TW202112799A

TW202112799A - 過載層析管柱之再生方法

Info

Publication number: TW202112799A
Application number: TW109118701A
Authority: TW
Inventors: 大漢黃; 唐娜Ｆ奎丘; 傑森Ａ布朗; 喬瑟菲Ｋ皮爾森; 艾咪林
Original assignee: 美商建南德克公司
Priority date: 2019-06-05
Filing date: 2020-06-03
Publication date: 2021-04-01
Also published as: AR119264A1; BR112021024147A2; SG11202112816WA; CN114096553A; IL288518A; US20220203347A1; MX2021014920A; WO2020247634A1; KR20220017436A; CA3140903A1; AU2020286442A1; JP2022535526A; EP3980153A1

Abstract

本發明提供用於清潔或再生層析材料供再使用之方法。本發明之方法可用於清潔或再生離子交換層析管柱以在大規模製造多種多肽產物中再使用，其中該離子交換層析管柱以過載模式使用。

Description

過載層析管柱之再生方法

本發明提供用於層析之方法。

已證實過載(OL)陽離子交換層析具有與結合及溶析模式等效之雜質移除能力，同時加強製程以改良樹脂利用率及設備效率。樹脂在強結合條件下加載超過樹脂動態結合容量。雜質優先結合於樹脂，同時收集穿透之產物。歸因於高加載密度(典型地＞ 500 g/L)，較高濃度之宿主細胞蛋白質保持結合於樹脂。因此，管柱在純化製程之消毒階段(0.5N氫氧化鈉)期間結垢(高管柱壓力，＞80 psi) (圖 1 )。需要使消毒階段之壓力增加減至最少且在層析運行之間沒有雜質遺留的改良製程。

過載層析之方法描述於美國專利申請公開案US 2013/0079272A1及US 2014/0301977A1中，該等專利申請公開案中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。

本文引用之所有參考文獻(包括專利申請案及出版物)皆以全文引用之方式併入。

在一些態樣中，本發明提供用於清潔離子交換層析材料(例如陽離子交換層析材料)供再使用之方法，其中層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟：a)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含乙酸鈉；b)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及c)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，再生緩衝液包含約50至約600 mM乙酸鈉(NaOAc)。在一些實施例中，再生緩衝液包含約350 mM NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約pH 4.0至11。在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約pH 8.3。在一些實施例中，使約3至約12倍材料體積之再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約2至約12倍材料體積之消毒緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過使再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，將離子交換層析材料儲存於約1至5倍材料體積之儲存緩衝液中。在一些實施例中，將離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中。

在一些態樣中，本發明提供一種用於清潔離子交換層析材料供再使用之方法，其中層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟：a)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含乙酸鈉；b)使酸洗液穿過離子交換層析材料，c)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH及約1 M NaCl；及d)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，再生緩衝液及第二再生緩衝液包含約25至約600 mM NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液包含約350 mM NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液包含約40 mM NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約pH 2.0至7.0。在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約pH 4.0。在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約pH 5.0。在一些實施例中，使約3至約12倍材料體積之再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約7倍材料體積之再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，酸洗液為約167M NaOAc及約0.3M磷酸。在一些實施例中，使約1至約5倍材料體積之酸洗液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約3倍材料體積之酸洗液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約2至約12倍材料體積之消毒緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約4倍材料體積之消毒緩衝液穿過使再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，將離子交換層析材料儲存於約1至5倍材料體積之儲存緩衝液中。在一些實施例中，將離子交換層析材料儲存於約3倍材料體積之儲存緩衝液中。

在一些態樣中，本發明提供用於清潔離子交換層析材料(例如陽離子交換層析材料)供再使用之方法，其中層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟：a)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含Tris及乙酸鈉；b)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及c)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，再生緩衝液包含約25至約75 mM Tris及約50至約100 mM NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液包含約50 mM Tris及約85 mM NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約pH 7至9。在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約pH 8.0。在一些實施例中，使約3至約12倍材料體積之再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約2至約12倍材料體積之消毒緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過使再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，將離子交換層析材料儲存於約1至5倍材料體積之儲存緩衝液中。在一些實施例中，將離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中。

在一些態樣中，本發明提供用於使用離子交換層析材料(例如陽離子交換層析材料)自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含乙酸鈉；f)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，平衡緩衝液包含約20 mM至約60 mM乙酸鈉。在一些實施例中，平衡緩衝液包含約40 mM乙酸鈉。在一些實施例中，平衡緩衝液之pH值為約pH 5.0至約pH 6.0。在一些實施例中，平衡緩衝液之pH值為約pH 5.5。在一些實施例中，將離子交換層析材料用約3-7倍材料體積之平衡緩衝液洗滌。在一些實施例中，將離子交換層析材料用約5倍材料體積之平衡緩衝液洗滌。在一些實施例中，再生緩衝液包含約50至約600 mM NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液包含約350 mM NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約pH 4.0至11。在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約pH 8.3。在一些實施例中，使約3至約12倍材料體積之再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約2至約12倍材料體積之消毒緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過使再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，將離子交換層析材料儲存於約1至5倍材料體積之儲存緩衝液中。在一些實施例中，將離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中。

在一些態樣中，本發明提供一種用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度超過離子交換層析對該多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含乙酸鈉；f)使酸洗液穿過離子交換層析材料，g)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH及約1 M NaCl；及h)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，加載密度≤約1000 g/L。在一些實施例中，加載密度≥約20 g/L。在一些實施例中，加載密度≥約70 g/L。在一些實施例中，加載密度為離子交換層析材料對該多肽之動態結合容量之至少約2倍。在一些實施例中，加載密度為離子交換層析材料對該多肽之動態結合容量之約2倍至約100倍。在一些實施例中，加載密度為離子交換層析材料對該多肽之動態結合容量之約10倍。在一些實施例中，平衡緩衝液包含約50 mM至約100 mM NaOAc及約25 mM至約75 mM Tris。在一些實施例中，平衡緩衝液包含約85 mM乙酸鈉及約50 mM Tris。在一些實施例中，平衡緩衝液之pH值為約pH 6.0至約pH 10.0。在一些實施例中，平衡緩衝液之pH值為約pH 8.0。在一些實施例中，將離子交換層析材料用約5至約15倍材料體積之平衡緩衝液洗滌。在一些實施例中，將離子交換層析材料用約10倍材料體積之平衡緩衝液洗滌。在一些實施例中，再生緩衝液包含約25至約600 mM NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液包含約350 mM NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液包含約40 mM NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約pH 2.0至7.0。在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約pH 4.0。在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約pH 5.0。在一些實施例中，使約3至約12倍材料體積之再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約7倍材料體積之再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，酸洗液為約167M NaOAc及約0.3M磷酸。在一些實施例中，使約1至約5倍材料體積之酸洗液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約3倍材料體積之酸洗液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約2至約12倍材料體積之消毒緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約4倍材料體積之消毒緩衝液穿過使再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，將離子交換層析材料儲存於約1至5倍材料體積之儲存緩衝液中。在一些實施例中，將離子交換層析材料儲存於約3倍材料體積之儲存緩衝液中。

在一些態樣中，本發明提供用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含Tris及乙酸鈉；f)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。

在一些態樣中，本發明提供用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度≥20 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含乙酸鈉；f)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。

在一些實施例中，加載密度≥70 g/L。在一些態樣中，本發明提供用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度≥20 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含Tris及乙酸鈉；f)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。

在一些態樣中，本發明提供用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度超過離子交換層析對該多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含乙酸鈉；f)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，加載密度為離子交換層析材料對該多肽之動態結合容量之至少約2倍。在一些實施例中，加載密度為離子交換層析材料對該多肽之動態結合容量之約2倍至約100倍。在一些實施例中，加載密度為離子交換層析材料對該多肽之動態結合容量之約10倍。

在一些態樣中，本發明提供用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度超過離子交換層析對該多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含Tris及乙酸鈉；f)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。

在以上態樣之一些實施例中，平衡緩衝液包含約20 mM至約60 mM乙酸鈉。在一些實施例中，平衡緩衝液包含約40 mM乙酸鈉。在一些實施例中，平衡緩衝液之pH值為約pH 5.0至約pH 6.0。在一些實施例中，平衡緩衝液之pH值為約pH 5.5。在一些實施例中，將離子交換層析材料用約3-7倍材料體積之平衡緩衝液洗滌。在一些實施例中，將離子交換層析材料用約5倍材料體積之平衡緩衝液洗滌。在一些實施例中，再生緩衝液包含約25至約75 mM Tris及約50至約100 mM NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液包含約50 mM Tris及約85 mM NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約pH 7至9。在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約pH 8.0。在一些實施例中，使約3至約12倍材料體積之再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約2至約12倍材料體積之消毒緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過使再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，將離子交換層析材料儲存於約1至5倍材料體積之儲存緩衝液中。在一些實施例中，將離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中。

在本發明之一些實施例中，離子交換層析材料位於層析管柱中。在一些實施例中，離子交換層析材料為陽離子交換層析材料。在一些實施例中，離子交換層析材料包含鍵聯至載體基質之磺丙基部分。在一些實施例中，載體基質包含交聯聚(苯乙烯二乙烯基苯)。在一些實施例中，離子交換層析材料為POROS™ HS50材料。在一些實施例中，離子交換層析材料為混合模式陽離子交換材料。在一些實施例中，混合模式陽離子交換材料為Capto MMC™、Capto MMC™ ImpRes、Nuvia™ cPrime™或Toyopearl MX Trp-650M。

在本發明之一些實施例中，離子交換層析材料為陰離子交換層析材料。在一些實施例中，離子交換層析材料包含鍵聯至載體基質之一級胺、二級胺、三級胺或四級銨離子官能基、聚胺官能基或二乙胺基乙基官能基。在一些實施例中，離子交換層析材料為混合模式陰離子交換材料。在一些實施例中，混合模式陰離子交換材料為Capto Adhere™或Capto Adhere™ ImpRes。

在本發明之一些實施例中，離子交換層析材料用於大規模製備多肽。在一些實施例中，多肽為抗體、免疫黏附素、含Fc蛋白質或免疫結合物。在一些實施例中，多肽為抗體。在一些實施例中，抗體為單株抗體。在一些實施例中，單株抗體為嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。在一些實施例中，單株抗體為IgG單株抗體。在一些實施例中，抗體為抗原結合片段。在一些實施例中，抗原結合片段為Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv、二scFv、雙scFv、串聯(二、三)-scFv、Fv、sdAb、三功能抗體、BiTE、雙抗體或三抗體。在一些實施例中，抗體為雙特異性抗體。在一些實施例中，抗體選自由以下組成之群：抗CD20抗體、抗CD40抗體、抗HER2抗體、抗IL6抗體、抗IgE抗體、抗IL13抗體、抗Flu A抗體、抗TIGIT抗體、抗PD-L1抗體、抗VEGF-A抗體、抗VEGF-A/ANG2抗體、抗CD79b抗體、抗ST2抗體、抗因子D抗體、抗因子IX抗體、抗因子X抗體、抗aβ抗體、抗τ蛋白抗體、抗CEA抗體、抗CEA/CD3抗體、抗CD20/CD3抗體、抗FcRH5/CD3抗體、抗Her2/CD3抗體、抗FGFR1/KLB抗體、FAP-4-1 BBL融合蛋白及FAP-IL2v融合蛋白。在一些實施例中，抗體選自由以下組成之群：奧瑞珠單抗(ocrelizumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、托珠單抗(tocilizumab)、法瑞西單抗(faricimab)、普拉土珠單抗(polatuzumab)、甘特珠單抗(gantenerumab)、西比沙他單抗(cibisatamab)、克雷內珠單抗(crenezumab)、莫蘇尼妥珠單抗(mosunetuzumab)、替拉格魯單抗(tiragolumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、利妥昔單抗(rituximab)、阿特珠單抗(atezolizumab)、奧妥珠單抗(obinutuzumab)、蘭帕珠單抗(lampalizumab)、來金珠單抗(lebrikizumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)雷珠單抗(ranibizumab)、艾美賽珠單抗(emicizumab)、賽利克瑞盧單抗(selicrelumab)、普拉辛珠單抗(prasinezumab)、RO6874281及RO7122290。

在本發明之一些實施例中，在穿過離子交換層析材料之前將多肽使用親和層析材料純化，其中離子交換層析材料為陽離子交換層析材料。在一些實施例中，親和材料選自由以下組成之群：蛋白質A層析、蛋白質G層析、蛋白質A/G層析、蛋白質L層析、FcXL層析、蛋白質XL層析、κ層析及κXL層析。在一些實施例中，蛋白質A親和材料為MAbSelect材料、MAbSelect SuRe™材料或MAbSelect SuRe™ LX材料。在一些實施例中，使緩衝液以約15-20倍材料體積/小時穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使再生緩衝液以約10倍材料體積/小時穿過離子交換層析材料。

在本發明之一些實施例中，多肽在宿主細胞中產生。在一些實施例中，宿主細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在一些實施例中，雜質包含IgG片段、宿主細胞蛋白質或宿主細胞核酸中之一或多者。在一些實施例中，多肽在CHO細胞中產生且雜質包含CHO宿主細胞蛋白質(CHOP)及/或CHO核酸。

相關申請案之交叉參考

本申請案主張於2019年6月5日提出申請之美國臨時申請案第62/857,734號之優先權益，該臨時申請案以全文引用之方式併入本文中。

本文提供用於清潔離子交換層析材料供再使用之方法，其中層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟：a)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含乙酸鈉；b)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料；及c)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。在一些態樣中，本發明提供用於清潔離子交換層析材料供再使用之方法，其中層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟：a)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含Tris及乙酸鈉；b)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料；及c)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。

本文提供用於清潔陽離子交換層析材料供再使用之方法，其中層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟：a)使再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含乙酸鈉；b)使消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料；及c)將陽離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。在一些態樣中，本發明提供用於清潔陽離子交換層析材料供再使用之方法，其中層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟：a)使再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含Tris及乙酸鈉；b)使消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料；及c)將陽離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。

本文提供用於清潔陰離子交換層析材料供再使用之方法，其中層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟：a)使再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含乙酸鈉；b)使消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料；及c)將陰離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。在一些態樣中，本發明提供用於清潔陰離子交換層析材料供再使用之方法，其中層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟：a)使再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含Tris及乙酸鈉；b)使消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料；及c)將陰離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。

在一些態樣中，本發明提供一種用於清潔離子交換層析材料供再使用之方法，其中層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟：a)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含乙酸鈉；b)使酸洗液穿過離子交換層析材料，c)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH及約1 M NaCl；及d)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，離子交換材料為陰離子交換材料。在一些實施例中，離子交換材料為混合模式陰離子交換材料。

在一些態樣中，本發明提供用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含乙酸鈉；f)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料；及g)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。在一些態樣中，本發明提供一種用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含Tris及乙酸鈉；f)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料；g)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。

在一些態樣中，本發明提供用於使用陽離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陽離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陽離子交換層析材料；b)將組合物加載於陽離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陽離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含乙酸鈉；f)使消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料；及g)將陽離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。在一些態樣中，本發明提供一種用於使用陽離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陽離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陽離子交換層析材料；b)將組合物加載於陽離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陽離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含Tris及乙酸鈉；f)使消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料；g)將陽離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。

在一些態樣中，本發明提供用於使用陰離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陰離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陰離子交換層析材料；b)將組合物加載於陰離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陰離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含乙酸鈉；f)使消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料；及g)將陰離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。在一些態樣中，本發明提供一種用於使用陰離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陰離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陰離子交換層析材料；b)將組合物加載於陰離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陰離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含Tris及乙酸鈉；f)使消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料；g)將陰離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。

在一些態樣中，本發明提供用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度≥20 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含乙酸鈉；f)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料；及g)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。在一些態樣中，本發明提供一種用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度≥20 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含Tris及乙酸鈉；f)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料；g)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。

在一些態樣中，本發明提供用於使用陽離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陽離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陽離子交換層析材料；b)將組合物加載於陽離子交換層析材料上，其中加載密度≥20 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陽離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含乙酸鈉；f)使消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料；及g)將陽離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。在一些態樣中，本發明提供一種用於使用陽離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陽離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陽離子交換層析材料；b)將組合物加載於陽離子交換層析材料上，其中加載密度≥20 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陽離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含Tris及乙酸鈉；f)使消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料；g)將陽離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。

在一些態樣中，本發明提供用於使用陰離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陰離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陰離子交換層析材料；b)將組合物加載於陰離子交換層析材料上，其中加載密度≥20 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陰離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含乙酸鈉；f)使消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料；及g)將陰離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。在一些態樣中，本發明提供一種用於使用陰離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陰離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陰離子交換層析材料；b)將組合物加載於陰離子交換層析材料上，其中加載密度≥20 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陰離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含Tris及乙酸鈉；f)使消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料；g)將陰離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。

在一些態樣中，本發明提供用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度超過離子交換層析材料對多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含乙酸鈉；f)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料；及g)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。在一些態樣中，本發明提供一種用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度超過離子交換層析材料對多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含Tris及乙酸鈉；f)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料；g)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。

在一些態樣中，本發明提供用於使用陽離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陽離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陽離子交換層析材料；b)將組合物加載於陽離子交換層析材料上，其中加載密度超過陽離子交換層析材料對多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陽離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含乙酸鈉；f)使消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料；及g)將陽離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。在一些態樣中，本發明提供一種用於使用陽離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陽離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陽離子交換層析材料；b)將組合物加載於陽離子交換層析材料上，其中加載密度超過陽離子交換層析材料對多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陽離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含Tris及乙酸鈉；f)使消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料；g)將陽離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。

在一些態樣中，本發明提供用於使用陰離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陰離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陰離子交換層析材料；b)將組合物加載於陰離子交換層析材料上，其中加載密度超過陰離子交換層析材料對多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陰離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含乙酸鈉；f)使消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料；及g)將陰離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。在一些態樣中，本發明提供一種用於使用陰離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陰離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陰離子交換層析材料；b)將組合物加載於陰離子交換層析材料上，其中加載密度超過陰離子交換層析材料對多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陰離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含Tris及乙酸鈉；f)使消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料；g)將陰離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。

在一些態樣中，本發明提供一種用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度超過離子交換層析對該多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含乙酸鈉；f)使酸洗液穿過離子交換層析材料，g)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH及約1 M NaCl；及h)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，離子交換層析材料為陽離子交換層析材料。在一些實施例中，離子交換層析材料為陰離子交換層析材料。在一些實施例中，離子交換層析材料為混合模式陰離子交換層析材料。在一些實施例中，離子交換層析材料為Capto™ Adhere層析材料。

在本發明之一些實施例中，離子交換層析(例如陽離子交換層析)用於大規模製備多肽。在一些實施例中，多肽為抗體；例如單株抗體。定義

術語「多肽」或「蛋白質」在本文中可互換地用於指任何長度之胺基酸聚合物。聚合物可為直鏈或具支鏈的，其可包含經修飾胺基酸，且其可由非胺基酸間隔開。該等術語亦涵蓋已天然地或藉由干預修飾之胺基酸聚合物；例如二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操縱或修飾，諸如與標記組分結合。該定義內亦包括例如含有一或多種胺基酸類似物(包括例如非天然胺基酸等)之多肽，以及此項技術中已知之其他修飾。如本文所用之術語「多肽」及「蛋白質」特定而言涵蓋抗體。

「經純化」之多肽(例如抗體或免疫黏附素)意謂多肽純度已增加，使得其以比其存在於其天然環境及/或當最初在實驗室條件下合成及/或擴增時更純之形式存在。純度為相對術語且不一定意謂絕對純度。

如本文所用，「過載層析」係指加載之相關產物超過層析材料對產物之動態結合容量的層析程序。雜質比產物結合得更強，從而在蛋白質穿透之後得到經純化產物溶析物。在一些實例中，在達到動態結合容量之後在流穿物(flow through)中之級分中收集相關產物。

如本文所用，層析材料之「材料體積」為用於層析程序之層析材料的總體積。舉例而言，當層析材料在管柱中時，材料體積為管柱中之層析材料的總體積。在此實例中，「材料體積」亦可稱為「管柱體積」。

「結合」相關抗原(例如腫瘤相關多肽抗原靶標)之多肽為以充足之親和力結合抗原使得多肽在靶向表現抗原之細胞或組織時適合作為診斷及/或治療劑且不顯著地與其他多肽交叉反應的多肽。在該等實施例中，如藉由螢光活化細胞分選(FACS)分析或放射免疫沈澱(RIA)所測定，多肽與「非靶標」多肽結合之程度將小於多肽與其特定目標多肽之結合的約10%。

關於多肽與目標分子之結合，術語「特異性結合」或「特異性結合於」特定多肽或特定多肽靶標上之抗原決定基或「對特定多肽或特定多肽靶標上之抗原決定基具特異性」意謂結合可量測地不同於非特異性相互作用。特異性結合可例如藉由測定與對照分子之結合相比的分子結合來量測，該對照分子通常為具有類似結構且不具有結合活性之分子。舉例而言，特異性結合可藉由與類似於靶標之對照分子(例如過量之非標記靶標)競爭來測定。在此情況下，若經標記靶標與探針之結合受到過量未標記靶標之競爭性抑制，則指示特異性結合。

術語「抗體」在本文中以廣義使用且特定地涵蓋單株抗體、多株抗體、由至少兩種完整抗體形成之多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要該等抗體片段展現所需生物活性即可。術語「免疫球蛋白」(Ig)在本文中與抗體可互換使用。

抗體為天然存在之免疫球蛋白分子，其具有變化之結構，全部係基於免疫球蛋白摺疊。舉例而言，IgG抗體具有以二硫鍵鍵結之兩條「重」鏈及兩條「輕」鏈以形成功能性抗體。各重鏈及輕鏈本身包含「恆定」(C)及「可變」(V)區。V區決定抗體之抗原結合特異性，而C區提供結構支撐及在與免疫效應子之非抗原特異性相互作用中之功能。抗體或抗體之抗原結合片段之抗原結合特異性為抗體特異性結合於特定抗原之能力。

抗體之抗原結合特異性由V區之結構特徵決定。變異性在可變結構域之110-胺基酸跨度內不均勻地分佈。反而，V區由被稱為「高變區」且各自長9-12個胺基酸之具有極端變異性之較短區域隔開的稱為構架區(FR)且具有15-30個胺基酸之相對不變的延伸段組成。天然重鏈及輕鏈之可變結構域各自包含主要採用β-摺疊構形之四個FR，其由三個高變區(「HVR」)連接，該三個高變區形成環連接，且在一些情況下形成β-摺疊結構之一部分。各鏈中之高變區藉由FR且與來自其他鏈之高變區緊密地結合在一起，促使形成抗體之抗原結合位點(參見Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。恆定結構域不直接參與抗體與抗原之結合，但展現各種效應功能，諸如使抗體參與抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。

各V區典型地包含三個高變區，例如互補決定區(「CDR」)，其各自含有「高變環」及四個構架區。因此，抗體結合位點(以相當大親和力結合於特定所需抗原所需之最小結構單位)將典型地包括三個CDR及其間散佈之至少三個、較佳四個構架區以保持及呈現呈適當構象之CDR。經典四鏈抗體具有由V_H 及V_L 結構域合作確定之抗原結合位點。某些抗體(諸如駱駝及鯊魚抗體)缺乏輕鏈且依賴於僅由重鏈形成之結合位點。可製備單結構域工程化免疫球蛋白，其中結合位點由單獨重鏈或輕鏈形成，V_H 與V_L 之間不存在合作。

術語「可變」係指可變結構域之某些部分在序列方面在抗體間不完全不同且用於各特定抗體對其特定抗原之結合及特異性中的事實。然而，變異性在抗體之可變結構域中不均勻分佈。其在輕鏈與重鏈可變結構域中集中於稱為高變區之三個區段中。可變結構域之更高度保守部分稱為構架區(FR)。天然重鏈及輕鏈之可變結構域各包含主要採用β-摺疊構形之四個FR，其由三個高變區連接，該三個高變區形成環連接，且在一些情況下形成β-摺疊結構之一部分。各鏈中之高變區藉由FR且與來自其他鏈之高變區緊密地結合在一起，促使形成抗體之抗原結合位點(參見Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。恆定結構域不直接參與抗體與抗原之結合，但展現各種效應功能，諸如使抗體參與抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。

術語「高變區」當在本文中使用時係指抗體中負責抗原結合之胺基酸殘基。高變區可包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基(例如V_L 中圍繞約殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)及89-97 (L3)，以及V_H 中圍繞約31-35b (H1)、50-65 (H2)及95-102 (H3) (Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))及/或來自「高變環」之彼等殘基(例如V_L 中之殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)及91-96 (L3)，以及V_H 中之26-32 (H1)、52A-55 (H2)及96-101 (H3) (Chothia及LeskJ. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。

「構架」或「FR」殘基為除如本文所定義之高變區殘基外之彼等可變結構域殘基。

「抗體片段」包含完整抗體之一部分，較佳包含其抗原結合區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')₂ 及Fv片段；雙抗體；串聯雙抗體(taDb)、三抗體、線性抗體(例如美國專利第5,641,870號，實例2；Zapata等人,Protein Eng . 8(10):1057-1062 (1995))；單臂抗體、單可變結構域抗體、微型抗體、單鏈抗體分子；由抗體片段(例如包括但不限於Db-Fc、taDb-Fc、taDb-CH3、(scFV)4-Fc、sc-Fv、二scFv、雙scFv或串聯(二、三)-scFv)形成之多特異性抗體；雙特異性T細胞銜接器(BiTE)及三功能抗體。

抗體之木瓜蛋白酶消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，各自具有單一抗原結合位點；以及剩餘的「Fc」片段，其名稱反映其容易結晶之能力。胃蛋白酶處理產生F(ab')₂ 片段，其具有兩個抗原結合位點且仍能夠交聯抗原。

「Fv」為含有完全抗原識別及抗原結合位點之最小抗體片段。此區域由緊密、非共價締合之一個重鏈及一個輕鏈可變結構域之二聚體組成。正是在此構形中，各可變結構域之三個高變區相互作用以界定V_H -V_L 二聚體之表面上的抗原結合位點。總起來說，六個高變區賦予抗體抗原結合特異性。然而，即使單一可變結構域(或僅包含三個對抗原具特異性之高變區之一半Fv)亦具有識別及結合抗原之能力，不過與整個結合位點相比親和力較低。

Fab片段亦含有輕鏈之恆定結構域及重鏈之第一恆定結構域(CH1)。Fab'片段因在重鏈CH1結構域之羧基端添加包括來自抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸在內之幾個殘基而不同於Fab片段。Fab'-SH為本文中針對其中恆定結構域之半胱胺酸殘基帶有至少一個游離硫醇基之Fab'的命名。F(ab')₂ 抗體片段最初作為兩者之間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab'片段對而產生。抗體片段之其他化學偶合亦為已知的。

來自任何脊椎動物物種之抗體(免疫球蛋白)之「輕鏈」均可基於其恆定結構域之胺基酸序列分配至兩種明顯不同之類型(稱為κ及λ)中之一者中。

視其重鏈之恆定結構域之胺基酸序列而定，抗體可分配至不同類別中。存在五大類別完整抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中若干可進一步劃分成諸多個子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及IgA2。對應於不同類別之抗體的重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同類別之免疫球蛋白之次單元結構及三維構形為熟知的。

「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體之V_H 及V_L 結構域，其中此等結構域存在於單一多肽鏈中。在一些實施例中，Fv多肽在V_H 與V_L 結構域之間進一步包含多肽連接子，該多肽連接子使scFv能夠形成抗原結合所需之結構。關於scFv之綜述參見Plückthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies , 第113卷, Rosenburg及Moore編, Springer-Verlag, New York, 第269-315頁(1994)。

術語「雙抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段包含相同多肽鏈(V_H -V_L )中連接至輕鏈可變結構域(V_L )之重鏈可變結構域(V_H )。藉由使用太短而不允許相同鏈上之兩個結構域之間配對的連接子，結構域被迫與另一鏈之互補結構域配對且形成兩個抗原結合位點。雙抗體更充分地描述於例如EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 90:6444-6448 (1993)中。

術語「多特異性抗體」以廣義使用且特定地涵蓋具有多抗原決定基特異性之抗體。此類多特異性抗體包括但不限於包含重鏈可變結構域(V_H )及輕鏈可變結構域(V_L )且其中V_H V_L 單元具有多抗原決定基特異性之抗體、具有兩個或更多個V_L 及V_H 結構域且各V_H V_L 單元結合於不同抗原決定基之抗體、具有兩個或更多個單一可變結構域且各單一可變結構域結合於不同抗原決定基之抗體、全長抗體、抗體片段(諸如Fab、Fv、dsFv、scFv)、雙抗體、雙特異性雙抗體、三抗體、三功能抗體、已共價或非共價鍵聯之抗體片段。「多抗原決定基特異性」係指特異性結合於相同或不同靶標上之兩種或更多種不同抗原決定基的能力。「單特異性」係指僅結合一種抗原決定基之能力。根據一個實施例，多特異性抗體為以5 µM至0.001 pM、3 µM至0.001 pM、1 µM至0.001 pM、0.5 µM至0.001 pM或0.1 µM至0.001 pM之親和力結合於各抗原決定基的IgG抗體。

表述「單結構域抗體」(sdAb)或「單可變結構域(SVD)抗體」通常指單一可變結構域(VH或VL)可賦予抗原結合之抗體。換言之，單一可變結構域不需要為識別靶標抗原與另一可變結構域相互作用。單結構域抗體之實例包括衍生自駱駝(美洲駝及駱駝)及軟骨魚(例如鉸口鯊)之彼等單結構域抗體及來自人及小鼠抗體之衍生自重組方法之彼等單結構域抗體((Nature (1989) 341:544-546；Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56；Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235；Trends Biotechnol (2003):21:484-490；WO 2005/035572；WO 03/035694；FEBs Lett (1994) 339:285-290；WO00/29004；WO 02/051870)。

如本文所用之術語「單株抗體」係指獲自實質上均質抗體之群體(亦即構成群體之個別抗體為相同的及/或結合相同抗原決定基)的抗體，除了在單株抗體之製備期間可產生之可能的變異體，此類變異體通常以微小量存在。與典型地包括針對不同決定位(抗原決定基)之不同抗體之多株抗體製劑相比，各單株抗體係針對抗原上之單一決定位。除其特異性之外，單株抗體亦為有利的，因為其未由其他免疫球蛋白污染。修飾語「單株」指示抗體之特徵為獲自實質上均質之抗體群體，且不應被視為需要藉由任何特定方法來產生抗體。舉例而言，要根據本文所提供之方法使用之單株抗體可藉由Kohler等人, Nature 256:495 (1975)首先描述之雜交瘤方法來製備，或可通過重組DNA方法製備(參見例如美國專利第4,816,567號)。「單株抗體」亦可使用例如Clackson等人, Nature 352:624-628 (1991)及Marks等人, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)中所描述之技術自噬菌體抗體文庫分離。

本文中之單株抗體特定地包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與抗體中衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或子類之對應序列相同或同源，而鏈之其餘部分與抗體中衍生自另一物種或屬於另一抗體類別或子類之對應序列相同或同源；以及此類抗體之片段，只要其展現所需生物活性即可(美國專利第4,816,567號；Morrison等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。本文中之相關嵌合抗體包括包含衍生自非人類靈長類動物(例如舊大陸猴，諸如狒狒、恆河猴或食蟹猴)之可變結構域抗原結合序列及人類恆定區序列(美國專利第5,693,780號)的「靈長類化」抗體。

非人類(例如鼠類)抗體之「人類化」形式為含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。在大多數情況下，人類化抗體為人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中接受者之高變區之殘基由具有所需特異性、親和力及能力之非人類物種(諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物) (供給者抗體)之高變區的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之構架區(FR)殘基由對應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含在接受者抗體中或供給者抗體中未發現之殘基。進行此等修飾以進一步改進抗體效能。一般而言，人類化抗體將包含至少一個且典型地兩個可變結構域之實質上全部，其中全部或實質上全部高變環對應於非人類免疫球蛋白之高變環且全部或實質上全部FR為人類免疫球蛋白序列之FR，除了如上文所提及之FR取代。人類化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白恆定區(典型地人類免疫球蛋白之恆定區)之至少一部分。其他細節參見Jones等人,Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等人, Nature 332:323-329 (1988)；及Presta,Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。

出於本文之目的，「完整抗體」為包含重可變結構域及輕可變結構域以及Fc區之抗體。恆定結構域可為天然序列恆定結構域(例如人類天然序列恆定結構域)或其胺基酸序列變異體。較佳地，完整抗體具有一或多種效應功能。

「天然抗體」通常為由兩條相同輕(L)鏈及兩條相同重(H)鏈組成之約150,000道爾頓之雜四聚糖蛋白。各輕鏈藉由一個共價二硫鍵鍵聯至重鏈，同時在不同免疫球蛋白同型之重鏈間二硫鍵之數目不同。各重鏈及輕鏈亦具有有規律地間隔開之鏈內二硫橋。各重鏈在一端具有可變結構域(V_H )，隨後為許多恆定結構域。各輕鏈在一端具有可變結構域(V_L )且在另一端具有恆定結構域；輕鏈之恆定結構域與重鏈之第一恆定結構域對齊，且輕鏈可變結構域與重鏈之可變結構域對齊。咸信特定胺基酸殘基形成輕鏈與重鏈可變結構域之間的界面。

「裸抗體」為不結合至異源分子(諸如細胞毒性部分或放射性標記)之抗體(如本文所定義)。

在一些實施例中，抗體「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變異體Fc區)的彼等生物活性，且隨抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；噬菌作用；細胞表面受體之下調。

「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」及「ADCC」係指細胞介導之反應，其中表現Fc受體(FcR)之非特異性細胞毒性細胞(例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性粒細胞及巨噬細胞)識別目標細胞上結合之抗體且隨後引起目標細胞之溶解。用於介導ADCC之原代細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現概述於Ravetch及Kinet,Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)第464頁之表3中。為評估相關分子之ADCC活性，可進行活體外ADCC分析，諸如描述於美國專利第5,500,362號或第5,821,337號中之活體外ADCC分析。適用於此類分析之效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。另選地或另外，可例如在動物模型，諸如Clynes等人, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998)中所揭示之動物模型中在活體內評估相關分子之ADCC活性。

「人類效應細胞」為表現一或多個FcR且執行效應功能之白細胞。在一些實施例中，細胞至少表現FcγRIII且執行ADCC效應功能。介導ADCC之人類白細胞之實例包括外周血單核細胞(PBMC)、自然殺手(NK)細胞、單核球、細胞毒性T細胞及嗜中性粒細胞；且PBMC及NK細胞為較佳的。

術語「Fc受體」或「FcR」用於描述結合於抗體之Fc區的受體。在一些實施例中，FcR為天然序列人類FcR。此外，較佳FcR為結合IgG抗體(γ受體)之FcR且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體，包括等位基因變異體及此等受體之替代剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA (「活化受體」)及FcγRIIB (「抑制受體」)，其具有類似胺基酸序列，該等胺基酸序列主要在其胞質結構域中不同。活化受體FcγRIIA在其胞質結構域中含有免疫受體酪胺酸基活化基元(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其胞質結構域中含有免疫受體酪胺酸基抑制基元(ITIM)。(參見 Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997))。FcR評述於Ravetch及Kinet,Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel等人, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及de Haas等人, J. Lab. Clin. Med . 126:330-41 (1995)中。本文中之術語「FcR」涵蓋其他FcR，包括將來要鑑定之彼等FcR。該術語亦包括新生兒受體FcRn，其負責母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人, J. Immunol . 117:587 (1976)及Kim等人, J. Immunol . 24:249 (1994))。

如本文關於層析所用之術語「依序」係指使第一層析隨後為第二層析。在第一層析與第二層析之間可包括其他步驟。

如本文關於層析所用之術語「連續」係指使第一層析材料與第二層析材料直接連接或允許兩種層析材料之間連續流動之另外一些機制。

如本文所用之術語「分離之」係指分子已與典型地在自然界中與其一起存在或一起產生之至少一些組分分離。舉例而言，當多肽與產生它之細胞之至少一些組分分離時，將該多肽稱為「分離之」多肽。在多肽表現之後由細胞分泌之情況下，以物理方式將含有該多肽之上清液與產生它之細胞分離被視為「分離」該多肽。類似地，當聚核苷酸不為其典型地在自然界中發現之更大聚核苷酸 (諸如在DNA聚核苷酸之情況下為基因體DNA或線粒體DNA)的一部分，或與產生它之細胞之至少一些組分分離(例如在RNA聚核苷酸之情況下)時，將該聚核苷酸稱為「分離之」聚核苷酸。因此，宿主細胞內部之載體中所含之DNA聚核苷酸可稱為「分離之」DNA聚核苷酸。

「污染物」係指不同於所需多肽產物之材料。污染物包括但不限於：宿主細胞材料，諸如CHO宿主細胞蛋白質(CHOP)；浸出蛋白質A；核酸；所需多肽之變異體、片段、聚集物或衍生物；另一多肽；內毒素；病毒污染物；細胞培養基組分等。在一些實例中，污染物可為來自例如但不限於細菌細胞(諸如大腸桿菌(E. coli )細胞)、昆蟲細胞、原核細胞、真核細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、禽類細胞、真菌細胞之宿主細胞蛋白質(HCP)。

在本文中提及「約」為一值或參數包括(且描述)關於該值或參數本身之變化。舉例而言，提及「約X」之描述包括「X」之描述。

除非上下文另外明確指示，否則如本文及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一(種/個)」、「或」及「該」包括複數指示物。應瞭解，本文所描述之本發明之態樣及變化形式包括「由態樣及變化形式組成」及/或「基本上由態樣及變化形式組成」。層析清潔之方法 層析

本發明提供用於清潔或再生離子交換層析材料供再使用之方法，其中離子交換層析以過載模式使用。在一些實施例中，層析材料用於大規模純化多肽；例如製造規模製備多肽，諸如抗體或其片段。在一些實施例中，離子交換層析材料為陽離子交換層析材料。在一些實施例中，離子交換層析材料為陰離子交換層析材料。

在一些態樣中，本發明提供用於清潔離子交換層析材料供再使用之方法，其中層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟：a)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含乙酸鈉(NaOAc)；b)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料；及c)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。在一些實施例中，離子交換層析材料為陽離子交換層析材料。在一些實施例中，離子交換層析材料為陰離子交換層析材料。

在一些實施例中，再生緩衝液包含約50至約600 mM NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液包含濃度範圍為約50 mM至600 mM、100 mM至600 mM、150 mM至600 mM、200 mM至600 mM、250 mM至600 mM、300 mM至600 mM、350 mM至600 mM、400 mM至600 mM、450 mM至600 mM、500 mM至600 mM、550 mM至600 mM、50 mM至550 mM、50 mM至450 mM、50 mM至400 mM、50 mM至350 mM、50 mM至300 mM、50 mM至250 mM、50 mM至200 mM、50 mM至150 mM、50 mM至100 mM、100 mM至550 mM、150 mM至500 mM、200 mM至450 mM、250 mM至400 mM或300 mM至400 mM中之任一者的NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液包含約50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600或650 mM中之任一者的NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液包含約350 mM NaOAc。

在一些實施例中，再生緩衝液包含濃度範圍為約70 mM至100 mM、75 mM至95 mM或80 mM至90 mM中之任一者的NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液包含85 mM NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液包含濃度範圍為約70 mM至100 mM、75 mM至95 mM或80 mM至90 mM中之任一者的NaOAc且進一步包含Tris。在一些實施例中，再生緩衝液包含濃度範圍為約70 mM至100 mM、75 mM至95 mM或80 mM至90 mM中之任一者的NaOAc且進一步包含約25 mM至75 mM、30 mM至75 mM、35 mM至40 mM、45 mM至75 mM、50 mM至75 mM、25 mM至70 mM、25 mM至65 mM、25 mM至60 mM、25 mM至55 mM或25 mM至50 mM中之任一者的Tris。在一些實施例中，再生緩衝液包含濃度範圍為約70 mM至100 mM、75 mM至95 mM或80 mM至90 mM中之任一者的NaOAc且進一步包含約25 mM、30 mM、35 mM、40 mM、45 mM、50 mM、55 mM、60 mM、65 mM、70 mM或75 mM中之任一者的Tris。在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約pH 4.0至約pH 11.0。在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約pH 4.0至約pH 10.5、約pH 4.0至約pH 10.0、約pH 4.0至約pH 9.5、約pH 4.0至約pH 9.0、約pH 4.0至約pH 8.5、約pH 4.0至約pH 8.0、約pH 5.5至約pH 11.0、約pH 5.5至約pH 10.5、約pH 5.5至約pH 10.0、約pH 5.5至約pH 9.5、約pH 5.5至約pH 9.0、約pH 5.5至約pH 8.5、約pH 5.5至約pH 8.0、約pH 6.0至約pH 11.0、約pH 6.5至約pH 11.0、約pH 7.0至約pH 11.0、約pH 7.5至約pH 11.0、約pH 8.0至約pH 11.0、約pH 6.0至約pH 11.0、約pH 6.5至約pH 10.5、約pH 7.0至約pH 10.0、約pH 7.5至約pH 9.5或約pH 8.0至約pH 9.0。在一些實施例中，再生緩衝液為約pH 7.5、約pH 8.0、約pH 8.1、約pH 8.2、約pH 8.3、約pH 8.4、約pH 8.5或約pH 9.0。在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約pH 8.3。在一些實施例中，包含約350 mM NaOAc之再生緩衝液之pH值為約pH 8.3。在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約pH 8。在一些實施例中，包含約50 mM Tris及約85 mM NaOAc之再生緩衝液之pH值為約pH 8.0。

在一些實施例中，使約3至約12、約3至約11、約3至約10、約3至約9、約3至約8、約3至約7、約3至約6、約3至約5、約3至約4、約4至約12、約5至約12、約6至約12、約7至約12、約8至約12、約9至約12、約10至約12、約11至約12、約5至約12、約5至約10、約8至約12或約9至約11倍材料體積(例如管柱體積)之再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約3、4、5、6、7、8、9、10、11或12倍材料體積(例如管柱體積)中之任一者之再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約10倍材料體積(例如管柱體積)之再生緩衝液穿過離子交換層析材料。

在一些態樣中，本發明提供一種用於清潔離子交換層析材料供再使用之方法，其中層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟：a)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含乙酸鈉；b)使酸洗液穿過離子交換層析材料，c)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH及約1 M NaCl；及d)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，離子交換層析材料為陽離子交換層析材料。在一些實施例中，離子交換層析材料為陰離子交換層析材料。在一些實施例中，離子交換層析材料為混合模式陰離子交換層析材料。在一些實施例中，離子交換層析材料為Capto™ Adhere層析材料。

在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約pH 2.0至約pH 7.0。在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約pH 2.0至約pH 6.5、約pH 2.0至約pH 6.0、約pH 2.0至約pH 5.5、約pH 2.0至約pH 5.0、約pH 2.0至約pH 4.5、約pH 2.0至約pH 4.0、約pH 2.0至約pH 3.5、約pH 2.0至約pH 3.0、約pH 2.0至約pH 2.5、約pH 2.5至約pH 7.0、約pH 3.0至約pH 7.0、約pH 3.5至約pH 7.0、約pH 4.0至約pH 7.0、約pH 4.5至約pH 7.0、約pH 5.0至約pH 7.0、約pH 5.5至約pH 7.0、約pH 6.0至約pH 7.0或約pH 6.5至約pH 7.0。在一些實施例中，再生緩衝液為約pH 2.0、約pH 8.0、約pH 2.5、約pH 3.0、約pH 3.5、約pH 4.0、約pH 4.5、約pH 5.0、約pH 5.5、約pH 6.0、約pH 6.5或約pH 7.0。在一些實施例中，再生緩衝液為350 mM NaOAc，pH 4.0。在一些實施例中，再生緩衝液為350 mM NaOAc，pH 5.0。在一些實施例中，再生緩衝液為40 mM NaOAc，pH 4.0。在一些實施例中，再生緩衝液為40 mM NaOAc，pH 5.0。

在一些實施例中，使約3至約12、約3至約11、約3至約10、約3至約9、約3至約8、約3至約7、約3至約6、約3至約5、約3至約4、約4至約12、約5至約12、約6至約12、約7至約12、約8至約12、約9至約12、約10至約12、約11至約12、約5至約12、約5至約10、約8至約12或約9至約11倍材料體積(例如管柱體積)之再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約3、4、5、6、7、8、9、10、11或12倍材料體積(例如管柱體積)中之任一者之再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約7倍材料體積(例如管柱體積)之再生緩衝液穿過離子交換層析材料。

在一些實施例中，酸洗液包含NaOAc。在一些實施例中，酸洗液包含磷酸。在一些實施例中，酸洗液包含NaOAc及磷酸。在一些實施例中，酸洗液中NaOAc之濃度大於約0.1M至小於約0.5 M中之任一者。在一些實施例中，酸洗液中NaOAc之濃度為約0.100 M、0.120M、0.130M、0.140M、0.150M、0.160M、0.161M、0.162M、0.163M、0.164M、0.167M、0.168M、0.169M、0.170M、0.180M、0.190M、0.200M、0.250M、0.300M、0.350M、0.400M、0.450M或0.500M中之任一者。在一些實施例中，酸洗液中磷酸之濃度為約0.10 M、0.15M、0.20M、0.25M、0.30M、0.35M、0.40M、0.45M、0.50M、0.55M或0.60M中之任一者。在一些實施例中，酸洗液包含約0.167M NaOAc及約0.3M磷酸。

在一些實施例中，使約1至約5、約1至約4、約1至約3、約1至約2、約2至約5、約2至約4、約2至約3、約3至約5、約3至約4、約4至約5倍材料體積(例如管柱體積)之酸洗液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約1、2、3、4或5倍材料體積(例如管柱體積)中之任一者的酸洗液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約3倍材料體積(例如管柱體積)之酸洗液穿過離子交換層析材料。

在一些態樣中，本發明提供用於清潔離子交換層析材料供再使用之方法，其中層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟：a)使第一再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含乙酸鈉；b)使第二再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中第二再生緩衝液包含乙酸鈉，c)使酸洗液穿過離子交換層析材料，使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH及約1 M NaCl；及d)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，離子交換層析材料為陽離子交換層析材料。在一些實施例中，離子交換層析材料為陰離子交換層析材料。在一些實施例中，離子交換層析材料為混合模式陰離子交換層析材料。在一些實施例中，離子交換層析材料為Capto™ Adhere層析材料。

在一些實施例中，第一再生緩衝液及/或第二再生緩衝液包含約50至約600 mM NaOAc。在一些實施例中，第一再生緩衝液及/或第二再生緩衝液包含濃度範圍為約25 mM至600 mM、30 mM至600 mM、40 mM至600 mM、50 mM至600 mM、75 mM至600 mM、100 mM至600 mM、125 mM至600 mM、150 mM至600 mM、175 mM至600 mM、200 mM至600 mM、225 mM至600 mM、250 mM至600 mM、275 mM至600 mM、300 mM至600 mM、325 mM至600 mM、350 mM至600 mM、375 mM至600 mM、400 mM至600 mM、450 mM至600 mM、500 mM至600 mM、550 mM至600 mM、25 mM至550 mM、25 mM至500 mM、25 mM至475 mM、25 mM至450 mM、25 mM至425 mM、25 mM至400 mM、25 mM至375 mM、25 mM至550 mM、25 mM至325 mM、25 mM至300 mM、25 mM至275 mM、25 mM至250 mM、25 mM至225 mM、25 mM至200 mM、25 mM至175 mM、25 mM至150 mM、25 mM至125 mM、25 mM至100 mM、25 mM至90 mM、25 mM至80 mM、25 mM至70 mM、25 mM至60 mM、25 mM至50 mM、25 mM至40 mM或25 mM至30 mM中之任一者的NaOAc。在一些實施例中，第一再生緩衝液包含約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或600 mM中之任一者的NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液包含約350 mM NaOAc。

在一些實施例中，第一再生緩衝液及/或第二再生緩衝液之pH值為約pH 2.0至約pH 7.0。在一些實施例中，第一再生緩衝液及/或第二再生緩衝液之pH值為約pH 2.0至約pH 6.5、約pH 2.0至約pH 6.0、約pH 2.0至約pH 5.5、約pH 2.0至約pH 5.0、約pH 2.0至約pH 4.5、約pH 2.0至約pH 4.0、約pH 2.0至約pH 3.5、約pH 2.0至約pH 3.0、約pH 2.0至約pH 2.5、約pH 2.5至約pH 7.0、約pH 3.0至約pH 7.0、約pH 3.5至約pH 7.0、約pH 4.0至約pH 7.0、約pH 4.5至約pH 7.0、約pH 5.0至約pH 7.0、約pH 5.5至約pH 7.0、約pH 6.0至約pH 7.0或約pH 6.5至約pH 7.0。在一些實施例中，再生緩衝液為約pH 2.0、約pH 8.0、約pH 2.5、約pH 3.0、約pH 3.5、約pH 4.0、約pH 4.5、約pH 5.0、約pH 5.5、約pH 6.0、約pH 6.5或約pH 7.0。

在一些實施例中，第一再生緩衝液為約40 mM NaOAc及約pH 4.0，且第二再生緩衝液為約350 mM NaOAc及約pH 4.0。在一些實施例中，第一再生緩衝液為約40 mM NaOAc及約pH 5.0，且第二再生緩衝液為約350 mM NaOAc及約pH 5.0。在一些實施例中，第一再生緩衝液為約350 mM NaOAc及約pH 4.0，且第二再生緩衝液為約40 mM NaOAc及約pH 4.0。在一些實施例中，第一再生緩衝液為約350 mM NaOAc及約pH 5.0，且第二再生緩衝液為約40 mM NaOAc及約pH 5.0。

在一些實施例中，使約3至約12、約3至約11、約3至約10、約3至約9、約3至約8、約3至約7、約3至約6、約3至約5、約3至約4、約4至約12、約5至約12、約6至約12、約7至約12、約8至約12、約9至約12、約10至約12、約11至約12、約5至約12、約5至約10、約8至約12或約9至約11倍材料體積(例如管柱體積)之第一再生緩衝液及/或第二再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約3、4、5、6、7、8、9、10、11或12倍材料體積(例如管柱體積)中之任一者的第一再生緩衝液及/或第二再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約10倍材料體積(例如管柱體積)之第一再生緩衝液及/或第二再生緩衝液穿過離子交換層析材料。

在一些實施例中，消毒緩衝液包含NaOH。在一些實施例中，消毒緩衝液包含約0.1 N至約1.0 N NaOH、約0.1 N至約0.9 N NaOH、約0.1 N至約0.8 N NaOH、約0.1 N至約0.7 N NaOH、約0.1 N至約0.8 N NaOH、約0.1 N至約0.6 N NaOH、約0.1 N至約0.5 N NaOH、約0.2 N至約1.0 N NaOH、約0.3 N至約1.0 N NaOH、約0.4 N至約1.0 N NaOH、約0.5 N至約1.0 N NaOH、約0.2 N至約0.8 N NaOH、約0.3 N至約0.7 N NaOH或約0.4 N至約0.6 N NaOH。在一些實施例中，消毒緩衝液包含約0.1 N、0.2 N、0.3 N、0.4 N、0.5 N、0.6 N、0.7 N NaOH、0.8 N、0.9 N或1.0 N NaOH中之任一者。在一些實施例中，消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH。

在一些實施例中，消毒緩衝液包含NaOH及NaCl。在一些實施例中，消毒緩衝液包含約0.1 N至約1.0 N NaOH、約0.1 N至約0.9 N NaOH、約0.1 N至約0.8 N NaOH、約0.1 N至約0.7 N NaOH、約0.1 N至約0.8 N NaOH、約0.1 N至約0.6 N NaOH、約0.1 N至約0.5 N NaOH、約0.2 N至約1.0 N NaOH、約0.3 N至約1.0 N NaOH、約0.4 N至約1.0 N NaOH、約0.5 N至約1.0 N NaOH、約0.2 N至約0.8 N NaOH、約0.3 N至約0.7 N NaOH或約0.4 N至約0.6 N NaOH。在一些實施例中，消毒緩衝液包含約0.1 N、0.2 N、0.3 N、0.4 N、0.5 N、0.6 N、0.7 N NaOH、0.8 N、0.9 N或1.0 N中之任一者的NaOH。在一些實施例中，消毒緩衝液包含約0.5 M至約1.5 M NaCl、0.75 M至約1.5 M NaCl、約1.0 M NaCl至約1.5 M NaCl、約1.25 M NaCl至約1.5 M NaCl、約0.5 M NaCl至約1.25 M NaCl、約0.5 M NaCl至約1.0 M NaOH或約0.5 M NaCl至約0.75 M NaCl。在一些實施例中，消毒緩衝液包含約0.5 M、0.75 M、1.0 M、1.25 M或1.5 M中之任一者的NaCl。在一些實施例中，消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH及約1 M NaCl。

在一些實施例中，使約3至約12、約3至約11、約3至約10、約3至約9、約3至約8、約3至約7、約3至約6、約3至約5、約3至約4、約4至約12、約5至約12、約6至約12、約7至約12、約8至約12、約9至約12、約10至約12、約11至約12、約5至約12、約5至約10、約8至約12或約9至約11倍材料體積(例如管柱體積)之消毒緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約3、4、5、6、7、8、9、10、11或12倍材料體積(例如管柱體積)中之任一者的消毒緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約10倍材料體積(例如管柱體積)之消毒緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約4倍材料體積(例如管柱體積)之消毒緩衝液穿過離子交換層析材料。

在一些實施例中，儲存緩衝液包含NaOH。在一些實施例中，儲存緩衝液包含約0.05 N至約0.5 N NaOH、0.05 N至約0.4 N NaOH、0.05 N至約0.4 N NaOH、0.05 N至約0.3 N NaOH、0.05 N至約0.2 N NaOH、0.05 N至約0.1 N NaOH、0.1 N至約0.5 N NaOH、0.2 N至約0.5 N NaOH、0.3 N至約0.05 N NaOH或0.4 N至約0.5 N NaOH。在一些實施例中，儲存緩衝液包含約0.05 N、0.06 N、0.07 N NaOH、0.08 N、0.09 N、0.1 N、0.2 N、0.3 N、0.4 N或0.5 N中之任一者的NaOH。在一些實施例中，儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。

在一些實施例中，將離子交換層析材料儲存於約1至約10、約1至約8、約1至約6、約1至約5、約1至約4、約1至約3、約1至約2、約2至約10、約3至約20、約4至約10、約5至約10、約1至約7、約2至約6、約3至約5倍材料體積(例如管柱體積)之儲存緩衝液中。在一些實施例中，將離子交換層析材料儲存於約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍材料體積(例如管柱體積)中之任一者的儲存緩衝液中。在一些實施例中，將離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積(例如管柱體積)之儲存緩衝液中。在一些實施例中，將離子交換層析材料儲存於約3倍材料體積(例如管柱體積)之儲存緩衝液中。

在一些態樣中，本發明提供用於清潔離子交換層析材料供再使用之方法，其中層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟：a)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.3下之約350 mM乙酸鈉；b)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及c)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些態樣中，本發明提供用於清潔離子交換層析材料供再使用之方法，其中層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟：a)使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.3下之約350 mM乙酸鈉；b)使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及c)將離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，離子交換層析材料為陽離子交換層析材料。在一些實施例中，離子交換層析材料為陰離子交換層析材料。

在一些態樣中，本發明提供用於清潔陽離子交換層析材料供再使用之方法，其中層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟：a)使再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.3下之約350 mM乙酸鈉；b)使消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及c)將陽離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些態樣中，本發明提供用於清潔陽離子交換層析材料供再使用之方法，其中層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟：a)使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.3下之約350 mM乙酸鈉；b)使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及c)將陽離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。

在一些態樣中，本發明提供用於清潔陰離子交換層析材料供使用之方法，其中層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟：a)使再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.3下之約350 mM乙酸鈉；b)使消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及c)將陰離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些態樣中，本發明提供用於清潔陰離子交換層析材料供使用之方法，其中層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟：a)使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.3下之約350 mM乙酸鈉；b)使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及c)將陰離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。

在一些實施例中，本發明提供一種用於清潔離子交換層析材料供再使用之方法，其中層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟：a)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.0下之約25 mM Tris及約85 mM乙酸鈉；b)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及c)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，本發明提供一種用於清潔離子交換層析材料供再使用之方法，其中層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟：a)使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.0下之約25 mM Tris及約85 mM乙酸鈉；b)使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及c)將離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，離子交換層析材料為陽離子交換層析材料。在一些實施例中，離子交換層析材料為陰離子交換層析材料。

在一些實施例中，本發明提供一種清潔陽離子交換層析材料供使用之方法，其中層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟：a)使再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.0下之約25 mM Tris及約85 mM乙酸鈉；b)使消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及c)將陽離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，本發明提供一種清潔陽離子交換層析材料供使用之方法，其中層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟：a)使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.0下之約25 mM Tris及約85 mM乙酸鈉；b)使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及c)將陽離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。

在一些實施例中，本發明提供一種清潔陰離子交換層析材料供使用之方法，其中層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟：a)使再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.0下之約25 mM Tris及約85 mM乙酸鈉；b)使消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及c)將陰離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，本發明提供一種清潔陰離子交換層析材料供使用之方法，其中層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟：a)使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.0下之約25 mM Tris及約85 mM乙酸鈉；b)使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及c)將陰離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。

在一些態樣中，本發明提供用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料；f)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，及g)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。在一些實施例中，離子交換層析材料為陽離子交換層析材料。在一些實施例中，離子交換層析材料為陰離子交換層析材料。

在一些態樣中，本發明提供用於使用陽離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陽離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陽離子交換層析材料；b)將組合物加載於陽離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陽離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料；f)使消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料，及g)將陽離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。

在一些態樣中，本發明提供用於使用陰離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陰離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陰離子交換層析材料；b)將組合物加載於陰離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陰離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料；f)使消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料，及g)將陰離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。

在一些態樣中，本發明提供用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度≥20 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料；f)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，及g)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。在一些實施例中，離子交換層析材料為陽離子交換層析材料。在一些實施例中，離子交換層析材料為陰離子交換層析材料。

在一些態樣中，本發明提供用於使用陽離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陽離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陽離子交換層析材料；b)將組合物加載於陽離子交換層析材料上，其中加載密度≥20 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陽離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料；f)使消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料，及g)將陽離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。

在一些態樣中，本發明提供用於使用陰離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陰離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陰離子交換層析材料；b)將組合物加載於陰離子交換層析材料上，其中加載密度≥20 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陰離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料；f)使消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料，及g)將陰離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。

在一些態樣中，本發明提供用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度超過離子交換層析材料對多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料；f)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，及g)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。在一些實施例中，離子交換層析材料為陽離子交換層析材料。在一些實施例中，離子交換層析材料為陰離子交換層析材料。

在一些態樣中，本發明提供用於使用陽離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陽離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陽離子交換層析材料；b)將組合物加載於陽離子交換層析材料上，其中加載密度超過陽離子交換層析材料對多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陽離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料；f)使消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料，及g)將陽離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。

在一些態樣中，本發明提供用於使用陰離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陰離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陰離子交換層析材料；b)將組合物加載於陰離子交換層析材料上，其中加載密度超過陰離子交換層析材料對多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陰離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料；f)使消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料，及g)將陰離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中。

在一些實施例中，平衡緩衝液包含約10 mM至約100 mM、約20 mM至約100 mM、約30 mM至約100 mM、約40 mM至約100 mM、約10 mM至約90 mM、約10 mM至約80 mM、約10 mM至約70 mM、約10 mM至約60 mM、約10 mM至約50 mM、約10 mM至約40 mM、約10 mM至約70 mM、約20 mM至約60 mM或約30 mM至約50 mM NaOAc。在一些實施例中，平衡緩衝液包含約10 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM、60 mM、70 mM、80 mM、90 mM或100 mM中之任一者的NaOAc。在一些實施例中，平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc。

在一些實施例中，平衡緩衝液之pH值為約4.0至約8.0、約5.0至約8.0、約6.0至約8.0、約7.0至約8.0、約4.0至約7.0、約4.0至約6.0、約4.0至約5.0、約4.0至約7.0、約4.5至約6.5或約5.0至約6.0。在一些實施例中，平衡緩衝液之pH值為約4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或8.0中之任一者。在一些實施例中，平衡緩衝液之pH值為約5.5。

在一些實施例中，在加載組合物之前使約3至約10、約3至約9、約3至約8、約3至約7、約3至約6、約3至約5、約3至約4、約4至約10、約5至約10、約6至約10、約7至約10、約8至約10、約9至約10、約3至約8、約4至約7或約5至約6倍材料體積(例如管柱體積)之平衡緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，在加載組合物之前使約3、4、5、6、7、8、9或10倍材料體積(例如管柱體積)中之任一者的平衡緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，在加載組合物之前使約5倍材料體積(例如管柱體積)之平衡緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，在加載組合物之後將離子交換材料用平衡緩衝液洗滌，直至級分中收集了充足量之多肽。

在一些實施例中，再生緩衝液包含約50至約600 mM NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液包含約350 mM NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液包含約25至約75 mM Tris及約50至約100 mM NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液包含約50 mM Tris及約85 mM NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約pH 4.0至11.0。在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約pH 8.3。在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約pH 8.0。在一些實施例中，再生緩衝液包含在約pH 8.3下之約350 mM NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液包含在約pH 8.0下之約50 mM Tris及約85 mM NaOAc。在一些實施例中，使約3至約12倍材料體積之再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過離子交換層析材料。

在一些實施例中，消毒緩衝液包含約0.1 N至約1 N NaOH。在一些實施例中，消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH。在一些實施例中，使約2至約12倍材料體積之消毒緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過使再生緩衝液穿過離子交換層析材料。

在一些實施例中，儲存緩衝液包含約0.05 N至約0.5 N NaOH。在一些實施例中，消毒緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，將離子交換層析材料儲存於約1至5倍材料體積之儲存緩衝液中。在一些實施例中，將離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中。

在一些實施例中，組合物的加載密度為每公升層析材料≤ 1000g/L。在一些實施例中，組合物的加載密度為每公升層析材料約≤ 1000、≤ 900、≤ 800、≤ 750、≤ 700、≤ 600、≤ 500、≤ 400、≤ 300、≤ 250、≤ 200、≤ 100g中之任一者。在一些實施例中，組合物的加載密度在每公升層析材料約20至 g與約1000 g、約50 g與約1000 g、約100 g與約1000 g、約200 g與約1000 g、約250 g與約1000 g、約300 g與約1000 g、約400 g與約1000 g、約500 g與約1000 g、約600 g與約1000 g、約700 g與約1000 g、約750 g與約1000 g、約800 g與約1000 g、或約900 g與約1000 g中之任一者之間。在一些實施例中，組合物的加載密度在每公升層析材料約20 g與約900 g、約20 g與約800 g、約20 g與約750 g、約20 g與約700 g、約20 g與約600 g、約20 g與約500 g、約20 g與約400 g、約20 g與約300 g、約20 g與約250 g、約20 g與約200 g、約20 g與約100 g、約20 g與約75 g、或約20 g與約50 g中之任一者之間。

在一些實施例中，組合物之加載密度為每公升層析材料≥20g。在一些實施例中，組合物之加載密度為每公升層析材料約≥20g、≥50g、≥75g、≥100g、≥200g、≥250g、≥300g、≥400g、≥500g、≥600g、≥700g、≥750g、≥800g、≥900g、≥1000g、≥1200g、≥1400g、≥1500g、≥1750g或≥2000g中之任一者。在一些實施例中，組合物之加載密度為每公升層析材料約20 g至約2000 g、約50 g至約2000 g、約100 g至約2000 g、約200 g至約2000 g、約250 g至約2000 g、約300 g至約2000 g、約400 g至約2000 g、約500 g至約2000 g、約600 g至約2000 g、約700 g至約2000 g、約750 g至約2000 g、約800 g至約2000 g、約900 g至約2000 g、約1000 g至約2000 g、約1250 g至約2000 g或約1500 g至約2000 g中之任一者。在一些實施例中，組合物之加載密度為每公升層析材料約20 g至約1750 g、約20 g至約1500 g、約20 g至約1250 g、約20 g至約1200 g或約20 g至約1100 g中之任一者。

在一些實施例中，組合物之加載密度超過層析材料對多肽之動態結合容量。在一些實施例中，組合物之加載密度超過層析材料對多肽之動態結合容量約2倍(2-倍)、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、75倍、80倍、90倍或100倍中之任一者。在一些實施例中，組合物之加載密度超過層析材料對多肽之動態結合容量2倍至100倍、5倍至100倍、10倍至100倍、20倍至100倍、25倍至100倍、30倍至100倍、40倍至100倍、50倍至100倍、60倍至100倍、70倍至100倍、75倍至100倍、80倍至100倍或90倍至100倍。在一些實施例中，組合物之加載密度超過層析材料對多肽之動態結合容量2倍至100倍、2倍至75倍、2倍至50倍、2倍至25倍、2倍至20倍、2倍至15倍、2倍至14倍、2倍至13倍、2倍至12倍、2倍至11倍、2倍至10倍、2倍至9倍、2倍至8倍、2倍至7倍、2倍至6倍、2倍至5倍、2倍至4倍或2倍至3倍。

在一些實施例中，平衡緩衝液包含約50 mM至約100 mM、約55 mM至約100 mM、約60 mM至約100 mM、約65 mM至約100 mM、約70 mM至約100 mM、約75 mM至約100 mM、約80 mM至約100 mM、約85 mM至約100 mM、約90 mM至約100 mM、約95 mM至約100 mM、約50 mM至約95 mM、約50 mM至約90 mM、約50 mM至約85 mM、約50 mM至約80 mM、約50 mM至約75 mM、約50 mM至約70 mM、約50 mM至約65 mM、約50 mM至約60 mM或約50 mM至約55 mM NaOAc。在一些實施例中，平衡緩衝液包含約50 mM、55 mM、60 mM、65 mM、70 mM、75 mM、80 mM、85 mM、90 mM、95 mM或100 mM中之任一者的NaOAc。在一些實施例中，平衡緩衝液包含約85 mM NaOAc。在一些實施例中，平衡緩衝液包含約20 mM至約80 mM、約30 mM至約80 mM、約40 mM至約80 mM、約50 mM至約80 mM、約60 mM至約80 mM、約70 mM至約80 mM、約20 mM至約70 mM、約20 mM至約60 mM、約20 mM至約50 mM、約20 mM至約40 mM或約20 mM至約30 mM Tris。在一些實施例中，平衡緩衝液包含約25 mM、30 mM、35 mM、40 mM、45 mM、50 mM、55 mM、60 mM、65 mM、70 mM或70 mM中之任一者的Tris。在一些實施例中，平衡緩衝液包含約50 mM Tris。在一些實施例中，平衡緩衝液包含約50 mM Tris及85 mM NaOAc。

在一些實施例中，平衡緩衝液之pH值為約6.0至約10.0、約7.0至約10.0、約8.0至約10.0、約9.0至約10.0、約9.0至約9.0、約6.0至約8.0或約6.0至約7.0。在一些實施例中，平衡緩衝液之pH值為約6.0.、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0中之任一者。在一些實施例中，平衡緩衝液之pH值為約8.0。在一些實施例中，平衡緩衝液包含約50 mM Tris及85 mM NaOAc，約pH 8.0。

在一些實施例中，在加載組合物之前使約3至約10、約3至約9、約3至約8、約3至約7、約3至約6、約3至約5、約3至約4、約4至約10、約5至約10、約6至約10、約7至約10、約8至約10、約9至約10、約3至約8、約4至約7或約5至約6倍材料體積(例如管柱體積)之平衡緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，在加載組合物之前使約3、4、5、6、7、8、9或10倍材料體積(例如管柱體積)中之任一者的平衡緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，在加載組合物之前使約5倍材料體積(例如管柱體積)之平衡緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，在加載組合物之後將離子交換材料用平衡緩衝液洗滌，直至級分中收集了充足量之多肽。在一些實施例中，在加載組合物之後使約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15倍材料體積(例如管柱體積)中之任一者的平衡緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，在加載組合物之後使約10倍材料體積(例如管柱體積)之平衡緩衝液穿過離子交換層析材料。

在一些實施例中，再生緩衝液包含約50至約600 mM NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液包含濃度範圍為約25 mM至600 mM、30 mM至600 mM、40 mM至600 mM、50 mM至600 mM、75 mM至600 mM、100 mM至600 mM、125 mM至600 mM、150 mM至600 mM、175 mM至600 mM、200 mM至600 mM、225 mM至600 mM、250 mM至600 mM、275 mM至600 mM、300 mM至600 mM、325 mM至600 mM、350 mM至600 mM、375 mM至600 mM、400 mM至600 mM、450 mM至600 mM、500 mM至600 mM、550 mM至600 mM、25 mM至550 mM、25 mM至500 mM、25 mM至475 mM、25 mM至450 mM、25 mM至425 mM、25 mM至400 mM、25 mM至375 mM、25 mM至550 mM、25 mM至325 mM、25 mM至300 mM、25 mM至275 mM、25 mM至250 mM、25 mM至225 mM、25 mM至200 mM、25 mM至175 mM、25 mM至150 mM、25 mM至125 mM、25 mM至100 mM、25 mM至90 mM、25 mM至80 mM、25 mM至70 mM、25 mM至60 mM、25 mM至50 mM、25 mM至40 mM或25 mM至30 mM中之任一者的NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液包含約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或600 mM中之任一者的NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液包含約350 mM NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液包含約40 mM NaOAc。

在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約pH 2.0至約pH 7.0。在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約pH 2.0至約pH 6.5、約pH 2.0至約pH 6.0、約pH 2.0至約pH 5.5、約pH 2.0至約pH 5.0、約pH 2.0至約pH 4.5、約pH 2.0至約pH 4.0、約pH 2.0至約pH 3.5、約pH 2.0至約pH 3.0、約pH 2.0至約pH 2.5、約pH 2.5至約pH 7.0、約pH 3.0至約pH 7.0、約pH 3.5至約pH 7.0、約pH 4.0至約pH 7.0、約pH 4.5至約pH 7.0、約pH 5.0至約pH 7.0、約pH 5.5至約pH 7.0、約pH 6.0至約pH 7.0或約pH 6.5至約pH 7.0。在一些實施例中，再生緩衝液為約pH 2.0、約pH 8.0、約pH 2.5、約pH 3.0、約pH 3.5、約pH 4.0、約pH 4.5、約pH 5.0、約pH 5.5、約pH 6.0、約pH 6.5或約pH 7.0。在一些實施例中，再生緩衝液之pH值為約4.0。在一些實施例中，再生緩衝液為在約pH 4.0下之約350 mM NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液為在約pH 5.0下之約350 mM NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液為在約pH 4.0下之約40 mM NaOAc。在一些實施例中，再生緩衝液為在約pH 4.0下之約40 mM NaOAc。

在一些實施例中，使約3至約12、約3至約11、約3至約10、約3至約9、約3至約8、約3至約7、約3至約6、約3至約5、約3至約4、約4至約12、約5至約12、約6至約12、約7至約12、約8至約12、約9至約12、約10至約12、約11至約12、約5至約12、約5至約10、約8至約12或約9至約11倍材料體積(例如管柱體積)之再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約3、4、5、6、7、8、9、10、11或12倍材料體積(例如管柱體積)中之任一者的再生緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約7倍材料體積(例如管柱體積)之再生緩衝液穿過離子交換層析材料。

在一些實施例中，酸洗液包含NaOAc。在一些實施例中，酸洗液包含磷酸。在一些實施例中，酸洗液包含NaOAc及磷酸。在一些實施例中，酸洗液中NaOAc之濃度為大於約0.1M至小於約0.5 M中之任一者。在一些實施例中，酸洗液中NaOAc之濃度為約0.100 M、0.120M、0.130M、0.140M、0.150M、0.160M、0.161M、0.162M、0.163M、0.164M、0.167M、0.168M、0.169M、0.170M、0.180M、0.190M、0.200M、0.250M、0.300M、0.350M、0.400M、0.450M或0.500M中之任一者。在一些實施例中，酸洗液中磷酸之濃度為約0.10 M、0.15M、0.20M、0.25M、0.30M、0.35M、0.40M、0.45M、0.50M、0.55M或0.60M中之任一者。在一些實施例中，酸洗液包含約0.167M NaOAc及約0.3M磷酸。

在一些實施例中，消毒緩衝液包含約0.1 N至約1 N NaOH。在一些實施例中，消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH。在一些實施例中，消毒緩衝液包含約0.5 M至約1.5 M NaCl。在一些實施例中，消毒緩衝液包含約0.5 M NaCl至約2 M NaCl。在一些實施例中，消毒緩衝液包含約1.0 M NaCl。在一些實施例中，消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH及約1M NaCl。在一些實施例中，使約1至約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約4倍材料體積之消毒緩衝液穿過離子交換層析材料。

在一些實施例中，儲存緩衝液包含約0.05 N至約0.5 N NaOH。在一些實施例中，消毒緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，將離子交換層析材料儲存於約1至5倍材料體積之儲存緩衝液中。在一些實施例中，將離子交換層析材料儲存於約3倍材料體積之儲存緩衝液中。

在一些實施例中，組合物之加載密度為每公升層析材料≤ 1000g。在一些實施例中，組合物之加載密度為每公升層析材料約≤ 1000g、≤ 900g、≤ 800g、≤ 750g、≤ 700g、≤ 600g、≤ 500g、≤ 400g、≤ 300g、≤ 250g、≤ 200g、≤ 100g中之任一者。在一些實施例中，組合物之加載密度為每公升層析材料約20 g至約1000 g、約50 g至約1000 g、約100 g至約1000 g、約200 g至約1000 g、約250 g至約1000 g、約300 g至約1000 g、約400 g至約1000 g、約500 g至約1000 g、約600 g至約1000 g、約700 g至約1000 g、約750 g至約1000 g、約800 g至約1000 g或約900 g至約1000 g中之任一者。在一些實施例中，組合物之加載密度為每公升層析材料約20 g至約900 g、約20 g至約800 g、約20 g至約750 g、約20 g至約700 g、約20 g至約600 g、約20 g至約500 g、約20 g至約400 g、約20 g至約300 g、約20 g至約250 g、約20 g至約200 g、約20 g至約100 g、約20 g至約75 g或約20 g至約50 g中之任一者。

在一些態樣中，本發明提供用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度超過離子交換層析對該多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使第一再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含乙酸鈉；f)使第二再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中第二再生緩衝液包含乙酸鈉，使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含乙酸鈉；h)使酸洗液穿過離子交換層析材料；i)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及j)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，離子交換層析材料為陽離子交換層析材料。在一些實施例中，離子交換層析材料為陰離子交換層析材料。在一些實施例中，離子交換層析材料為混合模式陰離子交換層析材料。在一些實施例中，離子交換層析材料為Capto™ Adhere層析材料。

在一些實施例中，消毒緩衝液包含約0.1 N至約1 N NaOH。在一些實施例中，消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH。在一些實施例中，消毒緩衝液包含約0.5 M至約1.5 M NaCl。在一些實施例中，消毒緩衝液包含約1.0 M NaCl。在一些實施例中，消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH及約1M NaCl。在一些實施例中，使約1至約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過離子交換層析材料。在一些實施例中，使約4倍材料體積之消毒緩衝液穿過離子交換層析材料。

在一些態樣中，本發明提供用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.3下之約350 mM NaOAc；f)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些態樣中，本發明提供用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用約4倍材料體積之平衡緩衝液平衡離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.3下之約350 mM NaOAc；f)使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，組合物之加載密度為每公升層析材料約≤ 1000g、≤ 900g、≤ 800g、≤ 750g、≤ 700g、≤ 600g、≤ 500g、≤ 400g、≤ 300g、≤ 250g、≤ 200g、≤ 100g中之任一者。

在一些態樣中，本發明提供用於使用陽離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陽離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陽離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於陽離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陽離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.3下之約350 mM NaOAc；f)使消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將陽離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些態樣中，本發明提供用於使用陽離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陽離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用約4倍材料體積之平衡緩衝液平衡陽離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於陽離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陽離子交換層析材料；e)使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.3下之約350 mM NaOAc；f)使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將陽離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，組合物之加載密度為每公升層析材料約≤ 1000g、≤ 900g、≤ 800g、≤ 750g、≤ 700g、≤ 600g、≤ 500g、≤ 400g、≤ 300g、≤ 250g、≤ 200g、≤ 100g中之任一者。

在一些態樣中，本發明提供用於使用陰離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陰離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陰離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於陰離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陰離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.3下之約350 mM NaOAc；f)使消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將陰離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些態樣中，本發明提供用於使用陰離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陰離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用約4倍材料體積之平衡緩衝液平衡陰離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於陰離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陰離子交換層析材料；e)使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.3下之約350 mM NaOAc；f)使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將陰離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，組合物之加載密度為每公升層析材料約≤ 1000g、≤ 900g、≤ 800g、≤ 750g、≤ 700g、≤ 600g、≤ 500g、≤ 400g、≤ 300g、≤ 250g、≤ 200g、≤ 100g中之任一者。

在一些態樣中，本發明提供用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度≥約20 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.3下之約350 mM NaOAc；f)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些態樣中，本發明提供用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用約4倍材料體積之平衡緩衝液平衡離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度≥約20 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.3下之約350 mM NaOAc；f)使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，組合物之加載密度為每公升層析材料約≥20g、≥50g、≥70g、≥100g、≥200g、≥250g、≥300g、≥400g、≥500g、≥600g、≥700g、≥750g、≥800g、≥900g、≥1000g、≥1200g、≥1400g、≥1500g、≥1750g或≥2000g中之任一者。

在一些態樣中，本發明提供用於使用陽離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陽離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陽離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於陽離子交換層析材料上，其中加載密度≥約20g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陽離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.3下之約350 mM NaOAc；f)使消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將陽離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些態樣中，本發明提供用於使用陽離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陽離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用約4倍材料體積之平衡緩衝液平衡陽離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於陽離子交換層析材料上，其中加載密度≥約20 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陽離子交換層析材料；e)使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.3下之約350 mM NaOAc；f)使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將陽離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，組合物之加載密度為每公升層析材料約≥20g、≥50g、≥70g、≥100g、≥200g、≥250g、≥300g、≥400g、≥500g、≥600g、≥700g、≥750g、≥800g、≥900g、≥1000g、≥1200g、≥1400g、≥1500g、≥1750g或≥2000g中之任一者。

在一些態樣中，本發明提供用於使用陰離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陰離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陰離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於陰離子交換層析材料上，其中加載密度≥約20 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陰離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.3下之約350 mM NaOAc；f)使消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將陰離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些態樣中，本發明提供用於使用陰離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陰離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用約4倍材料體積之平衡緩衝液平衡陰離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於陰離子交換層析材料上，其中加載密度≥約20 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陰離子交換層析材料；e)使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.3下之約350 mM NaOAc；f)使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將陰離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，組合物之加載密度為每公升層析材料約≥20g、≥50g、≥70g、≥100g、≥200g、≥250g、≥300g、≥400g、≥500g、≥600g、≥700g、≥750g、≥800g、≥900g、≥1000g、≥1200g、≥1400g、≥1500g、≥1750g或≥2000g中之任一者。

在一些態樣中，本發明提供用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度超過離子交換層析材料對多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.3下之約350 mM NaOAc；f)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些態樣中，本發明提供用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用約4倍材料體積之平衡緩衝液平衡離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度超過離子交換層析材料對多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.3下之約350 mM NaOAc；f)使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，組合物之加載密度超過層析材料對多肽之動態結合容量2倍至100倍。在一些實施例中，組合物之加載密度超過層析材料對多肽之動態結合容量約10倍。

在一些態樣中，本發明提供用於使用陽離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陽離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陽離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於陽離子交換層析材料上，其中加載密度超過陽離子交換層析材料對多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陽離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.3下之約350 mM NaOAc；f)使消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將陽離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些態樣中，本發明提供用於使用陽離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陽離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用約4倍材料體積之平衡緩衝液平衡陽離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於陽離子交換層析材料上，其中加載密度超過陽離子交換層析材料對多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陽離子交換層析材料；e)使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.3下之約350 mM NaOAc；f)使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將陽離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，組合物之加載密度超過層析材料對多肽之動態結合容量2倍至100倍。在一些實施例中，組合物之加載密度超過層析材料對多肽之動態結合容量約10倍。

在一些態樣中，本發明提供用於使用陰離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陰離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陰離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於陰離子交換層析材料上，其中加載密度超過陰離子交換層析材料對多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陰離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.3下之約350 mM NaOAc；f)使消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將陰離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些態樣中，本發明提供用於使用陰離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陰離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用約4倍材料體積之平衡緩衝液平衡陰離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於陰離子交換層析材料上，其中加載密度超過離子交換層析材料對多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陰離子交換層析材料；e)使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.3下之約350 mM NaOAc；f)使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將陰離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，組合物之加載密度超過層析材料對多肽之動態結合容量2倍至100倍。在一些實施例中，組合物之加載密度超過層析材料對多肽之動態結合容量約10倍。

在一些態樣中，本發明提供用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.0下之約25 mM Tris及約85 mM NaOAc；f)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些態樣中，本發明提供用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用約4倍材料體積之平衡緩衝液平衡離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.0下之約25 mM Tris及約85 mM NaOAc；f)使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，組合物之加載密度為每公升層析材料約≤ 1000g、≤ 900g、≤ 800g、≤ 750g、≤ 700g、≤ 600g、≤ 500g、≤ 400g、≤ 300g、≤ 250g、≤ 200g、≤ 100g中之任一者。

在一些態樣中，本發明提供用於使用陽離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陽離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陽離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於陽離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陽離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.0下之約25 mM Tris及約85 mM NaOAc；f)使消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將陽離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些態樣中，本發明提供用於使用陽離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陽離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用約4倍材料體積之平衡緩衝液平衡陽離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於陽離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陽離子交換層析材料；e)使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.0下之約25 mM Tris及約85 mM NaOAc；f)使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將陽離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，組合物之加載密度為每公升層析材料約≤ 1000g、≤ 900g、≤ 800g、≤ 750g、≤ 700g、≤ 600g、≤ 500g、≤ 400g、≤ 300g、≤ 250g、≤ 200g、≤ 100g中之任一者。

在一些態樣中，本發明提供用於使用陰離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陰離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陰離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於陰離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陰離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.0下之約25 mM Tris及約85 mM NaOAc；f)使消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將陰離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些態樣中，本發明提供用於使用陰離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陰離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用約4倍材料體積之平衡緩衝液平衡陰離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於陰離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陰離子交換層析材料；e)使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.0下之約25 mM Tris及約85 mM NaOAc；f)使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將陰離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，組合物之加載密度為每公升層析材料約≤ 1000g、≤ 900g、≤ 800g、≤ 750g、≤ 700g、≤ 600g、≤ 500g、≤ 400g、≤ 300g、≤ 250g、≤ 200g、≤ 100g中之任一者。

在一些態樣中，本發明提供用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度≥約20 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.0下之約25 mM Tris及約85 mM NaOAc；f)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些態樣中，本發明提供用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用約4倍材料體積之平衡緩衝液平衡離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度≥約20 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.0下之約25 mM Tris及約85 mM NaOAc；f)使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，組合物之加載密度為每公升層析材料約≥20g、≥50g、≥70g、≥100g、≥200g、≥250g、≥300g、≥400g、≥500g、≥600g、≥700g、≥750g、≥800g、≥900g、≥1000g、≥1200g、≥1400g、≥1500g、≥1750g或≥2000g中之任一者。

在一些態樣中，本發明提供用於使用陽離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陽離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陽離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於陽離子交換層析材料上，其中加載密度≥約20 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陽離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.0下之約25 mM Tris及約85 mM NaOAc；f)使消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將陽離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些態樣中，本發明提供用於使用陽離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陽離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用約4倍材料體積之平衡緩衝液平衡陽離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於陽離子交換層析材料上，其中加載密度≥約20 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陽離子交換層析材料；e)使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.0下之約25 mM Tris及約85 mM NaOAc；f)使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將陽離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，組合物之加載密度為每公升層析材料約≥20g、≥50g、≥70g、≥100g、≥200g、≥250g、≥300g、≥400g、≥500g、≥600g、≥700g、≥750g、≥800g、≥900g、≥1000g、≥1200g、≥1400g、≥1500g、≥1750g或≥2000g中之任一者。

在一些態樣中，本發明提供用於使用陰離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陰離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陰離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於陰離子交換層析材料上，其中加載密度≥約20 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陰離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.0下之約25 mM Tris及約85 mM NaOAc；f)使消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將陰離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些態樣中，本發明提供用於使用陰離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陰離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用約4倍材料體積之平衡緩衝液平衡陰離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於陰離子交換層析材料上，其中加載密度≥約20 g/L；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陰離子交換層析材料；e)使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.0下之約25 mM Tris及約85 mM NaOAc；f)使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將陰離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，組合物之加載密度為每公升層析材料約≥20g、≥50g、≥70g、≥100g、≥200g、≥250g、≥300g、≥400g、≥500g、≥600g、≥700g、≥750g、≥800g、≥900g、≥1000g、≥1200g、≥1400g、≥1500g、≥1750g或≥2000g中之任一者。

在一些態樣中，本發明提供用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度超過離子交換層析材料對多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.0下之約25 mM Tris及約85 mM NaOAc；f)使消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些態樣中，本發明提供用於使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用約4倍材料體積之平衡緩衝液平衡離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於離子交換層析材料上，其中加載密度超過離子交換層析材料對多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌離子交換層析材料；e)使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.0下之約25 mM Tris及約85 mM NaOAc；f)使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，組合物之加載密度超過層析材料對多肽之動態結合容量2倍至100倍。在一些實施例中，組合物之加載密度超過層析材料對多肽之動態結合容量約10倍。

在一些態樣中，本發明提供用於使用陽離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陽離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陽離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於陽離子交換層析材料上，其中加載密度超過陽離子交換層析材料對多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陽離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.0下之約25 mM Tris及約85 mM NaOAc；f)使消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將陽離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些態樣中，本發明提供用於使用陽離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陽離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用約4倍材料體積之平衡緩衝液平衡陽離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於陽離子交換層析材料上，其中加載密度超過陽離子交換層析材料對多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陽離子交換層析材料；e)使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.0下之約25 mM Tris及約85 mM NaOAc；f)使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過陽離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將陽離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，組合物之加載密度超過層析材料對多肽之動態結合容量2倍至100倍。在一些實施例中，組合物之加載密度超過層析材料對多肽之動態結合容量約10倍。

在一些態樣中，本發明提供用於使用陰離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陰離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用平衡緩衝液平衡陰離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於陰離子交換層析材料上，其中加載密度超過陰離子交換層析材料對多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陰離子交換層析材料；e)使再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.0下之約25 mM Tris及約85 mM NaOAc；f)使消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將陰離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些態樣中，本發明提供用於使用陰離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化多肽之方法，其中陰離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟：a)用約4倍材料體積之平衡緩衝液平衡陰離子交換層析材料，其中平衡緩衝液包含約40 mM NaOAc；b)將組合物加載於陰離子交換層析材料上，其中加載密度超過離子交換層析材料對多肽之動態結合容量；c)收集包含該多肽之級分；d)用平衡緩衝液洗滌陰離子交換層析材料；e)使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中再生緩衝液包含在約pH 8.0下之約25 mM Tris及約85 mM NaOAc；f)使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過陰離子交換層析材料，其中消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及g)將陰離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中，其中儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。在一些實施例中，組合物之加載密度超過層析材料對多肽之動態結合容量2倍至100倍。在一些實施例中，組合物之加載密度超過層析材料對多肽之動態結合容量約10倍。

在本發明所描述之方法中之任一者的一些實施例中，層析材料為離子交換材料(例如陽離子交換材料或陰離子交換材料)。在一些實施例中，離子交換材料位於層析管柱(例如陽離子交換層析管柱或陰離子交換層析管柱)中。

在一些實施例中，陽離子交換材料為帶負電荷之固相且具有用於與繞過或穿過固相之水溶液中之陽離子交換的游離陽離子。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，陽離子交換劑可為膜、整體料或樹脂。在一些實施例中，陽離子交換劑可為樹脂。陽離子交換劑可包含羧酸官能基或磺酸官能基，諸如但不限於磺酸酯、含羧基的、羧基甲基磺酸、磺異丁基、磺乙基、羧基、磺丙基、磺醯基、磺醯氧基乙基或正磷酸酯。在上文之一些實施例中，陽離子交換層析材料為陽離子交換層析樹脂。在上文之一些實施例中，陽離子交換層析材料為陽離子交換層析膜。在本發明之一些實施例中，層析材料不為陽離子交換層析材料。在一些實施例中，陽離子交換層析材料用於大規模純化多肽；例如製造規模製備多肽，諸如抗體或其片段。

在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，離子交換材料可使用習用層析材料或對流層析材料。習用層析材料包括例如灌注材料(例如聚(苯乙烯-二乙烯基苯)樹脂)及擴散材料(例如交聯瓊脂糖樹脂)。在一些實施例中，聚(苯乙烯-二乙烯基苯)樹脂可為Poros™樹脂。在一些實施例中，交聯瓊脂糖樹脂可為磺丙基-Sepharose® Fast Flow (「SPSFF」)樹脂。對流層析材料可為膜(例如聚醚碸)或整體材料(例如交聯聚合物)。聚醚碸膜可為Mustang。交聯聚合物整體材料可為交聯聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯-共-二甲基丙烯酸伸乙酯)。

陽離子交換材料之實例為此項技術中已知的，包括但不限於Mustang® S、Sartobind® S、SO3整體料(Monolith)、S Ceramic HyperD™、Poros™ XS、Poros™ HS50、Poros™ HS20、SPSFF、SP-Sepharose® XL (SPXL)、CM Sepharose® Fast Flow、Capto™ S、Fractogel® Se HiCap、Fractogel® SO3或Fractogel® COO。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，陽離子交換劑為Poros™ HS50。在一些實施例中，Poros™ HS樹脂可為Poros™ HS 50 μm或Poros™ HS 20 μm粒子。

在本發明之一些態樣中，陰離子交換層析材料為帶正電荷之固相且具有用於與繞過或穿過固相之水溶液中之陰離子交換的游離陰離子。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，陰離子交換材料可為膜、整體料或樹脂。在一實施例中，陰離子交換材料可為樹脂。在一些實施例中，陰離子交換材料可包含一級胺、二級胺、三級胺或四級銨離子官能基、聚胺官能基或二乙胺基乙基官能基。在上文之一些實施例中，陰離子交換層析材料為陰離子交換層析管柱。在上文之一些實施例中，陰離子交換層析材料為陰離子交換層析膜。陰離子交換材料之實例為此項技術中已知的且包括但不限於Poros™ HQ 50、Poros™ PI 50、Poros™ D、Mustang® Q、Q Sepharose® FF及DEAE Sepharose®。

在一些實施例中，離子交換層析材料為混合模式離子交換層析材料。混合模式層析材料包含能夠進行以下功能中之一或多者的官能基：陰離子交換、陽離子交換、氫鍵結及疏水相互作用。在一些實施例中，離子交換層析材料為混合模式陽離子交換層析材料。陽離子交換混合模式材料之實例包括但不限於Capto MMC™、Capto MMC™ ImpRes、Nuvia™ cPrime™及Toyopearl MX Trp-650M。在一些實施例中，離子交換層析材料為混合模式陰離子交換層析材料。陰離子交換混合模式材料之實例包括但不限於Capto Adhere™及Capto Adhere™ ImpRes。

在一些實施例中，離子交換層析材料用於純化多種多肽產物。在一些實施例中，離子交換層析材料用於純化多種抗體產物。在一些實施例中，清潔方法之後的遺留物包含以下中之一或多者：＜0.25 mg/mL總蛋白、＜1 ppm IgG片段、＜1 ppm IgG聚集物、＜1 ppm浸出蛋白質A、＜1 μg/mL CZE LIF、＜1 ppm CHOP及＜1 pg/mL CHO DNA。

在一些實施例中，在多肽之純化中將離子交換層析與一或多個其他層析程序組合。在一些實施例中，在抗體之純化中將離子交換層析與一或多個其他層析程序組合。在一些實施例中，在多肽之大規模純化中；例如在多肽(諸如抗體或其片段)之製造規模製備中將離子交換層析與一或多個其他層析程序組合。在一些實施例中，在多肽之大規模純化中；例如在多肽(諸如抗體或其片段)之製造規模製備中將離子交換層析與一或多個其他層析程序組合。在一些實施例中，在過載離子交換層析之前進行一或多個其他層析程序。在一些實施例中，在過載離子交換層析之後進行一或多個其他層析程序。在一些實施例中，在過載離子交換層析之前進行一或多個其他層析程序，且在過載離子交換層析之後進行一或多個其他層析程序。在一些實施例中，將過載離子交換層析與選自由以下組成之群的一或多個層析程序組合：混合模式層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析、疏水相互作用層析(HIC)、親和層析及粒徑排阻層析。

在一些實施例中，在多肽之純化中將陽離子交換層析與一或多個其他層析程序組合。在一些實施例中，在抗體之純化中將陽離子交換層析與一或多個其他層析程序組合。在一些實施例中，在多肽之大規模純化中；例如在多肽(諸如抗體或其片段)之製造規模製備中將陽離子交換層析與一或多個其他層析程序組合。在一些實施例中，在多肽之大規模純化中；例如在多肽(諸如抗體或其片段)之製造規模製備中將陽離子交換層析與一或多個其他層析程序組合。在一些實施例中，在過載陽離子交換層析之前進行一或多個其他層析程序。在一些實施例中，在過載陽離子交換層析之後進行一或多個其他層析程序。在一些實施例中，在過載陽離子交換層析之前進行一或多個其他層析程序，且在過載陽離子交換層析之後進行一或多個其他層析程序。在一些實施例中，將過載陽離子交換層析與選自由以下組成之群的一或多個層析程序組合：混合模式層析、陰離子交換層析、疏水相互作用層析(HIC)、親和層析、粒徑排阻層析及其他陽離子交換層析。

用於單株抗體之2000 L純化製程之實例包括收穫產生該抗體之CHO細胞以產生饋料流。在每公升樹脂≤30 g之加載密度下以結合及溶析模式對饋料流進行蛋白質A親和層析(例如MabSelect SuRe™)，在每公升樹脂≤85 g之加載密度下以結合及溶析模式對蛋白質A溶析物進行陽離子交換層析(例如POROS™XS)，在每公升樹脂≤100 g之加載密度下以流穿模式對陽離子交換溶析物進行混合模式陰離子交換層析(例如Q-Sepharose^® FF)，及對混合模式陰離子交換級分進行超濾/透濾(例如Pellicon® 3 )以按50 g/L之最終濃度對抗體進行調配。

用於單株抗體之2000 L純化製程之另一實例包括收穫產生該抗體之CHO細胞以產生饋料流。在每公升樹脂≤30 g之加載密度下以結合及溶析模式對饋料流進行蛋白質A親和層析(例如MabSelect SuRe™)，在每公升樹脂≤41 g之加載密度下以結合及溶析模式對蛋白質A溶析物進行陽離子交換層析(例如POROS™HS)，在每公升樹脂≤100 g之加載密度下以流穿模式對陽離子交換溶析物進行混合模式陰離子交換層析(例如Q-Sepharose^® FF)，對混合模式陰離子交換級分進行過濾以去除病毒(例如1:1 Viresolve^® ProShield/Viresolve^® Pro) (在1.2-2.6 kg/m² 下)，及對饋料流進行超濾/透濾以按50 g/L之最終濃度對抗體進行調配。

用於單株抗體之12000 L製造規模純化製程之實例包括收穫產生該抗體之CHO細胞以產生饋料流。對饋料流進行洗滌劑病毒滅活步驟(例如Triton-CG110)，在每公升樹脂≤40 g之加載密度下以結合及溶析模式對饋料流進行蛋白質A親和層析(例如MabSelect SuRe™)，在每公升樹脂≤1000 g之加載密度下以過載模式對蛋白質A溶析物進行陽離子交換層析(例如POROS™ HS)，在每公升樹脂≤350 g之加載密度下以流穿模式對陽離子交換溶析物進行混合模式陰離子交換層析(例如Capto™ Adhere)，及對混合模式陰離子交換級分進行超濾/透濾(例如Pellicon® 3)以按60 g/L之最終濃度對抗體進行調配。

用於單株抗體之12000 L製造規模純化製程之另一實例包括收穫產生該抗體之CHO細胞以產生饋料流。在每公升樹脂≤35 g之加載密度下以結合及溶析模式對饋料流進行蛋白質A親和層析(例如MabSelect SuRe™)，在每公升樹脂≤800 g之加載密度下以過載模式對蛋白質A溶析物進行陽離子交換層析(例如POROS™ HS)，在每公升樹脂≤250 g之加載密度下以流穿模式對陽離子交換溶析物進行混合模式陰離子交換層析(例如Capto™ Adhere)，對混合模式陰離子交換級分進行過濾以去除病毒(例如1:1 Viresolve^® ProShield/Viresolve^® Pro) (在9-10 kg/m² 下)，及對饋料流進行超濾/透濾以按100 g/L之最終濃度對抗體進行調配。

在本發明之一些態樣中，將過載陽離子交換層析與親和層析材料組合使用。親和層析材料之實例包括但不限於用蛋白質A及/或蛋白質G衍生之層析材料。親和層析材料之實例包括但不限於Prosep®-VA、Prosep®-VA Ultra Plus、蛋白質A sepharose® fast flow、Toyopearl®蛋白質A、MAbSelect、MAbSelect SuRe™及MAbSelect SuRe™ LX、蛋白質L、FcXL、蛋白質XL、κ層析及κXL層析。在上文之一些實施例中，親和層析材料為親和層析管柱。在上文之一些實施例中，親和層析材料為親和層析膜。

在本發明之一些態樣中，將過載離子交換層析(例如過載陽離子交換層析)與混合模式層析材料組合使用。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，層析材料為混合模式材料，其包含能夠進行以下功能中之一或多者的官能基：陰離子交換、陽離子交換、氫鍵結及疏水相互作用。在一些實施例中，混合模式材料包含能夠進行陰離子交換及疏水相互作用之官能基。混合模式材料可含有N-苯甲基-N-甲基乙醇胺、4-巰基-乙基-吡啶、己基胺或苯基丙基胺作為配位體或含有交聯聚烯丙基胺。混合模式材料之實例包括Capto™ Adhere樹脂、QMA樹脂、Capto™ MMC樹脂、MEP HyperCel™樹脂、HEA HyperCel™樹脂、PPA HyperCel™樹脂或ChromaSorb™膜或Sartobind® STIC。在一些實施例中，混合模式材料為Capto™ Adhere樹脂。在上文之一些實施例中，混合模式材料為混合模式層析管柱。在上文之一些實施例中，混合模式材料為混合模式膜。

在本發明之一些態樣中，將過載離子交換層析(例如過載陽離子交換層析)與陰離子交換層析材料組合使用。在一些實施例中，陰離子交換層析材料為帶正電荷之固相且具有用於與繞過或穿過固相之水溶液中之陰離子交換的游離陰離子。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，陰離子交換材料可為膜、整體料或樹脂。在一實施例中，陰離子交換材料可為樹脂。在一些實施例中，陰離子交換材料可包含一級胺、二級胺、三級胺或四級銨離子官能基、聚胺官能基或二乙胺基乙基官能基。在上文之一些實施例中，陰離子交換層析材料為陰離子交換層析管柱。在上文之一些實施例中，陰離子交換層析材料為陰離子交換層析膜。

在本發明之一些態樣中，將過載離子交換層析(例如過載陽離子交換層析)與疏水相互作用層析材料組合使用。疏水相互作用層析(HIC)為根據疏水性分離生物分子之液相層析技術。HIC層析材料之實例包括但不限於Toyopearl®己基650、Toyopearl®丁基650、Toyopearl®苯基650、Toyopearl®醚650、Source、Resource、Sepharose® Hi-Trap、辛基sepharose®、苯基sepharose®。在上文之一些實施例中，HIC層析材料為HIC層析管柱。在上文之一些實施例中，HIC層析材料為HIC層析膜。

在本發明之一些態樣中，將過載離子交換層析(例如過載陽離子交換層析)與羥磷灰石(HA)層析材料組合使用。羥磷灰石層析材料之實例包括但限於HA Ultrogel®及CHT羥磷灰石。在上文之一些實施例中，HA層析材料為HA層析管柱。在上文之一些實施例中，HA層析材料為HA層析膜。

在一些實施例中，過載離子交換層析在管柱中進行(即，管柱層析)。在一些實施例中，在管柱中進行一或多個其他層析程序。

在一些實施例中，本發明提供用於清潔或再生鹼穩定性層析材料(例如鹼穩定性層析管柱)之方法。

在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，流速為小於約每小時50倍材料體積、每小時40倍材料體積或每小時30倍材料體積中之任一者。流速可為約每小時5倍材料體積至每小時50倍材料體積、每小時10倍材料體積至每小時40倍材料體積或每小時18倍材料體積至每小時36倍材料體積中之任一者。在一些實施例中，流速為約每小時9倍材料體積、每小時18倍材料體積、每小時25倍材料體積、每小時30倍材料體積、每小時36倍材料體積或每小時40倍材料體積中之任一者。

在一些實施例中，層析材料位於層析管柱中。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，流速為小於約50管柱體積(CV)/h、40 CV/h、30 CV/h、20 CV/h或15 CV/h中之任一者。流速可為約5 CV/h至50 CV/h、10 CV/h至40 CV/h或15 CV/h至20 CV/h中之任一者。在一些實施例中，流速為約10 CV/h、15 CV/h、20 CV/h、25 CV/h、30 CV/h或40 CV/h中之任一者。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，流速為小於約100 cm/h、75 cm/h或50 cm/h中之任一者。流速可為約25 cm/h至150 cm/h、25 cm/h至100 cm/h、50 cm/h至100 cm/h或65 cm/h至85 cm/h中之任一者。

柱床高度為所用層析材料之高度。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，柱床高度為大於約3 cm、10 cm或15 cm中之任一者。柱床高度可為約3 cm至35 cm、5 cm至15 cm、3 cm至10 cm或5 cm至8 cm中之任一者。在一些實施例中，柱床高度為約3 cm、5 cm、10 cm、15 cm、20 cm、25 cm或30 cm中之任一者。在一些實施例中，柱床高度係基於加載物中多肽或污染物之量來測定。在一些實施例中，層析材料位於用於多肽之大規模純化之管柱；例如多肽(諸如抗體或其片段)之製造規模製備中。在一些實施例中，製造規模層析材料具有約10 cm、15 cm、20 cm、25 cm或30 cm中之任一者的柱床高度。

柱床直徑為所用層析材料之直徑。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，柱床直徑為大於約80 cm、100 cm或120 cm中之任一者。在一些實施例中，柱床直徑為約50 cm、60 cm、70 cm、80 cm、90 cm、100 cm、110 cm、120 cm、130 cm、140 cm、150 cm、160 cm、170 cm、180 cm、190或200 cm中之任一者。在一些實施例中，柱床直徑係基於加載物中多肽或污染物之量來測定。在一些實施例中，層析材料位於用於多肽之大規模純化；例如多肽(諸如抗體或其片段)之製造規模製備中之管柱中。在一些實施例中，製造規模層析材料具有約50 cm、60 cm、70 cm、80 cm、90 cm、100 cm、110 cm、120 cm、130 cm、140 cm、150 cm、160 cm、170 cm、180 cm、190或200 cm中之任一者的柱床直徑。

在一些實施例中，層析係在體積大於約1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL、40 mL、50 mL、75 mL、100 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mL、1 L、2 L、3 L、4 L、5 L、6 L、7 L、8 L、9 L、10 L、25 L、50 L、100 L、200 L、300 L、400 L、500 L、600 L、700 L、800 L、900 L或1000 L之管柱或容器中進行。在一些實施例中，容器具有14 cm之柱床高度及80 cm之柱床體積；例如大規模蛋白質A管柱。在一些實施例中，容器具有19 cm之柱床高度及100 cm之柱床體積，例如大規模陰離子交換管柱。在一些實施例中，容器具有30 cm之柱床高度及120 cm之柱床體積，例如大規模離子交換管柱。

如本文所用，加載物為加載至層析材料上之組合物。在一些實施例中，加載物為加載至先前已用於分離不同多肽之層析材料上之多肽。加載緩衝液為用於將包含相關產物之組合物加載至層析材料上之緩衝液。可在加載所要純化之組合物之前將層析材料用平衡緩衝液平衡。在一些實例中，在將組合物加載至層析材料上之後及相關多肽自固相溶析之前使用洗滌緩衝液。在一些實施例中，洗滌緩衝液與加載緩衝液相同。在一些實施例中，可藉由洗滌緩衝液(例如過載模式)自層析材料移除一些相關產物(例如多肽)。

如本文所用，溶析為自層析材料移除產物，例如多肽。在本發明之一些實施例中，溶析為「模擬溶析」，其中對層析材料應用溶析程序，在該溶析程序中在最後的清潔程序之後不加載蛋白質。在本發明之一些實施例中，在本文所描述之清潔程序中之任一者之後對層析材料應用模擬溶析程序。在一些實施例中，模擬溶析模擬了將用於溶析蛋白質且將應用於材料以確定在實際製備運行期間是否可能存在遺留材料(例如污染物)的溶析。模擬溶析可用作用於評估清潔程序之功效的手段。

溶析緩衝液為用於自層析材料溶析多肽或其他相關產物之緩衝液。在許多情況下，溶析緩衝液具有不同於加載緩衝液之物理特徵。舉例而言，溶析緩衝液可具有不同於加載緩衝液之電導率或不同於加載緩衝液之pH值。在一些實施例中，溶析緩衝液具有比加載緩衝液低之電導率。在一些實施例中，溶析緩衝液具有比加載緩衝液高之電導率。在一些實施例中，溶析緩衝液具有比加載緩衝液低之pH值。在一些實施例中，溶析緩衝液具有比加載緩衝液高之pH值。在一些實施例中，溶析緩衝液具有與加載緩衝液不同之電導率及不同之pH值。溶析緩衝液可具有較高或較低之電導率及較高或較低之pH值的任何組合。

電導率係指水溶液在兩個電極之間傳導電流之能力。在溶液中，電流藉由離子遷移而流動。因此，隨水溶液中存在之離子的量增加，溶液將具有更高之電導率。電導率之基本量測單位為西門子(Siemen) (或姆歐(mho))、姆歐(mS/cm)，且可使用電導率計(諸如各種型號之Orion電導率計)量測。由於電解電導率為溶液中之離子運輸電流之能力，故可藉由改變溶液中之離子濃度來改變溶液之電導率。舉例而言，可改變緩衝劑之濃度及/或溶液中鹽(例如氯化鈉、乙酸鈉或氯化鉀)之濃度以達成所需電導率。較佳地，改變各種緩衝液之鹽濃度以達成所需電導率。 污染物

本發明提供用於在大規模純化多肽時；例如多肽(諸如抗體或其片段)之製造規模製備中使用之層析材料的再使用的方法。該方法提供多種多肽產物之層析材料的多次使用。舉例而言，使用本發明之方法，可將第一抗體以工業規模在層析材料上純化，隨後為本文所描述之清潔/再生層析材料之方法，且接著隨後為第二抗體產物之工業規模純化。在一些實施例中，使用本發明之方法來減少使用層析材料純化之先前產物之「遺留」。在一些實施例中，遺留污染物包括但不限於全抗體、IgG片段、Fc、Fc片段及抗體聚集物。

在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，至少一種污染物為以下中之至少一或多者：宿主細胞材料，諸如CHOP；浸出蛋白質A；核酸；所需多肽之變異體、片段、聚集物或衍生物；另一多肽；內毒素；病毒污染物；細胞培養基組分、羧肽酶B、慶大黴素(gentamicin)等。在一些實例中，污染物可為來自例如但不限於細菌細胞(諸如大腸桿菌細胞)、昆蟲細胞、原核細胞、真核細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、禽類細胞、真菌細胞之宿主細胞蛋白質(HCP)。

浸出蛋白質A為自與其結合之固相剝離或洗滌之蛋白質A。舉例而言，浸出蛋白質A可自蛋白質A層析材料浸出。蛋白質A之量可例如藉由ELISA來量測。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，浸出蛋白質A之量降低大於約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%中之任一者。浸出蛋白質A之量可降低約10%至99%、30%至95%、30%至99%、50%至95%、50%至99%、75%至99%或85%至99%中之任一者。在一些實施例中，浸出蛋白質A之量降低約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%中之任一者。在一些實施例中，該降低係藉由將自純化步驟回收之組合物中浸出蛋白質A之量與純化步驟之前組合物中浸出蛋白質A之量相比較來測定。

宿主細胞蛋白質(HCP)為來自產生多肽之細胞的蛋白質。舉例而言，CHOP為來自宿主細胞之蛋白質，亦即中國倉鼠卵巢蛋白質。CHOP之量可藉由酶聯免疫吸附分析(「ELISA」)或Meso Scale Discovery (「MSO」)來量測。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，在模擬溶析中溶析物中HCP (例如CHOP)之量為極小的。在一些實施例中，將使用與不使用清潔方法或清潔方法之前與之後來自模擬溶析之溶析物中宿主細胞蛋白質之含量相比較。

量測DNA (諸如宿主細胞DNA)之方法為此項技術中已知的且描述於實例部分中。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，DNA之量降低大於約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%中之任一者。DNA之量可降低約10%至99%、30%至95%、30%至99%、50%至95%、50%至99%、75%至99%或85%至99%中之任一者。DNA之量可降低約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%中之任一者。在一些實施例中，該降低係藉由將自純化步驟回收之組合物中DNA之量與純化步驟之前組合物中DNA之量相比較來測定。

片段多肽可為低分子量(LMW)蛋白質。在一些實施例中，片段化之多肽為相關多肽之片段。LMW蛋白質之實例包括但不限於Fab (片段抗原結合)、Fc (片段，可結晶的)區或兩者或相關抗體之任何隨機片段化部分之組合。量測片段化蛋白質(例如LMW蛋白質)之方法為此項技術中已知的且描述於實例部分中。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，LMW蛋白質之量降低大於約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%中之任一者。LMW蛋白質之量可降低約10%至99%、30%至95%、30%至99%、50%至95%、50%至99%、75%至99%或85%至99%中之任一者。LMW蛋白質之量可降低約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%中之任一者。在一些實施例中，該降低係藉由將自純化步驟回收之組合物中片段化蛋白質(例如LMW蛋白質)之量與純化步驟之前組合物中片段化蛋白質(例如LMW蛋白質)之量相比較來測定。

聚集多肽可為高分子量(HMW)蛋白質。在一些實施例中，聚集多肽為相關多肽之多聚體。HMW蛋白質可為相關多肽之二聚體、高至8倍單體或更大。量測聚集蛋白質(例如HMW蛋白質)之方法為此項技術中已知的。在一些實施例中，模擬溶析中HMW之含量為極小的；例如小於約5 ppm、小於約4 ppm、小於約3 ppm、小於約2 ppm或小於約1 ppm。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，聚集蛋白質之量降低大於約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%中之任一者。聚集蛋白質之量可降低約10%至99%、30%至95%、30%至99%、50%至95%、50%至99%、75%至99%或85%至99%中之任一者。聚集蛋白質之量可降低約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%中之任一者。在一些實施例中，該降低係藉由將自純化步驟回收之組合物中聚集蛋白質(例如HMW蛋白質)之量與純化步驟之前組合物中聚集蛋白質(例如HMW蛋白質)之量相比較來測定。

細胞培養基組分係指存在於細胞培養基中之組分。細胞培養基可為收穫細胞時之細胞培養基。在一些實施例中，細胞培養基組分為慶大黴素。慶大黴素之量可藉由ELISA量測。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，細胞培養基組分之量降低大於約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%中之任一者。細胞培養基組分之量可降低約10%至99%、30%至95%、30%至99%、50%至95%、50%至99%、75%至99%或85%至99%中之任一者。在一些實施例中，細胞培養基組分之量降低約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%中之任一者。在一些實施例中，該降低係藉由將自純化步驟回收之組合物中細胞培養基組分之量與純化步驟之前組合物中細胞培養基組分之量相比較來測定。 用於偵測污染物之方法

本發明提供用於評估清潔可再使用之層析材料之有效性的方法。舉例而言，藉由上文所描述之本發明方法清潔先前已加載且溶析至少一次之多肽之層析材料。接著對材料進行模擬溶析，其中在清潔程序之後未將額外的多肽加載於材料上。模擬溶析可跟在先前加載於材料上之多肽所使用之溶析程序之後或溶析程序可跟在用於將在清潔程序之後純化之多肽的溶析程序之後。在一些實施例中，在模擬溶析之前對材料進行模擬加載。模擬加載使用與將多肽加載於材料上相同的程序，只是該加載中不包括多肽。在一些實施例中，將來自模擬溶析之溶析物收集於一或多種級分中。在一些實施例中，將模擬溶析之溶析物收集於單一級分中。在一些實施例中，針對包括來自先前加載之層析材料之遺留多肽的污染物、IgG片段、浸出蛋白質A、CHOP及CHO DNA，對溶析物或溶析物之樣品進行分析。 多肽定量

多肽(諸如單株抗體(mAb))之濃度可使用UV-可見分光光度計(8453型號G1103A；Agilent Technologies; Santa Clara, CA, U.S.A.)或NanoDrop™ 1000型號ND-1000 (Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, U.S.A.)經由280及320 nm下之吸光度來測定。除先前加載於可再使用之層析材料上之多肽或加載至藉由本發明之方法清潔之材料上的多肽以外的物質(亦即雜質)可能濃度太低而對UV吸光度沒有可感知之影響。按需要，可將樣品用適當之在0.1-1.0吸光度單位範圍內之無干擾稀釋劑稀釋。一式兩份地進行樣品製備及UV量測且記錄平均值。MAb吸收係數可在1.42至1.645/mg·ml·cm範圍內。

總蛋白可藉由毛細管區帶電泳/雷射誘發螢光偵測分析來測定。IgG 偵測

完整人類IgG及人類IgG片段可使用完整人類IgG特異性或IgG片段特異性ELISA偵測。人類Fc可使用人類Fc特異性ELISA偵測。IgG 聚集物

IgG聚集物可使用粒徑排阻層析法偵測。IgG聚集物典型地大於完整IgG。CHO 宿主細胞蛋白質 (CHOP) 定量

ELISA可用於對稱為CHOP之CHO宿主細胞蛋白質之含量進行定量。將抗CHOP抗體固定於微量滴定板孔上。將含有CHOP、標準物及對照之樣品的稀釋液在孔中培育，隨後與同辣根過氧化酶(HRP)結合之抗CHOP抗體一起培育。可使用鄰苯二胺偵測HRP酶活性，且藉由在微量滴定板讀數器中在490 nm下讀取吸光度來對CHOP進行定量。基於夾心ELISA之原理，過氧化物酶之濃度對應於CHOP濃度。ELISA之分析範圍典型地為5-320 ng/ml，分析內變異性＜10%。CHOP值可以單位ng/ml報告。或者，可用CHOP值除以多肽濃度且可以PPM (百萬分率；例如每毫克多肽中之CHOP奈克數)報告結果。可使用CHOP ELISA對樣品中之總CHOP含量進行定量，但不對個別蛋白質之濃度進行定量。 CHO DNA 定量

產物樣品中之CHO DNA可使用實時PCR (TaqMan PCR)定量。可首先使用Qiagen之病毒仿生機器人套組(Virus Biorobot kit)提取來自樣品及對照之DNA。使用ABI之序列偵測系統在96孔板中使用PCR引子及探針對提取之樣品、對照及標準DNA進行TaqMan實時聚合酶鏈反應(PCR)。引子由灰倉鼠(Cricetulus griseus )基因體中之重複DNA序列之110鹼基對區段界定。將探針在5'端用螢光報告基團染料標記且在3'端用淬滅基團染料標記。當探針完整時，報告基團之發射光譜受到淬滅基團的抑制。聚合酶之5'核酸酶活性將探針水解且釋放報告基團，從而使得螢光發射增加。序列偵測器對與在DNA擴增期間連續量測之螢光發射增加成正比的擴增產物進行定量。針對標準曲線計算DNA已擴增超過臨限值之循環數目(CT)。可產生在1 pg/mL-10,000 pg/mL範圍內之標準曲線，將其用於對樣品中之DNA進行定量。 浸出蛋白質 A 定量

蛋白質A彙集物中浸出蛋白質A之含量可藉由夾心蛋白質A ELISA來測定。將雞抗葡萄球菌蛋白A抗體固定於微量滴定板孔上。樣品處理程序可包括在夾心ELISA上運行樣品之前進行樣品稀釋及使用微波輔助加熱作為預處理步驟解離蛋白質A/IgG複合物。若蛋白質A存在於樣品中，則可結合於經包被之抗體。所結合之蛋白質A使用辣根過氧化酶結合之抗蛋白質抗體來偵測。辣根過氧化酶酶活性使用產生比色信號之雙組分TMB受質溶液來定量。多肽

本發明之方法可用於清潔用於多種多肽之純化中之層析材料。在一些實施例中，層析材料係大規模地使用；例如在多肽(諸如抗體或其片段)之製造規模製備中使用。在一些實施例中，層析材料用於第一多肽(諸如第一抗體)之純化中，接著將該材料藉由本發明之方法進行清潔，且接著層析材料可用於純化第二多肽，諸如第二抗體。在一些實施例中，清潔為有效的，使得包含第二純化多肽之製劑基本上不含第一多肽。在一些實施例中，包含第二純化多肽(例如第二抗體)之製劑包含小於1 ppm之第一多肽(例如第一抗體)。在一些實施例中，第二純化多肽包含小於1 ppm、2 ppm、3 ppm、4 ppm、5 ppm、10 ppm、20 ppm、30 ppm、40 ppm、50 ppm或100 ppm中之任一者的第一多肽。

在一些實施例中，本發明之方法用於再使用用於純化治療性多肽之層析材料。在一些實施例中，多肽為拮抗劑。在一些實施例中，多肽為促效劑。在一些實施例中，多肽為抗體。在一些實施例中，多肽為抗原決定基經標記的。在一些實施例中，多肽保留生物及/或免疫活性。在一些實施例中，多肽為拮抗劑。在一些實施例中，多肽起始補體依賴性細胞毒性。在一些實施例中，多肽為抗體或免疫黏附素。

在一些實施例中，多肽(第一多肽及/或第二多肽)具有大於約5,000道耳頓、10,000道耳頓、15,000道耳頓、25,000道耳頓、50,000道耳頓、75,000道耳頓、100,000道耳頓、125,000道耳頓或150,000道耳頓中之任一者的分子量。多肽可具有約50,000道耳頓至200,000道耳頓或100,000道耳頓至200,000道耳頓中之任一者的分子量。或者，用於本文中之用途之多肽可具有約120,000道耳頓或約25,000道耳頓之分子量。

pI為等電點且為特定分子或分子表面不帶淨電荷時之pH值。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，多肽(例如第一多肽及/或第二多肽)之pI可為約6至10、7至9或8至9中之任一者。在一些實施例中，多肽具有約6、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10中之任一者的pI。

要使用藉由本文所描述之方法清潔之可再使用的層析材料純化之多肽通常使用重組技術產生。用於產生重組蛋白之方法描述於例如美國專利第5,534,615號及第4,816,567號中，該等專利特定地以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，相關蛋白質在CHO細胞中產生(參見例如WO 94/11026)。當使用重組技術時，多肽可在細胞內、在周質間隙中產生或直接地分泌至培養基中。

要使用藉由本文所描述之方法清潔之可再使用的層析材料純化之多肽可回收自培養基或來自宿主細胞溶解產物。可藉由各種物理或化學方法(諸如冷凍-解凍循環、超音處理、機械破碎或細胞溶解劑)將用於表現多肽之細胞破碎。若在細胞內產生多肽，則作為第一步驟，例如藉由離心或超濾移除微粒碎屑，亦即宿主細胞或溶解片段。Carter等人，Bio/Technology 10: 163-167 (1992)描述用於分離分泌至大腸桿菌之周質間隙之多肽的程序。簡言之，在存在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯基甲基磺醯氟(PMSF)之情況下經約30 min將細胞漿解凍。可藉由離心移除細胞碎片。在多肽分泌至培養基中之情況下，通常首先使用市售多肽濃縮過濾器(例如Amicon®或Millipore Pellicon®超濾單元)將來自此類表現系統之上清液濃縮。可將諸如PMSF之蛋白酶抑制劑包括於前述步驟中之任一者中以抑制蛋白水解且可包括抗生素以防止外來污染物之生長。

可使用藉由本文所描述之方法清潔之可再使用的層析材料純化之多肽之實例包括但不限於免疫球蛋白、免疫黏附素、抗體、酶、激素、融合蛋白、含Fc蛋白質、免疫結合物、細胞介素及介白素。多肽之實例包括但不限於哺乳動物蛋白質，諸如腎素；激素；生長激素，包括人類生長激素及牛生長激素；生長激素釋放因子；副甲狀腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；促黃體生成激素；胰高血糖素；凝血因子，諸如因子VIIIC、因子IX、組織因子及馮威里氏因子(von Willebrands factor)；抗凝血因子，諸如蛋白質C；心房利鈉因子；肺表面活性劑；纖維蛋白溶酶原活化劑，諸如尿激酶或人類尿液或組織型纖維蛋白溶酶原活化劑(t-PA)；鈴蟾素；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α及腫瘤壞死因子-β；腦啡肽酶；RANTES (活化後通常調控T細胞表現及分泌)；人類巨噬細胞炎性蛋白質(MIP-1-α)；血清白蛋白，諸如人類血清白蛋白；繆勒管抑制物質(Muellerian- inhibiting substance)；鬆弛肽A-鏈；鬆弛肽B-鏈；鬆弛素原；小鼠促性腺素相關肽；酶；微生物蛋白質，諸如β-內醯胺酶；DNA酶；IgE；細胞毒性T-淋巴球相關抗原(CTLA)，諸如CTLA-4；抑制素；活化素；血管內皮生長因子(VEGF)；激素或生長因子之受體；蛋白質A或D；類風濕因子；神經營養因子，諸如骨骼源性神經營養因子(BDNF)、神經營養素-3、神經營養素-4、神經營養素-5或神經營養素-6 (NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神經生長因子，諸如NGF-b；血小板源性生長因子(PDGF)；纖維母細胞生長因子，諸如aFGF及bFGF；表皮生長因子(EGF)；轉型生長因子(TGF)，諸如TGF-α及TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長因子-I及胰島素樣生長因子-II (IGF-I及IGF-II)；des(1-3)-IGF-I (腦IGF-I)、胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP)；細胞介素；CD蛋白質，諸如CD3、CD4、CD8、CD19及CD20；紅血球生成素；骨誘導因子；免疫毒素；融合多肽，亦即包含兩種或更多種異源多肽或其片段且由重組核酸編碼之多肽；含Fc多肽，例如包含融合至第二多肽之免疫球蛋白Fc區或其片段之融合蛋白；免疫結合物；骨形態發生蛋白(BMP)；干擾素，諸如干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ；群落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF及G-CSF；介白素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，諸如AIDS包膜之一部分；轉運蛋白；歸巢受體；地址素；調控蛋白；整合素，諸如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4及VCAM；腫瘤相關抗原，諸如CA125 (卵巢癌抗原)或HER2、HER3或HER4受體；免疫黏附素；及以上所列蛋白質中之任一者的片段及/或變異體以及結合於蛋白質(包括例如以上所列蛋白質中之任一者)之抗體，包括抗體片段。抗體

在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，可使用藉由本文所描述之方法清潔之可再使用的層析材料純化之多肽(例如第一多肽、第二多肽或任何後續多肽)為抗體。

抗體之分子靶標包括CD蛋白質及其配位體，諸如但不限於：(i) CD3、CD4、CD8、CD19、CD11a、CD20、CD22、CD34、CD40、CD79α (CD79a)及CD79β (CD79b)；(ii)ErbB受體家族之成員，諸如EGF受體、HER2、HER3或HER4受體；(iii)細胞黏附分子，諸如LFA-1、Mac1、p150,95、VLA-4、ICAM-1、VCAM及αv/β3整合素，包括其α或β次單元(例如抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗體)；(iv)生長因子，諸如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖症(OB)受體；mpl 受體；CTLA-4；蛋白質C、BR3、c-met、組織因子、β7等；及(v)細胞表面及跨膜腫瘤相關抗原(TAA)，諸如美國專利第7,521,541號中描述之彼等細胞表面及跨膜腫瘤相關抗原。

其他示例性抗體包括選自但不限於以下之彼等抗體：抗CD20抗體、抗CD40抗體、抗HER2抗體、抗IL6抗體、抗IgE抗體、抗IL13抗體、抗A型流感抗體、抗TIGIT抗體、抗PD-L1抗體、抗VEGF-A抗體、抗VEGF-A/ANG2抗體、抗CD79b抗體、抗ST2抗體、抗因子D抗體、抗因子IX抗體、抗因子X抗體、抗aβ抗體、抗τ蛋白抗體、抗CEA抗體、抗CEA/CD3抗體、抗CD20/CD3抗體、抗FcRH5/CD3抗體、抗Her2/CD3抗體、抗FGFR1/KLB抗體、FAP-4-1 BBL融合蛋白、FAP-IL2v融合蛋白、抗雌激素受體抗體、抗孕激素受體抗體、抗p53抗體、抗EGFR抗體、抗組織蛋白酶D抗體、抗Bcl-2抗體、抗E-鈣黏蛋白抗體、抗CA125抗體、抗CA15-3抗體、抗CA19-9抗體、抗C-erbB-2抗體、抗P-糖蛋白抗體、抗CEA抗體、抗視網膜母細胞瘤蛋白抗體、抗ras致癌蛋白抗體、抗路易斯X抗體(anti-Lewis X antibody)、抗Ki-67抗體、抗PCNA抗體、抗CD3抗體、抗CD4抗體、抗CD5抗體、抗CD7抗體、抗CD8抗體、抗CD9/p24抗體、抗CD10抗體、抗CD11a抗體、抗CD11c抗體、抗CD13抗體、抗CD14抗體、抗CD15抗體、抗CD19抗體、抗CD22抗體、抗CD23抗體、抗CD30抗體、抗CD31抗體、抗CD33抗體、抗CD34抗體、抗CD35抗體、抗CD38抗體、抗CD41抗體、抗LCA/CD45抗體、抗CD45RO抗體、抗CD45RA抗體、抗CD39抗體、抗CD100抗體、抗CD95/Fas抗體、抗CD99抗體、抗CD106抗體、抗泛素抗體、抗CD71抗體、抗c-myc抗體、抗細胞角蛋白抗體、抗波形蛋白抗體、抗HPV蛋白抗體、抗κ輕鏈抗體、抗λ輕鏈抗體、抗黑素體抗體、抗前列腺特異性抗原抗體、抗S-100抗體、抗τ蛋白抗原抗體、抗纖維蛋白抗體、抗角蛋白抗體及抗Tn抗原抗體。在一些實施例中，抗體選自由以下組成之群：奧瑞珠單抗、帕妥珠單抗、曲妥珠單抗、托珠單抗、法瑞西單抗、普拉土珠單抗、甘特珠單抗、西比沙他單抗、克雷內珠單抗、莫蘇尼妥珠單抗、替拉格魯單抗、貝伐單抗、利妥昔單抗、阿特珠單抗、奧妥珠單抗、蘭帕珠單抗、來金珠單抗、奧馬珠單抗雷珠單抗、艾美賽珠單抗、賽利克瑞盧單抗、普拉辛珠單抗、RO6874281及RO7122290。多株抗體

在一些實施例中，抗體為多株抗體。較佳藉由多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射相關抗原及佐劑在動物中產生多株抗體。使用雙功能劑或衍生劑(例如順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基磺基丁二醯亞胺酯(藉助半胱胺酸殘基結合)、N-羥基丁二醯亞胺(藉助離胺酸殘基)、戊二醛、丁二酸酐、SOCl₂ 或R¹ N=C=NR，其中R及R¹ 為不同烷基)使相關抗原結合至在所要免疫之物種中具免疫原性之多肽(例如鑰孔戚血藍素、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)可為有用的。

藉由將例如100 μg或5 μg之多肽或結合物(分別針對兔或小鼠)與3體積之弗氏不完全佐劑(Freund's complete adjuvant)組合且在多個位點皮內注射溶液來使動物對抗原、免疫原性結合物或衍生物免疫。一個月後，藉由在多個位點皮下注射用含1/5至1/10原始量之肽或結合物之弗氏不完全佐劑對動物進行加強免疫。七至14天後，對動物進行放血且針對抗體效價對血清進行分析。對動物進行加強免疫直至效價平台期。在一些實施例中，用抗原相同但與不同多肽及/或通過不同交聯試劑結合之結合物對動物進行加強免疫。結合物亦可在重組細胞培養中作為多肽融合物而製得。另外，適當使用聚集劑(諸如明礬)來增強免疫反應。單株抗體

在一些實施例中，在藉由本發明之方法清潔之可再使用的層析材料上純化之抗體為單株抗體。單株抗體係獲自實質上均質之抗體群體，亦即構成群體之個別抗體為相同的及/或結合相同抗原決定基。除了在單株抗體之製備期間產生之可能的變異體，此類變異體通常以微小量存在。因此，修飾語「單株」指示抗體不為離散或多株抗體之混合物的特徵。

舉例而言，單株抗體可使用由Kohler等人, Nature 256:495 (1975)首次描述之雜交瘤方法製備，或可藉由重組DNA方法製備(美國專利第4,816,567號)。

在雜交瘤方法中，如本文所描述對小鼠或其他適當之宿主動物(諸如倉鼠)進行免疫以使得淋巴球產生或能夠產生將特異性結合於用於免疫之多肽的抗體。另選地，可在活體外對淋巴球進行免疫。接著，使用適合融合劑(諸如聚乙二醇)使淋巴球與骨髓瘤細胞融合，以形成雜交瘤細胞(Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice , 第59-103頁(Academic Press, 1986))。

將因此製備之雜交瘤細胞接種且使其在適合之培養基中生長，該適合之培養基較佳含有抑制未融合之親本骨髓瘤細胞生長或存活的一或多種物質。舉例而言，若親本骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用於雜交瘤之培養基典型地將包括次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸腺嘧啶(HAT培養基)，該等物質防止HGPRT缺陷型細胞生長。

在一些實施例中，骨髓瘤細胞為高效融合、支持所選抗體產生細胞穩定高水準產生抗體且對諸如HAT培養基之培養基敏感的彼等骨髓瘤細胞。其中，在一些實施例中，骨髓瘤細胞株為鼠類骨髓瘤細胞株，諸如可購自索爾克研究所細胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center, SanDiego, California USA)之源自MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤之彼等鼠骨髓瘤細胞株，及可購自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA)之SP-2或X63-Ag8-653細胞。亦描述人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞株用於製備人類單株抗體(Kozbor,J. Immunol . 133:3001 (1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Application s第51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。

分析雜交瘤細胞在其中生長之培養基中針對抗原之單株抗體的產生。在一些實施例中，藉由免疫沈澱或藉由活體外結合分析(諸如放射免疫分析(RIA)或酶聯免疫吸附分析(ELISA))測定由雜交瘤細胞產生之單株抗體的結合特異性。

單株抗體之結合親和力可例如藉由Munson等人,Anal. Biochem. 107:220 (1980)之斯卡查德分析(Scatchard analysis)來測定。

在將雜交瘤細胞鑑定為產生具有所需特異性、親和力及/或活性之抗體之後，可藉由有限稀釋程序對純系進行亞選殖且藉由標準方法使其生長(Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice 第59-103頁(Academic Press, 1986))。適合用於此目的之培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。此外，可使雜交瘤細胞作為腹水腫瘤在動物中在活體內生長。

藉由諸如多肽A-瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、滲析或親和層析之習用免疫球蛋白純化程序將由亞純系分泌之單株抗體適當地與培養基、腹水流體或血清分離。

編碼單株抗體之DNA容易分離且使用習用程序測序(例如藉由使用能夠特異性結合於編碼鼠類抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)。在一些實施例中，雜交瘤細胞充當此類DNA之來源。在分離後，可將DNA放入表現載體中，接著將其轉染至原本不產生免疫球蛋白多肽之諸如大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞之宿主細胞中，以獲得單株抗體在重組宿主細胞中之合成。關於在具有編碼抗體之DNA的細菌中重組表現之綜述文章包括Skerra等人,Curr. Opinion in Immunol . 5:256-262 (1993)及Plückthun,Immunol. Revs ., 130:151-188 (1992)。

在另一實施例中，可自使用McCafferty等人,Nature 348:552-554 (1990)中所描述之技術產生之抗體噬菌體文庫分離抗體或抗體片段。Clackson等人,Nature 352:624-628 (1991)及Marks等人,J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)分別描述使用噬菌體文庫分離鼠類及人類抗體。後續的出版物描述藉由鏈改組(Marks等人,Bio/Technology 10:779-783 (1992))以及組合感染及活體內重組作為用於構築極大噬菌體文庫之策略(Waterhouse等人,Nuc. Acids. Res . 21:2265-2266 (1993))來產生高親和力(nM範圍)人類抗體。因此，此等技術為用於分離單株抗體之傳統單株抗體雜交瘤技術的可行替代方案。

亦可例如藉由用人類重鏈及輕鏈恆定結構域之編碼序列取代同源鼠類序列(美國專利第4,816,567號；Morrison等人, Proc. Natl Acad. Sci. USA 81:6851 (1984))，或藉由將非免疫球蛋白多肽之所有或部分編碼序列共價連接至免疫球蛋白編碼序列對DNA進行修飾。

典型地，使此類非免疫球蛋白多肽取代抗體之恆定結構域，或使其取代抗體之一個抗原組合位點之可變結構域以形成嵌合二價抗體，該嵌合二價抗體包含對抗原具有特異性之一個抗原組合位點及對不同抗原具有特異性之另一抗原組合位點。

在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，抗體為IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在一些實施例中，抗體為IgG單株抗體。人類化抗體

在一些實施例中，抗體為人類化抗體。此項技術中已描述用於人類化非人類抗體之方法。在一些實施例中，人類化抗體具有自非人類來源引入其中之一或多個胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基常常稱為「輸入」殘基，其典型地取自「輸入」可變結構域。人類化可基本上遵循Winter及同事(Jones等人,Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等人,Science 239:1534-1536 (1988))之方法，藉由用高變區序列取代人類抗體之對應序列來進行。因此，此類「人類化」抗體為嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中實質上不夠完整之人類可變結構域已由來自非人類物種之對應序列取代。在實踐中，人類化抗體典型地為其中一些高變區殘基及可能一些FR殘基由來自囓齒動物抗體中之類似位點的殘基取代的人類抗體。

選擇人類可變結構域(輕與重)用於製備人類化抗體對於降低抗原性而言為非常重要的。根據所謂的「最佳擬合」方法，針對已知人類可變結構域序列之整個文庫對囓齒動物抗體之可變結構域之序列進行篩選。接著將最接近囓齒動物序列之人類序列當作人類化抗體之人類構架區(FR) (Sims等人,J. Immunol. 151:2296 (1993)；Chothia等人,J. Mol. Biol. 196:901 (1987))。另一方法使用自輕鏈或重鏈可變區之特定亞組之所有人類抗體的共同序列衍生的特定構架區。相同構架可用於若干不同人類化抗體(Carter等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)；Presta等人,J. Immunol . 151:2623 (1993))。

進一步重要的是，抗體經人類化且保留對抗原之高親和力及其他有利生物特性。為達成此目標，在該等方法之一些實施例中，藉由使用親本及人類化序列之三維模型分析親本序列及各種概念人類化產物之方法來製備人類化抗體。三維免疫球蛋白模型通常為可獲得的且為熟習此項技術者所熟悉。說明及展示所選候選免疫球蛋白序列之可能的三維構象結構之電腦程式為可獲得的。對此等展示之檢查容許分析殘基在候選免疫球蛋白序列之功能中之可能的作用，亦即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原之能力的殘基。以此方式，可選擇及組合來自接受者及輸入序列之FR殘基使得達成所需抗體特徵，諸如對靶標抗原之親和力增加。一般而言，高變區殘基直接地且最實質性地參與影響抗原結合。人類抗體

在一些實施例中，抗體為人類抗體。作為人類化之替代方案，可產生人類抗體。舉例而言，現在有可能產生在免疫後能夠在不存在內源性免疫球蛋白產生之情況下產生完整人類抗體譜之基因轉殖動物(例如小鼠)。舉例而言，已描述在嵌合及生殖細胞系突變體小鼠中抗體重鏈連接區域(J_H )基因之純合子缺失引起內源性抗體產生之完全抑制。此類生殖細胞系突變體小鼠中人類生殖細胞系免疫球蛋白基因陣列之轉移將使得在抗原攻擊後產生人類抗體。參見例如Jakobovits等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993)；Jakobovits等人, Nature 362:255-258 (1993)；Bruggermann等人, Year in Immuno. 7:33 (1993)；及美國專利第 5,591,669號；第5,589,369號；及第5,545,807號。

另選地，噬菌體展示技術(McCafferty等人,Nature 348:552-553 (1990))可用於在活體外由來自未免疫供體之免疫球蛋白可變(V)結構域基因譜產生人類抗體及抗體片段。根據此技術，將抗體V結構域基因框內選殖至絲狀噬菌體之主要或次要外殼多肽基因(諸如M13或fd)中，且作為功能抗體片段展示於噬菌體粒子之表面上。由於絲狀粒子含有噬菌體基因體之單股DNA拷貝，基於抗體之功能特性進行的選擇亦產生對編碼展現彼等特性之抗體之基因的選擇。因此，噬菌體模擬B細胞之一些特性。噬菌體展示可以多種模式進行；其綜述參見例如Johnson, Kevin S.及Chiswell, David J.,Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)。V-基因區段之若干來源可用於噬菌體展示。Clackson等人,Nature 352: 624-628 (1991)自衍生自經免疫小鼠之脾臟的V基因之小隨機組合文庫分離多種抗噁唑酮抗體。可構築來自未免疫人類供體之V基因譜且可基本上遵循Marks等人,J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)或Griffith等人,EMBO J. 12:725-734 (1993)所描述之技術分離針對多種抗原(包括自體抗原)之抗體。亦參見美國專利第5,565,332號及第5,573,905號。

人類抗體亦可由活體外活化之B細胞產生(參見美國專利5,567,610及5,229,275)。抗體片段

在一些實施例中，抗體為抗體片段。已開發各種技術用於產生抗體片段。傳統地，經由完整抗體之蛋白水解消化來衍生此等片段(參見例如Morimoto等人,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及Brennan等人, Science 229:81 (1985))。然而，此等片段現可直接由重組宿主細胞產生。舉例而言，抗體片段可分離自上文論述之抗體噬菌體文庫。另選地，Fab'-SH片段可直接自大腸桿菌回收且化學偶合以形成F(ab')₂ 片段(Carter等人,Bio/Technology 10:163-167 (1992))。根據另一方法，F(ab')₂ 片段可直接自重組宿主細胞培養物分離。用於產生抗體片段之其他技術對熟練從業者而言將為顯而易見的。在其他實施例中，選擇之抗體為單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185；美國專利第5,571,894號；及美國專利第5,587,458號。舉例而言，抗體片段亦可為「線性抗體」，例如如美國專利5,641,870中所描述。此類線性抗體片段可為單特異性或雙特異性。

在一些實施例中，提供本文所描述之抗體的片段。在一些實施例中，抗體片段為抗原結合片段。在一些實施例中，抗原結合片段選自由以下組成之群：Fab片段、Fab'片段、F(ab’)₂ 片段、scFv、二scFv、雙scFv、串聯(二、三)-scFv、Fv、sdAb、三功能抗體、BiTE、雙抗體及三抗體。雙特異性抗體

在一些實施例中，抗體為雙特異性抗體。雙特異性抗體為對至少兩種不同抗原決定基具有結合特異性之抗體。示例性雙特異性抗體可結合於兩種不同抗原決定基。另選地，雙特異性抗體結合臂可與結合於白血球上之觸發分子(諸如T細胞受體分子(例如CD2或CD3))或IgG之Fc受體(FcγR) (諸如FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)及FcγRIII (CD16))的臂組合以便使細胞防禦機制集中於該細胞。雙特異性抗體可經製備呈全長抗體或抗體片段(例如F(ab')₂ 雙特異性抗體)形式。

用於製備雙特異性抗體之方法為此項技術中已知的。傳統的全長雙特異性抗體產生係基於兩個免疫球蛋白重鏈輕鏈對之共表現，其中兩條鏈具有不同特異性(Millstein等人, Nature 305:537-539 (1983))。由於免疫球蛋白重鏈及輕鏈之隨機分配，此等雜交瘤(四體瘤)產生10種不同抗體分子之潛在混合物，其中僅一種具有恰當的雙特異性結構。恰當分子之純化通常藉由親和層析步驟進行，相當繁瑣，且產物產率低。類似程序揭示於WO 93/08829中及Traunecker等人, EMBO J. , 10:3655-3659 (1991)中。

根據不同方法，使具有所需結合特異性(抗體-抗原組合位點)之抗體可變結構域融合至免疫球蛋白恆定結構域序列。在一些實施例中，融合係與免疫球蛋白重鏈恆定結構域融合，包含鉸鏈之至少一部分、CH2及CH3區。在一些實施例中，含有輕鏈結合所必需之位點的第一重鏈恆定區(CH1)存在於融合物中之至少一者中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物及(若需要)免疫球蛋白輕鏈之DNA插入單獨的表現載體，且共轉染至適合之宿主有機體中。在當構築中使用之不相等比率之三個多肽鏈時提供最佳產率之實施例中，此在調節三個多肽片段之相互比例中提供極大撓性。然而，當相等比率之至少兩個多肽鏈之表現產生高產率時或當比率不具有特定顯著性時，可能將三個多肽鏈中之兩者或全部之編碼序列插入一個表現載體中。

在此方法之一些實施例中，雙特異性抗體由一條臂中之具有第一結合特異性之雜合免疫球蛋白重鏈及另一臂中之雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)組成。發現此非對稱結構促進所需雙特異性化合物自不希望之免疫球蛋白鏈組合中分離，因為僅一半之雙特異性分子中存在免疫球蛋白輕鏈提供簡易分離方式。此方法揭示於WO 94/04690中。關於產生雙特異性抗體之其他細節參見例如Suresh等人, Methods in Enzymology 121:210 (1986)。

根據美國專利第5,731,168號中所描述之另一方法，可將一對抗體分子之間的界面工程化以使自重組細胞培養物回收之異二聚體的百分比最大化。在一些實施例中，界面包含抗體恆定結構域之C_H 3結構域之至少一部分。在此方法中，第一抗體分子之界面的一或多個小胺基酸側鏈經較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換。藉由將大胺基酸側鏈用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換在第二抗體分子之界面上形成大小與大側鏈相同或類似之補償性「空腔」。此提供用於相較於其他不希望之製成品(諸如同二聚體)增加異二聚體之產率的機制。

雙特異性抗體包括交聯或「雜結合」抗體。舉例而言，雜結合物中之抗體中之一者可偶合至親和素，另一者偶合至生物素。已例如提出此類抗體使免疫系統細胞靶向不希望之細胞(美國專利第4,676,980號)，且用於治療HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373及EP 03089)。雜結合抗體可使用任何方便之交聯方法來製備。適合之交聯劑為此項技術中熟知，且與許多交聯技術一起揭示於美國專利第4,676,980號中。

用於自抗體片段產生雙特異性抗體之技術亦已描述於文獻中。舉例而言，雙特異性抗體可使用化學鍵聯來製備。Brennan等人,Science 229: 81 (1985)描述將完整抗體蛋白水解裂解以產生F(ab')₂ 片段之程序。此等片段在存在二硫醇複合劑亞砷酸鈉之情況下經還原以使鄰近之二硫醇穩定且防止分子間二硫化物形成。所產生之Fab'片段接著轉化為硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。接著藉由用巰基乙胺還原將Fab'-TNB衍生物中之一者再轉化為Fab'-硫醇且與等莫耳量之另一Fab'-TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。所產生之雙特異性抗體可用作用於酶之選擇性固定的劑。

亦已描述用於直接自重組細胞培養物製備及分離雙特異性抗體片段之各種技術。舉例而言，已使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體。Kostelny等人,J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。藉由基因融合將來自Fos及Jun蛋白之白胺酸拉鏈肽連接至兩種不同抗體之Fab'部分。在鉸鏈區將抗體同二聚體還原以形成單體且接著再氧化以形成抗體異二聚體。亦可利用此方法來製備抗體同二聚體。Hollinger等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)描述之「雙抗體」技術提供用於製備雙特異性抗體片段之替代機制。片段包含藉由連接子連接至輕鏈可變結構域(V_L )之重鏈可變結構域(V_H )，該連接子過短而不允許相同鏈上之兩個結構域之間配對。因此，一個片段之V_H 及V_L 結構域被迫與另一片段之互補V_L 及V_H 結構域配對，由此形成兩個抗原結合位點。亦已報道藉由使用單鏈Fv (sfv)二聚體來製備雙特異性抗體片段之另一策略。參見Gruber等人,J. Immunol. 152:5368 (1994)。

涵蓋超過二價之抗體。舉例而言，可製備三特異性抗體。Tutt等人,J. Immunol. 147: 60 (1991)。多價抗體

在一些實施例中，抗體為多價抗體。多價抗體可比二價抗體更快地由表現與抗體結合之抗原的細胞內化(及/或異化)。本文所提供之抗體可為具有三個或更多個抗原結合位點之多價抗體(其不屬於IgM類別) (例如四價抗體)，其可藉由編碼抗體多肽鏈之核酸的重組表現而容易地產生。多價抗體可包含二聚化結構域及三個或更多個抗原結合位點。較佳二聚化結構域包含Fc區或鉸鏈區(或由其組成)。在此情況下，抗體將包含Fc區及Fc區胺基端之三個或更多個抗原結合位點。本文中之較佳多價抗體包含三至約八個，但較佳四個抗原結合位點(或由其組成)。多價抗體包含至少一條多肽鏈(且較佳兩條多肽鏈)，其中多肽鏈包含兩個或更多個可變結構域。舉例而言，多肽鏈可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2) n-Fc，其中VD1為第一可變結構域，VD2為第二可變結構域，Fc為Fc區之一條多肽鏈，X1及X2表示胺基酸或多肽，且n為0或1。舉例而言，多肽鏈可包含：VH-CH1-柔性連接子-VH-CH1-Fc區鏈；或VH-CH1-VH-CH1-Fc區鏈。本文中之多價抗體較佳進一步包含至少兩個(且較佳四個)輕鏈可變結構域多肽。本文中之多價抗體可例如包含約兩個至約八個輕鏈可變結構域多肽。在此涵蓋之輕鏈可變結構域多肽包含輕鏈可變結構域且視情況進一步包含CL結構域。

在一些實施例中，抗體為多特異性抗體。多特異性抗體之實例包括但不限於包含重鏈可變結構域(V_H )及輕鏈可變結構域(V_L )且其中V_H V_L 單元具有多抗原決定基特異性之抗體、具有兩個或更多個V_L 及V_H 結構域且各V_H V_L 單元結合於不同抗原決定基之抗體、具有兩個或更多個單一可變結構域且各單一可變結構域結合於不同抗原決定基之抗體、全長抗體、抗體片段，諸如Fab、Fv、dsFv、scFv、雙抗體、雙特異性雙抗體、三抗體、三功能抗體、已共價或非共價連接之抗體片段。在一些實施例中，抗體具有多抗原決定基特異性；例如特異性結合於相同或不同靶標上之兩種或更多種不同抗原決定基之能力。在一些實施例中，抗體為單特異性的；例如僅結合一種抗原決定基之抗體。根據一個實施例，多特異性抗體為以5 µM至0.001 pM、3 µM至0.001 pM、1 µM至0.001 pM、0.5 µM至0.001 pM或0.1 µM至0.001 pM之親和力結合於各抗原決定基的IgG抗體。其他抗體修飾

可能需要關於效應功能對本文所提供之抗體進行修飾，例如以便增強抗體之抗原依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。此可藉由在抗體之Fc區中引入一或多個胺基酸取代來達成。另選地或另外，可將半胱胺酸殘基引入Fc區，由此允許此區域中之鏈間二硫鍵形成。由此產生之同二聚抗體可具有改良之內化能力及/或增加之補體介導之細胞殺傷及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。參見Caron等人,J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)及Shopes, B. J.,Immunol. 148:2918-2922 (1992)。亦可如Wolff等人,Cancer Research 53:2560-2565 (1993)中所描述使用異雙官能交聯劑製備具有增強之抗腫瘤活性的同二聚抗體。另選地，抗體可經工程化從而具有雙Fc區且可由此具有增強之補體介導之溶解及ADCC能力。參見Stevenson等人,Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)。

為增加抗體之血清半衰期，可如US 2006/0067930中所描述在抗體中作出胺基酸改變，該專利特此以全文引用之方式併入。 多肽變異體及修飾

本文所描述之多肽(包括抗體)的胺基酸序列修飾可用於藉由本文所描述之方法清潔之可再使用的層析材料中。變異體多肽

「多肽變異體」意謂如本文所定義與多肽之全長天然序列、缺乏信號肽之多肽序列、多肽之細胞外結構域(在存在或不存在信號肽之情況下)具有至少約80%胺基酸序列一致性的多肽，較佳為活性多肽。此類多肽變異體包括例如在全長天然胺基酸序列之N或C端添加或缺失一或多個胺基酸殘基之多肽。一般地，TAT多肽變異體將與全長天然序列多肽序列、缺乏信號肽之多肽序列、多肽之細胞外結構域(在存在或不存在信號肽之情況下)具有至少約80%胺基酸序列一致性或者至少約85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性中之任一者。視情況，變異體多肽與天然多肽序列相比將具有不超過一個保守胺基酸取代，另選地與天然多肽序列相比具有不超過約2、3、4、5、6、7、8、9或10個保守胺基酸取代中之任一者。

變異體多肽例如當與全長天然多肽相比時可在N端或C端截短，或可缺乏內部殘基。某些變異體多肽可缺乏並非所需生物活性所必需之胺基酸殘基。此等具有截短、缺失及插入之變異體多肽可藉由許多習用技術中之任一者來製備。所需變異體多肽可為化學合成的。另一適合之技術涉及分離及藉由聚合酶鏈反應(PCR)擴增編碼所需變異體多肽之核酸片段。在PCR中在5'及3'引子處採用確定核酸片段之所需端的寡核苷酸。較佳地，變異體多肽與本文所揭示之天然多肽共同擁有至少一種生物及/或免疫活性。

胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百或更多個殘基之多肽範圍內的胺基未端及/或羧基未端融合，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體或融合至細胞毒性多肽之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N端或C端融合至增加抗體之血清半衰期的酶或多肽。

舉例而言，可能需要改良多肽之結合親和力及/或其他生物特性。多肽之胺基酸序列變異體係藉由將適當核苷酸變化引入抗體核酸或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如多肽之胺基酸序列內之殘基的缺失及/或插入及/或取代。進行缺失、插入及取代之任何組合以得到最終構築體，前提條件為最終構築體具有所需特徵。胺基酸變化亦可改變多肽(例如抗體)之轉譯後過程，諸如改變糖基化位點之數目或位置。

可藉由將多肽之序列與同源已知多肽分子之序列相比較及使高同源性區域中形成之胺基酸序列變化的數目最小化找到確定哪些胺基酸殘基可插入、取代或缺失而不會不利地影響所需活性的指導。

可用於鑑定對於誘變為較佳位置之多肽(例如抗體)之某些殘基或區域的方法如Cunningham及Wells,Science 244:1081-1085 (1989)所描述稱為「丙胺酸掃描誘變」。在此，鑑定殘基或目標殘基群(例如帶電荷之殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)且由中性或帶負電荷之胺基酸(最佳為丙胺酸或聚丙胺酸)置換以影響胺基酸與抗原之相互作用。接著藉由在取代位點處或針對取代位點引入另外的或其他變異體對彼等對取代展示功能靈敏性之胺基酸位置進行改進。因此，雖然用於引入胺基酸序列變化之位點為預定的，但突變本身之性質不需要為預定的。舉例而言，為分析給定位點處之突變的效能，在目標密碼子或區域處進行ala掃描或隨機誘變且針對所需活性對表現之抗體變異體進行篩選。

另一類型之變異體為胺基酸取代變異體。此等變異體在抗體分子中有至少一個胺基酸殘基由不同殘基置換。最令人關注之用於取代誘變之位點包括高變區，但亦涵蓋FR改變。保守取代顯示於下表1中之標題「較佳取代」下。若此類取代引起生物活性變化，則可引入在表1中命名為「示例性取代」或如下文關於胺基酸類別進一步描述之更實質性之變化，且對產物進行篩選。表1. 示例性胺基酸取代

原始殘基	示例性取代	較佳取代
Ala (A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg (R)	Lys；Gln；Asn	Lys
Asn (N)	Gln；His；Asp、Lys；Arg	Gln
Asp (D)	Glu；Asn	Glu
Cys (C)	Ser；Ala	Ser
Gln (Q)	Asn；Glu	Asn
Glu (E)	Asp；Gln	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile (I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸	Leu
Leu (L)	正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys (K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Met (M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe (F)	Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Val；Ser	Ser
Trp (W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val (V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸	Leu

對多肽之生物特性的實質性修飾係藉由選擇對維持(a)在取代區域內之多肽骨架之結構，例如呈摺疊或螺旋構象，(b)在目標位點處分子之電荷或疏水性，或(c)側鏈體積之影響顯著不同的取代來實現。可根據側鏈特性之相似性對胺基酸進行分組(A. L. Lehninger,Biochemistry 第二版, 第73-75頁, Worth Publishers, New York (1975))： (1) 非極性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M) (2) 不帶電荷極性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q) (3) 酸性：Asp(D)、Glu(E) (4) 鹼性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)

另選地，可基於共同側鏈特性將天然存在之殘基分組： (1) 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3) 酸性：Asp、Glu； (4) 鹼性：His、Lys、Arg； (5) 影響鏈取向之殘基：Gly、Pro； (6) 芳族：Trp、Tyr、Phe。

非保守取代將需要將此等類別中之一者的成員換成另一類別。

不參與維持抗體之適當構象的任何半胱胺酸殘基亦可經取代，通常經絲胺酸取代，以改良分子之氧化穩定性且防止異常交聯。相反地，可將半胱胺酸鍵添加至多肽中以改良其穩定性(尤其在抗體為諸如Fv片段之抗體片段的情況下)。

尤佳類型之取代變異體涉及取代親本抗體(例如人類化抗體)之一或多個高變區殘基。通常，經選擇用於進一步研發之所得變異體將相對於產生它們之母體抗體具有改良之生物特性。方便用於產生此類取代變異體之方式涉及使用噬菌體展示實現親和力成熟。簡言之，使若干高變區位點(例如6-7個位點)突變以在各位點處產生所有可能之胺基取代。由此產生之抗體變異體由絲狀噬菌體粒子以單價方式展示為與包裝於各粒子內之M13的基因III產物之融合物。接著如本文所揭示針對生物活性(例如結合親和力)對噬菌體展示變異體進行篩選。為鑑定用於修飾之候選高變區位點，可進行丙胺酸掃描誘變以鑑定顯著有助於抗原結合之高變區殘基。另選地或另外，分析抗原-抗體複合物之晶體結構以鑑定抗體與靶標之間的接觸點可為有益的。根據本文詳細描述之技術，此類接觸殘基及相鄰殘基為用於取代之候選者。在產生此類變異體後，如本文所描述對變異體組進行篩選且可選擇在一或多個相關分析中具有優良特性之抗體用於進一步研發。

多肽之另一類型之胺基酸變異體改變抗體之原始糖基化模式。多肽可包含非胺基酸部分。舉例而言，多肽可為糖基化的。此類糖基化可天然地發生在多肽在宿主細胞或宿主有機體中表現期間，或可為由人類干預產生之有意進行之修飾。改變意謂缺失存在於多肽中之一或多個碳水化合物部分，及/或添加不存在於多肽中之一或多個糖基化位點。

多肽之糖基化典型地為N-連接或O-連接的。N-連接的係指碳水化合物部分連接至天冬醯胺殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸外之任何胺基酸)為用於使碳水化合物部分酶連接至天冬醯胺側鏈之識別序列。因此，多肽中存在此等三肽序列中之任一者形成潛在糖基化位點。O-連接之糖基化係指糖N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖中之一者連接至羥基胺基酸，最通常為絲胺酸或蘇胺酸，不過亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。

添加糖基化位點至多肽方便地藉由改變胺基酸序列使得其含有上文所描述之三肽序列中之一或多者來實現(對於N-連接之糖基化位點)。改變亦可藉由向原始抗體之序列中添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或由一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代來實現(對於O-連接之糖基化位點)。

移除存在於多肽上之碳水化合物部分可以化學方式或酶促方式或藉由編碼充當糖基化靶標之胺基酸殘基之密碼子的突變取代來實現。多肽上之碳水化合物部分的酶裂解可藉由使用多種內切及外切糖苷酶來達成。

其他修飾包括麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基分別去醯胺化為對應麩胺醯基及天冬胺醯基殘基、脯胺酸及離胺酸之羥基化、絲氨醯基或蘇氨醯基殘基之羥基的磷酸化、離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基之甲基化、N端胺之乙醯化及任何C端羧基之醯胺化。嵌合多肽

可以一方式對本文所描述之多肽進行修飾，以形成包含融合至另一異源多肽或胺基酸序列之多肽的嵌合分子。在一些實施例中，嵌合分子包含多肽與標籤多肽之融合，此提供抗標籤抗體可選擇性結合之抗原決定基。抗原決定基標籤通常放置於多肽之胺基端或羧基端。此類抗原決定基標記形式之多肽的存在可使用針對標籤多肽之抗體來偵測。另外，提供抗原決定基標籤使多肽能夠容易地藉由親和力純化使用抗標籤抗體或結合於抗原決定基標籤之另一類型之親和力基質進行純化。

在一替代實施例中，嵌合分子可包含多肽與免疫球蛋白或特定免疫球蛋白區域之融合。二價形式之嵌合分子稱為「免疫黏附素」。

如本文所用，術語「免疫黏附素」對將異源多肽之結合特異性與免疫球蛋白恆定結構域之效應功能組合之抗體樣分子進行命名。在結構上，免疫黏附素包含具有除抗體之抗原識別及結合位點外之所需結合特異性之胺基酸序列(亦即，為「異源」的)與免疫球蛋白恆定結構域序列之融合。免疫黏附素分子之黏附素部分典型地為至少包含受體或配位體之結合位點的連續胺基酸序列。免疫黏附素中之免疫球蛋白恆定結構域序列可獲自任何免疫球蛋白，諸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亞型、IgA (包括IgA-1及IgA-2)、IgE、IgD或IgM。

Ig融合較佳包括可溶性(跨膜結構域缺失或去活化)形式之多肽取代Ig分子內之至少一個可變區。在一尤佳實施例中，免疫球蛋白融合物包括IgG1分子之鉸鏈、CH₂ 及CH₃ ，或鉸鏈、CH₁ 、CH₂ 及CH₃ 區。多肽結合物

用於多肽調配物中之多肽可結合至細胞毒性劑，諸如化學治療劑、生長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素或其片段)，或放射性同位素(亦即，放射性結合物)。

可使用適用於產生此類結合物之化學治療劑。此外，可使用之酶活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌)、篦麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-八疊球菌素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻風樹毒素、巴豆毒素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素、絲林黴素、侷限麴菌素、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及單端孢黴烯。多種放射性核素可用於製備放射性結合之多肽。實例包括²¹² Bi、¹³¹ I、¹³¹ In、⁹⁰ Y及¹⁸⁶ Re。多肽及細胞毒性劑之結合物使用諸如以下之多種雙官能蛋白質-偶合劑來製備：N-丁二醯亞胺基-3-(2- 吡啶基二硫酚)丙酸鹽(SPDP)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞胺酸酯之雙官能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯HCL)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如2,6-二異氰酸甲代伸苯酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，篦麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人,Science 238: 1098 (1987)中所描述來製備。碳-14標記之1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)為用於使放射性核苷酸結合至多肽之示例性螯合劑。

本文中亦涵蓋多肽及諸如加利車黴素(calicheamicin)、類美登素(maytansinoid)、單端孢黴烯(trichothene)及CC1065之一或多種小分子毒素及此等毒素之具有毒素活性之衍生物的結合物。

類美登素為有絲分裂抑制劑，其藉由抑制微管蛋白聚合來起作用。美登素最初分離自東非灌木齒葉美登木(Maytenus serrata )。隨後，發現某些微生物亦產生類美登素，諸如美登醇及C-3美登醇酯。亦涵蓋合成美登醇及衍生物及其類似物。存在許多此項技術中已知用於製備多肽-類美登素結合物之鍵聯基團，包括例如美國專利第5,208,020號中揭示之彼等鍵聯基團。鍵聯基團包括如上述專利中所揭示的二硫化物基團、硫醚基團、酸不穩定性基團、光不穩性基團、肽酶不穩定性基團或酯酶不穩定性基團，二硫化物及硫醚基團為較佳的。

視連接類型而定，連接子可在各個位置處連接至類美登素分子。舉例而言，酯鍵聯可藉由使用習用偶合技術與羥基反應來形成。反應可發生在具有羥基之C-3位置、經羥基甲基修飾之C-14位置、經羥基修飾之C-15位置及具有羥基之C-20位置處。在一較佳實施例中，鍵聯形成於美登醇或美登醇類似物之C-3位置處。

另一相關結合物包含結合至一或多個加利車黴素分子之多肽。加利車黴素家族之抗生素能夠在亞皮莫耳濃度下產生雙股DNA斷裂。對於加利車黴素家族之結合物的製備，參見例如美國專利第5,712,374號。可使用之加利車黴素之結構類似物包括但不限於γ₁ ^I 、α₂ ^I 、α₃ ^I 、N-乙酰基-γ₁ ^I 、PSAG及θ₁ ^I 。抗體可結合之另一抗腫瘤藥物為QFA，其為一種抗葉酸劑。加利車黴素與QFA均具有細胞內作用位點且不容易跨越質膜。因此，此等藥劑藉助多肽(例如抗體)介導之內化進行之細胞攝取極大地增強其細胞毒性作用。

可結合至本文所描述之多肽的其他抗腫瘤劑包括BCNU、鏈脲菌素、長春新鹼及5-氟尿嘧啶、已知統稱為LL-E33288複合物之藥劑家族以及埃斯培拉黴素(esperamicin)。

在一些實施例中，多肽可為多肽與具有溶核活性之化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸內切酶，諸如去氧核糖核酸酶；DNA酶)之間的結合物。

在另一實施例中，多肽(例如抗體)可結合至「受體」(此類鏈黴親和素)以便用於腫瘤預靶向中，其中向患者投與多肽受體結合物，隨後使用澄清劑將未結合之結合物自循環中移除且接著投與「配位體」(例如親和素)，該配位體結合至細胞毒性劑(例如放射性核苷酸)。

在一些實施例中，多肽可結合至將前藥(例如肽基化學治療劑)轉化為活性抗癌藥之前藥活化酶。免疫結合物之酶組分包括能夠以此類方式作用於前藥以便將其轉化為其更具活性之細胞毒性形式的任何酶。

可用之酶包括但不限於可用於將含磷酸酯前藥轉化為游離藥物之鹼性磷酸酶；可用於將含硫酸酯前藥轉化為游離藥物之芳基硫酸酯酶；可用於將無毒5-氟胞嘧啶轉化為抗癌藥5-氟尿嘧啶之胞嘧啶去胺酶；蛋白酶，諸如沙雷氏菌屬(serratia)蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶及組織蛋白酶(諸如組織蛋白酶B及L)，其可用於將含肽前藥轉化為游離藥物；可用於轉化含有D-胺基酸取代基之前藥的D-丙胺醯基羧肽酶；碳水化合物裂解酶(諸如β-半乳糖苷酶)及可用於將糖基化前藥轉化為游離藥物之神經胺糖酸酶；可用於將用β-內醯胺衍生之藥物轉化為游離藥物之β-內醯胺酶；及可用於將在胺氮處分別用苯氧基乙醯基或苯基乙醯基衍生之藥物轉化為游離藥物之青黴素醯胺酶，諸如青黴素V醯胺酶或青黴素G醯胺酶。另選地，具有酶活性之抗體在此項技術中亦稱為「抗體酶」，其可用於將前藥轉化為游離活性藥物。其他

多肽之另一類型之共價修飾包括將多肽連接至多種非蛋白質聚合物中之一者，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇及聚丙二醇之共聚物。多肽亦可包埋於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、膠態藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或巨乳液中。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences , 第18版, Gennaro, A.R.編, (1990)中。獲得用於調配物及方法中之多肽

要使用藉由本文所描述之方法清潔之可再使用的層析材料純化之多肽可使用此項技術中熟知之方法，包括重組方法來獲得。以下部分提供關於此等方法之指導。 聚核苷酸

如本文中可互換使用，「聚核苷酸」或「核酸」係指任何長度之核苷酸聚合物，且包括DNA及RNA。

編碼多肽之聚核苷酸可獲自任何來源，包括但不限於由咸信具有多肽mRNA且以可偵測水準表現多肽mRNA之組織製備之cDNA文庫。因此，編碼多肽之聚核苷酸可方便地獲自由人類組織製備之cDNA文庫。多肽編碼基因亦可自基因體文庫或藉由已知合成程序(例如自動化核酸合成)來獲得。

舉例而言，聚核苷酸可編碼整個免疫球蛋白分子鏈，諸如輕鏈或重鏈。完整重鏈不僅包括重鏈可變區(V_H )而且包括重鏈恆定區(C_H )，其典型地將包含三個恆定結構域：C_H 1、C_H 2及C_H 3；及「鉸鏈」區。在一些情況下，恆定區之存在為所需的。

可由聚核苷酸編碼之其他多肽包括抗原結合抗體片段，諸如單結構域抗體(「dAb」)、Fv、scFv、Fab'及F(ab')₂ 及「微型抗體」。微型抗體為(典型地)已切除C_H 1及C_K 或C_L 結構域之二價抗體片段。由於微型抗體比習用抗體小，故其在臨床/診斷使用中會達成更佳之組織穿透率，但為二價的，其會保留比單價抗體片段(諸如dAb)更高之結合親和力。因此，除非上下文另有指示，否則如本文所用之術語「抗體」不僅涵蓋全抗體分子而且涵蓋上文所論述類型之抗原結合抗體片段。較佳存在於編碼之多肽中的各構架區相對於對應人類受體構架將包含至少一個胺基酸取代。因此，舉例而言，構架區相對於受體構架區可包含總計三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個或十五個胺基酸取代。

適當地，本文所描述之聚核苷酸可經分離及/或純化。在一些實施例中，聚核苷酸為經分離之聚核苷酸。

術語「經分離之聚核苷酸」旨在表明分子自其正常或天然環境移除或分離或已以使得其不存在於其正常或天然環境中之方式產生。在一些實施例中，聚核苷酸為經純化之聚核苷酸。術語經純化旨在表明已移除至少一些污染分子或物質。

適當地，聚核苷酸為實質上經純化的，使得相關聚核苷酸構成存在於組合物中之優勢(亦即，最豐富)聚核苷酸。 聚核苷酸之表現

以下描述主要係關於藉由培養用含有多肽編碼聚核苷酸之載體轉型或轉染之細胞來產生多肽。當然，預期可使用此項技術中熟知之替代方法來製備多肽。舉例而言，適當胺基酸序列或其部分可藉由使用固相技術進行直接肽合成來產生(參見例如Stewart等人,Solid-Phase Peptide Synthesis W.H. Freeman Co., San Francisco, Calif. (1969)；Merrifield,J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963))。可使用人工技術或藉由自動化進行活體外蛋白質合成。自動化合成可例如使用製造商之說明書使用應用生物系統肽合成器(Foster City, Calif.)來實現。可分開地化學合成多肽之各種部分且使用化學或酶法組合以產生所需多肽。

將如本文所描述之聚核苷酸插入表現載體中以便產生多肽。術語「控制序列」係指為可操作地連接之編碼序列在特定宿主有機體中表現所必需之DNA序列。控制序列包括但不限於啟動子(例如天然相關或異源之啟動子)、信號序列、增強子元件及轉錄終止序列。

聚核苷酸在其被放入與另一聚核苷酸序列之功能關係時為「可操作地連接的」。舉例而言，若前序列或分泌前導子表現為參與多肽分泌之前蛋白，則前序列或分泌前導子之核酸可操作地連接至多肽之核酸；若啟動子或增強子影響編碼序列之轉錄，則啟動子或增強子可操作地連接至該序列；或若核糖體結合位點經安置以促進轉譯，則核糖體結合位點可操作地連接至編碼序列。通常，「可操作地連接」意謂連接之核酸序列為連續的，且在分泌前導子之情況下，為連續的且處於閱讀階段中。然而，增強子未必為連續的。通連接係藉由在方便之限制位點處連結來實現。若此類位點不存在，則根據習用作法使用合成寡核苷酸銜接子或連接子。

對於抗體，輕鏈及重鏈可在相同或不同表現載體中選殖。編碼免疫球蛋白鏈之核酸區段可操作地連接至表現載體中之控制序列，從而確保免疫球蛋白多肽之表現。

可藉由熟知方法將含有聚核苷酸序列(例如可變重鏈及/或可變輕鏈編碼序列及視情況存在之表現控制序列)之載體轉移至宿主細胞中，該等熟知方法視細胞宿主之類型而變化。舉例而言，氯化鈣轉染通常用於原核細胞，而磷酸鈣處理、電穿孔、脂質體轉染、生物彈射擊或基於病毒之轉染可用於其他細胞宿主。(通常參見 Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 第2版, 1989)。用於將哺乳動物細胞轉型之其他方法包括使用聚凝胺、原生質體融合、脂質體、電穿孔及微量注射。對於基因轉殖動物之產生，可將轉殖基因顯微注射至受精之卵母細胞中，或可併入胚胎幹細胞之基因體中，且將此類細胞之核轉移至去核之卵母細胞中。載體

術語「載體」包括表現載體及轉型載體及穿梭載體。

術語「表現載體」意謂能夠活體內或活體外表現之構築體。

術語「轉型載體」意謂能夠自一個實體轉移至可屬於該物種或可屬於不同物種之另一實體的構築體。若構築體能夠自一個物種轉移至另一物種(諸如自大腸桿菌(Escherichia coli )質粒至細菌，諸如芽孢桿菌屬(Bacillus )之細菌)，則轉型載體有時稱為「穿梭載體」。其甚至可能為能夠自大腸桿菌質粒轉移至土壤桿菌屬(Agrobacterium )轉移至植物之構築體。

載體可轉型至如下文所描述適合於提供多肽之表現的宿主細胞中。各種載體為公共可獲得的。載體可例如呈質粒、黏粒、病毒粒子或噬菌體形式。適當之核酸序列可藉由多種程序插入載體中。一般而言，使用此項技術中已知之技術將DNA插入適當之限制性內切核酸酶位點。含有此等組分中之一或多者之適合的載體的構築採用熟練技工已知之標準連結技術。

載體可為例如質粒、病毒或噬菌體載體，其具備複製起點、視情況存在之用於該聚核苷酸之表現的啟動子及視情況存在之啟動子之調控子。載體可含有此項技術中熟知之一或多個可選標記基因。

此等表現載體典型地在宿主有機體中作為游離基因體或作為宿主染色體DNA之組成部分複製。 宿主細胞

宿主細胞可為例如細菌、酵母或其他真菌細胞、昆蟲細胞、植物細胞或哺乳動物細胞。

已經基因操縱之基因轉殖多細胞宿主有機體可用於產生多肽。有機體可為例如基因轉殖哺乳動物有機體(例如基因轉殖山羊或小鼠系)。

適合之原核生物包括但不限於真細菌，諸如革蘭氏陰性(Gram-negative)或格蘭氏陽性有機體，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae )，諸如大腸桿菌。各種大腸桿菌株為公共可獲得的，諸如大腸桿菌K12株MM294 (ATCC 31,446)；大腸桿菌X1776 (ATCC 31,537)；大腸桿菌株W3110 (ATCC 27,325)及K5 772 (ATCC 53,635)。其他適合之原核宿主細胞包括腸桿菌科，諸如埃希氏桿菌屬(Escherichia ) (例如大腸桿菌 ) 、腸桿菌屬 (Enterobacter) 、歐文氏菌屬 (Erwinia) 、克雷伯氏桿菌屬 (Klebsiella) 、變形桿菌屬 (Proteus) 、沙門氏菌屬 (Salmonella) ( 例如鼠傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhimurium)) 、沙雷氏菌屬 (Serratia) ( 例如黏質沙雷氏菌 (Serratia marcescans ))及志賀氏菌屬(Shigella )，以及芽孢桿菌屬(Bacilli ) (諸如枯草芽孢桿菌(B.subtilis )及地衣芽孢桿菌(B.licheniformis ) (例如地衣芽孢桿菌41P))、假單胞菌屬(Pseudomonas ) (諸如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa ))及鏈黴菌屬(Streptomyces )。此等實例為說明性而非限制性的。株W3110為一種尤佳之宿主或母體宿主，乃因其為用於重組聚核苷酸產物醱酵之常見宿主株。較佳地，宿主細胞分泌最小量之蛋白水解酶。舉例而言，可對株W3110進行修飾以實現對宿主而言為內源性的編碼多肽之基因的基因突變，此類宿主之實例包括大腸桿菌W3110株1A2，其具有完整基因型tonA ；大腸桿菌W3110株9E4，其具有完整基因型tonA ptr3 ；大腸桿菌W3110株27C7 (ATCC 55,244)，其具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kan' ；大腸桿菌W3110株37D6，其具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7ilvG kan' ；大腸桿菌W3110株40B4，其為具有非卡那黴素抗性degP 缺失突變之株37D6；及具有突變體周質蛋白酶之大腸桿菌株。另選地，活體外選殖方法(例如PCR或其他核酸聚合酶反應)為適合的。

在此等原核宿主中，吾人可製備表現載體，其將典型地含有與宿主細胞相容之表現控制序列(例如複製起點)。此外，將存在任何數目之多種熟知啟動子，諸如乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或來自噬菌體λ之啟動子系統。啟動子將典型地視情況與操縱子序列一起控制表現，且具有核糖體結合位點序列及類似序列，用於起始及完成轉錄及轉譯。

可使用真核微生物來進行表現。諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為適合用於多肽編碼載體之選殖或表現宿主。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae )為常用之低等真核宿主微生物。其他包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )；克魯維酵母屬(Kluyveromyces )宿主，諸如乳酸克魯維酵母(K. lactis ) (MW98-8C、CBS683、CBS4574)、脆壁克魯維酵母(K. fragilis ) (ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(K. bulgaricus ) (ATCC 16,045)、威克克魯維酵母(K. wickeramii ) (ATCC 24,178)、瓦爾提克魯維酵母(K. waltii ) (ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K. drosophilarum ) (ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母(K. thermotolerans )及馬克思克魯維酵母(K. marxianus) ；耶氏酵母屬 (yarrowia ) (EP 402,226)；巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris )；念珠菌屬(Candida) ；里氏木黴菌 (Trichoderma reesia )；紅麵包黴菌(Neurospora crassa )；許旺酵母屬(Schwanniomyces )，諸如西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis )；及絲狀真菌，諸如紅黴菌屬(Neurospora )、青黴屬(Penicillium) 、彎頸黴屬 (Tolypocladium )及麴菌屬宿主，諸如小巢狀麴菌(A.nidulans )及黑麴菌(A. niger )。甲醇酵母在本文中為適合的且包括但不限於能夠基於甲醇生長之酵母，其選自由以下組成之屬：漢遜酵母屬(Hansenula) 、念珠菌屬、克勒克酵母屬 (Kloeckera) 、畢赤酵母屬 (Pichia) 、糖酵母屬 (Saccharomyces) 、球擬酵母屬 (Torulopsis )及紅酵母屬(Rhodotorula )。糖酵母屬為較佳之酵母宿主，且適合之載體按需要具有表現控制序列(例如啟動子)、複製起點、終止序列及諸如此類。典型啟動子包括3-磷酸甘油酸激酶及其他糖解酶。可誘導酵母啟動子尤其包括來自乙醇脫氫酶、異細胞色素C及負責麥芽糖及半乳糖利用之酶的啟動子。

除微生物之外，哺乳動物組織細胞培養亦可用於表現及產生如本文所描述之多肽且在一些情況下為較佳的(參見Winnacker,From Genes to Clones VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)。對於一些實施例，真核細胞可為較佳的，此乃因此項技術中已開發許多能夠分泌異源多肽(例如完整免疫球蛋白)之適合之宿主細胞株，且包括CHO細胞株、各種Cos細胞株、HeLa細胞，較佳為骨髓瘤細胞株，或轉型之B細胞或雜交瘤。在一些實施例中，哺乳動物宿主細胞為CHO細胞。

在一些實施例中，宿主細胞為脊椎動物宿主細胞。可用哺乳動物宿主細胞株之實例為由SV40轉型之猴腎臟CV1株(COS-7，ATCC CRL 1651)；人類胚胎腎株(經亞選殖用於在懸浮液培養物中生長之293或293細胞)；幼倉鼠腎臟細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR (CHO或CHO-DP-12株)；小鼠足細胞；猴腎臟細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎臟細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎臟細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝細胞瘤株(Hep G2)。調配物及製備調配物之方法

本文亦提供包含藉由本文所描述之方法純化之多肽(例如抗體)的調配物及製備調配物之方法。舉例而言，經純化之多肽可與醫藥學上可接受之載劑組合。

在一些實施例中，可藉由將具有所需程度之純度的多肽與視情況選用之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版, Osol, A.編(1980))混合以凍乾調配物或水溶液形式製備多肽調配物以便儲存。

如本文所用之「載劑」包括醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑，該等醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑對暴露於所採用劑量及濃度之該等物質之細胞或哺乳動物無毒。生理學上可接受之載劑常常為水性pH緩衝溶液。

可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所採用之劑量及濃度下對接受者無毒，且包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六烴季銨；苯紮氯銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子表面活性劑，諸如TWEEN™、PLURONICS™或聚乙二醇(PEG)。

在一些實施例中，多肽調配物中之多肽維持功能活性。

要用於活體內投與之調配物必須為無菌的。此容易藉由通過無菌過濾膜過濾來實現。

本文中之調配物亦可含有超過一種為所治療之特定適應症所必需的活性化合物，較佳為具有互補活性且不會不利地彼此影響之彼等活性化合物。舉例而言，除一多肽之外，可能需要在一種調配物中包括另一多肽(例如抗體)。另選地或另外，組合物可進一步包含化學治療劑、細胞毒性劑、細胞介素、生長抑制劑、抗激素劑及/或心臟保護劑。此類分子適當地以對預期目標有效之量組合存在。製品

藉由本文所描述之方法純化之多肽及/或包含藉由本文所描述之方法純化之多肽的調配物可含於製品內。製品可包含含有多肽及/或多肽調配物之容器。較佳地，製品包含：(a)包含在容器內之包含本文所描述之多肽及/或多肽調配物之組合物的容器；及(b)具有關於向個體投與調配物之說明書的包裝插頁。

製品包含容器及容器上或與容器締合之標籤或包裝插頁。適合之容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。容器容納或含有調配物且可具有無菌存取埠(例如容器可為靜脈內溶液袋或具有皮下注射針頭可刺穿之塞子的小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為多肽。標籤或包裝插頁以關於給藥量及提供多肽及任何其他藥物之間隔的特定指導指示組合物在個體中之使用。製品可進一步包括由商業及用戶觀點來看所需之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭及注射器。在一些實施例中，容器為注射器。在一些實施例中，注射器進一步含於注射裝置內。在一些實施例中，注射裝置為自動注射器。

「包裝插頁」用於指照例包括於治療劑產品之商業包裝中之說明書，其含有關於涉及此類治療劑產品之使用的適應症、用法、劑量、投與、禁忌、要與包裝之產品組合之其他治療劑產品及/或警告的資訊。示例性實施例

本發明提供以下示例性實施例。

實施例1. 一種用於清潔離子交換層析材料供再使用之方法，其中該層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟： a) 使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該再生緩衝液包含乙酸鈉(NaOAc)； b) 使消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及 c) 將該離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中該儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。

實施例2. 如實施例1之方法，其中該再生緩衝液包含約50至約600 mM NaOAc。

實施例3. 如實施例1或2之方法，其中該再生緩衝液包含約350 mM NaOAc。

實施例4. 如實施例1-3中任一項之方法，其中該再生緩衝液之pH值為約pH 4.0至11。

實施例5. 如實施例1-4中任一項之方法，其中該再生緩衝液之pH值為約pH 8.3。

實施例6. 如實施例1-5中任一項之方法，其中使約3至約12倍材料體積之再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。

實施例7. 如實施例1-6中任一項之方法，其中使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。

實施例8. 如實施例1-7中任一項之方法，其中使約2至約12倍材料體積之消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料。

實施例9. 如實施例1-8中任一項之方法，其中使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。

實施例10. 如實施例1-9中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料儲存於約1至5倍材料體積之儲存緩衝液中。

實施例11. 如實施例1-10中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中。

實施例12. 一種用於清潔離子交換層析材料供再使用之方法，其中該層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟： a) 使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該再生緩衝液包含乙酸鈉； b) 使酸洗液穿過該離子交換層析材料， c) 使消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH及約1 M NaCl；及 d) 將該離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中該儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。

實施例13. 如實施例12之方法，其中該再生緩衝液及第二再生緩衝液包含約25至約600 mM NaOAc。

實施例14. 如實施例12或13之方法，其中該再生緩衝液包含約350 mM NaOAc。

實施例15. 如實施例12或13之方法，其中該再生緩衝液包含約40 mM NaOAc。

實施例16. 如實施例12-15中任一項之方法，其中該再生緩衝液之pH值為約pH 2.0至7.0。

實施例17. 如實施例12-16中任一項之方法，其中該再生緩衝液之pH值為約pH 4.0。

實施例18. 如實施例12-17中任一項之方法，其中使約3至約12倍材料體積之再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。

實施例19. 如實施例12-18中任一項之方法，其中使約7倍材料體積之再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。

實施例20. 如實施例12-19中任一項之方法，其中該酸洗液為約167M NaOAc及約0.3M磷酸。

實施例21. 如實施例12-20中任一項之方法，其中使約1至約5倍材料體積之該酸洗液穿過該離子交換層析材料。

實施例22. 如實施例12-21中任一項之方法，其中使約3倍材料體積之該酸洗液穿過該離子交換層析材料。

實施例23. 如實施例12-22中任一項之方法，其中使約2至約12倍材料體積之消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料。

實施例24. 如實施例12-23中任一項之方法，其中使約4倍材料體積之消毒緩衝液穿過使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。

實施例25. 如實施例12-24中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料儲存於約1至5倍材料體積之儲存緩衝液中。

實施例26. 如實施例12-25中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料儲存於約3倍材料體積之儲存緩衝液中。

實施例27. 一種用於清潔離子交換層析材料供再使用之方法，其中該層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟： a) 使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該再生緩衝液包含Tris及乙酸鈉； b) 使消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及 c) 將該離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中該儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。

實施例28. 如實施例27之方法，其中該再生緩衝液包含約25至約75 mM Tris及約50至約100 mM NaOAc。

實施例29. 如實施例27或28之方法，其中該再生緩衝液包含約50 mM Tris及約85 mM NaOAc。

實施例30. 如實施例27-29中任一項之方法，其中該再生緩衝液之pH值為約pH 7至9。

實施例31. 如實施例27-30中任一項之方法，其中該再生緩衝液之pH值為約pH 8.0。

實施例32. 如實施例27-中任一項之方法，其中使約3至約12倍材料體積之再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。

實施例33. 如實施例27-32中任一項之方法，其中使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。

實施例34. 如實施例27-33中任一項之方法，其中使約2至約12倍材料體積之消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料。

實施例35. 如實施例27-34中任一項之方法，其中使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。

實施例36. 如實施例27-35中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料儲存於約1至5倍材料體積之儲存緩衝液中。

實施例37. 如實施例27-36中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中。

實施例38. 一種使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化該多肽之方法，其中該離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟： a) 用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料； b) 將該組合物加載於該離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L； c) 收集包含該多肽之級分； d) 用平衡緩衝液洗滌該離子交換層析材料； e) 使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該再生緩衝液包含乙酸鈉； f) 使消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及 g) 將該離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中該儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。

實施例39. 一種使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化該多肽之方法，其中該離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟： a) 用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料； b) 將該組合物加載於該離子交換層析材料上，其中加載密度≥20 g/L； c) 收集包含該多肽之級分； d) 用平衡緩衝液洗滌該離子交換層析材料； e) 使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該再生緩衝液包含乙酸鈉； f) 使消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及 g) 將該離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中該儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。

實施例40. 如實施例39之方法，其中該加載密度≥70 g/L。

實施例41. 一種使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化該多肽之方法，其中該離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟： a) 用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料； b) 將該組合物加載於該離子交換層析材料上，其中加載密度超過該離子交換層析對該多肽之動態結合容量； c) 收集包含該多肽之級分； d) 用平衡緩衝液洗滌該離子交換層析材料； e) 使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該再生緩衝液包含乙酸鈉； f) 使消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及 g) 將該離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中該儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。

實施例42. 如實施例41之方法，其中該加載密度為該離子交換層析材料對該多肽之動態結合容量之至少約2倍。

實施例43. 如實施例42之方法，其中該加載密度為該離子交換層析材料對該多肽之動態結合容量之約2倍至約100倍。

實施例44. 如實施例42之方法，其中該加載密度為該離子交換層析材料對該多肽之動態結合容量之約10倍。

實施例45. 如實施例38-44中任一項之方法，其中該平衡緩衝液包含約20 mM至約60 mM乙酸鈉。

實施例46. 如實施例38-45中任一項之方法，其中該平衡緩衝液包含約40 mM乙酸鈉。

實施例47. 如實施例38-46中任一項之方法，其中該平衡緩衝液之pH值為約pH 5.0至約pH 6.0。

實施例48. 如實施例38-47中任一項之方法，其中該平衡緩衝液之pH值為約pH 5.5。

實施例49. 如實施例38-48中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料用約3-7倍材料體積之平衡緩衝液洗滌。

實施例50. 如實施例38-49中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料用約5倍材料體積之平衡緩衝液洗滌。

實施例51. 如實施例38-50中任一項之方法，其中該再生緩衝液包含約50至約600 mM NaOAc。

實施例52. 如實施例38-51中任一項之方法，其中該再生緩衝液包含約350 mM NaOAc。

實施例53. 如實施例38-52中任一項之方法，其中該再生緩衝液之pH值為約pH 4.0至11。

實施例54. 如實施例38-53中任一項之方法，其中該再生緩衝液之pH值為約pH 8.3。

實施例55. 如實施例38-54中任一項之方法，其中使約3至約12倍材料體積之再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。

實施例56. 如實施例38-55中任一項之方法，其中使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。

實施例57. 如實施例38-56中任一項之方法，其中使約2至約12倍材料體積之消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料。

實施例58. 如實施例38-57中任一項之方法，其中使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。

實施例59. 如實施例38-58中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料儲存於約1至5倍材料體積之儲存緩衝液中。

實施例60. 如實施例38-59中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中。

實施例61. 一種使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化該多肽之方法，其中該離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟： a) 用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料； b) 將該組合物加載於該離子交換層析材料上，其中加載密度超過該離子交換層析對該多肽之動態結合容量； c) 收集包含該多肽之級分； d) 用平衡緩衝液洗滌該離子交換層析材料； e) 使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該再生緩衝液包含乙酸鈉； f) 使酸洗液穿過該離子交換層析材料， g) 使消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH及約1 M NaCl；及 h) 將該離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中該儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。

實施例62. 如實施例61之方法，其中該加載密度≤約1000 g/L。

實施例63. 如實施例61或62之方法，其中該加載密度≥約20 g/L。

實施例64. 如實施例61-63中任一項之方法，其中該加載密度≥約70 g/L。

實施例65. 如實施例67之方法，其中該加載密度為該離子交換層析材料對該多肽之動態結合容量之至少約2倍。

實施例66. 如實施例61之方法，其中該加載密度為該離子交換層析材料對該多肽之動態結合容量之約2倍至約100倍。

實施例67. 如實施例61之方法，其中該加載密度為該離子交換層析材料對該多肽之動態結合容量之約10倍。

實施例68. 如實施例61-67中任一項之方法，其中該平衡緩衝液包含約50 mM至約100 mM NaOAc及約25 mM至約75 mM Tris。

實施例69. 如實施例61-68中任一項之方法，其中該平衡緩衝液包含約85 mM乙酸鈉及約50 mM Tris。

實施例70. 如實施例61-69中任一項之方法，其中該平衡緩衝液之pH值為約pH 6.0至約pH 10.0。

實施例71. 如實施例61-70中任一項之方法，其中該平衡緩衝液之pH值為約pH 8.0。

實施例72. 如實施例61-71中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料用約5至約15倍材料體積之平衡緩衝液洗滌。

實施例73. 如實施例61-72中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料用約10倍材料體積之平衡緩衝液洗滌。

實施例74. 如實施例61-73中任一項之方法，其中該再生緩衝液包含約25至約600 mM NaOAc。

實施例75. 如實施例61-74中任一項之方法，其中該再生緩衝液包含約350 mM NaOAc。

實施例76. 如實施例61-74中任一項之方法，其中該再生緩衝液包含約40 mM NaOAc。

實施例77. 如實施例61-76中任一項之方法，其中該平衡緩衝液之pH值為約pH 2.0至7.0。

實施例78. 如實施例61-77中任一項之方法，其中該平衡緩衝液之pH值為約pH 4.0。

實施例79. 如實施例61-78中任一項之方法，其中使約3至約12倍材料體積之該再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。

實施例80. 如實施例61-79中任一項之方法，其中使約7倍材料體積之該再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。

實施例81. 如實施例61-80中任一項之方法，其中該酸洗液為約167M NaOAc及約0.3M磷酸。

實施例82. 如實施例61-81中任一項之方法，其中使約1至約5倍材料體積之該酸洗液穿過該離子交換層析材料。

實施例83. 如實施例61-82中任一項之方法，其中使約3倍材料體積之該酸洗液穿過該離子交換層析材料。

實施例84. 如實施例61-83中任一項之方法，其中使約2至約12倍材料體積之消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料。

實施例85. 如實施例61-84中任一項之方法，其中使約4倍材料體積之消毒緩衝液穿過使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。

實施例86. 如實施例61-85中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料儲存於約1至5倍材料體積之儲存緩衝液中。

實施例87. 如實施例61-86中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料儲存於約3倍材料體積之儲存緩衝液中。

實施例88. 一種使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化該多肽之方法，其中該離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟： a) 用平衡緩衝液平衡該離子交換層析材料； b) 將該組合物加載於該離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L； c) 收集包含該多肽之級分； d) 用平衡緩衝液洗滌該離子交換層析材料； e) 使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該再生緩衝液包含Tris及乙酸鈉； f) 使消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及 g) 將該離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中該儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。

實施例89. 一種使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化該多肽之方法，其中該離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟： a) 用平衡緩衝液平衡該離子交換層析材料； b) 將該組合物加載於該離子交換層析材料上，其中加載密度≥20 g/L； c) 收集包含該多肽之級分； d) 用平衡緩衝液洗滌該離子交換層析材料； e) 使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該再生緩衝液包含Tris及乙酸鈉； f) 使消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及 g) 將該離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中該儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。

實施例90. 如實施例89之方法，其中該加載密度≥70 g/L。

實施例91. 一種使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化該多肽之方法，其中該離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟： a) 用平衡緩衝液平衡該離子交換層析材料； b) 將該組合物加載於該離子交換層析材料上，其中加載密度超過該離子交換層析對該多肽之動態結合容量； c) 收集包含該多肽之級分； d) 用平衡緩衝液洗滌該離子交換層析材料； e) 使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該再生緩衝液包含Tris及乙酸鈉； f) 使消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及 g) 將該離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中該儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。

實施例92. 如實施例91之方法，其中該加載密度為該離子交換層析材料對該多肽之動態結合容量之至少約2倍。

實施例93. 如實施例91之方法，其中該加載密度為該離子交換層析材料對該多肽之動態結合容量之約2倍至約100倍。

實施例94. 如實施例91之方法，其中該加載密度為該離子交換層析材料對該多肽之動態結合容量之約10倍。

實施例95. 如實施例94之方法，其中該平衡緩衝液包含約20 mM至約60 mM乙酸鈉。

實施例96. 如實施例88-95中任一項之方法，其中該平衡緩衝液包含約40 mM乙酸鈉。

實施例97. 如實施例88-96中任一項之方法，其中該平衡緩衝液之pH值為約pH 5.0至約pH 6.0。

實施例98. 如實施例88-97中任一項之方法，其中該平衡緩衝液之pH值為約pH 5.5。

實施例99. 如實施例88-98中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料用約3-7倍材料體積之平衡緩衝液洗滌。

實施例100. 如請求項88-99中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料用約5倍材料體積之平衡緩衝液洗滌。

實施例101. 如實施例88-100中任一項之方法，其中該再生緩衝液包含約25至約75 mM Tris及約50至約100 mM NaOAc。

實施例102. 如實施例88-101中任一項之方法，其中該再生緩衝液包含約50 mM Tris及約85 mM NaOAc。

實施例103. 如實施例88-102中任一項之方法，其中該平衡緩衝液之pH值為約pH 7至9。

實施例104. 如實施例88-103中任一項之方法，其中該平衡緩衝液之pH值為約pH 8.0。

實施例105. 如實施例88-104中任一項之方法，其中使約3至約12倍材料體積之再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。

實施例106. 如實施例88-105中任一項之方法，其中使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。

實施例107. 如實施例88-106中任一項之方法，其中使約2至約12倍材料體積之消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料。

實施例108. 如實施例88-107中任一項之方法，其中使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。

實施例109. 如實施例88-108中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料儲存於約1至5倍材料體積之儲存緩衝液中。

實施例110. 如實施例88-109中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中。

實施例111. 如實施例1-110中任一項之方法，其中該離子交換層析材料位於層析管柱中。

實施例112. 如實施例1-111中任一項之方法，其中該離子交換層析材料為陽離子交換層析材料。

實施例113. 如實施例1-112中任一項之方法，其中該離子交換層析材料包含鍵聯至載體基質之磺丙基部分。

實施例114. 如實施例113之方法，其中該載體基質包含交聯聚(苯乙烯二乙烯基苯)。

實施例115. 如實施例1-114中任一項之方法，其中該離子交換層析材料為POROS™ HS50材料。

實施例116. 如實施例1-115中任一項之方法，其中該離子交換層析材料為混合模式陽離子交換材料。

實施例117. 如實施例116之方法，其中該混合模式陽離子交換材料為Capto MMC™、Capto MMC™ ImpRes、Nuvia™ cPrime™或Toyopearl MX Trp-650M。

實施例118. 如實施例1-111中任一項之方法，其中該離子交換層析材料為陰離子交換層析材料。

實施例119. 如實施例1-111或118中任一項之方法，其中該離子交換層析材料包含鍵聯至載體基質之一級胺、二級胺、三級胺或四級銨離子官能基、聚胺官能基或二乙胺基乙基官能基。

實施例120. 如實施例1-111、118或119中任一項之方法，其中該離子交換層析材料為混合模式陰離子交換材料。

實施例121. 如實施例120之方法，其中該混合模式陰離子交換材料為Capto Adhere™或Capto Adhere™ ImpRes。

實施例122. 如實施例1-121中任一項之方法，其中該離子交換層析材料用於大規模製備該多肽。

實施例123. 如實施例1-122中任一項之方法，其中該多肽為抗體、免疫黏附素、含Fc蛋白質或免疫結合物。

實施例124. 如實施例123之方法，其中該多肽為抗體。

實施例125. 如實施例124之方法，其中該抗體為單株抗體。

實施例126. 如實施例125之方法，其中該單株抗體為嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。

實施例127. 如實施例125或126之方法，其中該單株抗體為IgG單株抗體。

實施例128. 如實施例124-127中任一項之方法，其中該抗體為抗原結合片段。

實施例129. 如實施例128之方法，其中該抗原結合片段為Fab片段、Fab'片段、F(ab’)2片段、scFv、二scFv、雙scFv、串聯(二、三)-scFv、Fv、sdAb、三功能抗體、BiTE、雙抗體或三抗體。

實施例130. 如實施例124-129中任一項之方法，其中該抗體為雙特異性抗體。

實施例131. 如實施例124-127中任一項之方法，其中該抗體選自由以下組成之群：抗CD20抗體、抗CD40抗體、抗HER2抗體、抗IL6抗體、抗IgE抗體、抗IL13抗體、抗Flu A抗體、抗TIGIT抗體、抗PD-L1抗體、抗VEGF-A抗體、抗VEGF-A/ANG2抗體、抗CD79b抗體、抗ST2抗體、抗因子D抗體、抗因子IX抗體、抗因子X抗體、抗aβ抗體、抗τ蛋白抗體、抗CEA抗體、抗CEA/CD3抗體、抗CD20/CD3抗體、抗FcRH5/CD3抗體、抗Her2/CD3抗體、抗FGFR1/KLB抗體、FAP-4-1 BBL融合蛋白及FAP-IL2v融合蛋白。

實施例132. 如實施例124-127中任一項之方法，其中該抗體選自由以下組成之群：奧瑞珠單抗、帕妥珠單抗、曲妥珠單抗、托珠單抗、法瑞西單抗、普拉土珠單抗、甘特珠單抗、西比沙他單抗、克雷內珠單抗、莫蘇尼妥珠單抗、替拉格魯單抗、貝伐單抗、利妥昔單抗、阿特珠單抗、奧妥珠單抗、蘭帕珠單抗、來金珠單抗、奧馬珠單抗雷珠單抗、艾美賽珠單抗、賽利克瑞盧單抗、普拉辛珠單抗、RO6874281及RO7122290。

實施例133. 如實施例124-132中任一項之方法，其中在穿過該離子交換層析材料之前將該多肽使用親和層析材料純化，其中該離子交換層析材料為陽離子交換層析材料。

實施例134. 如實施例133之方法，其中該親和材料選自由以下組成之群：蛋白質A層析、蛋白質G層析、蛋白質A/G層析、蛋白質L層析、FcXL層析、蛋白質XL層析、κ層析及κXL層析。

實施例135. 如實施例134之方法，其中該蛋白質A親和材料為MAbSelect材料、MAbSelect SuRe™材料或MAbSelect SuRe™ LX材料。

實施例136. 如實施例1-135中任一項之方法，其中使該等緩衝液以約15-20倍材料體積/小時穿過該離子交換層析材料。

實施例137. 如實施例1-136中任一項之方法，其中使該再生緩衝液以約10倍材料體積/小時穿過該離子交換層析材料。

實施例138. 如實施例1-137中任一項之方法，其中該多肽在宿主細胞中產生。

實施例139. 如實施例138之方法，其中該宿主細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。

實施例140. 如實施例1-139中任一項之方法，其中該雜質包含IgG片段、宿主細胞蛋白質或宿主細胞核酸中之一或多者。

實施例141. 如實施例140之方法，其中該多肽在CHO細胞中產生且該雜質包含CHO宿主細胞蛋白質(CHOP)及/或CHO核酸。

本說明書中揭示之所有特徵可以任何組合進行組合。本說明書中揭示之各特徵可由服務於相同、等效或類似目的之替代特徵代替。因此，除非另外明確陳述，否則所揭示之各特徵僅為一系列通用之等效或類似特徵之實例。

本發明之其他細節藉由以下非限制性實例來說明。本說明書中所有參考文獻之揭示內容明確地以引用之方式併入本文中。實例

以下實例意欲單純地例示本發明且因此不應視為以任何方式限制本發明。以下實例及詳細闡述係作為說明而非限制來提供。實例 1. 陽離子交換過載再生洗滌步驟之開展

開展再生步驟以減少過載陽離子交換層析材料在消毒期間之結垢且使層析運行之間的雜質遺留減至最少。材料及方法 進料

使用CHO細胞株使用自400 L中試工廠運行得到之經調節之抗體MabSelect SuRe™ (MSS)彙集物進行本研究。經由連續(密封)離心，隨後深度過濾及最終之滅菌級(0.2 μm)過濾收穫400 L細胞培養製備物。緩衝液

將表2中所列之緩衝液用於本發明之POROS™ 50HS (OL)層析製程中。表 2. POROS™ 50HS (OL) 層析緩衝液

緩衝液	pH	電導率 (mS/cm)
平衡 / 洗滌 40mM乙酸鈉	5.5 ± 0.10	2.7 ± 0.3
CEX OL 再生洗滌 50mM Tris，85mM乙酸鈉	8.00 ± 0.10	8.6 ± 0.7
CEX OL 再生洗滌 350mM乙酸鈉	8.00 ± 0.10	20 ± 2
消毒 0.5 M NaOH	不適用	55 ± 5 ，用水1:1稀釋之後
儲存 0.1 N NaOH	不適用	22 ± 5

設備

使用GE Healthcare ÄKTA™ Avant 150及Omnifit® 0.66 cm直徑管柱進行所有實驗室規模層析開展工作。純化方法

以下列入表內之方法為用於POROS™ 50HS (過載模式)及Capto™ Adhere步驟之方法。已在任何可能之處提供非規模依賴性參數。陽離子交換過載 (OL) 層析 (POROS™ 50 HS)

以過載模式操作POROS™ 50HS層析，其中進料在pH 5.5下加載，隨後用相同平衡緩衝液進行加載後洗滌。由於過載模式需要高加載密度來補償產率損失，故需要較高pH值及電導率再生步驟用乙酸鈉來洗掉任何所結合之蛋白質雜質，然後消毒且在存在氫氧化鈉之情況下儲存。當利用過載模式時，在超過mAb之動態結合容量的最佳結合容量下加載POROS™ 50HS樹脂。此產生蛋白質相關雜質(例如vHMWS及HMWS)及製程相關雜質(例如CHOP)從而競爭結合於樹脂，同時使得mAb穿透；因此，接著以過載彙集物形式收集穿透物。增加之加載密度使得回收產率增加。

POROS™50HS層析目標參數、階段資訊及運行條件描述於表3中。圖 2 顯示代表性Poros過載層析圖。表 3. POROS™ 50HS 層析製程、階段資訊及運行條件

樹脂	POROS™ 50HS
模式	過載
加載密度	≤1000 g/L
加載	經調節之MabSelect SuRe™彙集物，pH 5.5
流速	15-20 CV/h (再生階段10 CV/h)
柱床高度	20 cm
彙集準則	0.5 – 0.5 OD

步驟	緩衝液	CV 數
平衡	40 mM乙酸鈉，pH 5.5	5
加載	經調節之MabSelect SuRe™彙集物，pH 5.5	--
洗滌	40 mM乙酸鈉，pH 5.5	5
再生緩衝液	評估： 1.) 50 mM Tris，85 mM乙酸鈉，pH 8.0 2.) 350mM乙酸鈉，pH 8.3	10
消毒	0.5 N NaOH	10
儲存	0.1 N NaOH	4

分析方法 產物蛋白質濃度

藉由使用具有石英比色皿之Agilent 8453分光光度計在280 nm及320 nm下測定MAb濃度。將樣品用純化水(PW)稀釋以達到280 nm下0.1至1.0 AU之間的吸光度。使用以下等式來計算蛋白質濃度：蛋白質濃度 = (A280-A320)/(消光係數*路徑長度)×稀釋係數總蛋白 (mg) =蛋白質濃度

彙集物體積(ml)用於大小變異體之粒徑排阻層析 (SEC)

使用TSK G3000SWXL (7.8 x 300 mm)分析型HPLC管柱(Tosoh Bioscience)藉由粒徑排阻層析(SEC-HPLC)來測定極高分子量物質(vHMWS)、高分子量物質(HMWS)、總聚集物(vHMWS+HMWS)、單體及片段之相對比率。運行條件列於下表4中。管柱在表中所列之運行緩衝液中在0.5 mL/min下運行30分鐘，且在280 nm下監測。自動樣品室設定為5℃，範圍為2-8℃；然而，管柱室設定為環境溫度。樣品以純形式注射，目標質量加載量為25-50 μg。用於此分析之HPLC系統為Agilent 1100/1200。表 4. SEC 運行條件

管柱	TSK G3000SWXL (7.8 x 300 mm)
供應商	Tosoh Bioscience (部件號08541, VWR目錄號100368-358)
流速	0.5 mL/min
溫度	周圍
運行時間	30分鐘
運行模式	等度
移動相	0.20 M磷酸鉀、0.25 M氯化鉀，pH 6.2±0.1
UV偵測	280 nm
目標註射	25-50 µg

分析型操作分析

在製程開展及運行分析期間進行以下分析： CHO DNA，藉由Taqman PCR 遺留，藉由毛細管區帶電泳/雷射誘發螢光(CZE-LIF) 內毒素，藉由動力學分析來偵測革蘭氏陰性細菌內毒素。再生洗滌步驟開展 mAb1 POROS™ 50HS (OL) 管柱再生步驟及遺留研究

CEX過載層析操作包括再生步驟以有效地自POROS™ 50 HS樹脂移除任何所結合之雜質，特別是聚集物。評估兩種再生緩衝液以有效移除雜質：350 mM乙酸鈉，pH 8.3；及50 mM Tris、85 mM乙酸鈉，pH 8.0。

在再生緩衝液評估期間，兩次CEX過載運行加載高至1000 g/L_樹脂且併有兩個再生階段(各緩衝液持續5 CV)；然而，每次運行，再生緩衝液之序列均有改變。以下為使用所測試之再生緩衝液序列之兩種評估運行：評估運行A：再生階段1：50 mM Tris，85 mM NaOAc，pH 8.0 再生階段2：350 mM NaOAc，pH 8.3 評估運行B：再生階段1：350 mM NaOAc，pH 8.3 再生階段2：50 mM Tris，85 mM NaOAc，pH 8.0

分析典型輸出(KPI、雜質清除率及產物品質)；且兩次運行獲得類似效能。然而，除彼等輸出外，收集第一再生階段期間之管柱流出物且在SEC上分析以評估聚集物自管柱之移除，其藉由圖 3 (第一再生階段管柱流出物之SEC層析圖之疊加圖)概述。圖 3 表明使用350 mM NaOAc pH 8.3緩衝液之階段具有更高水準之vHMWS，表明其已自管柱移除更多聚集物，且因此為更佳之再生洗滌緩衝液。使用任一再生緩衝液均未觀測到管柱結垢。

當分析評估運行層析圖(圖 4 ，評估運行A之層析圖，及圖 5 ，評估運行B之層析圖)時，在使用350 mM NaOAc pH 8.3再生緩衝液之後在再生階段2中未觀測到OD峰，表明在使用該350 mM NaOAc pH 8.3再生緩衝液之後管柱中不存在殘餘蛋白質。使用任一再生緩衝液在製程期間均未觀測到壓力尖峰。藉由分析型觀測分析未觀測到殘餘蛋白質遺留(表5)。表 5. 蛋白質遺留結果

遺留資料	總蛋白 (µg/ml)	CHO DNA (pg/ml)	內毒素 (EU/ml)
實驗室規模管柱(11次運行之後)	＜0.25	＜ 1	未測試
中試工廠管柱(2次運行之後)	＜0.25	＜ 1	＜0.1

mAb2 POROS™ 50HS (OL) 管柱再生步驟及遺留研究

最佳化CEX管柱再生步驟以自Poros™ 50HS樹脂有效移除雜質且防止運行間遺留及消毒階段期間之樹脂結垢。測試兩種再生緩衝液：50 mM Tris、85 mM乙酸鈉，pH 8.0及350 mM乙酸鈉，pH 8.3。在再生緩衝液評估期間，兩次CEX過載運行加載高至800 g/L_樹脂且併有兩個再生階段(各緩衝液持續5 CV)；然而，每次運行，再生緩衝液之序列均有改變。以下為使用所測試之再生緩衝液序列之兩種評估運行：評估運行A：再生階段1：50 mM Tris，85 mM NaOAc，pH 8.0 再生階段2：350 mM NaOAc，pH 8.3 評估運行B：再生階段1：350 mM NaOAc，pH 8.3 再生階段2：50 mM Tris，85 mM NaOAc，pH 8.0

當分析評估運行層析圖(圖 6 ，評估運行A之層析圖，及圖 7 ，評估運行B之層析圖)時，在使用350 mM NaOAc pH 8.3再生緩衝液之後在再生階段2中未觀測到OD峰，表明在使用該350 mM NaOAc pH 8.3再生緩衝液之後管柱中不存在殘餘蛋白質。使用任一再生緩衝液在製程期間均未觀測到壓力尖峰。

為驗證清潔程序，使用各再生緩衝液進行一次產物接觸運行。在產物接觸運行之後使用表6中詳述之程序進行模擬運行(在不存在加載階段之情況下進行之運行)。為進行模擬運行，使兩種再生緩衝液與先前蛋白質接觸運行交替以評估蛋白質遺留。以下為用於評估之運行序列之概述： 1.) 蛋白質接觸運行，使用50 mM Tris、85 mM NaOAc，pH 8.0再生階段 2.) 模擬運行，使用350 mM NaOAc，pH 8.3再生階段 3.) 蛋白質接觸運行，使用350 mM NaOAc，pH 8.3再生階段 4.) 模擬運行，使用50 mM Tris、85 mM NaOAc，pH 8.0再生階段表 6. Poros™ 50HS 模擬運行清潔程序

步驟	階段持續時間 (CV)	緩衝液
平衡	5	40mM NaOAc，pH 5.5
溶析(模擬彙集物)*	4	500mM NaOAc，pH 5.5
平衡	4	40mM NaOAc，pH 5.5
再生	5	350mM NaOAc，pH 8.3
消毒	4	0.5 N NaOH
儲存	3	0.1 N NaOH

*收集針對所測試之兩種再生緩衝液之模擬彙集物且提交以進行Y:99 (總蛋白)及Y:77 (CHO DNA)分析。

對兩種蛋白質接觸運行及模擬運行之再生階段進行收集且在SEC上運行(圖 8A 及 8B )。收集模擬彙集物且進行CHO DNA (Y:77)及總蛋白(Y:99)分析。

對於兩種再生緩衝液，表中7所列之結果顯示相當之效能；在管柱上進行產物接觸運行之後CHO DNA及總蛋白降至≤LOQ。用於蛋白質接觸及模擬運行之再生溶液之SEC分析表明在蛋白質接觸運行期間與50mM Tris、85 mM NaOAc，pH 8.0相比350 mM NaOAc，pH 8.3能夠更有效地溶析所結合之蛋白質。當使用50mM Tris、85mM NaOAc，pH 8.0時，如當在後續模擬運行中使用350 mM NaOAc，pH 8.3時藉由額外蛋白質溶析所指示，蛋白質接觸運行仍留下結合於管柱之蛋白質(圖 8A 及 8B )。表 7. Poros™ 50HS 模擬運行 〖遺留〗 清潔結果

緩衝液	CHO DNA ， Y:77 (pg/mL)	總蛋白， Y:99* (µg/mL)
50mM Tris，85mM NaOAc，pH 8.0	≤1	≤0.25
350mM NaOAc，pH 8.3	≤1	≤0.25

*在樣品收集30-min內將遺留(Y99)樣品用0.1% PS20處理且在分析之前儲存在≤-70℃下。結論

對於mAb2及mAb1，350 mM NaOAc pH 8.3及50 mM Tris、85mM NaOAc，pH 8.0再生有效減輕了Poros™ 50HS樹脂結垢。使用任一緩衝液在消毒階段期間均觀測到極小之壓力增加。相較於50 mM Tris NaOAc pH 8.0緩衝液，選擇350mM NaOAc再生緩衝液作為用於CEX過載層析之平台再生緩衝液。實例 2 多模式陰離子交換過載再生洗滌步驟之開展

開展再生步驟以減少過載多模式陰離子交換層析材料在消毒期間之結垢且使層析運行之間的雜質遺留減至最少。材料及方法 進料

使用CHO細胞株使用自400 L中試工廠運行得到之經調節之抗體MabSelect SuRe™ (MSS)彙集物進行本研究。經由連續(密封)離心，隨後深度過濾及最終之滅菌級(0.2 μm)過濾收穫400 L細胞培養製備物。過載 (OL) 層析 (Capto™Adhere)

在「過載」操作期間，在產物與雜質均展現強結合(log K_p ＞ 2.0)之條件下直至開始發生蛋白質穿透之點加載管柱。當與產物蛋白質相比雜質結合更強(亦即雜質log K_p ＞mAb log K_p )時可實現最佳效能，使得產物蛋白質將經歷由雜質代替。此產生在穿透後產物富集且雜質空乏之溶析物。

對於Capto™Adhere過載層析研究，在pH 8.0、高log K_p (結合條件)下加載進料，如圖 9 中所示。加載階段之後為用平衡緩衝液進行加載後洗滌。製程條件描述於表8及9中。所測試之再生緩衝液列於表10中。

所有實驗室規模層析開展工作均使用GE Healthcare ÄKTA Avant 150及Omnifit 0.66 cm直徑管柱進行。表 8. Capto™ Adhere 層析製程 、階段資訊及運行條件

樹脂	Capto™ Adhere
模式	過載
加載密度	300 g/L
加載	經調節之MabSelect SuRe彙集物，pH 8.0
流速	150 cm/h
柱床高度	20 cm
彙集準則	0.5 – 0.5 OD

表 9

步驟 / 階段	緩衝液	管柱體積 (CV)
平衡	50 mM Tris，85 mM乙酸鈉，pH 8.0	5
加載	經調節之MabSelect SuRe彙集物，pH 8.0	按要求
洗滌	50 mM Tris，85 mM乙酸鈉，pH 8.0	10
再生洗滌1	評估緩衝液： 1.) 350mM乙酸鈉，pH 8.3 2.) 40mM NaOAc pH 4.0 3.) 40mM NaOAc pH 5.0 4.) 350mM NaOAc pH 4.0 5.) 350mM NaOAc pH 5.0	7
再生洗滌2	細節參見上文及表3.1-1之緩衝液列表。	5
酸洗滌	0.167M乙酸，0.3M磷酸	3
消毒	0.5 N NaOH，1M NaCl	4
儲存	0.1 N NaOH	3

表 10. Capto™ Adhere 再生洗滌緩衝液

再生洗滌緩衝液	pH	電導率 (mS/cm)
350mM乙酸鈉	8.3 ± 0.1	20.0 ± 3
40mM乙酸鈉	4.0 ± 0.1	1.0 ± 1.0
40mM乙酸鈉	5.0 ± 0.1	2.6 ± 1.0
350mM乙酸鈉	4.0 ± 0.1	6.6 ± 5
350mM乙酸鈉	5.0 ± 0.1	18.0 ± 5

分析方法 產物蛋白質濃度

藉由使用SoloVPE在278 nm下測定mAb濃度。使用以下等式來計算蛋白質濃度：蛋白質濃度 = (A280-A320)/(消光係數*路徑長度)×稀釋係數總蛋白 (mg) =蛋白質濃度

彙集物體積(ml)再生洗滌步驟開展 MAB3 Capto™ Adhere (OL) 管柱再生研究綜述

過載層析操作包括再生步驟以有效移除任何所結合之雜質。所評估之再生緩衝液描述於表10中。對於再生緩衝液評估，將管柱加載至300g/L樹脂且併入兩個再生階段。每次運行，再生緩衝液之序列均有改變。所測試之再生緩衝液之序列概括於表11中且在下文進行詳述。表 11 ：用於再生洗滌階段之緩衝液的序列 . 數字指示使用再生緩衝液之順序。

再生緩衝液	運行 A	運行 B	運行 C	運行 D	運行 E
350mM NaOAc，pH 8.3 mS/cm*	1
40mM NaOAc，pH 4.0	2	1		2
350mM NaOAc，pH 4.0		2		1
40mM NaOAc，pH 5.0			1		2
350mM NaOAc，pH 5.0			2		1

*使用5CV階段持續時間替代7CV 評估運行A：再生階段1：350 mM乙酸鈉，pH 8.3 再生階段2：40 mM乙酸鈉，pH 4.0 評估運行B：再生階段1：40 mM乙酸鈉，pH 4.0 再生階段2：350 mM乙酸鈉，pH 4.0 評估運行C：再生階段1：40 mM乙酸鈉，pH 5.0 再生階段2：350 mM乙酸鈉，pH 5.0 評估運行D：再生階段1：350 mM乙酸鈉，pH 4.0 再生階段2：40 mM乙酸鈉，pH 4.0 評估運行E：再生階段1：350 mM乙酸鈉，pH 5.0 再生階段2：40 mM乙酸鈉，pH 5.0結果

比較階段間之質量平衡(蛋白質回收%)及壓力概況以確定再生緩衝液之有效性。再生緩衝液階段中較高之回收%指示較有效之再生緩衝液。表12顯示每次運行之階段間質量平衡的概述。以下概述關鍵實驗比較。表 12 ：質量平衡概述 ( 蛋白質回收 %)

運行	質量平衡 ( 蛋白質回收 %)	總質量平衡蛋白質回收 %
彙集物	再生洗滌 1	再生洗滌 2	酸洗滌	消毒洗滌
A	75.9	6.7	21.3	0.2	0.2	104.3
B	72.3	28.1	0.2	0.1	0.2	100.9
C	72.3	27.2	0.4	0.7	0.2	100.8
D	72.6	27.7	0.0	0.1	0.1	100.5
E	72.1	26.6	0.6	0.6	0.1	100.0

評估運行 A ：

350 mM NaOAc pH 8.3緩衝液得到效果最差之再生洗滌。少量蛋白質溶析，而如階段中之較高回收%所示後續再生緩衝液(40mM NaOAc，pH 4.0)更有效。在第二再生階段之後極少蛋白質保留在管柱中。如圖 10A 中所示，未觀測到管柱結垢(無壓力尖峰)。評估運行 B 相較於運行 D ： 40 mM 相較於 350 mM NaOAc pH 4.0

40mM及350 mM NaOAc pH 4.0緩衝液具有等效有效性。兩種再生洗滌緩衝液用於第一再生洗滌階段具有類似蛋白質回收率。在第一再生階段之後極少蛋白質保留在管柱中。如圖 10B 及圖 10D 中所示，未觀測到管柱結垢(無壓力尖峰)。評估運行 C 相較於運行 E ： 40 mM NaOAc 相較於 350 mM NaOAc pH 5.0

與350 mM NaOAc pH 5.0相比，40mM NaOAc pH 5.0緩衝液在將蛋白質從管柱上溶析掉方面具有改良之有效性。當350mM NaOAc pH 5.0用於再生洗滌1 (運行E)時在再生洗滌2期間更多殘餘蛋白質溶析。在再生洗滌2中觀測到增加之UV信號(圖4.5)。如圖 10C 及圖 10E 中所示，未觀測到管柱結垢(無壓力尖峰)。評估運行 B 相較於運行 C ： pH 4.0 相較於 pH 5.0

pH 4.0與5.0在彙集階段之後充分溶析剩餘之所結合之蛋白質；然而，pH 4.0再生緩衝液對溶析所結合之蛋白質比pH 5.0更有效。如比較層析圖(圖 10B-10E )所示，使用pH 4.0條件在再生後階段2中存在較少之殘餘蛋白質溶析。結論

較低pH值作為Capto™ Adhere再生緩衝液更有效。與350 mM NaOAc pH 8.3相比，40mM及350mM pH 4.0及5.0為更有效之Capto Adhere再生洗滌緩衝液。在此評估中，40mM及350 mM NaOAc pH 4.0再生緩衝液為最有效之再生緩衝液。此與顯示對於mAB3，在較低pH值下蛋白質與樹脂之結合減少且在較高pH值下結合增加(亦即蛋白質溶析有效性降低)之結合等溫線資料相匹配(圖 9 )。在消毒階段期間觀測到極小之壓力增加。將來之再生緩衝液研究有可能擴大在消毒階段之前用於將蛋白質從管柱溶析掉之再生洗滌緩衝液的數目。

圖 1 為在不存在再生階段之情況下過載層析運行之層析圖。在消毒階段開始時在壓力尖峰期間觀測到樹脂之結垢。圖 2 顯示抗體mAb1之過載層析之POROS™ 50HS層析圖的實例。圖 3 顯示兩種評估運行之再生階段之粒徑排阻層析(SEC)的層析圖。用於評估運行1之再生緩衝液為50 mM Tris、85 mM NaOAc pH 8.0。用於評估運行2之再生緩衝液為350 mM NaOAc pH 8.3。圖 4 顯示用於抗體mAb1之評估運行A的層析圖。圖 5 顯示用於抗體mAb1之評估運行B的層析圖。圖 6 顯示用於抗體mAb2之評估運行A的層析圖。圖 7 顯示用於抗體mAb2之評估運行B的層析圖。圖 8A 及 8B 顯示POROS™ 50HS模擬運行清潔程序之SEC-HPLC層析圖。在圖 8A 中再生緩衝液之順序為1.) 50 mM Tris, 85 mM NaOAc pH 8.0，隨後2.) 350 mM NaOAc pH 8.3。在圖 8B 中再生緩衝液之順序為1.) 350 mM NaOAc pH 8.3，隨後2.) 50 mM Tris、85 mM NaOAc pH 8.0。圖 9 顯示Capto™ Adhere樹脂上之機器人雜質定位篩選。顯示mAb3、中國倉鼠卵巢細胞蛋白質(CHOP)及高分子量(HMW)多肽之結合。圖 10A-10E 分別顯示用於mAb3之評估運行A至E之層析圖。

Claims

一種用於清潔離子交換層析材料供再使用之方法，其中該層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟： a) 使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該再生緩衝液包含乙酸鈉(NaOAc)； b) 使消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及 c) 將該離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中該儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。
如請求項1之方法，其中該再生緩衝液包含約50至約600 mM NaOAc。
如請求項1或2之方法，其中該再生緩衝液包含約350 mM NaOAc。
如請求項1-3中任一項之方法，其中該再生緩衝液之pH值為約pH 4.0至11。
如請求項1-4中任一項之方法，其中該再生緩衝液之pH值為約pH 8.3。
如請求項1-5中任一項之方法，其中使約3至約12倍材料體積之再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。
如請求項1-6中任一項之方法，其中使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。
如請求項1-7中任一項之方法，其中使約2至約12倍材料體積之消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料。
如請求項1-8中任一項之方法，其中使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。
如請求項1-9中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料儲存於約1至5倍材料體積之儲存緩衝液中。
如請求項1-10中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中。
一種用於清潔離子交換層析材料供再使用之方法，其中該層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟： a) 使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該再生緩衝液包含乙酸鈉； b) 使酸洗液穿過該離子交換層析材料， c) 使消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH及約1 MNaCl；及 d) 將該離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中該儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。
如請求項12之方法，其中該再生緩衝液及第二再生緩衝液包含約25至約600 mM NaOAc。
如請求項12或13之方法，其中該再生緩衝液包含約350 mM NaOAc。
如請求項12或13之方法，其中該再生緩衝液包含約40 mM NaOAc。
如請求項12-15中任一項之方法，其中該再生緩衝液之pH值為約pH 2.0至7.0。
如請求項12-16中任一項之方法，其中該再生緩衝液之pH值為約pH 4.0。
如請求項12-17中任一項之方法，其中使約3至約12倍材料體積之再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。
如請求項12-18中任一項之方法，其中使約7倍材料體積之再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。
如請求項12-19中任一項之方法，其中該酸洗液為約167M NaOAc及約0.3M磷酸。
如請求項12-20中任一項之方法，其中使約1至約5倍材料體積之該酸洗液穿過該離子交換層析材料。
如請求項12-21中任一項之方法，其中使約3倍材料體積之該酸洗液穿過該離子交換層析材料。
如請求項12-22中任一項之方法，其中使約2至約12倍材料體積之消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料。
如請求項12-23中任一項之方法，其中使約4倍材料體積之消毒緩衝液穿過使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。
如請求項12-24中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料儲存於約1至5倍材料體積之儲存緩衝液中。
如請求項12-25中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料儲存於約3倍材料體積之儲存緩衝液中。
一種用於清潔離子交換層析材料供再使用之方法，其中該層析材料以過載模式用於多肽之純化中，該方法包括以下步驟： a) 使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該再生緩衝液包含Tris及乙酸鈉； b) 使消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及 c) 將該離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中該儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。
如請求項27之方法，其中該再生緩衝液包含約25至約75 mM Tris及約50至約100 mM NaOAc。
如請求項27或28之方法，其中該再生緩衝液包含約50 mM Tris及約85 mM NaOAc。
如請求項27-29中任一項之方法，其中該再生緩衝液之pH值為約pH 7至9。
如請求項27-30中任一項之方法，其中該再生緩衝液之pH值為約pH 8.0。
如請求項27-31中任一項之方法，其中使約3至約12倍材料體積之再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。
如請求項27-32中任一項之方法，其中使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。
如請求項27-33中任一項之方法，其中使約2至約12倍材料體積之消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料。
如請求項27-34中任一項之方法，其中使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。
如請求項27-35中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料儲存於約1至5倍材料體積之儲存緩衝液中。
如請求項27-36中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中。
一種使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化該多肽之方法，其中該離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟： a) 用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料； b) 將該組合物加載於該離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L； c) 收集包含該多肽之級分； d) 用平衡緩衝液洗滌該離子交換層析材料； e) 使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該再生緩衝液包含乙酸鈉； f) 使消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及 g) 將該離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中該儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。
一種使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化該多肽之方法，其中該離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟： a) 用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料； b) 將該組合物加載於該離子交換層析材料上，其中加載密度≥20g/L； c) 收集包含該多肽之級分； d) 用平衡緩衝液洗滌該離子交換層析材料； e) 使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該再生緩衝液包含乙酸鈉； f) 使消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及 g) 將該離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中該儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。
如請求項39之方法，其中該加載密度≥70g/L。
一種使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化該多肽之方法，其中該離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟： a) 用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料； b) 將該組合物加載於該離子交換層析材料上，其中加載密度超過該離子交換層析對該多肽之動態結合容量； c) 收集包含該多肽之級分； d) 用平衡緩衝液洗滌該離子交換層析材料； e) 使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該再生緩衝液包含乙酸鈉； f) 使消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及 g) 將該離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中該儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。
如請求項41之方法，其中該加載密度為該離子交換層析材料對該多肽之動態結合容量之至少約2倍。
如請求項42之方法，其中該加載密度為該離子交換層析材料對該多肽之動態結合容量之約2倍至約100倍。
如請求項42之方法，其中該加載密度為該離子交換層析材料對該多肽之動態結合容量之約10倍。
如請求項38-44中任一項之方法，其中該平衡緩衝液包含約20 mM至約60 mM乙酸鈉。
如請求項38-45中任一項之方法，其中該平衡緩衝液包含約40 mM乙酸鈉。
如請求項38-46中任一項之方法，其中該平衡緩衝液之pH值為約pH 5.0至約pH 6.0。
如請求項38-47中任一項之方法，其中該平衡緩衝液之pH值為約pH 5.5。
如請求項38-48中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料用約3-7倍材料體積之平衡緩衝液洗滌。
如請求項38-49中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料用約5倍材料體積之平衡緩衝液洗滌。
如請求項38-50中任一項之方法，其中該再生緩衝液包含約50至約600 mM NaOAc。
如請求項38-51中任一項之方法，其中該再生緩衝液包含約350 mM NaOAc。
如請求項38-52中任一項之方法，其中該再生緩衝液之pH值為約pH 4.0至11。
如請求項38-53中任一項之方法，其中該再生緩衝液之pH值為約pH 8.3。
如請求項38-54中任一項之方法，其中使約3至約12倍材料體積之再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。
如請求項38-55中任一項之方法，其中使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。
如請求項38-56中任一項之方法，其中使約2至約12倍材料體積之消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料。
如請求項38-57中任一項之方法，其中使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。
如請求項38-58中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料儲存於約1至5倍材料體積之儲存緩衝液中。
如請求項38-59中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中。
一種使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化該多肽之方法，其中該離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟： a) 用平衡緩衝液平衡離子交換層析材料； b) 將該組合物加載於該離子交換層析材料上，其中加載密度超過該離子交換層析對該多肽之動態結合容量； c) 收集包含該多肽之級分； d) 用平衡緩衝液洗滌該離子交換層析材料； e) 使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該再生緩衝液包含乙酸鈉； f) 使酸洗液穿過該離子交換層析材料， g) 使消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH及約1 M NaCl；及 h) 將該離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中該儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。
如請求項61之方法，其中該加載密度≤約1000 g/L。
如請求項61或62之方法，其中該加載密度≥約20 g/L。
如請求項61-63中任一項之方法，其中該加載密度≥約70 g/L。
如請求項61之方法，其中該加載密度為該離子交換層析材料對該多肽之動態結合容量之至少約2倍。
如請求項61之方法，其中該加載密度為該離子交換層析材料對該多肽之動態結合容量之約2倍至約100倍。
如請求項61之方法，其中該加載密度為該離子交換層析材料對該多肽之動態結合容量之約10倍。
如請求項61-67中任一項之方法，其中該平衡緩衝液包含約50 mM至約100 mM NaOAc及約25 mM至約75 mM Tris。
如請求項61-68中任一項之方法，其中該平衡緩衝液包含約85 mM乙酸鈉及約50 mM Tris。
如請求項61-69中任一項之方法，其中該平衡緩衝液之pH值為約pH 6.0至約pH 10.0。
如請求項61-70中任一項之方法，其中該平衡緩衝液之pH值為約pH 8.0。
如請求項61-71中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料用約5至約15倍材料體積之平衡緩衝液洗滌。
如請求項61-72中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料用約10倍材料體積之平衡緩衝液洗滌。
如請求項61-73中任一項之方法，其中該再生緩衝液包含約25至約600 mM NaOAc。
如請求項61-74中任一項之方法，其中該再生緩衝液包含約350 mM NaOAc。
如請求項61-74中任一項之方法，其中該再生緩衝液包含約40 mM NaOAc。
如請求項61-76中任一項之方法，其中該再生緩衝液之pH值為約pH 2.0至7.0。
如請求項61-77中任一項之方法，其中該再生緩衝液之pH值為約pH 4.0。
如請求項61-78中任一項之方法，其中使約3至約12倍材料體積之該再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。
如請求項61-79中任一項之方法，其中使約7倍材料體積之該再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。
如請求項61-80中任一項之方法，其中該酸洗液為約167M NaOAc及約0.3M磷酸。
如請求項61-81中任一項之方法，其中使約1至約5倍材料體積之該酸洗液穿過該離子交換層析材料。
如請求項61-82中任一項之方法，其中使約3倍材料體積之該酸洗液穿過該離子交換層析材料。
如請求項61-83中任一項之方法，其中使約2至約12倍材料體積之消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料。
如請求項61-84中任一項之方法，其中使約4倍材料體積之消毒緩衝液穿過使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。
如請求項61-85中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料儲存於約1至5倍材料體積之儲存緩衝液中。
如請求項61-86中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料儲存於約3倍材料體積之儲存緩衝液中。
一種使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化該多肽之方法，其中該離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟： a) 用平衡緩衝液平衡該離子交換層析材料； b) 將該組合物加載於該離子交換層析材料上，其中加載密度≤約1000 g/L； c) 收集包含該多肽之級分； d) 用平衡緩衝液洗滌該離子交換層析材料； e) 使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該再生緩衝液包含Tris及乙酸鈉； f) 使消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及 g) 將該離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中該儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。
一種使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化該多肽之方法，其中該離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟： a) 用平衡緩衝液平衡該離子交換層析材料； b) 將該組合物加載於該離子交換層析材料上，其中加載密度≥20g/L； c) 收集包含該多肽之級分； d) 用平衡緩衝液洗滌該離子交換層析材料； e) 使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該再生緩衝液包含Tris及乙酸鈉； f) 使消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及 g) 將該離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中該儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。
如請求項89之方法，其中該加載密度≥70g/L。
一種使用離子交換層析材料自包含多肽及雜質之組合物純化該多肽之方法，其中該離子交換層析材料適合再使用，該方法包括以下步驟： a) 用平衡緩衝液平衡該離子交換層析材料； b) 將該組合物加載於該離子交換層析材料上，其中加載密度超過該離子交換層析對該多肽之動態結合容量； c) 收集包含該多肽之級分； d) 用平衡緩衝液洗滌該離子交換層析材料； e) 使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該再生緩衝液包含Tris及乙酸鈉； f) 使消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料，其中該消毒緩衝液包含約0.5 N NaOH；及 g) 將該離子交換層析材料儲存於儲存緩衝液中，其中該儲存緩衝液包含約0.1 N NaOH。
如請求項91之方法，其中該加載密度為該離子交換層析材料對該多肽之動態結合容量之至少約2倍。
如請求項91之方法，其中該加載密度為該離子交換層析材料對該多肽之動態結合容量之約2倍至約100倍。
如請求項91之方法，其中該加載密度為該離子交換層析材料對該多肽之動態結合容量之約10倍。
如請求項94之方法，其中該平衡緩衝液包含約20 mM至約60 mM乙酸鈉。
如請求項88-95中任一項之方法，其中該平衡緩衝液包含約40 mM乙酸鈉。
如請求項88-96中任一項之方法，其中該平衡緩衝液之pH值為約pH 5.0至約pH 6.0。
如請求項88-97中任一項之方法，其中該平衡緩衝液之pH值為約pH 5.5。
如請求項88-98中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料用約3-7倍材料體積之平衡緩衝液洗滌。
如請求項88-99中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料用約5倍材料體積之平衡緩衝液洗滌。
如請求項88-100中任一項之方法，其中該再生緩衝液包含約25至約75 mM Tris及約50至約100 mM NaOAc。
如請求項88-101中任一項之方法，其中該再生緩衝液包含約50 mM Tris及約85 mM NaOAc。
如請求項88-102中任一項之方法，其中該再生緩衝液之pH值為約pH 7至9。
如請求項88-103中任一項之方法，其中該再生緩衝液之pH值為約pH 8.0。
如請求項88-104中任一項之方法，其中使約3至約12倍材料體積之再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。
如請求項88-105中任一項之方法，其中使約10倍材料體積之再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。
如請求項88-106中任一項之方法，其中使約2至約12倍材料體積之消毒緩衝液穿過該離子交換層析材料。
如請求項88-107中任一項之方法，其中使約10倍材料體積之消毒緩衝液穿過使再生緩衝液穿過該離子交換層析材料。
如請求項88-108中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料儲存於約1至5倍材料體積之儲存緩衝液中。
如請求項88-109中任一項之方法，其中將該離子交換層析材料儲存於約4倍材料體積之儲存緩衝液中。
如請求項1-110中任一項之方法，其中該離子交換層析材料位於層析管柱中。
如請求項1-111中任一項之方法，其中該離子交換層析材料為陽離子交換層析材料。
如請求項1-112中任一項之方法，其中該離子交換層析材料包含鍵聯至載體基質之磺丙基部分。
如請求項113之方法，其中該載體基質包含交聯聚(苯乙烯二乙烯基苯)。
如請求項1-114中任一項之方法，其中該離子交換層析材料為POROS™ HS50材料。
如請求項1-115中任一項之方法，其中該離子交換層析材料為混合模式陽離子交換材料。
如請求項116之方法，其中該混合模式陽離子交換材料為Capto MMC™、Capto MMC™ ImpRes、Nuvia™ cPrime™或Toyopearl MX Trp-650M。
如請求項1-111中任一項之方法，其中該離子交換層析材料為陰離子交換層析材料。
如請求項1-111或118中任一項之方法，其中該離子交換層析材料包含鍵聯至載體基質之一級胺、二級胺、三級胺或四級銨離子官能基、聚胺官能基或二乙胺基乙基官能基。
如請求項1-111、118或119中任一項之方法，其中該離子交換層析材料為混合模式陰離子交換材料。
如請求項120之方法，其中該混合模式陰離子交換材料為Capto Adhere™或Capto Adhere™ ImpRes。
如請求項1-121中任一項之方法，其中該離子交換層析材料用於大規模製備該多肽。
如請求項1-122中任一項之方法，其中該多肽為抗體、免疫黏附素、含Fc蛋白質或免疫結合物。
如請求項123之方法，其中該多肽為抗體。
如請求項124之方法，其中該抗體為單株抗體。
如請求項125之方法，其中該單株抗體為嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。
如請求項125或126之方法，其中該單株抗體為IgG單株抗體。
如請求項124-127中任一項之方法，其中該抗體為抗原結合片段。
如請求項128之方法，其中該抗原結合片段為Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂ 片段、scFv、二scFv、雙scFv、串聯(二、三)-scFv、Fv、sdAb、三功能抗體、BiTE、雙抗體或三抗體。
如請求項124-129中任一項之方法，其中該抗體為雙特異性抗體。
如請求項124-127中任一項之方法，其中該抗體選自由以下組成之群：抗CD20抗體、抗CD40抗體、抗HER2抗體、抗IL6抗體、抗IgE抗體、抗IL13抗體、抗Flu A抗體、抗TIGIT抗體、抗PD-L1抗體、抗VEGF-A抗體、抗VEGF-A/ANG2抗體、抗CD79b抗體、抗ST2抗體、抗因子D抗體、抗因子IX抗體、抗因子X抗體、抗aβ抗體、抗τ蛋白抗體、抗CEA抗體、抗CEA/CD3抗體、抗CD20/CD3抗體、抗FcRH5/CD3抗體、抗Her2/CD3抗體、抗FGFR1/KLB抗體、FAP-4-1BBL融合蛋白及FAP-IL2v融合蛋白。
如請求項124-127中任一項之方法，其中該抗體選自由以下組成之群：奧瑞珠單抗(ocrelizumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、托珠單抗(tocilizumab)、法瑞西單抗(faricimab)、普拉土珠單抗(polatuzumab)、甘特珠單抗(gantenerumab)、西比沙他單抗(cibisatamab)、克雷內珠單抗(crenezumab)、莫蘇尼妥珠單抗(mosunetuzumab)、替拉格魯單抗(tiragolumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、利妥昔單抗(rituximab)、阿特珠單抗(atezolizumab)、奧妥珠單抗(obinutuzumab)、蘭帕珠單抗(lampalizumab)、來金珠單抗(lebrikizumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)雷珠單抗(ranibizumab)、艾美賽珠單抗(emicizumab)、賽利克瑞盧單抗(selicrelumab)、普拉辛珠單抗(prasinezumab)、RO6874281及RO7122290。
如請求項124-132中任一項之方法，其中在穿過該離子交換層析材料之前使用親和層析材料純化該多肽，其中該離子交換層析材料為陽離子交換層析材料。
如請求項133之方法，其中該親和材料選自由以下組成之群：蛋白質A層析、蛋白質G層析、蛋白質A/G層析、蛋白質L層析、FcXL層析、蛋白質XL層析、κ層析及κXL層析。
如請求項134之方法，其中該蛋白質A親和材料為MAbSelect材料、MAbSelect SuRe™材料或MAbSelect SuRe™ LX材料。
如請求項1-135中任一項之方法，其中使該等緩衝液以約15-20倍材料體積/小時穿過該離子交換層析材料。
如請求項1-136中任一項之方法，其中使該再生緩衝液以約10倍材料體積/小時穿過該離子交換層析材料。
如請求項1-137中任一項之方法，其中該多肽在宿主細胞中產生。
如請求項138之方法，其中該宿主細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
如請求項1-139中任一項之方法，其中該雜質包含IgG片段、宿主細胞蛋白質或宿主細胞核酸中之一或多者。
如請求項140之方法，其中該多肽在CHO細胞中產生且該雜質包含CHO宿主細胞蛋白質(CHOP)及/或CHO核酸。