido; endotoxina; contaminante viral; el componente de los medios de cultivo celular, la carboxipeptidasa B, la gentamicina, etc. En algunos ejemplos, el contaminante puede ser una proteina de celula huesped (HCP), por ejemplo, pero no limitada a, una celula bacteriana tal como una celula de E. coli, una celula de insecto, una celula procariota, una celula eucariota, una celula de levadura, una celula de mamifero, una celula aviar, una celula fungica.
Las proteinas de celulas huesped (HCP) son proteinas de las celulas en las que se produjo el polipeptido. Por ejemplo, CHOP son proteinas de celulas huesped, es decir, proteinas de ovario de hamster chino. La cantidad de CHOP puede medirse mediante ensayo por inmunoabsorcion ligado a enzimas («ELISA») o Meso Scale Discovery («MSO»). En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la cantidad de HCP (por ejemplo, CHOP) se reduce en mas de aproximadamente cualquiera de un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % %, 90 % o 95 %. La cantidad de HCP puede reducirse entre aproximadamente cualquiera de un 10 % y 99 %, 30 % y 95 %, 30 % y 99 %, 50 % y 95 %, 50 % y 99 %, 75 % y 99 %, o 85 % y 99 %. En algunos modos de realizacion, la cantidad de HCP se reduce en aproximadamente cualquiera de un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 98 %. En algunos modos de realizacion, la reduccion se determina comparando la cantidad de HCP en la composicion recuperada de una etapa o etapas de purificacion a la cantidad de HCP en la composicion antes de la etapa o etapas de purificacion.
El polipeptido agregado puede ser una proteina de alto peso molecular (HMW). En algunos modos de realizacion, el polipeptido agregado es multimero del polipeptido de interes. La proteina HMW puede ser un dimero, hasta 8x monomero, o mayor del polipeptido de interes. Los procedimientos de medicion de la proteina agregada (por ejemplo, proteina HMW) se conocen en la tecnica y se describen en la seccion de ejemplos. En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la cantidad de proteina agregada se reduce en mas de aproximadamente cualquiera de un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %. La cantidad de proteina agregada puede reducirse entre aproximadamente cualquiera de un 10 % y 99 %, 30 % y 95 %, 30 % y 99 %, 50 % y 95 %, 50 % y 99 %, 75 % y 99 %, o 85 % y 99 %. La cantidad de proteina agregada puede reducirse aproximadamente cualquiera de un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %. En algunos modos de realizacion, la reduccion se determina comparando la cantidad de proteina agregada (por ejemplo, proteina HMW) en la composicion recuperada de una etapa o etapas de purificacion a la cantidad de proteina agregada (por ejemplo, proteina HMW) en la composicion antes de la etapa o etapas de purificacion.
El polipeptido fragmento puede ser proteina de bajo peso molecular (LMW). En algunos modos de realizacion, el polipeptido fragmentado es un fragmento del polipeptido de interes. Ejemplos de proteina LMW incluyen, pero no se limitan a, un Fab (union a antigeno fragmento), Fc (fragmento, cristalizable) o combinacion de ambos o cualquier parte aleatoria fragmentada de un anticuerpo de interes. Los procedimientos para medir la proteina fragmentada (por ejemplo, proteina LMW) se conocen en la tecnica y se describen en la seccion de ejemplos. En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la cantidad de proteina LMW se reduce en mas de aproximadamente cualquiera de un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %. La cantidad de proteina LMW puede reducirse entre aproximadamente cualquiera de un 10 % y 99 %, 30 % y 95 %, 30 % y 99 %, 50 % y 95 %, 50 % y 99 %, 75 % y 99 %, o 85 % y 99 %. La cantidad de proteina LMW puede reducirse aproximadamente cualquiera de un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %. En algunos modos de realizacion, la reduccion se determina comparando la cantidad de proteina fragmentada (por ejemplo, proteina LMW) en la composicion recuperada de una etapa o etapas de purificacion a la cantidad de proteina fragmentada (por ejemplo, proteina LMW) en la composicion antes de la etapa o etapas de purificacion.
La Proteina A lixiviada es la Proteina A separada o lavada de una fase solida a la que esta unida. Por ejemplo, la Proteina A lixiviada puede ser lixiviada de la columna de cromatografia de Proteina A. La cantidad de Proteina A se puede medir, por ejemplo, mediante ELISA. En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la cantidad de Proteina A lixiviada se reduce en mas de aproximadamente cualquiera de un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %. La cantidad de Proteina A lixiviada puede reducirse entre aproximadamente cualquiera de un 10 % y 99 %, 30 % y 95 %, 30 % y 99 %, 50 % y 95 %, 50 % y 99 %, 75 % y 99 % o 85 % y 99 %. En algunos modos de realizacion, la cantidad de Proteina A lixiviada se reduce aproximadamente cualquiera de un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %. En algunos modos de realizacion, la reduccion se determina comparando la cantidad de Proteina A lixiviada en la composicion recuperada de una etapa o etapas de purificacion con la cantidad de Proteina A lixiviada en la composicion antes de la etapa o etapas de purificacion.
Los procedimientos de medicion del ADN, tales como el ADN de la celula huesped, se conocen en la tecnica y se describen en la seccion de ejemplos. En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la cantidad de ADN se reduce en mas de aproximadamente cualquiera de un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %. La cantidad de ADN puede reducirse entre aproximadamente cualquiera de un 10 % y 99 %, 30 % y 95 %, 30 % y 99 %, 50 % y 95 %, 50 % y 99 %, 75 % y 99 %, o 85 % y 99 %. La cantidad de ADN puede reducirse aproximadamente cualquiera de un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 %. En algunos modos de realizacion, la reduccion se determina comparando la cantidad de ADN en la composicion
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recuperada de una etapa o etapas de purificacion con la cantidad de ADN en la composicion antes de la etapa o etapas de purificacion.
Componente de medio de cultivo celular se refiere a un componente presente en un medio de cultivo celular. Un medio de cultivo celular puede ser un medio de cultivo celular en el momento de la recoleccion de celulas. En algunos modos de realizacion, el componente de medio de cultivo celular es gentamicina. La cantidad de gentamicina se puede medir mediante ELISA. En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la cantidad de componente de medio de cultivo celular se reduce en mas de aproximadamente cualquiera de un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %. La cantidad de componente de medio de cultivo celular puede reducirse entre aproximadamente cualquiera de un 10 % y 99 %, 30 % y 95 %, 30 % y 99 %, 50 % y 95 %, 50 % y 99 %, 75 % y 99 %, u 85 % y 99 %. En algunos modos de realizacion, la cantidad de componente de medio de cultivo celular se reduce aproximadamente cualquiera de un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 98 % . En algunos modos de realizacion, la reduccion se determina comparando la cantidad de componente de medio de cultivo celular en la composicion recuperada de una etapa o etapas de purificacion con la cantidad de componente de medio de cultivo celular en la composicion antes de la etapa o etapas de purificacion.
En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, los procedimientos pueden comprender ademas una o mas etapas de purificacion ya sea antes o despues de cualquiera de las OEC descritas en el presente documento. Otros procedimientos de purificacion incluyen, por ejemplo, cromatografia de intercambio ionico tal como cromatografia de intercambio anionico y cromatografia de intercambio cationico, cromatografia de afinidad tal como cromatografia de proteina A y cromatografia de proteina G, cromatografia de modo mixto, cromatografia de hidroxilapatita; cromatografia de filtracion en gel; cromatografia de afinidad; electroforesis en gel; dialisis; precipitacion con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografia sobre silice; cromatofocalizacion; SDS- PAGE; precipitacion con sulfato de amonio; y columnas quelantes metalicas para unirse a las formas marcadas con epitopo del polipeptido.
En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, los procedimientos comprenden ademas la recuperacion del polipeptido purificado. En algunos modos de realizacion, el polipeptido purificado se recupera de cualquiera de las etapas de purificacion descritas en el presente documento. La etapa de cromatografia puede ser cromatografia de intercambio cationico, cromatografia en modo mixto o cromatografia de Proteina A. En algunos modos de realizacion, la cromatografia de OEC es una cromatografia de modo mixto y la cromatografia adicional es una cromatografia de intercambio anionico. En algunos modos de realizacion, la cromatografia de OEC es una cromatografia de modo mixto y la cromatografia adicional es una cromatografia de intercambio cationico. En algunos modos de realizacion, la cromatografia de OEC es una cromatografia de modo mixto y la cromatografia adicional es una cromatografia HIC. En algunos modos de realizacion, la cromatografia de OEC es una cromatografia de intercambio anionico y la cromatografia adicional es una cromatografia de intercambio cationico. En algunos modos de realizacion, la cromatografia de OEC es una cromatografia de intercambio anionico y la cromatografia adicional es una cromatografia de modo mixto. En algunos modos de realizacion, la cromatografia de OEC es una cromatografia de intercambio anionico y la cromatografia adicional es una cromatografia HIC. En algunos modos de realizacion, la cromatografia de OEC es una cromatografia de intercambio cationico y la cromatografia adicional es una cromatografia de intercambio anionico. En algunos modos de realizacion, la cromatografia de OEC es una cromatografia de intercambio cationico y la cromatografia adicional es una cromatografia de modo mixto. En algunos modos de realizacion, la cromatografia de OEC es una cromatografia de intercambio cationico y la cromatografia adicional es una cromatografia HIC. En algunos modos de realizacion, la cromatografia de OEC es una cromatografia HIC y la cromatografia adicional es una cromatografia de modo mixto. En algunos modos de realizacion, la cromatografia de OEC es una cromatografia HIC y la cromatografia adicional es una cromatografia de intercambio anionico. En algunos modos de realizacion, la cromatografia de OEC es una cromatografia HIC y la cromatografia adicional es una cromatografia de intercambio cationico.
En algunos modos de realizacion, el polipeptido se purifica adicionalmente despues de OEC por filtracion virica. La filtracion virica es la eliminacion de contaminantes viricos en una corriente de alimentacion de purificacion de polipeptidos. Los ejemplos de filtracion virica incluyen ultrafiltracion y microfiltracion. En algunos modos de realizacion, el polipeptido se purifica utilizando un filtro de parvovirus.
En algunos modos de realizacion, el polipeptido se concentra despues de la cromatografia por el modo OEC. Se conocen ejemplos de procedimientos de concentracion en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, ultrafiltracion y diafiltracion.
En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, los procedimientos comprenden ademas combinar el polipeptido purificado de los procedimientos de purificacion con un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
En algunos modos de realizacion, la invencion proporciona procedimientos para purificar un anticuerpo que comprende a) cargar una composicion que comprende el anticuerpo en una resina Capto Adhere con una densidad de carga de 150-200 g de anticuerpo por litro de resina Capto Adhere en un tampon de carga con un pH de aproximadamente 6,5 y una conductividad de aproximadamente 5,3 mS/cm a aproximadamente 5,6 mS/cm; b) eluir el anticuerpo de la resina
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con un tampon de elucion que comprende 100 mM de acido 2-(N-morfolino) etanosulfonico (MES) 100 mM con un pH de aproximadamente 6,5 y una conductividad de aproximadamente 1 mS/cm; y recoger una agrupacion que comprende el anticuerpo.
En algunos modos de realizacion, la invencion proporciona pocedimientos para purificar un anticuerpo que comprende: a) cargar una composicion que comprende el anticuerpo en una resina Capto Adhere en una columna de 1,6-10,8 l a una densidad de carga de 70-180 g de anticuerpo por litro de resina Capto Adhere en un tampon de carga con un pH de aproximadamente 6,5 y una conductividad de aproximadamente 5,3 mS/cm a aproximadamente 5,6 mS/cm; b) eluir el anticuerpo de la resina con un tampon de elucion que comprende MES 100 mM con un pH de aproximadamente 6,5 y una conductividad de aproximadamente 1 mS/cm; y recoger una agrupacion que comprende el anticuerpo.
En algunos modos de realizacion, la invencion proporciona procedimientos para purificar un anticuerpo que comprende: a) cargar una composicion que comprende el anticuerpo en una resina Capto Adhere con una densidad de carga de aproximadamente 200 g de anticuerpo por litro de resina Capto Adhere en un tampon de carga con un pH de aproximadamente 8,6 y una conductividad de aproximadamente menos de 6 mS/cm; b) eluir el anticuerpo de la resina con un tampon de elucion de MES 20 mM con un pH de aproximadamente 6,5 y una conductividad de aproximadamente 1 mS/cm; y recoger una agrupacion que comprende el anticuerpo.
En algunos modos de realizacion, la invencion proporciona procedimientos para purificar un anticuerpo que comprende: a) cargar una composicion que comprende el anticuerpo en una resina Capto Adhere con una densidad de carga de aproximadamente 200 g de anticuerpo por litro de resina Capto Adhere en un tampon de carga con un pH de aproximadamente 6,1 y una conductividad de aproximadamente menos de 6 mS/cm; b) eluir el anticuerpo de la resina con un tampon de elucion de MES 20 mM con un pH de aproximadamente 6,0 y una conductividad de aproximadamente 0,65 mS/cm; y recoger una agrupacion que comprende el anticuerpo.
En algunos modos de realizacion, la invencion proporciona procedimientos para purificar un anticuerpo que comprende: a) cargar una composicion que comprende el anticuerpo en una resina Capto Adhere con una densidad de carga de aproximadamente 200 g de anticuerpo por litro de resina Capto Adhere en un tampon de carga con un pH de aproximadamente 5,5 y una conductividad de aproximadamente menos de 6 mS/cm; b) eluir el anticuerpo de la resina con un tampon de elucion de MES 20 mM con un pH de aproximadamente 4,9 y una conductividad de
aproximadamente 1,1 mS/cm; y recoger una agrupacion que comprende el anticuerpo.
En algunos modos de realizacion, la invencion proporciona procedimientos para purificar un anticuerpo que comprende: a) cargar una composicion que comprende el anticuerpo en una resina Capto Adhere con una densidad de carga de aproximadamente 200 g de anticuerpo por litro de resina Capto Adhere en un tampon de carga con un pH de aproximadamente 6,5 y una conductividad de aproximadamente menos de 6 mS/cm; b) eluir el anticuerpo de la resina con un tampon de elucion de MES 20 mM con un pH de aproximadamente 6,5 y una conductividad de
aproximadamente 1 mS/cm; y recoger una agrupacion que comprende el anticuerpo.
En algunos modos de realizacion, la invencion proporciona procedimientos para purificar un anticuerpo que comprende: a) cargar una composicion que comprende el anticuerpo sobre una resina QMA con una densidad de carga de aproximadamente 103 g de anticuerpo por litro de resina QMA en un tampon de carga con un pH de aproximadamente
6,5 y una conductividad de aproximadamente menos de 5,5 mS/cm; b) eluir el anticuerpo de la resina con un tampon de elucion de MES 20 mM con un pH de aproximadamente 6,5 y una conductividad de aproximadamente 1 mS/cm; y recoger una agrupacion que comprende el anticuerpo.
En algunos modos de realizacion, la invencion proporciona procedimientos para purificar un anticuerpo que comprende: a) cargar una composicion que comprende el anticuerpo en una resina Poros XS a una densidad de carga de
aproximadamente 200 g de anticuerpo por litro de resina Poros XS en un tampon de carga con un pH de
aproximadamente 5,5 y una conductividad de aproximadamente menos de 6 mS/cm; b) eluir el anticuerpo de la resina con un tampon de elucion de acetato 50-350 mM con un pH de aproximadamente 5,5; y recoger una piscina que comprende el anticuerpo.
En algunos modos de realizacion, la invencion proporciona procedimientos para purificar un anticuerpo que comprende a) cargar una composicion que comprende el anticuerpo en una resina Capto MMC a una densidad de carga de aproximadamente 147 g de anticuerpo por litro de resina Capto MMC en un tampon de carga con un pH de aproximadamente 7,0 y una conductividad de aproximadamente menos de 6 mS/cm; b) eluir el anticuerpo de la resina con un tampon de elucion de MES 20 mM con un pH de aproximadamente 6,5 y una conductividad de aproximadamente 1 mS/cm; y recoger una piscina que comprende el anticuerpo.
III Polipeptidos
Se proporcionan polipeptidos para su uso en cualquiera de los procedimientos de purificacion de polipeptidos y formulaciones que comprenden los polipeptidos purificados por los procedimientos descritos en el presente documento.
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En algunos modos de realizacion, la invencion proporciona procedimientos para purificar un polipeptido usando cromatografia de sobrecarga y elucion. En algunos modos de realizacion, el anticuerpo es un polipeptido terapeutico. En algunos modos de realizacion, el polipeptido es un antagonista. En algunos modos de realizacion, el polipeptido es un agonista. En algunos modos de realizacion, el polipeptido es un anticuerpo. En algunos modos de realizacion, el polipeptido es un epitopo marcado. En algunos modos de realizacion, el polipeptido retiene una actividad biologica y/o inmunologica. En algunos modos de realizacion, el polipeptido es un antagonista. En algunos modos de realizacion, el polipeptido inicia la citotoxicidad dependiente del complemento. En algunos modos de realizacion, el polipeptido es un anticuerpo o inmunoadhesina. En modos de realizacion adicionales de los modos de realizacion anteriores, el polipeptido es purificado por OEC usando un medio de cromatografia de modo mixto. En modos de realizacion

adicionales de los modos de realizacion anteriores, el polipeptido es purificado por OEC usando un medio de
cromatografia de intercambio anionico. En modos de realizacion adicionales de los modos de realizacion anteriores, el polipeptido es purificado por OEC usando un medio de cromatografia de intercambio cationico. En modos de realizacion adicionales de los modos de realizacion anteriores, el polipeptido es purificado por OEC usando un medio de

cromatografia HIC. En modos de realizacion adicionales de las modos de realizacion anteriores, el polipeptido es

purificado por OEC usando un medio de cromatografia HAP. En modos de realizacion adicionales de las modos de
realizacion anteriores, el polipeptido es purificado por OEC usando un medio de cromatografia de afinidad. En modos de realizacion adicionales de los modos de realizacion anteriores, el polipeptido es purificado por OEC usando un medio de cromatografia que no es, o no incluye, una cromatografia de intercambio cationico.
En algunos modos de realizacion, el polipeptido tiene un peso molecular superior a aproximadamente cualquiera de 5000 Daltons, 10 000 Daltons, 15 000 Daltons, 25 000 Daltons, 50 000 Daltons, 75 000 Daltons, 100 000 Dalton, 125 000 Daltons o 150 000 Daltons. El polipeptido puede tener un peso molecular entre aproximadamente cualquiera de 50. 000 Daltons a 200 000 Daltons o 100 000 Daltons a 200 000 Daltons. Alternativamente, el polipeptido para uso en esta invencion puede tener un peso molecular de aproximadamente 120 000 Daltons o aproximadamente 25 000 Daltons.
pl es el punto isoelectrico y es el pH al cual una molecula o superficie particular no porta carga electrica neta. En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria, el pl del polipeptido puede estar entre aproximadamente cualquiera de 6 a 10, 7 a 9 u 8 a 9. En algunos modos de realizacion, el polipeptido tiene un pl de aproximadamente cualquiera de 6, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 o 10.
Los polipeptidos a purificar usando los procedimientos descritos en el presente documento se producen generalmente usando tecnicas recombinantes. Los procedimientos para producir proteinas recombinantes se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos n.° 5.534.615 y 4.816.567, especificamente incorporadas en el presente documento a modo de referencia. En algunos modos de realizacion, la proteina de interes se produce en una celula CHO (vease, por ejemplo, el documento WO 94/11026). Cuando se utilizan tecnicas recombinantes, el anticuerpo se puede producir intracelularmente, o directamente secretado al medio.
Los polipeptidos pueden recuperarse del medio de cultivo o de lisadosde celulas huesped. Las celulas empleadas en la expresion de los polipeptidos pueden ser interrumpidas por diversos medios fisicos o quimicos, tales como ciclos de congelacion-descongelacion, ultrasonidos, interrupcion mecanica o agentes de lisis celular. Si el polipeptido se produce intracelularmente, como un primer paso, los restos de particulas, bien celulas huesped o fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, mediante centrifugacion o ultrafiltracion. Carter et al ., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar polipeptidos que son secretados al espacio periplasmico de E. coli. En pocas palabras, la pasta celular se descongela en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los residuos celulares se pueden eliminar por centrifugacion. Cuando el polipeptido se secreta al medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresion generalmente se concentran primero usando un filtro de concentracion de polipeptido disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltracion Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF se puede incluir en cualquiera de los pasos anteriores para inhibir la proteolisis y se pueden incluir antibioticos para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios.
Ejemplos de polipeptidos que pueden purificarse mediante los procedimientos de la invencion incluyen pero no se limitan a inmunoglobulinas, inmunoadhesinas, anticuerpos, enzimas, hormonas, proteinas de fusion, proteinas que contienen Fc, inmunoconjugados, citocinas e interleucinas. Ejemplos de polipeptidos incluyen, pero no se limitan a, proteinas de mamifero, tales como, por ejemplo, renina; una hormona; una hormona de crecimiento, incluyendo la hormona de crecimiento humana y la hormona de crecimiento bovina; factor de liberacion de la hormona del crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante de la tiroides; lipoproteinas; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona estimuladora folicular; calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; factores de coagulacion tales como factor VIIIC, factor IX, factor tisular y factor de von Willebrands; factores anti- coagulacion tales como proteina C; factor natriuretico atrial; tensioactivo pulmonar; un activador de plasminogeno, tal como uroquinasa u orina humana o activador de plasminogeno de tipo tisular (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hemopoyetico; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (regulada tras activacion, expresada y secretada por celulas T normales); proteina inflamatoria de macrofagos humanos (MIP-1-alfa); una albumina de suero tal como albumina de suero humano; sustancia inhibidora de Muellerian; cadena A de la relaxina; cadena B de relaxina; prorelaxina; peptido asociado a gonadotropina de raton; una enzima; una proteina microbiana, tal
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como beta-lactamasa; DNasa; IgE; un antigeno citotoxico asociado a linfocitos T (CTLA), tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; proteina A o D; factores reumatoides; un factor neurotrofico tal como el factor neurotrofico derivado del hueso (BDNF), la neurotrofina-3, -4, -5, o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6) o un factor crecimiento nervioso tal como NGF-b; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidermico (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-p 1, TGF-p 2, TGF-p 3, TGF-p 4, o TGF-p 5; factor de crecimiento similar a la insulina-I y -II (IGF-I e IGF-II); des(1- 3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteinas de union al factor de crecimiento similar a la insulina (IGFBP); una citocina; proteinas CD tales como CD3, CD4, CD8, CD19 y CD20; eritropoyetina; factores osteoinductivos; inmunotoxinas; un polipeptido de fusion, es decir, un polipeptido compuesto por dos o mas polipeptidos heterologos o fragmentos de los mismos y codificado por un acido nucleico recombinante; un polipeptido que contiene Fc, por ejemplo, una proteina de fusion que comprende una region Fc de inmunoglobulina, o fragmento del mismo, fusionada a un segundo polipeptido; un inmunoconjugado; una proteina morfogenetica osea (BMP); un interferon tal como interferon alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (ILs), por ejemplo, IL-1 a IL-10; superoxido dismutasa; receptores de celulas T; proteinas de membrana de superficie; factor de aceleracion de la descomposicion; antigeno viral tal como, por ejemplo, una porcion de la envoltura de SIDA; proteinas de transporte; receptores homing; adresinas; proteinas reguladoras; integrinas tales como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA- 4 y VCAM; un antigeno asociado a un tumor tal como CA125 (antigeno de cancer de ovario) o receptor HER2, HER3 o HER4; inmunoadhesinas; y fragmentos y/o variantes de cualquiera de las proteinas mencionadas anteriormente, asi como anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpo, union a una proteina, incluyendo, por ejemplo, cualquiera de las proteinas mencionadas anteriormente.
(A) Anticuerpos
En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el polipeptido para uso en cualquiera de los procedimientos de purificacion de polipeptidos y formulaciones que comprenden los polipeptidos purificados por los procedimientos descritos en el presente documento es un anticuerpo.
Los dianas moleculares para anticuerpos incluyen las proteinas CD y sus ligandos, tales como, pero sin limitarse a: (I) CD3, CD4, CD8, CD19, CD11a, CD20, CD22, CD34, CD40, CD79 a (CD79a) y CD79 p (CD79b); (Ii) miembros de la familia de receptores ErbB tales como el receptor EGF, receptor HER2, HER3 o HER4; (iii) moleculas de adhesion celular tales como LFA-1, Macl, p150, 95, VLA-4, ICAM-1, VCAM y a v/p3, incluyendo sus subunidades alfa o beta (por ejemplo, anticuerpos anti-CD11a, anti-CD18 o anti-CD11b); (iv) factores de crecimiento tales como VEGF; IgE; antigenos de grupos sanguineos; receptor flk2/flt3; receptor de obesidad (OB); receptor mpl; CTLA-4; proteina C, BR3, c-met, factor tisular, p 7 etc.; y (v) la superficie celular y los antigenos asociados a tumores transmembrana (TAA), tales como los descritos en la Patente de EE. UU. n.° 7.521.541.
Otros anticuerpos ejemplo incluyen los seleccionados entre, y sin limitacion, el anticuerpo anti-receptor de estrogeno, anticuerpo anti-receptor de progesterona, anticuerpo anti-p53, el anticuerpo anti-HER-2/neu, anticuerpo anti-EGFR, el anticuerpo anti-catepsina D, antIcuerpo anti-Bcl-2, anticuerpo anti-E-cadherina, anticuerpo anti-CA125, anticuerpo anti- CA15-3, anticuerpo anti-CA19-9, anticuerpo anti-c-erbB-2, anticuerpo anti-P-glicoproteina, anticuerpo anti-CEA, anticuerpo anti-proteina reitnoblastoma, anticuerpo anti-oncoproteina ras, anticuerpo anti-Lewis X, anticuerpo anti-Ki-67, anticuerpo anti-PCNA, anticuerpo-CD3, anticuerpo anti-CD4, anticuerpo anti-CD5, anticuerpo anti-CD7, anticuerpo anti- CD8, anticuerpo anti-CD9/p24, anticuerpo anti-CDIO, anticuerpo anti-CD11a, anticuerpo anti-CD11c, anticuerpo anti- CD13, anticuerpo anti-CD14, anticuerpo anti-CD15, anticuerpo anti-CD19, anticuerpo anti-CD20, anticuerpo anti-CD22, anticuerpo anti-CD23, anticuerpo anti-CD30, anticuerpo anti-CD31, anticuerpo anti-CD33, anticuerpo anti-CD34, anticuerpo anti-CD35, anticuerpo anti-CD38, anticuerpo anti-CD41, anticuerpo anti-LCA/CD45, anticuerpo anti-CD45RO, anticuerpo anti-CD45RA, el anticuerpo anti-CD39, el anticuerpo anti-CD 100, anticuerpo anti-CD95/ Fas, anticuerpo anti- CD99, anticuerpo anti-CD106, anticuerpo anti-ubiquitina, anticuerpo anti-CD71, anticuerpo anti-c-myc, anticuerpo anti- citoqueratinas, anticuerpo anti-vimentinas, anticuerpo anti-proteinas VPH, anticuerpo anti-cadenas ligeras kappa, anticuerpo anti-cadenas ligeras lambda, anticuerpo anti-melanosomas, anticuerpo anti-antigeno especifico de la prostata, anticuerpo anti-S-100, anticuerpo anti-antigeno tau, anticuerpo anti-fibrina, anticuerpo anti-queratinas y anticuerpo anti-antigeno Tn.
(I) Anticuerpos policlonales
En algunos modos de realizacion, los anticuerpos son anticuerpos policlonales. Los anticuerpos policlonales se incrementan preferentemente en animales mediante multiples inyecciones subcutaneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antigeno relevante y un adyuvante. Puede ser util conjugar el antigeno relevante con un polipeptido que sea inmunogenico en la especie a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, seroalbumina, tiroglobulina bovina o inhibidor de la tripsina de soja usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo ester maleimidobenzoilsulfosuccinimida (conjugacion a traves de restos de cisteina), N-hidroxisuccinimida (a traves de residuos de lisina), glutaraldehido, anhidrido succinico, SOCI2, o R1N=C=NR, donde R y R1 son diferentes grupos alquilo.
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Los animales se inmunizan contra el antigeno, conjugados inmunogenicos o derivados combinando, por ejemplo, 100 pg o 5 pg del polipeptido o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volumenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solucion intradermicamente en multiples sitios. Un mes despues, los animales se refuerzan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de peptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyeccion subcutanea en multiples sitios. Siete a 14 dias mas tarde se sangran los animales y se determina el suero para el titulo de anticuerpos. Los animales se refuerzan hasta que el titulo se estanca. En algunos modos de realizacion, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antigeno, pero se conjuga con un polipeptido diferente y/o a traves de un reactivo de reticulacion diferente. Los conjugados tambien pueden hacerse en cultivo celular recombinante como fusiones polipeptidicas. Tambien se usan de forma adecuada agentes agregantes tales como alumbre para mejorar la respuesta inmune.
(ii) Anticuerpos monoclonales
En algunos modos de realizacion, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se obtienen de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos y/o se unen al mismo epitopo a excepcion de posibles variantes que pueden surgir durante la produccion del anticuerpo monoclonal, estando presentes dichas variantes, en general, en cantidades menores. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el caracter del anticuerpo como que no es una mezcla de anticuerpos discretos o policlonales.
Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden preparar con el procedimiento de hibridoma descrito inicialmente por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o se pueden preparar por procedimientos de ADN recombinante (vease, por ejemplo, la patente de EE. UU- n.° 4.816.567).
En el procedimiento de hibridoma, se inmuniza un raton u otro animal huesped apropiado, tal como un hamster, como se describe en el presente documento para obtener linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se uniran especificamente al polipeptido usado para la inmunizacion. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Los linfocitos se fusionan despues con celulas de mieloma usando un agente de fusion adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una celula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pags. 59-103 (Academic Press, 1986)).
Las celulas de hibridoma asi preparadas se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o mas sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las celulas de mieloma parentales no fusionadas. Por ejemplo, si las celulas de mieloma parental carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluira tipicamente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que impiden el crecimiento de celulas deficientes en HGPRT.
En algunos modos de realizacion, las celulas de mieloma son aquellas que se fusionan eficientemente, mantienen una produccion de alto nivel estable de anticuerpos por las celulas productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Entre estas, en algunos modos de realizacion, las lineas celulares de mieloma son lineas de mieloma murino, tales como las derivadas de tumores de raton MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EE. UU., y SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EE. UU. Se han descrito tambien las lineas celulares de mieloma humano y heteromieloma de raton-humano para la produccion de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, paginas 5163 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).
El medio de cultivo en el que crecen las celulas de hibridoma se ensaya para la produccion de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antigeno. En algunos modos de realizacion, la especificidad de union de anticuerpos monoclonales producidos por celulas de hibridoma se determina por inmunoprecipitacion o por un ensayo de union in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
La afinidad de union del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, estar determinada por el analisis de Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem. 107:220 (1980).
Despues de que se identifican celulas de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilucion limitantes y cultivarse mediante procedimientos estandar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice pags. 59-103 (Academic Press, 1986)). Medios de cultivo adecuados para este proposito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o medio RPMI-1640. Ademas, las celulas de hibridoma pueden crecer in vivo como tumores de ascitis en un animal.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido ascitico o suero mediante procedimientos convencionales de purificacion de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, polipeptido A-Sepharose, cromatografia de hidroxilapatita, electroforesis en gel, dialisis o cromatografia de afinidad.
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El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se puede aislar y secuenciar facilmente aplicando procedimientos convencionales (por ejemplo, empleando sondas de oligonucleotidos que sean capaces de unirse especificamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). En algunos modos de realizacion, las celulas de hibridoma sirven como fuente de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresion, que despues se transfectan en celulas huesped tales como celulas de E. coli, celulas COS de simio, celulas de ovario de hamster chino (CHO) o celulas de mieloma que no producen de otro modo polipeptido de inmunoglobulina, para obtener la sintesis de anticuerpos monoclonales en las celulas huesped recombinantes. Articulos de revision sobre la expresion recombinante en bacterias de ADN que codifican el anticuerpo incluyen Skerra et a/., Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262 (1993) y Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).
En un modo de realizacion adicional, se pueden aislar anticuerpos o fragmentos de anticuerpo a partir de bibliotecas de fagos de anticuerpos generadas usando las tecnicas descritas en McCafferty et a/., Nature 348:552-554 (1990). Clackson et al, Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Las publicaciones posteriores describen la produccion de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) mediante barrido de cadena (Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)), asi como la infeccion combinatoria y recombinacion in vivo como estrategia para construir Bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). Por tanto, estas tecnicas son alternativas viables a las tecnicas tradicionales de hibridoma de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.
El ADN tambien puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia de codificacion por dominios constantes de cadenas pesada y ligera humanas en lugar de las secuencias murinas homologas (Patente de Estados Unidos n.° 4.816.567; Morrison et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81: 6851 (1984)), o uniendose covalentemente a la secuencia que codifica la inmunoglobulina todo o parte de la secuencia de codificacion para un polipeptido no de inmunoglobulina.
Tipicamente, dichos polipeptidos no inmunoglobulinicos son sustituidos por los dominios constantes de un anticuerpo, o son sustituidos por los dominios variables de un sitio de combinacion de antigenos de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimerico que comprende un sitio de combinacion de antigenos que tiene especificidad para un antigeno y otro sitio de combinacion de antigenos que tiene especificidad para un antigeno diferente.
En algunos modos de realizacion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el anticuerpo es IgA, IgD, IgE, IgG o IgM. En algunos modos de realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal IgG.
(iii) Anticuerpos humanizados
En algunos ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos se han descrito en la tecnica. En algunos modos de realizacion, un anticuerpo humanizado tiene uno o mas residuos de aminoacidos introducidos en el a partir de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoacidos no humanos se denominan a menudo residuos de «importacion», que tipicamente se toman de un dominio variable de «importacion». La humanizacion puede realizarse esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones et al, Nature 321: 522-525 (1986), Riechmann et al, Nature 332: 323-327 (1988), Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)), sustituyendo secuencias de la region hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, dichos anticuerpos «humanizados» son anticuerpos quimericos (patente de EE. UU- n.° 4.816.567) en los que sustancialmente se ha sustituido menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la practica, los anticuerpos humanizados son tipicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de la region hipervariable y posiblemente algunos residuos de FR se han sustituido por residuos de sitios analogos en anticuerpos de roedores.
La eleccion de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, a utilizar en la preparacion de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el denominado procedimiento de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se examina frente a la biblioteca completa de secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana mas proxima a la del roedor se acepta entonces como la region estructural humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol 151: 2296 (1993), Chothia et al, J. Mol Biol 196:901 (1987)). Otro procedimiento usa una region estructural particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada. El mismo marco puede usarse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta et al, J. Immunol. 151:2623 (1993)).
Es ademas importante que los anticuerpos se humanicen con retencion de alta afinidad por el antigeno y otras propiedades biologicas favorables. Para conseguir este objetivo, en algunos modos de realizacion de los procedimientos, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de analisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina estan comunmente disponibles y son familiares para los expertos en la tecnica. Estan disponibles programas informaticos que ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspeccion de estas muestras permite el analisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la
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secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el analisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antfgeno. De esta manera, los residuos de FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias de receptor e importacion de manera que se consiga la caractenstica de anticuerpo deseada, tal como una mayor afinidad por el antfgeno o los antfgenos diana. En general, los residuos de la region hipervariable estan directamente y mas sustancialmente implicados en la influencia de la union al antfgeno.
(V) Anticuerpos humanos
En algunos modos de realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo humano. Como una alternativa a la humanizacion, se pueden generar anticuerpos humanos. Los anticuerpos humanos pueden obtenerse tambien en animales transgenicos (por ejemplo, ratones) que, despues de la inmunizacion, son capaces de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de produccion endogena de inmunoglobulina. Por ejemplo, se ha descrito que la delecion homocigotica del gen de la region de union a la cadena pesada del anticuerpo (Jh) en ratones mutantes quimericos y de lfnea germinal da como resultado una inhibicion completa de la produccion de anticuerpos endogenos. La transferencia de la disposicion genetica de la inmunoglobulina a dichos ratones mutantes de lfnea germinal puede traducirse en la produccion de anticuerpos humanos despues de la exposicion al antfgeno. Vease, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993); y Patentes de Estados Unidos n.° 5.591.669; 5.589.369; y 5.545.807.
De forma alternativa, se puede usar la tecnologfa de presentacion en fagos (McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990)) para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta tecnica, los genes del dominio V del anticuerpo se clonan en marco en un gen polipeptido de recubrimiento mayor o menor de un bacteriofago filamentoso, tal como M13 o fd, y se muestran como fragmentos de anticuerpos funcionales en la superficie de la partfcula fagica. Debido a que la partfcula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo tambien dan como resultado la seleccion del gen que codifica el anticuerpo que exhibe dichas propiedades. Por lo tanto, el fago imita algunas de las propiedades de la celula B. La presentacion del fago se puede realizar en una variedad de formatos; para su revision vease, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Se pueden usar varias fuentes de segmentos de gen V para la presentacion de fagos. Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) aislaron una diversidad de anticuerpos anti-oxazolona de una pequena biblioteca combinatoria aleatoria de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Se puede construir un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados y se pueden aislar anticuerpos frente a una diversidad de antfgenos (incluyendo auto-antfgenos) siguiendo esencialmente las tecnicas descritas por Marks et al, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Vease, por ejemplo, las patentes de EE. Uu. n.° 5.565.332 y 5.573.905.
Los anticuerpos humanos tambien pueden generarse por celulas B activadas in vitro (veanse las patentes de los Estados Unidos 5.567.610 y 5.229.275).
(v) Fragmentos de anticuerpo
En algunos modos de realizacion, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. Se han desarrollado varias tecnicas para la produccion de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron mediante digestion proteolftica de anticuerpos intactos (vease, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden ahora ser producidos directamente por celulas huesped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de las bibliotecas de fagos de anticuerpos discutidas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse qufmicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, los fragmentos F(ab')2 se pueden aislar directamente del cultivo de celulas huesped recombinantes. Otras tecnicas para la produccion de fragmentos de anticuerpo seran evidentes para el experto en la materia. En otros modos de realizacion, el anticuerpo de eleccion es un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv).
Vease el documento WO 93/16185; Patente de Estados Unidos n.° 5.571.894; y la Patente de Estados Unidos n.° 5.587.458. El fragmento de anticuerpo puede ser tambien un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la Patente de EE. UU. 5.641.870, por ejemplo. Dichos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecfficos o biespecfficos.
En algunos modos de realizacion, se proporcionan fragmentos de los anticuerpos descritos en el presente documento. En algunos modos de realizacion, el fragmento de anticuerpo es un fragmento de union al antfgeno. En algunos modos de realizacion, el fragmento de union al antfgeno se selecciona del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento Fab ', un fragmento F(ab')2, un scFv, un Fv y un diacuerpo.
(vi) Anticuerpos biespecificos
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En algunos modos de realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo biespecifico. Los anticuerpos biespecificos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades antigenicas para al menos dos epitopos diferentes. Anticuerpos biespecificos ejemplo se puede unir a dos epitopos diferentes. Alternativamente, un brazo de union de anticuerpo biespecifico puede combinarse con un brazo que se une a una molecula disparadora sobre un leucocito tal como una molecula de receptor de celulas T (p.e. CD2 o CD3), o receptores Fc para IgG (FcyR), tal como FcyRI (CD64), Fcyyll (CD32) y FcyRIII (CD 16) para centrar los mecanismos de defensa celular en la celula. Se pueden preparar anticuerpos biespecificos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (p.e. anticuerpos biespecificos F(ab')2).
Los procedimientos para generar anticuerpos biespecificos son conocidos en la tecnica. La produccion tradicional de anticuerpos biespecificos de longitud completa se basa en la coexpresion de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)). Debido al surtido aleatorio de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moleculas de anticuerpo diferentes, de las cuales solo una tiene la estructura biespecifica correcta. La purificacion de la molecula correcta, que se realiza habitualmente mediante etapas de cromatografia de afinidad, es bastante engorrosa y los rendimientos del producto son bajos. Procedimientos similares se describen en el documento WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).
De acuerdo con un enfoque diferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de union deseadas (sitios de combinacion anticuerpo-antigeno) se fusionan con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. En algunos modos de realizacion, la fusion es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. En algunos modos de realizacion, la primera region constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la union a la cadena ligera, presenta en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresion separados y se cotransfectan en un organismo huesped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad en el ajuste de las propartes mutuas de los tres fragmentos polipeptidicos en modos de realizacion cuando relaciones desiguales de las tres cadenas polipeptidicas usadas en la construccion proporcionan los rendimientos optimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codifiacion para dos o para las tres cadenas polipeptidicas en un vector de expresion cuando la expresion de al menos dos cadenas polipeptidicas en propartes iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las propartes no son de particular importancia.
En algunos modos de realizacion de este enfoque, los anticuerpos biespecificos estan compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina hibrida con una primera especificidad de union en un brazo, y un par de cadena pesada- cadena ligera de inmunoglobulina hibrida (proporcionando una segunda especificidad de union) en el otro brazo. Se encontro que esta estructura asimetrica facilita la separacion del compuesto biespecifico deseado de combinaciones indeseadas de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo la mitad de la molecula biespecifica proporciona un modo facil de separacion. Este enfoque se describe en el documento WO 94/04690. Para mas detalles sobre la generacion de anticuerpos biespecificos vease, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986).
De acuerdo con otro enfoque descrito en la Patente de Estados Unidos n.° 5.731.168, la interfaz entre un par de moleculas de anticuerpo puede ser modificada geneticamente para maximizar el porcentaje de heterodimeros que se recuperan del cultivo de celulas recombinantes. En algunos modos de realizacion, la interfaz comprende al menos una parte del dominio Ch3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o mas pequenas cadenas laterales de aminoacidos de la interfaz de la primera molecula de anticuerpo se sustituyen por cadenas laterales mas grandes (por ejemplo, tirosina o triptofano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamano identico o similar a la (s) cadena(s) lateral(es) grande(s) en la interfaz de la segunda molecula de anticuerpo sustituyendo las cadenas laterales de aminoacidos grandes por otras mas pequenas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodimero sobre otros productos finales no deseados tales como homodimeros.
Los anticuerpos biespecificos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, y el otro a biotina. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir las celulas del sistema inmunologico a celulas no deseadas (Patente de Estados Unidos n.° 4.676.980), y para el tratamiento de la infeccion por VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden prepararse usando cualquier procedimiento de reticulacion conveniente. Los agentes de reticulacion adecuados son bien conocidos en la tecnica, y se describen en la Patente de Estados Unidos n.° 4.676.980, junto con una serie de tecnicas de reticulacion.
Tambien se han descrito en la bibliografia tecnicas para generar anticuerpos biespecificos a partir de fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecificos usando un enlace quimico. Brennan et al., Science 229: 81 (1985) describen un procedimiento en el que los anticuerpos intactos se escinden proteoliticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol arsenito de sodio para estabilizar los ditioles vicinales y prevenir la formacion de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab‘ generados se convierten a continuacion en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-NB se reconverte entonces al Fab'-tiol mediante reduccion con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del
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otro derivado de Fab'- NB para formar el anticuerpo biespecifico. Los anticuerpos biespecificos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilizacion selectiva de enzimas.
Tambien se han descrito varias tecnicas para fabricar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecificos directamente del cultivo de celulas recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecificos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al, J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992). Los peptidos de cremallera de leucina de las proteinas Fos y Jun se unieron a las partes Fab‘ de dos anticuerpos diferentes por fusion genica. Los homodimeros de anticuerpo se redujeron en la region de bisagra para formar monomeros y luego se reoxidaron para formar los heterodimeros de anticuerpo. Este procedimiento tambien puede usarse para la produccion de homodimeros de anticuerpos. La tecnologia de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6444 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpos biespecificos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (Vh) conectado a un dominio variable de cadena ligera (Vl) mediante un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios Vh y Vl de un fragmento se ven obligados a acoplarse con los dominios Vh y Vl complementarios de otro fragmento, formando de este modo dos sitios de union al antigeno. Tambien se ha descrito otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpos biespecificos mediante el uso de dimeros de Fv(sFv) de cadena sencilla. Vease Gruber et al, J. Immunol. 152:5368 (1994).
Se contemplan anticuerpos con mas de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos trispecificos. Tutt et al, J. Immunol. 147: 60 (1991).
(Vii) Anticuerpos multivalentes
En algunos modos de realizacion, los anticuerpos son anticuerpos multivalentes. Un anticuerpo multivalente puede internalizarse (y/o catabolizarse) mas rapidamente que un anticuerpo bivalente por una celula que expresa un antigeno al que se unen los anticuerpos. Los anticuerpos proporcionados en el presente documento pueden ser anticuerpos multivalentes (que son distintos de la clase IgM) con tres o mas sitios de union a antigenos (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes), que pueden producirse facilmente por expresion recombinante de acido nucleico que codifica las cadenas polipeptidicas del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerizacion y tres o mas sitios de union al antigeno. El dominio de dimerizacion preferido comprende (o consiste en) una region Fc o una region bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprendera una region Fc y tres o mas sitios de union al antigeno amino-terminal a la region Fc. El anticuerpo multivalente preferido en el presente documento comprende (o consiste en) de tres a aproximadamente ocho, pero preferentemente cuatro, sitios de union al antigeno. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena polipeptidica (y preferentemente dos cadenas polipeptidicas), en donde la cadena o cadenas polipeptidicas comprenden dos o mas dominios variables. Por ejemplo, la o las cadenas polipeptidicas pueden comprender VD1-(X1) n-VD2- (X2) n-Fc, donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fc es una cadena polipeptidica de una region Fc, X1 y X2 representan un aminoacido o polipeptido, y n es 0 o 1. Por ejemplo, la o las cadenas polipeptidicas pueden comprender: cadena VH-CH1-conector flexible-VH-CH1-region Fc; o cadena VH-CH1-VH-CH1-region Fc. El anticuerpo multivalente de la presente invencion comprende preferentemente ademas al menos dos (y preferentemente cuatro) polipeptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente de la presente invencion puede comprender, por ejemplo, de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipeptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipeptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados en el presente documento comprenden un dominio variable de cadena ligera y, opcionalmente, comprenden ademas un dominio CL.
En algunos modos de realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo multiespecifico. Ejemplos de anticuerpos multiespecificos incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (Vh) y un dominio variable de cadena ligera (Vl), donde la unidad VhVl tiene especificidad poliepitopica, anticuerpos que tienen dos o mas dominios Vl y Vh con cada unidad VhVl unida a un epitopo diferente, anticuerpos que tienen dos o mas dominios variables individuales con cada dominio variable unico que se une a un epitopo diferente, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpo tales como Fab, Fv, DsFv, scFv, diacuerpos, diacuerpos biespecificos, triacuerpos, anticuerpos trifuncionales, fragmentos de anticuerpos que se han unido covalentemente o no covalentemente. En algunos modos de realizacion ese anticuerpo tiene especificidad poliepitopica; por ejemplo, la capacidad de unirse especificamente a dos o mas epitopos diferentes de la misma diana o de diferentes dianas. En algunos modos de realizacion, los anticuerpos son monoespecificos; por ejemplo, un anticuerpo que se une solo a un epitopo. De acuerdo con un modo de realizacion, el anticuerpo multiespecifico es un anticuerpo IgG1 que se une a cada epitopo con una afinidad de 5 pM a 0,001 pM, de 3 pM a 0,001 pM, de 1 pM a 0,001 pM, de 0,5 pM a 0,001 pM o de 0,1 pM a 0,001 pM.
(viii) Otras modificaciones de anticuerpos
Puede ser deseable modificar el anticuerpo proporcionado en el presente documento con respecto a la funcion efectora, por ejemplo, para aumentar la citotoxicidad mediada por celulas dependiente de antigeno (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto puede conseguirse introduciendo una o mas sustituciones de aminoacidos en una region Fc del anticuerpo. Alternativamente o adicionalmente, se pueden introducir restos de cisteina en la region Fc, permitiendo de este modo la formacion de enlaces disulfuro entre cadenas en esta region. El
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anticuerpo homodimerico asi generado puede tener capacidad mejorada de internalizacion y/o aumento de la muerte celular mediada por complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Vease Caron et al., J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, B.J., Immunol . 148:2918-2922 (1992). Tambien se pueden preparar anticuerpos homodimericos con actividad antitumoral mejorada utilizando agentes de reticulacion heterobifuncionales como se describe en Wolff et al., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, se puede disenar un anticuerpo que tiene regiones Fc duales y puede por lo tanto tener una capacidad mejorada de lisis mediada por complemento y ADCC. Vease Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219 - 230 (1989).
Para aumentar la semivida ensuero del anticuerpo, se pueden hacer alteraciones de aminoacidos en el anticuerpo como se describe en el documento US 2006/0067930, que se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad.
(B) Variantes y modificaciones de polipeptidos
La modificacion o modificaciones de secuencia de aminoacidos de los polipeptidos, incluyendo anticuerpos, descritos en el presente documento, se pueden usar en los procedimientos de purificacion de polipeptidos (por ejemplo, anticuerpos) descritos en el presente documento.
(i) Polipeptidos Variantes
"Variante de polipeptido" significa un polipeptido, preferentemente un polipeptido activo, como se define en el presente documento que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoacidos con una secuencia nativa de longitud completa del polipeptido, una secuencia polipeptidica que carece del peptido senal, un dominio extracelular de un polipeptido, con o sin el peptido senal. Dichas variantes de polipeptidos incluyen, por ejemplo, polipeptidos en los que uno o mas residuos de aminoacidos se anaden o eliminan en el extremo N o C termianl de la secuencia de aminoacidos nativa de longitud completa. Normalmente, una variante de polipeptido TAT tendra al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoacidos, de forma alternativa al menos aproximadamente cualquiera de un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoacidos con una secuencia polipeptidica de secuencia nativa de longitud completa, una secuencia polipeptidica que carece del peptido senal, un dominio extracelular de un polipeptido, con o sin el peptido senal. Opcionalmente, los polipeptidos variantes no tendran mas de una sustitucion conservativa de aminoacidos en comparacion con la secuencia polipeptidica nativa, alternativamente no mas de aproximadamente cualquiera de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones de aminoacidos conservativos en comparacion con la secuencia polipeptidica nativa.
El polipeptido variante puede estar truncado en el extremo N terminal o en el extremo C terminal, o puede carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se compara con un polipeptido nativo de longitud completa. Ciertos polipeptidos variantes pueden carecer de residuos de aminoacidos que no son esenciales para una actividad biologica deseada. Estos polipeptidos variantes con truncamientos, deleciones e inserciones pueden prepararse por cualquiera de una serie de tecnicas convencionales. Los polipeptidos variantes deseados pueden sintetizarse quimicamente. Otra tecnica adecuada implica aislar y amplificar un fragmento de acido nucleico que codifica un polipeptido variante deseado, por reaccion en cadena de polimerasa (PCR).
Los oligonucleotidos que definen los extremos terminales deseados del fragmento de acido nucleico se emplean en los cebadores 5 'y 3' en la PCR. Preferentemente, los polipeptidos variantes comparten al menos una actividad biologica y/o inmunologica con el polipeptido nativo descrito en el presente documento.
Las inserciones en la secuencia de aminoacidos incluyen fusiones de extremo amino y/o carboxilo terminales que varian en longitud de un resto respecto a polipeptidos que contienen cien o mas restos, asi como inserciones dentro la secuencia de restos de aminoacido individuales o multiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un resto metionilo N terminal o el anticuerpo fusionado con un polipeptido citotoxico. Otras variantes de insercion de la molecula de anticuerpo incluyen la fusion en el extremo N o C terminal del anticuerpo con una enzima o un polipeptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.
Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de union y/u otras propiedades biologicas del polipeptido. Las variantes de secuencia de aminoacidos del polipeptido se preparan introduciendo cambios de nucleotidos apropiados en el acido nucleico del anticuerpo, o mediante sintesis de peptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, supresiones y/o inserciones y/o sustituciones de restos dentro de las secuencias de aminoacidos del polipeptido. Se puede hacer cualquier combinacion de supresion, insercion y sustitucion para llegar a la construccion final, siempre que la construccion final posea las caracteristicas deseadas. Los cambios de aminoacidos tambien pueden alterar los procesos postraduccionales del polipeptido (por ejemplo, anticuerpo), tales como cambiar el numero o posicion de sitios de glucosilacion.
La orientacion para determinar que residuo de aminoacido puede ser insertado, sustituido o suprimido sin afectar negativamente a la actividad deseada se puede encontrar comparando la secuencia del polipeptido con la de moleculas polipeptidicas conocidas homologas y minimizando el numero de cambios de secuencia de aminoacidos realizados en regiones de alta homologia.
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Un procedimiento util para la identificacion de ciertos restos o regiones del polipeptido (por ejemplo, anticuerpo) que son loalizaciones preferidas para la mutagenesis se denomina "mutagenesis por barrido de alanina" como se describe en Cunningham y Wells, Science, 244:1081-1085 (1989). En el presente documento, un resto o grupo de restos diana (por ejemplo, restos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) se identifican y se remplazan por un aminoacido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para afectar la interaccion de los aminoacidos con el antigeno. Aquellas posiciones de aminoacidos que demuestran la sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan entonces introduciendo otras u otras variantes en, o para, los sitios de sustitucion. Por tanto, aunque el sitio para introducir una variacion de secuencia de aminoacidos esta predeterminado, la naturaleza de la mutacion per se no necesita ser predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutacion en un sitio dado, se realiza un escaneo ala o una mutagenesis aleatoria en el codon o region objetivo y se seleccionan las variantes de anticuerpo expresadas para la actividad deseada.
Otro tipo de variante es una variante de sustitucion de aminoacidos. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoacido en la molecula de anticuerpo reemplazado por un residuo diferente. Los sitios de mayor interes para la mutagenesis sustitutiva incluyen las regiones hipervariables, pero tambien se contemplan alteraciones FR. Las sustituciones conservativas se muestran en la tabla 1 bajo el encabezamiento de "sustituciones preferidas". Si tales sustituciones resultan en un cambio en la actividad biologica, entonces se pueden introducir cambios mas sustanciales, denominados "sustituciones ejemplo" en la tabla 1, o como se describe adicionalmente mas adelante con referencia a las clases de aminoacidos, y se examinan los productos.
Tabla 1.
Resto original
Sustituciones ejemplo Sustituciones preferentes
Ala (A)
Val; Leu; Ile Val
Arg (R)
Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N)
Gln; His; Asp, Lys; Arg Gin
Asp (D)
Glu; Asn Glu
Cys (C)
Ser; Ala Ser
Gin (Q)
Asn; Glu Asn
Glu (E)
Asp; Gln Asp
Gly (G)
Ala Ala
His (H)
Asn; Gln; Lys; Arg Arg
lie (I)
Leu; Val; Met; Ala; Phe; norleucina Leu
Leu (L)
Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe He
Lys (K)
Arg; Gin; Asn Arg
Met (M)
Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F)
Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P)
Ala Ala
Ser (S)
Thr Thr
Thr (T)
Val; Ser Ser
Trp (W)
Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y)
Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V)
Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu
Se realizan modificaciones sustanciales en las propiedades biologicas del polipeptido seleccionando sustituciones que difieren significativamente en sua efecto en mantener (a) la estructura del esqueleto polipeptidico en la zona de la sustitucion, por ejemplo, como una conformacion en forma de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molecula en el sitio diana, o (c) la mayor parte de la cadena lateral. Los aminoacidos pueden agruparse segun similitudes en las propiedades de sus cadenas laterales (en AL Lehninger, Biochemistry, segunda edicion, pags. 73-75, Worth Publishers, Nueva York (1975)):
(1) no polar: Al (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) polar sin carga: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gin (Q)
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(3) acido: Asp (D), Glu (E)
(4) basico: Lys (K), Arg (R), His (H)
Alternativamente, los residuos naturales se pueden dividir en grupos basandose en las propiedades comunes de la cadena lateral:
(1) hidrofobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) hidrofilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;
(3) Acidos: Asp, Glu;
(4) Basicos: His, Lys, Arg;
(5) Restos que influyen en la orientacion de la cadena: Gly, Pro;
(6) Aromaticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservativas implicaran el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.
Cualquier residuo de cisteina que no este implicado en mantener la conformacion apropiada del anticuerpo tambien puede estar sustituido, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molecula y evitar la reticulacion aberrante. Por el contrario, se pueden anadir enlaces cisteina al polipeptido para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).
Un tipo de variante de sustitucion implica sustituir uno o mas restos de la region hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado). Generalmente, la o las variantes resultantes seleccionadas para el desarrollo posterior tendran propiedades biologicas mejoradas con respecto al anticuerpo parental del que se generan. Una manera conveniente de generar dichas variantes de sustitucion usa la presentacion en fagos. Brevemente, diversos sitios de la region hiperavariable (por ejemplo, 6-7 sitios) son mutados para generar todas las posibles sustituiones amino en cada sitio. Las variantes de anticuerpo asi generadas se presentan de una manera monovalente a partir de particulas de fagos filamentosos como fusiones al producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada particula. Las variantes presentadas en fagos se criban entonces por su actividad biologica (por ejemplo, afinidad de union) como se describe en el presente documento. Para identificar los sitios candidatos de la region hipervariable para su modificacion, se puede realizar una mutagenesis de barrido de alanina para identificar los restos de la region hipervariable que contribuyen significativamente a la union al antigeno. De forma alternativa, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antigeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y la diana. Dichos restos de contacto y los restos adyacentes son candidatos para la sustitucion de acuerdo con las tecnicas elaboradas en el presente documento. Una vez que se generan dichas variantes, el panel de variantes se somete a cribado como se describe en el presente documento y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o mas ensayos relevantes se pueden seleccionar para un mayor desarrollo.
Otro tipo de variante de aminoacidos del polipeptido altera el patron de glicosilacion original del anticuerpo. El polipeptido puede comprender restos no aminoacidos. Por ejemplo, el polipeptido puede estar glicosilado. Dicha glicosilacion puede ocurrir naturalmente durante la expresion del polipeptido en la celula huesped o en el organismo huesped, o puede ser una modificacion deliberada que surja de la intervencion humana. Por alteracion se entiende suprimir uno o mas restos de hidratos de carbono encontrados en el polipeptido, y/o anadir uno o mas sitios de glicosilacion que no estan presentes en el polipeptido.
La glicosilacion del polipeptido esta tipicamente unida a N o unida a O. Unido a N se refiere a la union del resto de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptidicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoacido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la union enzimatica del resto carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De este modo, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripeptidos en un polipeptido crea un sitio de glicosilacion potencial. La glicosilacion unida a O se refiere a la union de uno de los azucares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoacido, mas comunmente serina o treonina, aunque tambien se puede usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
La adicion de sitios de glicosilacion al polipeptido se realiza convenientemente alterando la secuencia de aminoacidos tal que contiene una o mas de las secuencias tripeptidicas descritas anteriormente (para sitios de glicosilacion unidos a N). La alteracion puede realizarse tambien mediante la adicion o sustitucion de uno o mas residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilacion unidos a O).
La eliminacion de los restos de carbohidratos presentes en el polipeptido puede realizarse quimicamente o enzimaticamente o mediante sustitucion mutacional de codones que codifican restos de aminoacidos que sirven como
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dianas para la glicosilacion. La escision enzimatica de restos de carbohidratos en polipeptidos se puede lograr mediante el uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas.
Otras modificaciones incluyen la desamidacion de restos glutaminilo y asparaginilo a los correspondientes restos glutamilo y aspartilo, respectivamente, hidroxilacion de prolina y lisina, fosforilacion de grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo, metilacion de grupos a-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina, andhistidina, acetilacion de la amina del extremo N terminal y amidacion de cualquier grupo carboxilo del extremo C terminal.
(ii) Polipeptidos quimericos
El polipeptido descrito en el presente documento puede ser modificado de manera que forme moleculas quimericas que comprenden el polipeptido fusionado a otro polipeptido o secuencia de aminoacidos heterologo. En algunos modos de realizacion, una molecula quimerica comprende una fusion del polipeptido con un polipeptido etiqueta que proporciona un epitopo al que un anticuerpo anti-etiqueta puede unirse selectivamente. La etiqueta del epitopo se coloca generalmente en el extremo amino o carboxilo terminal del polipeptido. La presencia de tales formas etiquetadas con epitopo del polipeptido se puede detectar usando un anticuerpo contra el polipeptido etiqueta. Ademas, la provision de la etiqueta de epitopo permite que el polipeptido se purifique facilmente por purificacion por afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se una a la etiqueta de epitopo.
En un modo de realizacion alternativa, la molecula quimerica puede comprender una fusion del polipeptido con una inmunoglobulina o una region particular de una inmunoglobulina. Una forma bivalente de la molecula quimerica se denomina "inmunoadhesina".
Como se usa en el presente documento, el termino "inmunoadhesina" designa moleculas similares a anticuerpos que combinan la especificidad de union de un polipeptido heterologo con las funciones efectoras de dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusion de una secuencia de aminoacidos con la especificidad de union deseada que es distinta del reconocimiento antigenico y sitio de union de un anticuerpo (es decir, es "heterologa"), y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molecula de inmunoadhesina es tipicamente una secuencia de aminoacidos contigua que comprende al menos el sitio de union de un receptor o un ligando. La secuencia del dominio constante de la inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse a partir de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD o IgM.
Las fusiones de Ig incluyen preferentemente la sustitucion de una forma soluble (dominio suprimido o inactivado de la transmembrana) de un polipeptido en lugar de al menos una region variable dentro de una molecula de Ig. En un modo de realizacion particularmente preferida, la fusion de inmunoglobulina incluye la bisagra, CH2 and CH3, o las regiones bisagra, CH1, CH2 y CH3 de una molecula de IgG1.
(iii) Conjugados polipeptidicos
El polipeptido para uso en formulaciones de polipeptidos puede conjugarse con un agente citotoxico tal como un agente quimioterapeutico, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimaticamente activa de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, o fragmentos de los mismos), o un isotopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).
Pueden usarse agentes quimioterapeuticos utiles en la generacion de tales conjugados. Las toxinas enzimaticamente activas y los fragmentos de las mismas que se pueden usar incluyen la cadena A de difteria, fragmentos activos no enlazantes de la toxina de la difteria, la cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de ricina, la cadena A de abrina, la cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteinas de Aleurites fordii, proteinas de diantina, proteinas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Una variedad de radionucleidos estan disponibles para la produccion de polipeptidos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 186Re. Se preparan conjugados del polipeptido y del agente citotoxico usando una variedad de agentes bifuncionales de acoplamiento de proteinas tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoesteres (tales como clorhidrato de adipimidato de dimetilo), esteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (tales como glutaraldehido), compuestos bis-azido (tales como bis-(p- azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de fluor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina se puede preparar segun se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El acido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacetico (MX-DTPA) marcado con carbono-14 es un agente quelante ejemplo para la conjugacion de radionucleotidos al polipeptido.
Los conjugados de un polipeptido y una o mas toxinas de molecula pequena, tales como una caliqueamicina, maitansinoides, un tricoteceno y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina, tambien se contemplan en el presente documento.
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Los maitansinoides son inhibidores mitoticos que actuan inhibiendo la polimerizacion de tubulina. La maitansina se aislo por primera vez del arbusto del Este de Africa Maytenus serrata. Posteriormente, se descubrio que ciertos microbios tambien producen maitansinoides, tales como maitansinol y esteres C-3 de maitansinol. Tambien se contemplan el maytansinol sintetico y sus derivados y analogos. Existen muchos grupos de union conocidos en la tecnica para la preparacion de conjugados polipeptido-maytansinoida, incluyendo, por ejemplo, los descritos en la Patente de EE. UU. n.° 5.208.020. Los grupos de union incluyen grupos disulfuro, grupos tioeter, grupos labiles a acidos, grupos fotolabiles, grupos labiles a peptidasas o grupos labiles a esterasas, tal como se divulgan en las patentes identificadas anteriormente, siendo preferentes los grupos disulfuro y tioeter.
El enlazador se puede unir a la molecula de maitansinoide en varias posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, se puede formar un enlace ester por reaccion con un grupo hidroxilo utilizando tecnicas de acoplamiento convencionales. La reaccion se puede producir en la posicion C-3 que tiene un grupo hidroxilo, en la posicion C-14 modificada con hidroximetilo, en la posicion C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posicion C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En un modo de realizacion preferente, el enlace se forma en la posicion C-3 del maitansinol o un analogo de maitansinol.
Otro conjugado de interes comprende un polipeptido conjugado con una o mas moleculas de caliqueamicina. Los antibioticos de la familia de las caliqueamicinas son capaces de producir roturas de ADN bicatenario a concentraciones sub-picomolares. Para la preparacion de conjugados de la familia de la caliqueamicina, vease, por ejemplo, la Patente de EE. UU. n.° 5.712.374. Los analogos estructurales de la caliqueamicina que pueden usarse incluyen, pero no se
limitan a, 71', 02',
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N-acetil-711, PSAG y 0/ Otro farmaco anti-tumoral que se puede conjugar con el anticuerpo es QFA
que es un antifolato. Tanto la caliqueamicina como QFA tienen sitios intracelulares de accion y no atraviesan facilmente la membrana plasmatica. Por lo tanto, la captacion celular de estos agentes mediante internalizacion mediada por polipeptido (p.e. anticuerpo) mejora enormemente sus efectos citotoxicos.
Otros agentes anti-tumorales que se pueden conjugar con los polipeptidos de la invencion incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocidos colectivamente como complejo LL-E33288 asi como esperamicinas.
En algunos modos de realizacion el polipeptido puede ser un conjugado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolitica (por ejemplo, una ribonucleasa o una ADN endonucleasa tal como una desoxirribonucleasa; ADNsa).
En otra realizacion mas, el polipeptido (por ejemplo, anticuerpo) se puede conjugar con un “receptor” (tal como estreptavidina) para usarse en el marcado de un tumor, en el que el conjugado polipeptido-receptor se administra al individuo, seguido de la eliminacion del conjugado no unido de la circulacion utilizando un agente de aclaramiento y, a continuacion la administracion de un “ligando” (por ejemplo, avidina) que se conjuga con un agente citotoxico (por ejemplo, un radionucleotido).
En algunos modos de realizacion, el polipeptido puede conjugarse con una enzima activadora de profarmacos que convierte un profarmaco (por ejemplo, un agente quimioterapeutico peptidilico) en un farmaco anticanceroso activo. El componente enzimatico del inmunoconjugado incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profarmaco de tal manera que lo encubra en su forma citotoxica mas activa.
Las enzimas que son utiles incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina util para convertir profarmacos que contienen fosfato en farmacos libres; arilsulfatasa util para convertir profarmacos que contienen sulfato en farmacos libres; citosinadesaminasa util para convertir 5-fluorocitosina no toxica en el farmaco anticanceroso, 5-fluorouracilo; proteasas tales como serratiaproteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L), que son utiles para convertir profarmacos que contienen peptidos en farmacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, utiles para convertir profarmacos que contienen sustituyentes D-aminoacidos; enzimas que escinden carbohidratos tales como p -galactosidasa y neuraminidasa utiles para convertir profarmacos glicosilados en farmacos libres; p-lactamasa util para la conversion de farmacos derivatizados con p-lactamas en farmacos libres; y penicilinaamidasas, tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, utiles para convertir farmacos derivatizados en sus nitrogenos aminicos con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en farmacos libres. De forma alternativa, pueden usarse anticuerpos con actividad enzimatica, tambien conocidos en la tecnica como "abzimas", para convertir los profarmacos en farmacos activos libres.
(iv) Otros
Otro tipo de modificacion covalente del polipeptido comprende la union del polipeptido a uno de una variedad de polimeros no proteinicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolimeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. El polipeptido tambien se puede atrapar en microcapsulas preparadas, por ejemplo, por tecnicas de coacervacion o por polimerizacion interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcapsulas de gelatina y microcapsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente), en sistemas de administracion de farmacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanoparticulas y nanocapsulas) o en
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macroemulsiones. Dichas tecnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a edicion, Gennaro, A.R., Ed., (1990).
IV. Obtencion de polipeptidos para su uso en las formulaciones y procedimientos
Los polipeptidos usados en los procedimientos de purificacion descritos en el presente documento se pueden obtener usando procedimientos bien conocidos en la tecnica, incluyendo los procedimientos de recombinacion. Las siguientes secciones proporcionan orientacion sobre estos procedimientos.
(A) Polinucleotidos
"Polinucleotido", o "acido nucleico", como se usa indistintamente en el presente documento, se refieren a polimeros de nucleotidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN.
Los polinucleotidos que codifican polipeptidos pueden obtenerse a partir de cualquier fuente incluyendo, pero sin limitarse a, una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que se cree posee el ARNm del polipeptido y para expresarlo a un nivel detectable. Por consiguiente, los polinucleotidos que codifican el polipeptido se pueden obtener convenientemente a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido humano. El gen que codifica el polipeptido tambien puede obtenerse a partir de una biblioteca genomica o mediante procedimientos sinteticos conocidos (por ejemplo, sintesis automatizada de acido nucleico).
Por ejemplo, el polinucleotido puede codificar una cadena de molecula de inmunoglobulina entera, tal como una cadena ligera o una cadena pesada. Una cadena pesada completa incluye no solo una region variable de cadena pesada(VH) sino tambien una region constante de cadena pesada (Ch), que tipicamente comprendera tres dominios constantes: Ch1 , Ch2 Y Ch3 ; y una region de bisagra. En algunas situaciones, la presencia de una region constante es deseable.
Otros polipeptidos que pueden ser codificados por el polinucleotido incluyen fragmentos de anticuerpo de union a antigenos tales como anticuerpos de dominio unico ("dAbs"), Fv, scFv, Fab‘ y F(ab')2 y "minicuerpos". Los minicuerpos son (tipicamente) fragmentos de anticuerpos bivalentes a partir de los cuales se ha extirpado el dominio Ch1 y Ck o Cl. Debido a que los minicuerpos son mas pequenos que los anticuerpos convencionales, deberian lograr una mejor penetracion de tejido en el uso clinico/diagnostico, pero siendo bivalentes deberian retener mayor afinidad de union que los fragmentos de anticuerpos monovalentes, tales como dAbs. Por consiguiente, a menos que el contexto lo indique de otra manera, el termino "anticuerpo" tal como se usa en la presente invencion abarca no solo moleculas de anticuerpo entero sino tambien fragmentos de anticuerpo de union a antigenos del tipo discutido anteriormente. Preferentemente, cada region estructural presente en el polipeptido codificado comprendera al menos una sustitucion de aminoacidos con respecto al marco aceptor humano correspondiente. Asi, por ejemplo, las regiones estructurales pueden comprender, en total, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, o quince sustituciones de aminoacidos con respecto a las regiones estructurales aceptoras.
Convenientemente, los polinucleotidos descritos en el presente documento pueden aislarse y/o purificarse. En algunos modos de realizacion, los polinucleotidos son polinucleotidos aislados.
El termino «polinucleotido aislado» pretende indicar que la molecula se elimina o se separa de su entorno normal o natural o se ha producido de tal manera que no esta presente en su entorno normal o natural. En algunos modos de realizacion, los polinucleotidos son polinucleotidos purificados. El termino purificado pretende indicar que al menos algunas moleculas o sustancias contaminantes han sido eliminadas.
De manera adecuada, los polinucleotidos estan sustancialmente purificados, de tal manera que los polinucleotidos relevantes constituyen los polinucleotidos dominantes (es decir, mas abundantes) presentes en una composicion.
(B) Expresion de polinucleotidos
La descripcion que sigue se refiere principalmente a la produccion de polipeptidos cultivando celulas transformadas o transfectadas con un vector que contiene polinucleotidos que codifican polipeptidos. Se contempla, por supuesto, que se pueden emplear procedimientos alternativos, que son bien conocidos en la tecnica, para preparar polipeptidos. Por ejemplo, la secuencia de aminoacidos apropiada, o partes de la misma, puede producirse por sintesis directa de peptidos usando tecnicas de fase solida (vease, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis WH Freeman Co., San Francisco, California (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)). Se puede realizar la sintesis de proteinas usando tecnicas manuales o por automatizacion. La sintesis automatizada puede realizarse, por ejemplo, usando un Sintetizador de Peptidos Applied Biosystems (Foster City, California) usando las instrucciones del fabricante. Se pueden sintetizar varias partes del polipeptido quimicamente por separado y combinar usando procedimientos quimicos o enzimaticos para producir el polipeptido deseado.
Los polinucleotidos como se describen en el presente documento se insertan en un vector o vectores de expresion para la produccion de los polipeptidos. El termino "secuencias de control" se refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresion de una secuencia de codificacion unida operativamente en un organismo huesped particular. Las
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secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, promotores (por ejemplo, promotores asociados de forma natural o heterologos), secuencias senal, elementos potenciadores y secuencias de terminacion de la transcripcion.
Un acido nucleico se "une de manera funcional" cuando se dispone en una relacion funcional con otra secuencia de polinucleotidos. Por ejemplo, acidos nucleicos para una presecuencia o secuencia lider secretora esta unido operativamente a acidos nucleicos para un polipeptido si se expresa como una preproteina que participa en la secrecion del polipeptido; un promotor o potenciador esta unido operativamente a una secuencia de codificacion si afecta a la transcripcion de la secuencia; o un sitio de union a ribosoma esta unido operativamente a una secuencia de codificacion si esta posicionado de manera que facilite la traduccion. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de acido nucleico que estan unidas son contiguas y, en el caso de una secuencia lider secretora, que son contiguas y estan en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La union se consigue mediante ligadura a sitios de restriccion convenientes. Si no existen tales sitios, los adaptadores o conectores de oligonucleotidos sinteticos se usan de acuerdo con la practica convencional.
Para anticuerpos, las cadenas ligera y pesada pueden clonarse en el mismo o en diferentes vectores de expresion. Los segmentos de acido nucleico que codifican las cadenas de inmunoglobulina estan unidos operativamente a secuencias de control en el vector o vectores de expresion que aseguran la expresion de polipeptidos de inmunoglobulina.
Los vectores que contienen las secuencias polinucleotidicas (por ejemplo, las secuencias de codificacion de cadenas ligeras pesadas y/o variables y las secuencias de control de expresion opcionales) se pueden transferir a una celula huesped por procedimientos bien conocidos, que varian dependiendo del tipo de huesped celular. Por ejemplo, la transfeccion de cloruro de calcio se usa comunmente para celulas procariotas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio, electroporacion, lipofeccion, biolistica o transfeccion basada en virus se puede usar para otros huespedes celulares. (Vease, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2a edicion, 1989). Otros procedimientos usados para transformar celulas de mamiferos incluyen el uso de polibreno, fusion de protoplastos, liposomas, electroporacion y microinyeccion. Para la produccion de animales transgenicos, los transgenes pueden ser microinyectados en oocitos fertilizados, o pueden ser incorporados en el genoma de celulas madre embrionarias, y los nucleos de tales celulas se transfieren a oocitos enucleados.
(C) Vectores
El termino "vector" incluye vectores de expresion y vectores de transformacion y vectores lanzadera.
El termino "vector de expresion" significa un constructo capaz de expresion in vivo o in vitro .
El termino "vector de transformacion" significa un constructo capaz de ser transferido de una entidad a otra entidad - que puede ser de la especie o puede ser de una especie diferente. Si el constructo es capaz de ser transferido de una especie a otra, tal como de un plasmido de Escherichia coli a una bacteria, tal como del genero Bacillus, entonces el vector de transformacion se denomina a veces "vector lanzadera". Puede incluso ser un constructo capaz de ser transferido de un plasmido de E. coli a un Agrobacterium a una planta.
Los vectores pueden transformarse en una celula huesped adecuada como se describe a continuacion para proporcionar la expresion de un polipeptido. Varios vectores se encuentran disponibles publicamente. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plasmido, cosmido, particula viral o fago. La secuencia de acido nucleico apropiada puede insertarse en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio o sitios de endonucleasa de restriccion apropiados usando tecnicas conocidas en la tecnica. La construccion de vectores adecuados que contienen uno o mas de estos componentes emplea tecnicas de ligadura convencionales que son conocidas por el experto en la tecnica.
Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores de plasmidos, virus o fagos provistos de un origen de replicacion, opcionalmente un promotor para la expresion de dicho polinucleotido y opcionalmente un regulador del promotor. Los vectores pueden contener uno o mas genes marcadores seleccionables que son bien conocidos en la tecnica.
Estos vectores de expresion son tipicamente replicables en los organismos huesped bien como episomas o como parte integral del ADN cromosomico del huesped.
(D) Celulas huesped
La celula huesped puede ser una bacteria, una levadura u otra celula fungica, celula de insecto, una celula de planta, o una celula de mamifero, por ejemplo.
Se puede usar un organismo huesped multicelular transgenico que ha sido manipulado geneticamente para producir un polipeptido. El organismo puede ser, por ejemplo, un organismo transgenico de mamifero (por ejemplo, una linea transgenica de cabra o raton).
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Los procariotas adecuados incluyen, pero no se limitan a, eubacterias, tales como organismos Gramnegativos o Grampositivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como E. coli. Varias cepas de E. coli estan disponibles al publico, tales como cepa MM294 de E. coli K12 (ATCC 31.446); X1776 de E. coli (ATCC 31.537); cepa W3110 de E. coli (ATCC 27.325) y K5 772 (ATCC 53.635). Otras celulas huesped procariotas adecuadas incluyen Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella, asi como Bacillos tales como B. Subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P), Pseudomonas tales como P. aeruginosa y Streptomyces. Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes. La cepa W3110 es un huesped o huesped parental particularmente preferido porque es una cepa huesped comun para fermentaciones de producto de polinucleotido recombinante. Preferentemente, la celula huesped segrega cantidades minimas de enzimas proteoliticas. Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para efectuar una mutacion genetica en los genes que codifican los polipeptidos endogenos para el huesped, con ejemplos de tales huespedes incluyendo cepa 1A2 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA; E. coli W3110 cepa 9E4, que tiene el genotipo completo tonA ptr3; cepa 27C7 de E. coli W3110 (ATCC 55,244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompTkan’; cepa 37D6 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan’; cepa 40B4 de E. coli W3110, que es la cepa 37D6 con una mutacion de supresion degP no resistente a la kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene proteasa periplasmica mutante. De forma alternativa, son adecuados prcedimientos de clonacion in vitro, por ejemplo, PCR u otras reacciones de polimerasa de acido nucleico.
En estos huespedes procariotas, se pueden hacer vectores de expresion, los cuales tipicamente contienen secuencias de control de expresion compatibles con la celula huesped (por ejemplo, un origen de replicacion). Ademas, estaran presentes cualquier numero de una variedad de promotores bien conocidos, tales como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptofano (trp), un sistema promotor de beta-lactamasa o un sistema promotor a partir de fago lambda. Los promotores controlaran tipicamente la expresion, opcionalmente con una secuencia operadora, y tendran secuencias de sitios de union al ribosoma y similares, para iniciar y completar la transcripcion y traduccion.
Los microbios eucariotas se pueden usar para la expresion. Los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huespedes de clonacion o expresion adecuados para vectores que codifican polipeptidos. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huesped eucariota inferior comunmente usado. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe; huespedes de Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. Lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045 ), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans y K. marxianus; Yarrowia (documento EP 402.226); Pichia pastoris; Candida ; Trichoderma reesia; Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, huespedes Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger. Las levaduras metilotropicas son adecuadas en el presente documento e incluyen, pero no se limitan a, levaduras capaces de crecer sobre metanol seleccionado de los generos que consisten en Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis y Rhodotorula. Saccharomyces es un huesped de levadura preferido, con vectores adecuados que tienen secuencias de control de expresion (por ejemplo, promotores), un origen de replicacion, secuencias de terminacion y similares como se desee. Los promotores tipicos incluyen 3-fosfoglicerato quinasa y otras enzimas glicoliticas. Los promotores de levadura inducibles incluyen, entre otros, promotores de alcohol deshidrogenasa, isociocromo C y enzimas responsables de la utilizacion de maltosa y galactosa.
Ademas de microorganismos, el cultivo de celulas de tejido de mamifero tambien puede usarse para expresar y producir los polipeptidos como se describe en el presente documento y en algunos casos se prefieren (vease Winnacker, From Genes to Clones VCH Publishers, NY, NY (1987). Para algunos modos de realizacion, se pueden preferir celulas eucariotas, porque se han desarrollado en la tecnica varias lineas celulares huesped adecuadas capaces de segregar polipeptidos heterologos (por ejemplo, inmunoglobulinas intactas), e incluyen lineas celulares CHO, diversas lineas celulares Cos, celulas HeLa, preferentemente, lineas celulares de mieloma, o celulas B transformadas o hibridomas. En algunos modos de realizacion, la celula huesped de mamifero es una celula CHO.
En algunos modos de realizacion, la celula huesped es una celula huesped de vertebrado. Los ejemplos de lineas de celulas huesped de mamifero incluyen lineas VC1 de rinon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linea de rinon embrionario humano (293 o celulas 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo de suspension); celulas de rinon de cria de hamster (BHK, ATCC CCL 10); celulas de ovario de hamster chino/-DHFR (linea CHO o CHO-DP-12); celulas de Sertoli de raton; celulas de rinon de mono (CV1 ATCC CCL 70); celulas de rinon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); celulas de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); celulas de rinon canino (MdCK, ATCC CCL 34); celulas de higado de rata Buffalo (BRL 3A, AtCc CRL 1442); celulas de pulmon humano (W138, ATCC CCL 75); celulas de higado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de raton (mMt 060562, ATCC CCL51); celulas TR1; celulas MRC 5; celulas FS4; y una linea de hepatoma humano (Hep G2).
V. Formulaciones y procedimientos de produccion de las formulaciones
En el presente documento tambien se proporcionan formulaciones y procedimientos para preparar la formulacion que comprende los polipeptidos (por ejemplo, anticuerpos) purificada mediante los procedimientos descritos en el presente documento. Por ejemplo, el polipeptido purificado puede combinarse con un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
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Las formulaciones de polipeptido en algunos modos de realizacion se pueden preparar para almacenamiento mezclando un polipeptido que tiene el grado deseado de pureza con vehfculos, excipientes o estabilizantes farmaceuticamente aceptables (Remington Pharmaceutical Sciences, 16.a edicion, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas.
«Vehfculos» tal como se usa en el presente documento incluyen vehfculos, excipientes o estabilizantes farmaceuticamente aceptables que son no toxicos para la celula o mamffero que esta expuesto a los mismos en las dosificaciones y concentraciones empleadas. Frecuentemente el vehfculo fisiologicamente aceptable es una solucion acuosa tamponada en pH.
Los vehfculos, excipientes o estabilizantes aceptables no son toxicos para los destinatarios a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros acidos organicos; antioxidantes incluyendo acido ascorbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butflico o bencflico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol); polipeptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); protefnas, tales como seroalbumina, gelatina o inmunoglobulinas; polfmeros hidrofilos tales como polivinilpirrolidona; aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacaridos, disacaridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azucares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metalicos (por ejemplo, complejos de Zn-protefna) y/o tensioactivos no ionicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).
En algunos modos de realizacion, el polipeptido en la formulacion de polipeptido mantiene la actividad funcional.
Las formulaciones que se vayan a usar para la administracion in vivo deben ser esteriles. Esto se consigue facilmente por filtracion a traves de membranas de filtracion esteriles.
La formulacion del presente documento tambien puede contener mas de un compuesto activo segun sea necesario para la indicacion particular que se esta tratando, preferentemente los que tienen actividades complementarias que no resultan afectadas de manera adversa entre sf. Por ejemplo, ademas de un polipeptido, puede ser deseable incluir en la formulacion un polipeptido adicional (por ejemplo, un anticuerpo). Alternativamente, o adicionalmente, la composicion puede comprender ademas un agente quimioterapeutico, un agente citotoxico, una citocina, un agente inhibidor del crecimiento, un agente antihormonal y/o un cardioprotector. Tales moleculas estan presentes adecuadamente en combinacion en cantidades que son eficaces para el proposito pretendido.
H. Articulos de fabricacion
Los polipeptidos purificados por los procedimientos descritos en el presente documento y/o formulaciones que comprenden los polipeptidos purificados por los procedimientos descritos en la presente memoria pueden estar contenidos dentro de un artfculo de fabricacion. El artfculo de fabricacion puede comprender un recipiente que contiene el polipeptido y/o la formulacion de polipeptido. preferentemente, el artfcuio de fabricacion comprende: (a) un recipiente que comprende una composicion que comprende el polipeptido y/o la formulacion de polipeptido en el presente documento descrita dentro del recipiente; y (b) un inserto de paquete con instrucciones para administrar la formulacion a un sujeto.
El artfculo de fabricacion comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los recipientes se pueden obtener en una variedad de materiales, tales como vidrio o plastico. El recipiente aloja o contiene una formulacion y puede tener un puerto de acceso esteril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solucion intravenosa o un vial que tiene un tapon perforable por una aguja hipodermica). Al menos un agente activo de la composicion es el polipeptido. La etiqueta o prospecto indica el uso de la composicion en un sujeto con directrices especfficas en lo referente a las cantidades de dosificacion y los intervalos de polipeptido y cualquier otro farmaco que se proporcione. El artfculo de fabricacion puede incluir ademas otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas. En algunos modos de realizacion, el dispositivo es una jeringuilla. En algunos modos de realizacion, la jeringuilla esta ademas contenida dentro de un dispositivo de inyeccion. En algunos modos de realizacion, el dispositivo de inyeccion es un autoinyector.
El termino "prospecto" se usa para hacer referencia a las instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapeuticos, que contienen informacion sobre las indicaciones, uso, dosis, administracion, contraindicaciones, otros productos terapeuticos que se van a combinar con el producto envasado y/o advertencias sobre el uso de dichos productos terapeuticos.
VI. Modos de realizacion ejemplares
En algunos modos de realizacion, la invencion proporciona procedimientos para purificar un polipeptido a partir de una composicion que comprende el polipeptido y uno o mas contaminantes, comprendiendo dicho procedimiento a) cargar la
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composicion en un modo mixto, un intercambio anionico, una interaccion hidrofoba o un material de cromatografia de afinidad en 20 veces la capacidad de union dinamica del material de cromatografia para el polipeptido usando un tampon de carga, donde el coeficiente de reparto del material de cromatografia para el polipeptido es mayor que 30, b) eluyendo el polipeptido del material de cromatografia en condiciones en las que el uno o mas contaminantes permanecen unidos al material de cromatografia usando un tampon de elucion, en el que el tampon de elucion tiene una conductividad menor que la conductividad del tampon de carga y c) agrupacion de fracciones que comprenden el polipeptido en el efluente de cromatografia de las etapas a) y b).
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el polipeptido es un anticuerpo o inmunoadhesina.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el polipeptido es una inmunoadhesina.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el polipeptido es un anticuerpo.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En aun otra realizacion de la realizacion anterior, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo quimerico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal IgG.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el anticuerpo es un fragmento de union al antigeno.
En otros modos de realizacion adicionales de la realizacion anterior, el fragmento de union al antigeno se selecciona del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un scFv, un di-scFv, un bi-scFv, un tandem (di, tri)-scFv, un Fv, un sdAb, un anticuerpo trifuncional, un BiTE, un diacuerpo y un triacuerpo.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el polipeptido se selecciona de una enzima, una hormona, una proteina de fusion, una proteina que contiene Fc, un inmunoconjugado, una citocina y una interleucina.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el por lo menos un contaminante es uno o mas proteinas de ovario de hamster chino (CHOP), una proteina de celula huesped (HCP), proteina A lixiviada, carboxipeptidasa B, acido nucleico, ADN, variantes de producto, proteina agregada, componente de medio de cultivo celular, gentamicina, fragmento polipeptidico, endotoxina y contaminante viral.
En otras adicionales de la realizacion anterior, el material de cromatografia se selecciona de un material de modo mixto, un material de intercambio anionico, un material de intercambio cationico, un material de interaccion hidrofobico y un material de afinidad.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, la densidad de carga esta entre aproximadamente 50 g/l y aproximadamente 2000 g/l.
Aun en otros modos de realizacion de la realizacion anterior; la densidad de carga esta entre aproximadamente 200 g/l y aproximadamente 1000 g/l.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, la composicion se carga sobre el material de cromatografia a aproximadamente las capacidades de union dinamica de los materiales de cromatografia para uno o mas contaminantes.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, la composicion se carga sobre el material de cromatografia a 20 veces la capacidad de union dinamica del material de cromatografia para el polipeptido.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el coeficiente de reparto del material de cromatografia para el polipeptido es mayor que 30.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el coeficiente de reparto del material de cromatografia para el polipeptido es mayor que 100.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el procedimiento comprende ademas el uso de un tampon de carga y un tampon de elucion.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el tampon de elucion tiene una conductividad menor que la conductividad del tampon de carga.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el tampon de carga tiene una conductividad de aproximadamente 4,0 mS a aproximadamente 7,0 mS.
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En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el tampon de elucion tiene una conductividad de
aproximadamente 0,0 mS a aproximadamente 7,0 mS.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el tampon de elucion tiene una conductividad mayor que la conductividad del tampon de carga.

En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el tampon de carga tiene una conductividad de
aproximadamente 4,0 mS a aproximadamente 7,0 mS.

En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el tampon de elucion tiene una conductividad de
aproximadamente 5,5 mS a aproximadamente 17,0 mS.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, la conductividad del tampon de elucion disminuye en un gradiente de aproximadamente 5,5 mS a aproximadamente 1,0 mS sobre aproximadamente 10 volumenes de columna (VC).
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, la conductividad del tampon de elucion disminuye en un gradiente de aproximadamente 5,5 mS a aproximadamente 1,0 mS durante aproximadamente 15 VC.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, la conductividad del tampon de elucion disminuye en un gradiente de aproximadamente 10,0 mS a aproximadamente 1,0 mS durante aproximadamente 5 VC.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, la conductividad del tampon de elucion disminuye en un gradiente de aproximadamente 10,9 mS a aproximadamente 1,0 mS durante aproximadamente 10 VC.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el tampon de elucion tiene un pH menor que el pH del tampon de carga.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el tampon de carga tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el tampon de elucion tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el tampon de elucion tiene un pH mayor que el pH del tampon de carga.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el tampon de carga tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el tampon de elucion tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, la composicion es un eluyente de una cromatografia de afinidad, una cromatografia de intercambio cationico, una cromatografia de intercambio anionico, una cromatografia de modo mixto y una cromatografia de interaccion hidrofoba.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, la cromatografia de afinidad es una cromatografia de Proteina A.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el polipeptido se purifica adicionalmente.
En otros modos de realizacion adicionales de la realizacion anterior, el polipeptido se purifica adicionalmente mediante filtracion de virus.
En otros modos de realizacion adicionales de la realizacion anterior, el polipeptido se purifica adicionalmente mediante una o mas de una cromatografia de afinidad, una cromatografia de intercambio cationico, una cromatografia de intercambio anionico, una cromatografia de modo mixto o una cromatografia de interaccion hidrofoba.
En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el polipeptido se concentra adicionalmente.
Aun en otros modos de realizacion de la realizacion anterior, el polipeptido se concentra por ultrafiltracion, diafiltracion o una combinacion de ultrafiltracion y diafiltracion.
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En otros modos de realizacion de la realizacion anterior, los procedimientos comprenden ademas la combinacion del polipeptido con un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
Ejemplos
Los ejemplos que siguen estan destinados a ser puramente ejemplares de la invencion y, por lo tanto, no deben considerarse limitativos de la invencion en modo alguno. Los siguientes ejemplos y descripcion detallada se ofrecen a modo de ilustracion y no a modo de limitacion.
Materiales y procedimientos
Los materiales y procedimientos para todos los ejemplos se realizaron como se indica a continuacion a menos que se indique lo contrario en el Ejemplo.
Alimentacion de MAb
La alimentacion de MAb para todos los ejemplos se selecciono de lotes de cultivo celular a escala industriales, piloto o de pequena escala en Genentech (South San Francisco, CA, EE. UU.). Despues de un periodo de fermentacion del cultivo celular, las celulas se separaron y el liquido clarificado se purifico mediante cromatografia de Proteina A. La proteina A se uso para investigar el mecanismo de eliminacion de impurezas. La tabla 2 muestra las caracteristicas de la alimentacion para cada mAb usado en los ejemplos.
Tabla 2 Caracteristicas de la alimentacion de MAb.
MAb
MAb Identificacion pI
MAb 1
Rituxan® 8,8-9,3
MAb 2
Anti-oxLDL 9,3
MAb 3
Anti-ALKa 8,7
MAb 4
Xolair ® 7,6
MAb 5
Anti-FGFR3 8,1
Cuantificacion del MAb
La concentracion de anticuerpo se determino mediante absorbancia a 280 y 320 nm usando un espectrofotometro UV- visible (modelo 8453 G1103A, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EEUU) o NanoDrop 1000 modelo ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Especies distintas del anticuerpo (es decir, impurezas) eran demasiado bajas en concentracion para tener un efecto apreciable sobre la absorbancia UV. Cuando era necesario, las muestras se diluyeron con un diluyente no interferente apropiado en el intervalo de 0,1—1,0 unidad de absorbancia. La preparacion de la muestra y las mediciones UV se realizaron por duplicado y se registro el valor medio. Los coeficientes de absorcion de MAb oscilaron entre 1,42 y 1,645/mg- ml-cm.
Cuantificacion de la proteina de la celula huesped CHO (CHOP)
Se uso un ELISA para cuantificar los niveles de la proteina de la celula huesped llamada CHOP. Los anticuerpos antiCHOP se inmovilizaron en pocillos de placas de microtitulacion. Las diluciones de las muestras que contenian CHOP, patrones y controles se incubaron en los pocillos, seguido de incubacion con anticuerpos anti-CHOP conjugados con peroxidasa de rabano picante (HRP). La actividad enzimatica de HRP se detecto con o-fenilendiamina, y el CHOP se cuantifico por lectura de la absorbancia a 490 nm en un lector de placas de microtitulacion. Basandose en los principios de ELISA en sandwich, la concentracion de peroxidasa correspondia a la concentracion de CHOP. El intervalo de ensayo para el ELISA era tipicamente 5-320 ng/ ml con variabilidad intra-ensayo <10 %. Los valores de CHOP se informaron en unidades de ng/ ml. Alternativamente, los valores de CHOP se dividieron por la concentracion de MAb y los resultados se informaron en PPM (partes por millon, por ejemplo, ng de CHOP/mg de MAb). El ELISA de CHOP se puede usar para cuantificar los niveles totales de CHOP en una muestra, pero no cuantifica la concentracion de proteinas individuales.
Condiciones de funcionamiento de cromatografia
Las resinas Capto Adhere y Capto MMC Capto Adhere se aquirieron en GE Healthcare (Uppsala, Suecia). Se adquirieron resinas de intercambio cationico fuertes (Poros XS y Poros 50 HS) en Applied Biosystems (Address). Todos los experimentos de cromatografia de laboratorio se llevaron a cabo usando un sistema cromatografico AKLC FPLC de GE Healthcare (Uppsala, Suecia) usando el software UNICORN. Las columnas de laboratorio tenian 0,66 cm de diametro y 10-20 cm de altura. Las columnas se equilibraron a las condiciones de funcionamiento especificadas de pH y conductividad antes de la carga. A continuacion, las agrupaciones de proteina A se cargaron en la columna seguido por
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el tampon de elucion segun se requiera para eluir la proteina unida. El flujo o eluido durante la carga, la sobrecarga y las fases de elucion se recogieron como fracciones y despues se analizaron las impurezas. La densidad de carga del MAb variaba de 100 a 1000 g por litro de resina.
Analisis de la agrupacion cromatografica
Las agrupaciones de flujo durante la carga, la sobrecarga y las fases de elucion se recogieron en fracciones (1 volumen de columna cada una) y se analizaron para determinar la concentracion de MAb, la concentracion de CHOP, los agregados, la proteina A lixiviada, el ADN de CHO y el rendimiento. Se generaron graficos acumulativos en funcion de las fracciones de la agrupacion de elucion. El rendimiento acumulativo se obtuvo usando la Ecuacion 1.
donde, para la fraccion i, Ci es la concentracion de Mab (mg/ml), Vi es el volumen de la fraccion (ml), Mp es la masa de proteina cargada (mg).
% de rendimiento
y
X c.*v1
M
P
*100
Ecuacion 1
Cromatograffa de exclusion molecular
La heterogeneidad de tamano de los anticuerpos monoclonales se determino mediante un ensayo de cromatograffa de exclusion molecular de alta resolucion. Una columna TSK G3000SWXL SEC (diametro = 7,8 mm, altura = 300 mm, numero de referencia 08541) fabricada por Tosoh Bioscience (Tokio, Japon) se opero a temperatura ambiente en un equipo de HPLC de la serie 1200 (Agilent Technologies) y se uso para determinar la relacion de niveles de monomero de MAb para las muestras recogidas. La columna se opero a una velocidad de flujo de 0,3 ml/min usando una fase movil de fosfato de potasio 200 mM, fase movil de cloruro de potasio 250 mM a pH 6,2. Se inyecto 20 pg de anticuerpo para cada muestra. Se uso absorbancia UV a 280 nm para monitorizar la separacion de monomeros, proteinas LMW y proteinas HMW. Los porcentajes de monomero, proteinas LMW y proteinas HMW se analizaron manualmente utilizando el software ChemStation (Agilent Technologies).
Cuantificacion de ADN de CHO
El ADN de CHO en muestras de producto se cuantifico usando PCR a tiempo real (TaqMan PCR). El ADN de las muestras y los controles se extrajeron primero usando el kit Qiagen Virus Biorobot. Las muestras extraidas, los controles y el ADN estandar, fueron sometidos a reaccion en cadena de la polimerasa a tiempo real TaqMan (PCR) usando cebadores de PCR y sonda en una placa de 96 pocillos con el sistema de deteccion de secuencias de ABI. Los cebadores se definieron por un segmento de 110 pares de bases de una secuencia de ADN repetitiva en el genoma de Cricetulus griseus. La sonda se etiqueto con un colorante reportero fluorescente en el extremo 5 'y un colorante de extincion en el extremo 3'. Cuando la sonda esta intacta, el espectro de emision del reportero es suprimido por el extintor. La actividad 5‘ nucleasa de la polimerasa hidroliza la sonda y libera el reporte, lo que da como resultado un aumento en la emision de fluorescencia. El detector de secuencia cuantifico el producto amplificado en proporcion directa con el aumento de la emision de fluorescencia medida continuamente durante la amplificacion del ADN. Los numeros de ciclo en los que el ADN se habia amplificado mas alla del umbral (CT) se calcularon para la curva estandar. Se genero una curva estandar de 1 pg/ml-10 000 pg/ml, que se utilizo para cuantificar ADN en muestras.
Cuantificacion de Proteina A lixiviada
El nivel de Proteina A lixiviada en las agrupaciones de Proteina A se determino mediante un ELISA en sandwich de Proteina-A. Los anticuerpos de la proteina A anti-estafilococica de pollo se inmovilizaron en pocillos de placas de microtitulacion. El procedimiento de tratamiento de la muestra incluyo la dilucion de la muestra y luego la disociacion del complejo de Proteina A/IgG usando calentamiento asistido por microondas como una etapa de pretratamiento antes de ejecutar las muestras en un ELISA sandwich. La proteina A, si esta presente en la muestra, se une al anticuerpo recubierto. La proteina A unida se detecto usando anticuerpos anti-proteina conjugados con peroxidasa de rabano picante. La actividad enzimatica de la peroxidasa de rabano picante se cuantifico con una solucion de sustrato TMB de 2 componentes que produce una senal colorimetrica.
Acondicionamiento de la alimentacion
Las alimentaciones usadas para los experimentos en este estudio fueron frescas o se retiraron del almacenamiento en frio (2-8 0C o-70 0C) y se dejo equilibrar a temperatura ambiente. Posteriormente, se ajustaron el pH y/o la conductividad segun se necesitaba usando un agente de titulacion (base Tris 1,5 M o acido acetico 1 M) o diluyente (agua purificada, cloruro de sodio 5 M o acetato de sodio 5 M). Todas las alimentaciones fueron de 0,2 p M filtrado
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usando un Millipak 20 (Millipore), AcroPakTM 20 (Pall Corporation) o un filtro de vacio (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, EE. UU.).
Cribado de alto rendimiento
Se utilizo un robot Tecan Freedom Evo 200 (Tecan US, Research Triangle Park, NC) para el manejo de liquidos y resinas. Se uso una placa de filtro de 96 pocillos (Seahorse 800 p l de polipropileno de 0,45 pm, E & K Scientific EK- 2223) para incubar la resina con la proteina y el tampon. Despues de incubar la solucion de proteina con la resina, la placa de filtro se centrifugo a 1200 xg durante 3 minutos para separar la solucion de la resina. Para cada etapa, se pusieron en contacto 300 ml de solucion con 50 ml de resina, dando como resultado una relacion en volumen de fase de 6:1. Cada pocillo se equilibro hasta el pH apropiado y la concentracion de acetato de sodio. El pH variaba de 5,00 a 7,5 a intervalos de 0,5 unidades de pH (se uso acetato para tamponar las condiciones de pH 5,00 a 5,5, se uso MES para tamponar las condiciones de pH 6,00 a 6,5 y se uso MOPS para tamponar las condiciones de 7,00 a 7,5). Todos los experimentos fueron realizados a temperatura ambiente. Se uso como carga para estos experimentos una agrupacion de Proteina A parcialmente purificada, concentrada a 5 g/l o 97 mg/ml, y el tampon intercambiado en NaOAc 15 mM. La resina fue expuesta a 5 g/l para los experimentos para determinar los valores de producto Kp. Sin embargo, para la capacidad de union del producto real, la resina fue expuesta a 97 g/l. La solucion de filtrado se capturo en una placa de recogida y despues se analizo usando el lector de placas Infinite M200. La proteina unida se separo posteriormente de la resina usando dos etapas de un tampon de NaCl 2 M para aproximarse al equilibrio de masa.
Estudios de aclaramiento de virus
El objetivo de este estudio fue evaluar la capacidad de eliminacion de virus de la Capto Adhere para los virus modelo 2 (MMV y X-MuLV). Las columnas, de 0,66 cm de diametro, se empaquetaron con resinas originales hasta una altura de lecho de 20 cm. Se hizo pasar la alimentacion de MAb con un 1 % de virus y luego se proceso sobre la resina Capto Adhere. Las agrupaciones se recogieron de forma inmediata y las muestras de carga y de elucion se ensayaron para determinar los conteos virales. Se hicieron multiples diluciones de las agrupaciones con Medio Completo (1:10 y 1: 100) para determinar cualquier interferencia potencial entre los componentes del tampon y los virus.
Ejemplo 1. Cribado de alto rendimiento
Este ejemplo describe procedimientos de cribado de alto rendimiento para determinar las capacidades de union del material de cromatografia. Se realizo un cribado de alto rendimiento en la resina Capto Adhere en condiciones de union por lotes para el anticuerpo monoclonal MAb3.
Los resultados del cribado de alto rendimiento de las condiciones de union se presentan en la figura 1. En las figuras de superficie de respuesta (figuras 1A y 1B), las regiones de union al producto se indican en rojo (region 8 de la figura 1A y region 7 en la figura 1B) y el producto, por ejemplo polipeptido, las regiones no unidas son verdes (indicadas como region 1). Los contenidos reales de proteina de la celula huesped (HCP) (ng/mg) en el sobrenadante se muestran en la grafica de contorno de la figura 1C. Kp del producto como una funcion del pH y la concentracion de contraion para MAb3 se muestra en la fFigura 1A. La resina se cargo a 5 g/l y los datos brutos se analizaron usando un modelo de superficie de respuesta. El modelo se utilizo entonces para estimar el Kp para cualquier combinacion de pH y la concentracion de contraion en el espacio experimental. Los datos muestran que a medida que el pH aumenta y cuando la conductividad aumenta, el log Kp aumenta. Los incrementos en log Kp reflejan aumentos en el producto que se une a la resina. Con el fin de descubrir la capacidad real de union del producto a la resina, la resina se expuso a 80 g/l en 48 condiciones diferentes combinando diferentes pH y concentraciones de contraion (figura 1B). El sobrenadante de la misma placa experimental se analizo tambien para HCP (ng/mg) y los datos se representaron en forma de contorno (figura 1C). Se uso agrupacion de Proteina A parcialmente purificada que contiene varios miles de ppm de CHOP como una carga para los experimentos de cribado de alto rendimiento. Las regiones verdes (region 1) de la figura indican la menor cantidad de CHOP en el sobrenadante y las regiones rojas (region 8 de la figura 1B y region 9 de la figura 1C) indican una mayor cantidad de CHOP en el sobrenadante.
El espacio de diseno para las condiciones optimas de carga y elucion puede determinarse a partir de las graficas de contorno de datos de CHOP y de union. Estas agrupaciones permiten el diseno de un modo de funcionamiento de flujo o un modo de funcionamiento de union y elucion. Las condiciones de carga para una cromatografia de flujo completo son generalmente condiciones en las que se minimiza la union del producto, por ejemplo, polipeptido, y se maximiza la union de impurezas (CHOP). Las regiones verdes de solapamiento completas (region 1) entre las figuras 1B y 1C sugieren que es posible un modo F/T. Sin embargo, la region verde (region 1) en este diagrama es una region donde la conductividad es realmente baja ~ 1mS. Tales condiciones requieren aproximadamente 4 veces la dilucion de la agrupacion de Proteina A dando como resultado desafios de ajuste potenciales a la escala de la planta.
Las regiones rojas (region 7 en la figura 1B y region 8 en la figura 1C) indican regiones de union para MAb y CHOP. Hay algunas regiones rojas de solapamiento en ambos diagramas. Sin embargo, la figura 1 muestra que, dentro de las concentraciones de pH y contraion operables, era posible una capacidad de union maxima de 55 g/l. Para un procedimiento de titulo elevado con un titulo de cultivo celular de ~ 3,5 g/l, se necesitaria una columna de 1000 l para
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recuperar todo el producto, tal como un polipeptido, en un ciclo o ciclos multiples que se realizarian en una columna mas pequena .
En un modo OEC, se puede elegir una condicion de carga basada en el comportamiento de impurezas (por ejemplo, CHOP) en la columna. La cantidad de MAb que se une a la columna es menos preocupante porque el MAb unido puede ser recuperado por la fase de elucion. Por lo tanto, existe un espacio experimental completo para disenar la condicion de carga de modo que se obtenga el maxima aclaramiento de impurezas sin estar limitada por la capacidad de union de producto de la resina. Mientras que el modo de union y elucion permite una densidad de carga de 55 g/l, OEC permite una capacidad de carga aproximadamente 10 veces superior permitiendo de este modo la implementacion de una columna mas pequena que a su vez puede reducir el coste de resina por gramo de producto y ofrece un buen ajuste de planta.
Ejemplo 2. Modo OEC optimizado
Los datos HTS se usaron para la determinacion de parametros para operar en un modo OEC. Basandose en los requisitos de densidad de carga, ajuste de la planta y aclaramiento de impurezas, se seleccionaron las condiciones de carga para el MAb 3 que son pH 6,5 y 5,5 mS/cm. La densidad de carga para la prueba de cromatografica optimizada mostrada en la Figura 2 fue de 180 g/l. Aproximadamente 50 g/l de producto polipeptidico se une a la resina durante la fase de carga. La agrupacion de producto se recogio comenzando a aproximadamente 0,5 DO, y el producto se sobrecargo en la resina hasta 180 g/l. Despues de completarse la fase de carga, se uso la fase de elucion con tampon de baja conductividad de 1 mS/cm (tampon de elucion: MES 20 mM, pH 6,5) para eluir la proteina unida, resultando en una reduccion del volumen de la agrupacion del 10-15 % en comparacion con la cromatografia de flujo. El rendimiento y el aclaramiento de impurezas para esta prueba de cromatografia se muestran en la figura 3.
Ejemplo 3. Optimizacion de carga
Este estudio se llevo a cabo para comparar los datos de HTS y los datos reales de rendimiento de la columna en el modo de funcionamiento de OEC. Las columnas se cargaron a tres pH diferentes. Se selecciono pH 6,5 para ser la mejor condicion basandose en el aclaramiento inicial de CHOP y en los datos de rendimiento. Las concentraciones de CHOP en las agrupaciones oscilaron entre 900 y 50 a 400 ppm en funcion del pH de la carga. A partir de este estudio, se determino que el pH 6,5 era la mejor condicion para cargar la composicion. Ademas, aunque el rendimiento no se optimizo, el pH 6,5 proporciono tambien el rendimiento maximo (figura 3, tabla 3).
Tabla 3. Optimizacion de la condicion de carga para un modo OEC_______________________________
Carga
Elucion CHOP en la agrupacion (ppm) Union de MAb (g/l) Rendimi ento (%)
pH
Conductividad (mS/cm) pH Conductividad (mS/cm)
8
5,4 8 2,7 895 63 60
6,5
5,6 6,5 2,1 48 49 92
5,5
5,3 5,5 3,3 359 29 86
Carga CHOP: 20000 ppm Densidad de carga: 150 g/l
Ejemplo 4. Optimizacion de la elucion
Este estudio se llevo a cabo para optimizar las condiciones de elucion para OEC. Con el fin de recuperar el producto (MAb 3, ~ 50 g/l) que se unio durante la fase de carga, se pasaron unos cuantos volumenes de columna de tampon de lavado (MES 50 mM, acetato de Na 30 mM, pH 6,5, ~ 5,5 mS/cm) a traves de la columna despues de la finalizacion de la fase de carga. Se observo una gran cantidad de colas resultando en un aumento en el volumen del agrupamiento al final de la fase de carga. El aumento en el volumen del agrupamiento fue de aproximadamente un 45 % usando un tampon de lavado con un pH y conductividad similares al tampon de carga. Este aumento en el volumen de la agrupacion puede resultar en problemas de ajuste de la planta (figura 4).
El objetivo del estudio de optimizacion de la elucion fue obtener el maximo rendimiento con un minimo de CHOP y una reduccion maxima del volumen de la agrupacion. La fase de elucion se desarrollo para eluir los 50 g/l de producto unido de la columna. La figura 5 muestra la fase de elucion de los cromatogramas. Un tampon de conductividad inferior eluye el producto de la columna dentro de los volumenes de 2 columnas dando como resultado un rendimiento mas alto y un volumen de piscina menor (tabla 4). Por otro lado, los tampones de elucion de mayor conductividad dieron como resultado colas de mas de 8 volumenes de columna. Como se muestra en la Tabla 4, CHOP de la agrupacion fue menor de 20 ppm en todos los tampones de elucion probados. Por lo tanto, se selecciono MES 20 mM como tampon de elucion para aumentar el rendimiento y para minimizar la cola.
Tabla 4. Optimizacion de la elucion para OEC
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Tampon de elucion
CHOP (ppm) % Rendimient o
MES 100 mM, pH 6,5, 4 mS
13 91
MES 100 mM, pH 6,5, 2 mS
11 93
MES 100 mM, pH 6,5, 1 mS
17 94
Agua
15 90
Carga CHOP: 3200 ppm Condiciones de carga: pH 6,5, 5,5 mS/cm Densidad de carga: 100 mg/l
Ejemplo 5. Analisis de impurezas en OEC
Las fracciones de OEC se analizaron en busca de impurezas. La Figura 6A muestra las concentraciones de MAb y los niveles de CHOP en las fracciones recogidas durante la fase de carga y durante la fase de elucion. Durante la fase de carga, CHOP permanecio entre 20-25 ppm y durante la fase de elucion donde solo se eluye el MAb unido, el nivel de CHOP fraccionario disminuye. El analisis acumulativo demuestra que el CHOP y otras impurezas permanecen bastante consistentes a traves de toda la carga y de las fases de elucion (figura 6B). La densidad de carga para este ensayo fue de 180 g/l. El aclaramiento de virus, utilizando X-MuLV y MMV como virus modelo, tambien se estudio para la misma densidad de carga (tabla 5). Para este experimento, el pH de carga fue 6,5 y la conductividad de carga fue de 5,5 mS/cm. Las condiciones de elucion fueron MES 20 mM pH 6,5 y conductividad de ~ 1 mS/cm.
Tabla 5. Aclaramiento del virus para la cromatografia en modo OEC. _______
Densidad de carga para la resina Capto Adhere
X-MuLV LRV MMV LRV
180 g/l
3,6 3,3
Ejemplo 6. Determinacion de la capacidad de union de impurezas maxima
Para hallar la maxima capacidad de union de impurezas a la resina cargada con MAb3 por el modo OEC, la resina Capto Adhere fue expuesta a 1000 g/l con la agrupacion de Proteina A. El tampon de carga fue de pH 6,5, ~ 5,5 mS/cm; el tampon de elucion fue MES 20 mM, pH 6,5, ~1 mS/cm. La muestra de agrupacion se recogio cada 50 g/l y se analizo para CHOP y la concentracion de proteinas (figura 7). Para densidades de carga de hasta 800 g/l, CHOP no se rompio y el CHOP en el eluato fue inferior a 20 ng/mg.
Ejemplo 7. Implementacion a escala piloto
El modo de funcionamiento de OEC se implemento en columnas de escala piloto que varian en tamano de 1,6 l a 10,8 l. Los diametros de las columnas oscilaban entre 10 cm a 25 cm con alturas de lecho que varian de 20 - 22 cm (Tabla 6). Las muestras se cargaron a pH 6,5, ~ 5,5 mS/cm y se eluyeron con MES 20 mM a pH 6,5, ~ 1 mS/cm. El rendimiento a traves de la escala piloto se muestra en la Figura 8. Las densidades de carga en las pruebas a escala piloto cubrian una gama de densidades de carga de 70 a 180 g/l. Con todas las densidades de carga se alcanzo un rendimiento medio de un 94 %. No hubo impacto en el rendimiento sobre el intervalo de densidades de carga ensayadas. Con todos los ensayos de escala piloto, la agrupacion de CHOP de modo OEC era inferior a 25 ppm, que se elimino despues a <2 ppm de CHOP en el producto polipeptido final (agrupacion de UFDF) (tabla 7). En promedio, hubo una reduccion de un 1,1 % en las proteinas HMW en todas las pruebas a escala piloto (tabla 8) y una reduccion del 0,19 % en las proteinas LMW en todas las pruebas a escala piloto (tabla 9).
Tabla 6. Tamano de columna _ Capto Adhere para las pruebas a escala piloto _________
Prueba a Escala Piloto
BH Diametro (cm) VC (l)
Prueba 1
21 10 1,6
Prueba 2
21 10 1,6
Prueba 3
20 14 3,1
Prueba 4
19 14 2,9
Prueba 5
19 14 2,9
Prueba 6
22 25 10,8
Prueba 7
22 25 10,8
Prueba 8
21,5 10 1,7
5
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15
20
25
30
Prueba 9
20 14 3,1
Prueba 10
22 25 10,8
Tabla 7. Datos de CHOP para escala piloto
Etapas
Prueba 1 Prueba 2 Prueba 3 Prueba 4 Prueba 5 Prueba 6 Prueba 7 Prueba 8 Prueba 9 Prueba 10 Prueba 11 Prueba 12
HCCF
467000 446000 242000 343000 223000 310000 424000 355000 218000 329000 29700 21500
Proteina A Agrupacion
11360 2200* 5712 9100 5100 4800 5400 6200 9000 7300 5300 4800
Capto Resina Adhere (OEC)
13 14 21 11 22 17 17 13 15 25 17 9
* CHOP despues de la filtracion en profundidad a pH 6,5 HCCF es el fluido de cultivo celular recolectado
Tabla 8. % promedio de reduccion de proteinas HMW con 12 pruebas a escala piloto
% promedio de reduccion de la proteina HMW 0,95 ± 0,49
Tabla 9. % promedio de reduccion de proteinas LMW con 12 pruebas
a escala piloto.
% promedio de reduccion de la proteina LMW 0,19 ± 0,08
El ADN de CHO y la Proteina A lixiviada eran menos que detectables en la agrupacion despues de OEC.
Ejemplo 8. Implementacion a escala de produccion
El modo de funcionamiento de OEC se implemento en una columna de escala de produccion con un tamano de 157 l (100 cm de diametro x 20 cm de altura). A escala de produccion, la columna se cargo a ~ 96 g/l. % de rendimiento con las dos pruebas a escala industrial > 95 % para ambas pruebas. En todas las pruebas a escala de produccion, la CHOP en agrupcacion en el modo OEC fue inferior a 17 ppm (tabla 10), que se aclaro aguas abajo a un nivel menor que el detectable de CHOP. En promedio, hubo una reduccion de un 1,1 % en HMWs, una reduccion de un 0,1 % en LMWs y una reduccion de 1,65 % en acidicos con las dos pruebas a escala de produccion.
Tabla 10. Datos de CHOP (ppm) a escala de produccion________________________
Etapas
Prueba 1 Prueba 2
HCCE
30500 32500
Agrupacion de proteina A
5749 6157
Resina Capto Adhere (OEC)
16 17
El ADN de CHO y la Proteina A lixiviada eran menos detectables en la agrupacion despues del modo OEC.
Ejemplo 9. Aplicabilidad de OEC a otros MAb
Las agrupaciones de proteina A se usaron como cargas para estas pruebas. Las condiciones de carga y elucion se seleccionaron para permitir el modo OEC. Las densidades de carga, el rendimiento en %, el MAb unido a la resina (g/l), las impurezas en la carga y la agrupacion se muestran en las siguientes tablas (tablas 11, 12, 13 y 14).
Tabla 11. Aplicabilidad de OEC a otros MAb: CHOP__________________________________________________
MAb, pH en carga (conductividad < 6 mS/cm)
Densidad de carga (g/l) PH y conductividad de la elucion Union de MAb (g/l) Carga de CHOP (ppm) CHOP en la agrupacion (ppm) % Rendimiento
MAb 1,pH 8,6
200 PH 6,5, 1 mS/cm 35 2825 9 93
MAb 2, pH 8,6
200 PH 6,5, 1 mS/cm 24 5057 12 100
MAb 3, pH 6,5
200 PH 6,5, 1 mS/cm 45 3200 15 97
5
10
15
20
25
MAb 4, pH 6,1
200 pH 6,0, 0,65 mS/cm 59 193 4 93
MAb 5, pH 5,5
200 pH 4,9, 1,1 mS/cm 59 4560 145 92
Tabla 12. Aplicabilidad de OEC a otros MAb: % de proteinas HMW
MAb, pH en carga (conductividad < 6 mS/cm)
Densidad de carga (g/l) pH y conductividad de la elucion Union de MAb (g/l) Carga % de proteinas HMW Agrupacion % de proteinas HMW
MAb 1,pH 8,6
200 pH 6,5, 1 mS/cm 35 5,4 1,6
MAb 2, pH 8,6
200 pH 6,5, 1 mS/cm 24 5,4 3,8
MAb 3, pH 6,5
200 pH 6,5, 1 mS/cm 45 3,5 1,8
MAb 4, pH 6,1
200 pH 6,0, 0,65 mS/cm 59 1,9 0,5
MAb 5, pH 5,5
200 pH 4,9, 1,1 mS/cm 59 2,4 1,7
Tabla 13. Aplicabilidad de OEC a otros MAb: % de Proteina A lixiviada
MAb, pH en carga (Conductividad < 6 mS/cm)
Densidad de carga (g/l) pH y conductividad de la elucion Union de MAb (g/l) Carga de Proteina A lixiviada (ppm) Proteina A lixiviada en agrupacion (ppm)
MAb 1,pH 8,6
200 pH 6,5, 1 mS/cm 35 2 LTD*
MAb 2, pH 8,6
200 pH 6,5, 1 mS/cm 24 2 LTD
MAb 3, pH 6,5
200 pH 6,5, 1 mS/cm 45 3 LTD
MAb 4, pH 6,1
200 pH 6,0, 0,65 mS/cm 59 2 LTD
MAb 5, pH 5,5
200 pH 4,9, 1,1 mS/cm 59 6 LTD
*Menos que detectable
Tabla 14. Aplicabilidad de OEC a otros MAb: ADN de CHO
MAb, pH en carga (conductividad < 6 mS/cm)
Densidad de carga (g/l) pH y conductividad de la elucion Union de MAb (g/l) Carga ADN de CHO (pg/ ml) Agrupacion ADN de cHo (pg/ ml)
MAb 1,pH 8,6
200 pH 6,5, 1 mS/cm 35 253 LTD
MAb 2, pH 8,6
200 pH 6,5, 1 mS/cm 24 297 LTD
MAb 3, pH 6,5
200 pH 6,5, 1 mS/cm 45 106 LTD
MAb 4, pH 6,1
200 pH 6,0, 0,65 mS/cm 59 17 LTD
MAb 5, pH 5,5
200 pH 4,9, 1,1 mS/cm 59 4 LTD
Ejemplo 10. Modos de funcionamiento de cromatografia AEX basadas en valores de Kp
En cromatografia de flujo completo (F/T), Kp es <0,1 y no hay union de proteina a la resina. En la cromatografia de reparto debil (WPC), K p es de 0,1 a 20 y hay una reparto debil entre el producto y los medios de cromatografia. En un modo de union y eluido, el producto se une estrechamente a la resina y el Kp es >100 pero la densidad de carga se limita a la capacidad de union del producto. Sin embargo, en un modo de sobrecarga y elucion de cromatografia (MAb3), se encontraron condiciones de carga tales que Kp del producto y las impurezas eran > 100 y aunque el producto fluye despues de alcanzar su capacidad de union, las impurezas mantienen la union a la resina y no se rompe hasta que alcancen su capacidad de union, que podria ser superior a la capacidad de union del producto.
Se encontraron condiciones de elucion tales que el producto polipeptidico Kp <2. El producto unido se recupera pero la mayoria de las impurezas permanecen unidas (Kp de impureza > 100). Como tal, este modo permite una buena eliminacion de impurezas al tiempo que proporciona un rendimiento muy alto (por ejemplo, 3, tabla 15).
Tabla 15. MAb 3 como un modelo de anticuerpo en la resina Capto Adhere ____________________
Parametros
WPC OEC
Carga
Agrupacion de Proteina A (MAb 3)
Condiciones de carga
pH 5, 4,4 mS/cm pH 6,5, 5,5 mS/cm
Kp
2,6 >100
Log Kp
0,4 4,15
Carga de CHOP
20000 ppm
Producto de union (resina g/l)
20 50
5
10
15
20
25
30
35
CHOP en la agrupacion (ppm)
360 50
% Rendimiento
86 95
Los cromatogramas de pruebas en columna en condiciones de reparto debiles (Kp = 2,4) y condiciones de sobrecarga y elucion (Kp >100) muestran los efectos del aumento del Kp mAb en las regiones de ruptura del producto del cromatograma (figura 9). Condiciones de carga de WPC: pH 5,5, 4,4 mS/cm; condiciones de lavado de WPC: Acetato 20 mM pH 5, 4,4 mS/cm. Condiciones de carga en OEC: pH 6,5, 5,5 mS/cm; condiciones de elucion en OEC: MES 20 mM pH 6,5, ~1 mS/cm.
Tabla 16. AEX eAnalisis de una etapa de refinado de AEX para un MAb que se une a la resina AEX a un flujo tipico con las condiciones del proceso______________________________________________________________________
Modo de funcionamiento
F/T B/E OEC
Densidad de carga (g/lresina)
-200 50 800
Tamano de la columna *
220 l 850 l 52 l
Volumen de la agrupacion
11 000l Elucion ~4VC (3400 l) -2500 l
Ajuste de la planta (limitacion del tanque de la agrupacion)
Volumen de la agrupacion muy grande debido a una dilucion de carga de ~ 5X Columna grande o ciclos multiples Mejor ajuste de planta Reduce el volumen de la agrupacion por ~ 10 - 40 %
Coste de la resina**
$ 0,7 millones $ 2,98 millones $ 0,18 millones
Modelo de anticuerpo: MAb 3
* Se supone una cosecha de 12.500 l a un titulo de 3,5 g/l. ** Resina CA a $ 3500/l
Ejemplo 11. Aplicabilidad OEC para diferentes resinas
Dependiendo del pi de la molecula, puede aplicarse OEC a las siguientes resinas multi-modo (Capto Adhere, QMA, MEP Hypercel, HEA Hypercel, PPA Hypercel, Capto MMC). La union del producto polipeptidico a la resina Capto Adhere era mas hidrofoba por naturaleza y el producto unido se podia eluir de la columna disminuyendo la conductividad del tampon de elucion (figura 5). Sin embargo, el modo de union del producto a la resina y la elucion del producto a partir de la resina no se limita a las interacciones hidrofobas y por lo tanto el modo de funcionamiento de la OEC puede ser ampliamente usado tambien en otros materiales de cromatografia. La tabla 17 demuestra que OEC se puede aplicar a otras resinas CEX y resinas IEX. Los tampones de elucion eran MES 20 mM a menos que se indicara de otro modo. El potencial de OEC no se limita a las resinas anteriores y actualmente se esta evaluando. El analisis de avance del MAb 3 en la resina QMA se muestra en la figura 10. El analisis de avance del MAb 4 en la resina Capto Adhere se muestra en la figura 11. El analisis de avance del MAb 4 en la resina Capto MMC se muestra en la figura 12. El analisis de avance del MAb 3 en la resina Capto Adhere se muestra en la figura 13.
Tabla 17. Aplicabilidad de OEC a diferentes resinas.
mAb
Resina: Carga Elucion Densidad de carga (g/l) Union a MAb (g/l) Carga CHOP (ppm) CHOP en la agrupac ion (ppm) % Rendimi ento
pH
Condo (mS/cm) pH Condo (mS/cm)
MAb 3
Capto Adhere 6,5 <5,5 6,5 1 200 50 3200 15 97
QMA
6,5 <5,5 6,5 1 103 17 1800 99 93
MAb 3 *
Poros XS 5,5 <6 5,5 ** 200 100 9900 370 92
MAb 4
Capto Adhere 6,1 <5,5 6,0 0,65 200 59 193 4 93
Capto MMC
7 <6 6,5 1 147 10 187 27 93
** Condiciones de carga para Poros XS MAb 3: pH 5,5, <6 mS/cm; condiciones de elucion: Tampon A - Acetato 50 mM pH 5,5, ~ 3 mS/cm, tampon B - acetato 350 mM pH 5,5, -24 mS/cm, gradiente: 20-85 % mas de 10 VC, agrupacion: 1-8, 2000).
Ejemplo 12. Elucion con gradiente en OEC
Otro objetivo del estudio de optimizacion de la elucion fue evaluar el efecto de las condiciones de elucion con gradiente en el modo OEC sobre la resina Capto Adhere. La fase de elucion se desarrollo para eluir el producto unido (tabla 18). En una prueba de elucion con gradiente, se puede variar la fuerza ionica, el pH, la composicion y la concentracion de la 5 fase movil basandose en los requerimientos. La tabla 18 muestra las condiciones de funcionamiento: las condiciones de carga (pH y conductividad) y de elucion (pH y gradiente de conductividad). Todos los datos mostrados en la tabla se obtuvieron a partir de pruebas de cromatografia cargadas a una densidad de carga de 150 g/l con MAb3. Estas pruebas se realizaron como prueba de concepto para demostrar que la elucion con gradiente se puede realizar en modo de cromatografia de OEC y se puede optimizar la pendiente de gradiente (concentracion de la sal (mM)/volumen de 10 columna). Se puede observar que el % de HMWS se reduce en un 38 % en promedio cuando se compara con la carga (Tabla 18). CHOP se redujo a <20 ppm en una conductividad de 5,5 mS/cm y la mayor conductividad funciono a 10 mS/cm, resultando en agrupacion de CHOP de ~ 150 ppm (tabla 19).
Tabla 18. La elucion con gradiente se ejecuta en OEC: % de datos HMW 15
Carga pH
Carga Conductividad Elucion con gradiente Condiciones Producto Li'mite (g/l) % HMWS Carga % HMWS Agrupacion
6,5
5,5 mS/cm 5,5 mS/cm a 1 mS/cm mas de 10 VC 43 4,0 2,4
6,5
5,5 mS/cm 5,5 mS/cm a 1mS/cm mas de 15 VC 43 4,0 2,8
6,5
10 mS/cm 10 mS/cm a 1mS/cm mas de 5 VC 48 3,8 2,4
6,5
10 mS/cm 10 mS/cm a 1mS/cm mas de 10 VC 48 3,9 2,2
Tabla 19. La elucion con gradiente se ejecuta en OEC: Datos CHOP:
Carga
Carga
Elucion de gradiente Carga de CHOP CHOP de la
pH
Conductividad Condiciones (ppm) agrupacion (ppm)
6,5
5,5 mS/cm 5,5 mS/cm a 1 mS/cm mas de 10 VC 3100 17
6,5
5,5 mS/cm 5,5 mS/cm a 1mS/cm mas de 15 VC 3100 19
6,5
10 mS/cm 10 mS/cm a 1mS/cm mas de 5 VC 3100 160
6,5
10 mS/cm 10 mS/cm a lmS/cm mas de 10 VC 3100 143
20

Claims (16)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para purificar un polipeptido a partir de una composicion que comprende el polipeptido y uno o mas contaminantes, comprendiendo dicho procedimiento
    a) cargar la composicion en un modo mixto, un intercambio anionico, una interaccion hidrofoba, o un material de cromatografia de afinidad en 20 veces la capacidad de union dinamica del material de cromatografia para el polipeptido usando un tampon de carga, en donde el coeficiente de reparto del material de cromatografia para el polipeptido es mayor que 30,
    b) eluir el polipeptido del material de cromatografia en condiciones en las que el uno o mas contaminantes permanecen unidos al material de cromatografia utilizando un tampon de elucion, en el que el tampon de elucion tiene una conductividad menor que la conductividad del tampon de carga y
    c) agrupacion de fracciones que comprenden el polipeptido en el efluente de cromatografia de las etapas a) y b).
  2. 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el polipeptido es un anticuerpo o inmunoadhesina.
  3. 3. El procedimiento de la reivindicacion 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
  4. 4. El procedimiento de la reivindicacion 3, en el que el anticuerpo es un hanticuerpo quimerico, anticuerpo humanizado o
    humano.
  5. 5. El procedimiento de la reivindicacion 2, en el que el anticuerpo es un fragmento de union al antigeno, opcionalmente en el que el fragmento de union al antigeno es un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un scFv, un di-scFv, un bi-scFv, un tandem (di, tri)-scFv, un Fv, un sdAb, un anticuerpo trifuncional, un BiTE, un diacuerpo o un triacuerpo.
  6. 6. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el polipeptido es una enzima, una hormona, una proteina de fusion, una proteina que contiene Fc, un inmunoconjugado, una citocina o una interleucina.
  7. 7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el al menos un contaminante es uno o mas de la proteina de ovario de hamster chino (CHOP), una proteina de celula huesped (HCP), proteina A lixiviada, carboxipeptidasa B, acidos nucleicos, ADN, variantes del producto, proteina agregada, componente de medio de cultivo celular, gentamicina, fragmento polipeptidico, endotoxina y contaminante viral.
  8. 8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la densidad de carga esta entre aproximadamente 50 g/l y aproximadamente 2000 g/l.
  9. 9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la composicion se carga sobre el material de cromatografia a aproximadamente las capacidades de union dinamica de los materiales de cromatografia para uno o mas contaminantes.
  10. 10. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el tampon de carga tiene una conductividad de aproximadamente 4,0 mS a aproximadamente 7,0 mS y el tampon de elucion tiene una conductividad de aproximadamente 0,0 mS a aproximadamente 7,0 mS.
  11. 11. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la conductividad del tampon de elucion disminuye en un gradiente de aproximadamente 5,5 mS a aproximadamente 1,0 mS sobre aproximadamente 10 volumenes de columna (VC).
  12. 12. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el tampon de elucion tiene un pH menor que el pH del tampon de carga.
  13. 13. El procedimiento de la reivindicacion 12, en el que el tampon de carga tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9 y el tampon de elucion tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9.
  14. 14. El procedimiento de la reivindicacion 20, en el que el tampon de elucion tiene un pH mayor que el pH del tampon de carga.
  15. 15. El procedimiento de la reivindicacion 14, en el que el tampon de carga tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9 y el tampon de elucion tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9.
  16. 16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en el que la composicion es un eluyente de una cromatografia de afinidad, una cromatografia de intercambio cationico, una cromatografia de intercambio anionico, una cromatografia de modo mixto o una cromatografia de interaccion hidrofoba.
    5 17. El procedimiento de la reivindicacion 16, en el que la cromatografia de afinidad es una cromatografia de Proteina A.
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