KR20220017436A - 과부하 크로마토그래피 컬럼의 재생 방법 - Google Patents

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KR20220017436A
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ion exchange
buffer
polypeptide
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엘. 웡 마르크
도나 에프. 퀸초
제이슨 에이. 브라운
조세핀 케이. 퍼슨
에이미 임
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세척하거나 재생하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 과부하 모드에서 사용되는 다중 폴리펩티드 생성물의 대규모 제조에서 재사용을 위해 상기 이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 세척하거나 재생하는 데 사용될 수 있다.

Description

과부하 크로마토그래피 컬럼의 재생 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 6월 5일에 제출한 미합중국 가출원 제62/857,734호의 우선권 이익을 주장하고, 그 전체 내용은 본원에 원용된다.
본 발명은 크로마토그래피의 방법을 제공한다.
과부하(OL) 양이온 교환 크로마토그래피는 공정을 강화하여 수지 활용 및 플랜트 효율성을 개선하면서도 결합 및 용출 모드에 대해 동등한 불순물 제거 기능을 가지는 것으로 나타났다. 수지는 수지의 동적 결합 용량을 초과한 강한 결합 조건하에서 적재된다. 불순물은 통과한 생성물이 수집되는 동안 상기 수지에 우선적으로 결합한다. 높은 부하 밀도(일반적으로 > 500 g/L)로 인해, 더 높은 농도의 숙주 세포 단백질이 상기 수지에 결합된 상태로 유지된다. 이처럼, 컬럼은 정제 공정의 살균 단계(0.5 N 수산화나트륨) 중에 오염된다(높은 컬럼 압력, >80 psi)(도 1). 필요한 것은 크로마토그래피 실행 사이에 불순물의 캐리오버(carry-over) 없이 살균 단계 동안 압력 증가를 최소화하는 개선된 공정이다.
과부하 크로마토그래피 방법은 미국 특허출원공보 제US 2013/0079272A1호 및 제US 2014/0301977A1에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 원용된다.
특허 출원 및 공보물을 포함하여 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 원용된다.
일부 양태들에서, 본 발명은 재사용을 위한 이온 교환 크로마토그래피 물질(예컨대, 양이온 교환 크로마토그래피 물질)의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은: a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 c) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 50 내지 약 600 mM 아세트산 나트륨(NaOAc)을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 350 mM NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 4.0 내지 11이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 8.3이다. 일부 구현예들에서, 약 3 내지 약 12 물질 부피의 재생 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 10 물질 부피의 재생 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 2 내지 약 12 물질 부피의 살균 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 10 물질 부피의 살균 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 1 내지 5 물질 부피의 저장 완충액에 저장된다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장된다.
일부 양태들에서, 재사용을 위한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은: a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 산 세척액을 통과시키는 단계; c) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH 및 약 1 M NaCl을 포함하는 단계; 및 d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액 및 제2 재생 완충액은 약 25 내지 약 600 mM NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 350 mM NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 2.0 내지 7.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 4.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 5.0이다. 일부 구현예들에서, 약 3 내지 약 12 물질 부피의 재생 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 7 물질 부피의 재생 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액은 약 167 M NaOAc 및 약 0.3 M 인산이다. 일부 구현예들에서, 약 1 내지 약 5 물질 부피의 산 세척액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 3 물질 부피의 산 세척액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 2 내지 약 12 물질 부피의 살균 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 4 물질 부피의 살균 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 1 내지 5 물질 부피의 저장 완충액에 저장된다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 3 물질 부피의 저장 완충액에 저장된다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 재사용을 위한 이온 교환 크로마토그래피 물질(예컨대, 양이온 교환 크로마토그래피 물질)의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은: a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 트리스 및 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 c) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 25 내지 약 75 mM 트리스 및 약 50 내지 약 100 mM NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 50 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 7 내지 9이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 8.0이다. 일부 구현예들에서, 약 3 내지 약 12 물질 부피의 재생 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 10 물질 부피의 재생 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 2 내지 약 12 물질 부피의 살균 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 10 물질 부피의 살균 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 1 내지 5 물질 부피의 저장 완충액에 저장된다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장된다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질(예컨대, 양이온 교환 크로마토그래피 물질)을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액은 약 20 mM 내지 약 60 mM 아세트산 나트륨을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM 아세트산 나트륨을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액의 pH는 약 pH 5.5이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 3 내지 7 물질 부피의 평형 완충액으로 세척된다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 5 물질 부피의 평형 완충액으로 세척된다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 50 내지 약 600 mM NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 350 mM NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 4.0 내지 11이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 8.3이다. 일부 구현예들에서, 약 3 내지 약 12 물질 부피의 재생 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 10 물질 부피의 재생 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 2 내지 약 12 물질 부피의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 10 물질 부피의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 1 내지 5 물질 부피의 저장 완충액에 저장된다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장된다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 산 세척액을 통과시키는 단계, g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH 및 약 1 M NaCl을 포함하는 단계; 및 h) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L이다. 일부 구현예들에서, 상기 부하 밀도는 ≥ 약 20 g/L이다. 일부 구현예들에서, 상기 부하 밀도는 ≥ 약 70 g/L이다. 일부 구현예들에서, 상기 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량의 약 2배 이상이다. 일부 구현예들에서, 상기 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량의 약 2배 내지 약 100배이다. 일부 구현예들에서, 상기 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량의 약 10배이다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액은 약 50 mM 내지 약 100 mM NaOAc 및 약 25 mM 내지 약 75 mM 트리스를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액은 약 85 mM 아세트산 나트륨 및 약 50 mM 트리스를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액의 pH는 약 pH 6.0 내지 약 pH 10.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액의 pH는 약 pH 8.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 5 내지 약 15 물질 부피의 평형 완충액으로 세척된다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 10 물질 부피의 평형 완충액과 함께 저장된다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 25 내지 약 600 mM NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 350 mM NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 2.0 내지 7.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 4.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 5.0이다. 일부 구현예들에서, 약 3 내지 약 12 물질 부피의 상기 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 7 물질 부피의 상기 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액은 약 167 M NaOAc 및 약 0.3 M 인산이다. 일부 구현예들에서, 약 1 내지 약 5 물질 부피의 산 세척액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 3 물질 부피의 산 세척액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 2 내지 약 12 물질 부피의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 4 물질 부피의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 1 내지 5 물질 부피의 저장 완충액에 저장된다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 3 물질 부피의 저장 완충액에 저장된다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 트리스 및 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥20 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 상기 부하 밀도는 ≥ 70 g/L이다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥20 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 트리스 및 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량의 약 2배 이상이다. 일부 구현예들에서, 상기 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량의 약 2배 내지 약 100배이다. 일부 구현예들에서, 상기 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량의 약 10배이다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 트리스 및 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
상기 양태들의 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액은 약 20 mM 내지 약 60 mM 아세트산 나트륨을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM 아세트산 나트륨을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액의 pH는 약 pH 5.5이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 3 내지 7 물질 부피의 평형 완충액으로 세척된다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 5 물질 부피의 평형 완충액으로 세척된다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 25 내지 약 75 mM 트리스 및 약 50 내지 약 100 mM NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 50 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 7 내지 9이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 8.0이다. 일부 구현예들에서, 약 3 내지 약 12 물질 부피의 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 10 물질 부피의 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 2 내지 약 12 물질 부피의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 10 물질 부피의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 1 내지 5 물질 부피의 저장 완충액에 저장된다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장된다.
본 발명의 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 칼럼 내에 있다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 지지체 기질에 연결된 술포프로필 모이어티를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 지지체 기질은 가교 결합된 폴리(스티렌디비닐벤젠)을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 포로스(POROS)™ HS50 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 혼합형 양이온 교환 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 혼합형 양이온 교환 물질은 캡토(Capto) MMC™, 캡토 MMC™ 임프레스(ImpRes), 누비아(Nuvia)™ c프라임(Prime)™, 또는 토요펄(Toyopearl) MX Trp-650M이다.
본 발명의 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 지지체 기질에 연결된 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민 또는 4차 암모늄 이온 작용기, 폴리아민 작용기, 또는 디에틸아미노에틸 작용기를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 혼합형 음이온 교환 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 혼합형 음이온 교환 물질은 캡토 어드히어(Capto Adhere)™ or 캡토 어드히어™ 임프레스이다.
본 발명의 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 상기 폴리펩티드의 대규모 생산에 이용된다. 일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는 항체, 면역부착소, Fc 함유 단백질 또는 면역접합체이다. 일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는 항체이다. 일부 구현예들에서, 상기 항체는 단일클론 항체이다. 일부 구현예들에서, 상기 단일클론 항체는 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체이다. 일부 구현예들에서, 상기 단일클론 항체는 IgG 단일클론 항체이다. 일부 구현예들에서, 상기 항체는 항원 결합 단편이다. 일부 구현예들에서, 상기 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv, 디-scFv, 비-scFv, 탠덤(디, 트리)-scFv, Fv, sdAb, 3작용성 항체, BiTE, 디아바디 또는 트리아바디이다. 일부 구현예들에서, 상기 항체는 이중특이적 항체이다. 일부 구현예들에서, 상기 항체는 항 CD20 항체, 항 CD40 항체, 항 HER2 항체, 항 IL6 항체, 항 IgE 항체, 항 IL13 항체, 항 플루 A 항체, 항 TIGIT 항체, 항 PD-L1 항체, 항 VEGF-A 항체, 항 VEGF-A/ANG2 항체, 항 CD79b 항체, 항 ST2 항체, 항 인자 D 항체, 항 인자 IX 항체, 항 인자 X 항체, 항 아베타 항체, 항 타우 항체, 항 CEA 항체, 항 CEA/CD3 항체, 항 CD20/CD3 항체, 항 FcRH5/CD3 항체, 항 Her2/CD3 항체, 항 FGFR1/KLB 항체, FAP-4-1 BBL 융합 단백질, 및 FAP-IL2v 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, 상기 항체는 오크렐리주맙, 퍼투주맙, 트라스투주맙, 토실리주맙, 파리시맙, 폴라투주맙, 간테네루맙, 시비사타맙, 크레네주맙, 모수네투주맙, 티라골루맙, 베바시주맙, 리툭시맙, 아테졸리주맙, 오비누투주맙, 람팔리주맙, 레브리키주맙, 오말리주맙 라니비주맙, 에미시주맙, 셀리크렐루맙, 프라시네주맙, RO6874281, 및 RO7122290으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하기 전에 친화성 크로마토그래피 물질을 사용하여 정제되고, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 친화성 물질은 단백질 A 크로마토그래피, 단백질 G 크로마토그래피, 단백질 A/G 크로마토그래피, 단백질 L 크로마토그래피, FcXL 크로마토그래피, 단백질 XL 크로마토그래피, 카파 크로마토그래피, 및 카파XL 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, 상기 단백질 A 친화성 물질은 맙셀렉트(MabSelect) 물질, 맙셀렉트 슈어(SuRe)™ 물질 또는 맙셀렉트 슈어™ LX 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 완충액은 약 15 내지 20 물질 부피/시간으로 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 10 물질 부피/시간으로 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다.
본 발명의 일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는 숙주 세포에서 생성된다. 일부 구현예들에서, 상기 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 불순물은 IgG 단편, 숙주 세포 단백질, 또는 숙주 세포 핵산 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는 CHO 세포에서 생성되고 상기 불순물은 CHO 숙주 세포 단백질(CHOP) 및/또는 CHO 핵산을 포함한다.
도 1은 재생 단계 없이 실행된 과부하 크로마토그래피의 크로마토그램이다. 살균 단계의 시작 시 압력 상승 중에 수지의 오염이 관찰된다.
도 2는 항체 mAb1의 과부하 크로마토그래피로부터의 포로스(POROS)™ 50HS 크로마토그램의 예를 도시한다.
도 3은 2회의 평가 실행으로부터의 재생 단계의 크기 배제 크로마토그래피(SEC)의 크로마토그램을 도시한다. 평가 실행 1을 위한 재생 완충액은 50 mM 트리스, 85 mM NaOAc pH 8.0이었다. 평가 실행 2을 위한 재생 완충액은 350 mM NaOAc pH 8.3이었다.
도 4는 항체 mAb1에 대한 평가 실행 A의 크로마토그램을 도시한다.
도 5는 항체 mAb1에 대한 평가 실행 B의 크로마토그램을 도시한다.
도 6은 항체 mAb2에 대한 평가 실행 A의 크로마토그램을 도시한다.
도 7은 항체 mAb2에 대한 평가 실행 B의 크로마토그램을 도시한다.
도 8a 및 도 8b는 포로스(POROS)™ 50HS 모의 실행 세척 절차의 SEC-HPLC 크로마토그램을 도시한다. 도 8a에서, 재생 완충액의 순서는 1) 50 mM 트리스, 85 mM NaOAc pH 8.0 다음에 2) 350 mM NaOAc, pH 8.3이다. 도 8b에서, 재생 완충액의 순서는 1) 350 mM NaOAc pH 8.3 다음에 2) 50 mM 트리스, 85 mM NaOAc pH 8.0이다.
도 9는 캡토™ 어드히어 수지 상의 로봇 불순물 지도 선별검사를 도시한다. mAb3, 중국 햄스터 난소 세포 단백질(CHOP) 및 고분자량(HMW) 폴리펩티드의 결합이 도시된다.
도 10a-도 10e는 각각 mAb3에 대한 평가 실행 A 내지 E의 크로마토그램을 도시한다.
본원에서는 재사용을 위한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은: a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; 및 c) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태들에서, 본 발명은 재사용을 위한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은: a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 트리스 및 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; 및 c) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본원에서는 재사용을 위한 양이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은: a) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; 및 c) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태들에서, 본 발명은 재사용을 위한 양이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은: a) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 트리스 및 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; 및 c) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본원에서는 재사용을 위한 음이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은: a) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; 및 c) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태들에서, 본 발명은 재사용을 위한 음이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은: a) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 트리스 및 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; 및 c) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 양태들에서, 재사용을 위한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은: a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 산 세척액을 통과시키는 단계; c) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH 및 약 1 M NaCl을 포함하는 단계; 및 d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 물질은 음이온 교환 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 물질은 혼합형 음이온 교환 물질이다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; 및 g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 트리스 및 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; 및 g) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 트리스 및 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; g) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; 및 g) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 트리스 및 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; g) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥20 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; 및 g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥20 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 트리스 및 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥20 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; 및 g) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥20 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 트리스 및 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; g) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥20 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; 및 g) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥20 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 트리스 및 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; g) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; 및 g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 트리스 및 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 양이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; 및 g) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 양이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 트리스 및 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; g) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 음이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; 및 g) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 음이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 트리스 및 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; g) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 산 세척액을 통과시키는 단계, g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH 및 약 1 M NaCl을 포함하는 단계; 및 h) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 혼합형 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 캡토(Capto)™ 어드히어(Adhere) 크로마토그래피 물질이다.
본 발명의 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피(예컨대, 양이온 교환 크로마토그래피)는 상기 폴리펩티드의 대규모 생산에 이용된다. 일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는 항체, 예컨대 단일클론 항체이다.
정의
용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 임의의 길이를 갖는 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 이용된다. 중합체는 선형이거나 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비아미노산이 끼어들 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 개입에 의해; 예를 들면, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분으로 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 또한, 상기 정의 내에는 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체(예를 들어, 비자연적인 아미노산 등을 포함) 뿐만 아니라 당해 분야에서 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 포함된다. 본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 구체적으로 항체를 포괄한다.
“정제된” 폴리펩티드(예컨대, 항체 또는 면역부착소)는 폴리펩티드가 이의 자연 환경에서 존재하는 것보다 더 순수한 형태로 존재하도록 및/또는 초기에 합성되고 및/또는 실험실 조건하에 증폭될 때 순도가 증가된 폴리펩티드를 지칭한다. 순도는 상대적인 용어이며 반드시 절대 순도를 의미하지는 않는다.
본원에서 사용된 "과부하 크로마토그래피"는 관심 생성물이 상기 생성물에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 초과하여 로딩되는 크로마토그래피 절차를 지칭한다. 불순물은 상기 생성물보다 더 강력하게 결합하여 통과한 단백질이 달성된 후 정제된 생성물 용출액을 생성한다. 일부 예들에서, 관심 생성물은 동적 결합 용량에 도달한 후 흐르는 중에 분획으로 수집된다.
본원에서 사용된 크로마토그래피 물질의 "물질 부피"는 크로마토그래피 절차에 사용된 크로마토그래피 물질의 총 부피이다. 예를 들어, 상기 크로마토그래피 물질이 컬럼 내에 있는 경우, 상기 물질 부피는 상기 컬럼 내에 있는 크로마토그래피 물질의 총 부피이다. 상기 예에서, "물질 부피"는 "컬럼 부피"라고도 할 수 있다.
관심 항원, 예컨대 종양 관련 폴리펩티드 항원 표적에 "결합하는" 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드가 상기 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 표적으로 하는데 있어서 진단 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화성으로 상기 항원에 결합하고 다른 폴리펩티드와는 유의적으로 교차 반응하지 않는 것이다. 상기 구현예들에서, “비표적” 폴리펩티드에 대한 항체의 결합 정도는 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 분석 또는 방사면역침강(RIA)에 의해 결정될 때, 이의 특정 표적 폴리펩티드에 대한 폴리펩티드의 결합의 약 10%보다 적을 것이다.
표적 분자에 대한 폴리펩티드의 결합에 있어서, 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 “특이적 결합(specific binding)” 또는 “~에 특이적으로 결합하는(specifically binds to~)” 또는 "~에 특이적(specific for~)”이라는 용어는 측정가능한 수준으로 비특이적 상호작용과 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은 예를 들어, 일반적으로 결합 활성을 갖지 않는 유사한 구조의 분자인 대조 분자의 결합과 비교하여 분자의 결합을 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조 분자, 예를 들어, 과잉의 비표지화된 표적과의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 상기의 경우, 만약 프로브에 대한 표지화된 표적의 결합이 과잉의 표지화되지 않은 표적에 의해 경쟁적으로 저해되면, 특이적 결합이 지시된다.
용어 “항체”는 본원에서 가장 넓은 의미에서 사용되고, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 단일클론 항체, 다중클론 항체, 적어도 2개의 원형 항체로부터 형성된 다중특이적 항체, 및 항체 단편을 구체적으로 포괄한다. 용어 “면역글로불린”(Ig)은 본원에서 항체와 상호교환가능하게 사용된다.
항체는 모두 면역글로불린 접힘을 기반으로 하여 다양한 구조를 갖는 자연 발생 면역글로불린 분자이다. 예를 들어, IgG 항체는 기능적 항체를 형성하기 위해 이황화 결합된 2개의 "중" 사슬 및 2개의 "경" 사슬을 갖는다. 각각의 중쇄 및 경쇄 자체는 "불변"(C) 및 "가변"(V) 영역을 포함한다. 상기 V 영역은 항체의 항원 결합 특이성을 결정하는 반면, 상기 C 영역은 면역 작동체와의 비항원 특이적 상호작용에서 구조적 지지 및 기능을 제공한다. 항체 또는 항체의 항원 결합 단편의 항원 결합 특이성은 특정 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 능력이다.
항체의 항원 결합 특이성은 상기 V 영역의 구조적 특성에 의해 결정된다. 가변성은 가변 도메인의 110 아미노산 범위에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 대신에, 상기 V 영역은 각각 9-12개 아미노산 길이인 “초가변 영역”으로 불리는 극도로 가변성의 더 짧은 영역에 의해 분리된 15-30개 아미노산의 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 상대적으로 불변인 스트레치로 구성된다. 자연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 β 시트 형상을 주로 채택하는 4개의 FR을 포함하고, 이들은 루프 연결을 형성하고, 일부 경우에 β 시트 구조의 일부를 형성한다. 각 사슬에서 초가변 영역은 FR에 의해 매우 근접하여 묶여지고, 다른 사슬로부터 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는 데 직접적으로 관련되지 않지만, 다양한 작동체 기능, 예컨대 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)에서 항체의 참여를 나타낸다.
각각의 V 영역은 일반적으로 3개의 초가변 영역, 예를 들어 각각 "초가변 루프"를 포함하는 상보성 결정 영역("CDR") 및 4개의 프레임워크 영역을 포함한다. 따라서, 특정 원하는 항원에 상당한 친화도로 결합하는 데 필요한 최소 구조 단위인 항체 결합 부위는 일반적으로 3개의 CDR, 및 적절한 형태의 CDR을 보유 및 제시하기 위해 그 사이에 산재된 3개 이상, 바람직하게는 4개의 프레임워크 영역을 포함할 것이다. 고전적인 4개 사슬 항체는 VH 및 VL 도메인이 협력하여 정의하는 항원 결합 부위를 가진다. 낙타 및 상어 항체와 같은 특정 항체는 경쇄가 없고 중쇄로만 형성된 결합 부위에 의존한다. VH 및 VL 사이의 협력 없이 결합 부위가 중쇄 또는 경쇄 단독으로 형성되는 단일 도메인 조작된 면역글로불린이 제조될 수 있다.
용어 “가변”은 가변 도메인의 일정한 부분이 항체 사이의 서열에서 광범위하게 상이하고, 이의 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 결합 및 특이성에 이용된다는 사실을 지칭한다. 하지만, 상기 가변성은 항체의 가변 도메인에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 초가변 영역(HVR)이라고 불리는 3개의 분절에 집중되어 있다. 가변 도메인의 더 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역(FR)으로 불린다. 자연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 β 시트 형상을 주로 채택하는 4개의 FR을 포함하고, 이들은 루프 연결을 형성하고, 일부 경우에 β 시트 구조의 일부를 형성한다. 각 사슬에서 초가변 영역은 FR에 의해 매우 근접하여 묶여지고, 다른 사슬로부터 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는 데 직접적으로 관련되지 않지만, 다양한 작동체 기능, 예컨대 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)에서 항체의 참여를 나타낸다.
본원에서 사용될 때, 용어 “초가변 영역”은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 상기 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"(예컨대, VL에서의 대략 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3), VH에서의 대략 31-35B(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3)로부터의 아미노산 잔기(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 및/또는 "초가변성 루프"로부터의 상기 잔기(예컨대, VL에서의 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3), 및 VH에서의 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3)(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))를 포함할 수 있다.
“프레임워크” 또는 “FR” 잔기는 본원에서 정의된 초가변 영역 잔기 이외에 가변 도메인 잔기이다.
“항체 단편”은 원형 항체의 부분, 바람직하게는 이의 항원 결합 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 탠덤 디아바디(taDb), 트리아바디, 선형 항체(예컨대, 미국 특허 제5,641,870호, 실시예 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)); 외팔(one-armed) 항체, 단일 가변 도메인 항체, 미니바디, 단일 사슬 항체 분자; 항체 단편으로 형성된 다중특이적 항체(예컨대, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3, (scFV)4-Fc, sc-Fv, 디-scFv, 비-scFv, 또는 탠덤(디,트리)-scFv를 포함하지만, 이에 제한되지는 않음); 이중특이적 T세포 관여항체(BiTE) 및 3작용성 항체를 포함한다.
항체의 파파인 소화는 “Fab” 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편을 생성하고, 이들은 각각 단일 항원 결합 부위를 갖고, 쉽게 결정화하는 능력을 반영하는 명칭인 잔여 “Fc” 단편을 생성한다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 갖고 항원을 여전히 가교결합할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
“Fv”는 완전 항원 인식 및 항원 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 상기 영역은 단단한 비공유 결합으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 구성된다. 상기 형상에서 각 가변 도메인의 3개의 초가변 영역은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면상에서 항원 결합 부위를 정의한다. 집합적으로, 6개 HVR은 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 하지만, 심지어 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 초가변 영역 만을 포함하는 Fv의 절반)도 비록 전체 결합 부위보다 친화성이 낮긴 하지만, 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab’ 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 몇 개의 잔기들을 부가함에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인들의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 수반하는 Fab'에 대한 본원에서의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편들은 본래 Fab' 단편들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 상기 Fab' 단편들의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 연계 역시 알려져 있다.
임의의 척추동물 종으로부터 항체(면역글로불린)의 “경쇄”는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파(“κ”) 및 람다(“λ”)로 불리는 2가지 명확하게 상이한 유형 중에서 하나에 배정될 수 있다.
중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라서, 항체는 상이한 부류에 배정될 수 있다. 원형 항체에는 5가지 주요 분류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이며, 이들 중 몇몇은 하위부류(동형), 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가 분류될 수 있다. 항체의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각, α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 상이한 부류의 면역글로불린의 하위단위 및 3차원 구성은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.
“단일 사슬 Fv” 또는 “scFv” 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 상기 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. 일부 구현예들에서, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 VH 도메인 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, Pl
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ckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)를 참조한다.
용어 “디아바디”는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하는데, 이들 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH - VL) 내에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 너무 짧아 동일한 사슬 상에서 두 도메인 사이에 쌍 형성을 허용하지 않는 링커를 이용함으로써, 상기 도메인들은 다른 사슬의 상보성 도메인과 쌍을 형성하고 2개의 항원 결합 부위를 생성하도록 한다. 디아바디는 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)에 더 상세히 기재된다.
용어 "다중특이적 항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며 구체적으로는 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체를 포괄한다. 상기 다중특이적 항체는 VHVL 단위가 폴리에피토프 특이성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체, 2개 이상의 VL 및 VH 도메인을 갖고 각각의 VHVL 단위는 상이한 에피토프에 결합하는 항체, 2개 이상의 단일 가변 도메인을 갖고 각각의 단일 가변 도메인은 상이한 에피토프에 결합하는 항체, 전장 항체, 항체 단편, 예컨대 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디, 트리아바디, 3작용성 항체, 공유 또는 비공유 결합으로 연결된 항체 단편을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. “폴리에피토프 특이성”은 동일하거나 상이한 표적(들) 상에서 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다. “단일특이적”은 단지 하나의 에피토프에만 결합하는 능력을 지칭한다. 일 구현예에 따라서, 상기 다중특이적 항체는 각 에피토프에 5 mM 내지 0.001 pM, 3 mM 내지 0.001 pM, 1 mM 내지 0.001 pM, 0.5 mM 내지 0.001 pM, 또는 0.1 mM 내지 0.001 pM의 친화성으로 결합하는 IgG 항체이다.
"단일 도메인 항체"(sdAbs) 또는 "단일 가변 도메인(SVD) 항체"라는 표현은 일반적으로 단일 가변 도메인(VH 또는 VL)이 항원 결합을 부여할 수 있는 항체를 지칭한다. 즉, 상기 단일 가변 도메인은 표적 항원을 인식하기 위해 다른 가변 도메인과 상호작용할 필요가 없다. 단일 도메인 항체의 예로는 낙타과(라마 및 낙타) 및 연골어류(예컨대, 수염 상어)에서 유래한 항체와 인간 및 마우스 항체로부터 재조합 방법을 통해 유래된 항체가 포함된다(Nature (1989) 341:544-546; Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56; Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235; Trends Biotechnol (2003):21:484-490; WO 2005/035572; WO 03/035694; FEBs Lett (1994) 339:285-290; WO00/29004; WO 02/051870).
본원에서 사용된 용어 “단일클론 항체”는 실질적으로 균질한 항체의 개체군으로부터 획득된 항체를 지칭한다. 즉, 상기 개체군을 포함하는 개별 항체는 예를 들어, 단일클론 항체의 생성 중에 발생하는 가능한 변이체 항체(상기 변이체는 일반적으로 미량으로 존재함)를 제외하고, 동일하고 및/또는 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 포함하는 다중클론 항체 제조와 대조되게, 각각의 단일클론 항체는 항원 상에서 단일 결정인자에 대해 지향된다. 단일클론 항체는 그들의 특이성에 더하여, 다른 면역글로불린에 의한 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어 “단일클론”은 항체의 실질적으로 균질한 개체군으로부터 획득되는 것으로서 항체의 특징을 표시하고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라 사용되는 단일클론 항체는 Kohler et al., Nature 256:495 (1975)에 의해 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다(예컨대, 미국 특허 제4,816,567호를 참조). 상기 “단일클론 항체”는 또한, 예를 들어 Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원의 단일클론 항체는 구체적으로 “키메라” 항체(면역글로불린)를 포함하고, 중쇄 및/또는 경쇄 부분은 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 반면, 상기 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 뿐만 아니라 이들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 상기 항체의 단편 내에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이다(미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). 본원에서 관심이 되는 키메라 항체는 비인간 영장류(예컨대, 개코원숭이, 붉은털 원숭이 또는 시노몰구스 원숭이와 같은 구대륙 원숭이)로부터 유래된 가변 도메인 항원 결합 서열 및 인간 불변 영역 서열(미국 특허 제5,693,780호)을 포함하는 “영장류화” 항체를 포함한다.
비인간(예컨대, 뮤린) 항체의 “인간화” 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분에 대해, 인간화된 항체는 인간 면역글로불린(수용자 항체)이고, 여기서 상기 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기들은 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종(공여자 항체)의 초가변 영역 기원으로부터의 잔기들에 의해 대체된다. 일부 예들에서, 상기 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 상기 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 상기 인간화 항체는 적어도 1개, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프가 비인간 면역글로불린의 초가변 루프에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 상기 언급된 FR 대체물(들)을 제외하고는 인간 면역글로불린 서열의 FR이다. 상기 인간화 항체는 또한 선택적으로 면역글로불린 불변 영역, 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가적인 세부사항에 대해서는, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)를 참조한다.
본원의 목적을 위해, "원형 항체"는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 뿐만 아니라 Fc 영역을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 자연 서열 불변 도메인(예컨대, 인간 자연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 원형 항체는 하나 이상의 작동체 기능을 갖는다.
“자연 항체”는 일반적으로 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성되는 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되는 반면, 이황화 결합의 수는 상이한 면역글로불린 동형의 중쇄 사이에서 서로 상이하다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 이황화 가교를 갖는다. 각 중쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(VH)에 이어 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(VL) 및 이의 다른 말단에 불변 도메인을 갖는다; 상기 경쇄의 불변 도메인은 상기 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되며, 상기 경쇄 가변 도메인은 상기 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 생각된다.
"네이키드 항체"는 세포독성 모이어티 또는 방사성표지와 같은 이종 분자에 접합되지 않은 항체(본원에 정의된 바와 같음)이다.
일부 구현예들에서, 항체 “작동체 기능”은 항체의 Fc 영역(자연적 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인한 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 동형에 따라 가변된다. 항체 작동체 기능들의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체의 하향 조절.
"항체 의존성 세포 매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예컨대, 자연 살해(NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인식하고 그 후 상기 표적 세포의 용해를 유발하는 세포 매개 반응을 지칭한다. ADCC를 매개하는 일차 세포, NK 세포는 FcγRIII만을 발현시키는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현시킨다. 조혈 세포상의 Fc 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)의 페이지 464의 표 3에 요약된다. 관심이 되는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 제5,500,362호 또는 5,821,337호에 기재된 것과 같은 시험관내 ADCC 검정이 실시될 수 있다. 상기 분석을 위한 유용한 작동체 세포는 말초혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심이 되는 분자의 ADCC 활성은 생체내, 예컨대 동물 모델에서, 예컨대 Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998)에 개시된 바와 같이 평가될 수 있다.
“인간 작동체 세포”는 하나 이상의 FcR을 발현하고 작동체 기능을 수행하는 백혈구이다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 적어도 FcγRIII을 발현하고 ADCC 작동체 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 PBMC 및 NK 세포가 선호되는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포, 및 호중구를 포함한다.
“Fc 수용체” 또는 “FcR”은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명하는데 사용된다. 일부 구현예들에서, 상기 FcR은 자연 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체뿐만 아니라 상기 수용체의 대립형질 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함하는 것이다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA(“활성화 수용체”) 및 FcγRIIB (“억제 수용체”)를 포함하는데, 이들은 주로 이의 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 세포질 도메인에서 면역수용체 티로신 기반의 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRlIB는 이의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)를 함유한다. (Da
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ron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)을 참조). FcR은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)에서 검토된다. 앞으로 확인될 것들을 포함한 다른 FcR은 본원에서 용어 “FcR”에 의해 포괄된다. 또한, 상기 용어는 신생아 수용체인 FcRn이 포함되며, 이는 모계 IgG의 태아로의 전달을 담당한다(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).
크로마토그래피와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "순차적"은 1차 크로마토그래피에 이어 2차 크로마토그래피를 갖는 것을 지칭한다. 상기 제1 크로마토그래피 및 상기 제2 크로마토그래피 사이에 추가 단계가 포함될 수 있다.
크로마토그래피와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "연속적인"은 제1 크로마토그래피 물질 및 제2 크로마토그래피 물질이 직접 연결되거나 2개의 크로마토그래피 물질 사이의 연속적인 흐름을 허용하는 일부 다른 메커니즘을 갖는 것을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "단리된"은 자연에서 전형적으로 발견되거나 생성되는 성분의 적어도 일부로부터 분리된 분자를 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 그것이 생성된 세포의 구성요소 중 적어도 일부로부터 분리될 때 "단리된" 것으로 언급된다. 폴리펩티드가 발현 후 세포에 의해 분비되는 경우, 상기 폴리펩티드를 함유하는 상청액을 이를 생성한 세포로부터 물리적으로 분리하는 것은 폴리펩티드를 "분리"하는 것으로 간주된다. 유사하게, 폴리뉴클레오티드는 그것이 자연에서 전형적으로 발견되는 더 큰 폴리뉴클레오티드(예컨대, 예를 들어, DNA 폴리뉴클레오티드의 경우 유전체 DNA 또는 미토콘드리아 DNA)의 일부가 아닌 경우 또는, 예컨대 RNA 폴리뉴클레오티드의 경우에 그것이 생성된 세포의 성분 중 적어도 일부로부터 분리될 때 "단리된" 것으로 언급된다. 따라서, 숙주 세포 내부의 벡터에 함유된 DNA 폴리뉴클레오티드는 "단리된"이라고 언급될 수 있다.
"오염 물질"은 원하는 폴리펩티드 생성물과 상이한 물질을 지칭한다. 상기 오염 물질은 CHO 숙주 세포 단백질(CHOP)과 같은 숙주 세포 물질; 침출된 단백질 A; 핵산; 원하는 폴리펩티드의 변이체, 단편, 응집체 또는 유도체; 다른 폴리펩티드; 내독소; 바이러스 오염 물질; 세포 배양 배지 성분 등을 포함한다. 일부 예들에서, 상기 오염 물질은 예를 들어, 제한없이 세균 세포, 예컨대 대장균 세포, 곤충 세포, 원핵 세포, 진핵 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 조류 세포, 진균 세포로부터의 숙주 세포 단백질(HCP)일 수 있다.
본원의 값 또는 매개변수의 "약(about)"에 대한 언급은 상기 값 또는 매개변수 자체에 관한 변형을 포함한다(및 기재한다). 예를 들어, "약 X"를 지칭하는 기재는 "X"의 지재를 포함한다.
본원 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형 "하나(a)", "또는" 및 "그(the)"는 문맥에서 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 본원에 기재된 발명의 양태 및 구현예는 "구성되는(consisting) 및/또는 "~로 본질적으로 구성되는"의 양태 및 변형을 포함하는 것으로 이해된다.
크로마토그래피 세척 방법
크로마토그래피
본 발명은 이온 교환 크로마토그래피가 과부하 모드에서 사용되는 재사용을 위한 이온 교환 크로마토그래피 물질을 세척 또는 재생하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 대규모 정제; 예컨대, 항체 또는 이의 단편과 같은 폴리펩티드의 제조 규모의 생산에서 사용된다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다.
일부 양태들에서, 본 발명은 재사용을 위한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은: a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨(NaOAc)을 포함하는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; 및 c) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 50 내지 약 600 mM NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 50 mM 내지 600 mM, 100 mM 내지 600 mM, 150 mM 내지 600 mM, 200 mM 내지 600 mM, 250 mM 내지 600 mM, 300 mM 내지 600 mM, 350 mM 내지 600 mM, 400 mM 내지 600 mM, 450 mM 내지 600 mM, 500 mM 내지 600 mM, 550 mM 내지 600 mM, 50 mM 내지 550 mM, 50 mM 내지 450 mM, 50 mM 내지 400 mM, 50 mM 내지 350 mM, 50 mM 내지 300 mM, 50 mM 내지 250 mM, 50 mM 내지 200 mM, 50 mM 내지 150 mM, 50 mM 내지 100 mM, 100 mM 내지 550 mM, 150 mM 내지 500 mM, 200 mM 내지 450 mM, 250 mM 내지 400 mM, 또는 300 mM 내지 400 mM 중 약 임의의 것의 농도 범위로 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 또는 650 mM 중 약 임의의 것의 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 350 mM NaOAc를 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 70 mM 내지 100 mM, 75 mM 내지 95 mM, 또는 80 mM 내지 90 mM 중 약 임의의 농도 범위로 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 85 mM NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 70 mM 내지 100 mM, 75 mM 내지 95 mM, 또는 80 mM 내지 90 mM 중 약 임의의 농도 범위로 NaOAc를 포함하고 추가로 트리스를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 70 mM 내지 100 mM, 75 mM 내지 95 mM, 또는 80 mM 내지 90 mM 중 약 임의의 것의 농도 범위로 NaOAc를 포함하고, 25 mM 내지 75 mM, 30 mM 내지 75 mM, 35 mM 내지 40 mM, 45 mM 내지 75 mM, 50 mM 내지 75 mM, 25 mM 내지 70 mM, 25 mM 내지 65 mM, 25 mM 내지 60 mM, 25 mM 내지 55 mM, 또는 25 mM 내지 50 mM 중 약 임의의 것의 농도 범위로 트리스를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 70 mM 내지 100 mM, 75 mM 내지 95 mM, 또는 80 mM 내지 90 mM 중 약 임의의 농도 범위로 NaOAc를 포함하고 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM 또는 75 mM 중 약 임의의 것의 농도 범위로 트리스를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 4.0 내지 약 pH 11.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 4.0 내지 약 pH 10.5, 약 pH 4.0 내지 약 pH 10.0, 약 pH 4.0 내지 약 pH 9.5, 약 pH 4.0 내지 약 pH 9.0, 약 pH 4.0 내지 약 pH 8.5, 약 pH 4.0 내지 약 pH 8.0, 약 pH 5.5 내지 약 pH 11.0, 약 pH 5.5 내지 약 pH 10.5, 약 pH 5.5 내지 약 pH 10.0, 약 pH 5.5 내지 약 pH 9.5, 약 pH 5.5 내지 약 pH 9.0, 약 pH 5.5 내지 약 pH 8.5, 약 pH 5.5 내지 약 pH 8.0, 약 pH 6.0 내지 약 pH 11.0, 약 pH 6.5 내지 약 pH 11.0, 약 pH 7.0 내지 약 pH 11.0, 약 pH 7.5 내지 약 pH 11.0, 약 pH 8.0 내지 약 pH 11.0, 약 pH 6.0 내지 약 pH 11.0, 약 pH 6.5 내지 약 pH 10.5, 약 pH 7.0 내지 약 pH 10.0, 약 pH 7.5 내지 약 pH 9.5, 또는 약 pH 8.0 내지 약 pH 9.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 pH 7.5, 약 pH 8.0, 약 pH 8.1, 약 pH 8.2, 약 pH 8.3, 약 pH 8.4, 약 pH 8.5, 또는 약 pH 9.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 8.3이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 8.3에서 약 350 mM NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 8이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 8.0에서 약 50 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함한다.
일부 구현예들에서, 약 3 내지 약 12, 약 3 내지 약 11, 약 3 내지 약 10, 약 3 내지 약 9, 약 3 내지 약 8, 약 3 내지 약 7, 약 3 내지 약 6, 약 3 내지 약 5, 약 3 내지 약 4, 약 4 내지 약 12, 약 5 내지 약 12, 약 6 내지 약 12, 약 7 내지 약 12, 약 8 내지 약 12, 약 9 내지 약 12, 약 10 내지 약 12, 약 11 내지 약 12, 약 5 내지 약 12, 약 5 내지 약 10, 약 8 내지 약 12, 또는 약 9 내지 약 11 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피) 중 약 임의의 것의 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 10 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다.
일부 양태들에서, 재사용을 위한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은: a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 산 세척액을 통과시키는 단계; c) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH 및 약 1 M NaCl을 포함하는 단계; 및 d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 혼합형 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 캡토(Capto)™ 어드히어(Adhere) 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 50 내지 약 600 mM NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 50 mM 내지 600 mM, 100 mM 내지 600 mM, 150 mM 내지 600 mM, 200 mM 내지 600 mM, 250 mM 내지 600 mM, 300 mM 내지 600 mM, 350 mM 내지 600 mM, 400 mM 내지 600 mM, 450 mM 내지 600 mM, 500 mM 내지 600 mM, 550 mM 내지 600 mM, 50 mM 내지 550 mM, 50 mM 내지 450 mM, 50 mM 내지 400 mM, 50 mM 내지 350 mM, 50 mM 내지 300 mM, 50 mM 내지 250 mM, 50 mM 내지 200 mM, 50 mM 내지 150 mM, 50 mM 내지 100 mM, 100 mM 내지 550 mM, 150 mM 내지 500 mM, 200 mM 내지 450 mM, 250 mM 내지 400 mM, 또는 300 mM 내지 400 mM 중 약 임의의 것의 농도 범위로 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 또는 650 mM 중 약 임의의 것의 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 350 mM NaOAc를 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 2.0 내지 약 pH 7.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 2.0 내지 약 pH 6.5, 약 pH 2.0 내지 약 pH 6.0, 약 pH 2.0 내지 약 pH 5.5, 약 pH 2.0 내지 약 pH 5.0, 약 pH 2.0 내지 약 pH 4.5, 약 pH 2.0 내지 약 pH 4.0, 약 pH 2.0 내지 약 pH 3.5, 약 pH 2.0 내지 약 pH 3.0, 약 pH 2.0 내지 약 pH 2.5, 약 pH 2.5 내지 약 pH 7.0, 약 pH 3.0 내지 약 pH 7.0, 약 pH 3.5 내지 약 pH 7.0, 약 pH 4.0 내지 약 pH 7.0, 약 pH 4.5 내지 약 pH 7.0, 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0, 약 pH 5.5 내지 약 pH 7.0, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.0, 또는 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 pH 2.0, 약 pH 8.0, 약 pH 2.5, 약 pH 3.0, 약 pH 3.5, 약 pH 4.0, 약 pH 4.5, 약 pH 5.0, 약 pH 5.5, 약 pH 6.0, 약 pH 6.5, 또는 약 pH 7.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 pH 4.0의 350 mM NaOAc이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 pH 5.0의 350 mM NaOAc이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 pH 4.0의 40 mM NaOAc이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 pH 5.0의 40 mM NaOAc이다.
일부 구현예들에서, 약 3 내지 약 12, 약 3 내지 약 11, 약 3 내지 약 10, 약 3 내지 약 9, 약 3 내지 약 8, 약 3 내지 약 7, 약 3 내지 약 6, 약 3 내지 약 5, 약 3 내지 약 4, 약 4 내지 약 12, 약 5 내지 약 12, 약 6 내지 약 12, 약 7 내지 약 12, 약 8 내지 약 12, 약 9 내지 약 12, 약 10 내지 약 12, 약 11 내지 약 12, 약 5 내지 약 12, 약 5 내지 약 10, 약 8 내지 약 12, 또는 약 9 내지 약 11 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피) 중 약 임의의 것의 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 7 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다.
일부 구현예들에서, 상기 산 세척액은 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액은 인산을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액은 NaOAc 및 인산을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액 중 NaOAc의 농도는 0.1 M 내지 약 0.5 M 미만 중 약 임의의 것을 초과한다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액 중 NaOAc의 농도는 약 0.100 M, 0.120 M, 0.130 M, 0.140 M, 0.150 M, 0.160 M, 0.161 M, 0.162 M, 0.163 M, 0.164 M, 0.167 M, 0.168 M, 0.169 M, 0.170 M, 0.180 M, 0.190 M, 0.200 M, 0.250 M, 0.300 M, 0.350 M, 0.400 M, 0.450 M, 또는 0.500 M 중 임의의 것이다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액 중 인산의 농도는 약 0.10 M, 0.15 M, 0.20 M, 0.25 M, 0.30 M, 0.35 M, 0.40 M, 0.45 M, 0.50 M, 0.55 M, 또는 0.60 M 중 임의의 것이다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액은 약 0.167 M NaOAc 및 약 0.3 M 인산을 포함한다.
일부 구현예들에서, 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 4, 약 1 내지 약 3, 약1 내지 약 2, 약 2 내지 약 5, 약 2 내지 약 4, 약 2 내지 약 3, 약 3 내지 약 5, 약 3 내지 약 4, 약 4 내지 약 5 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 산 세척액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 1, 2, 3, 4 또는 5 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피) 중 약 임의의 것의 산 세척액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 3 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 산 세척액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다.
일부 양태들에서, 본 발명은 재사용을 위한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은: a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 제1 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 제2 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 제2 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; c) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 산 세척액을 통과시키는 단계,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH 및 약 1 M NaCl을 포함하는 단계; 및 d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 혼합형 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 캡토(Capto)™ 어드히어(Adhere) 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 상기 제1 재생 완충액 및/또는 상기 제2 재생 완충액은 약 50 내지 약 600 mM NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 제1 재생 완충액 및/또는 상기 제2 재생 완충액은 NaOAc를 25 mM 내지 600 mM, 30 mM 내지 600 mM, 40 mM 내지 600 mM, 50 mM 내지 600 mM, 75 mM 내지 600 mM, 100 mM 내지 600 mM, 125 mM 내지 600 mM, 150 mM 내지 600 mM, 175 mM 내지 600 mM, 200 mM 내지 600 mM, 225 mM 내지 600 mM, 250 mM 내지 600 mM, 275 mM 내지 600 mM, 300 mM 내지 600 mM, 325 mM 내지 600 mM, 350 mM 내지 600 mM, 375 mM 내지 600 mM, 400 mM 내지 600 mM, 450 mM 내지 600 mM, 500 mM 내지 600 mM, 550 mM 내지 600 mM, 25 mM 내지 550 mM, 25 mM 내지 500 mM, 25 mM 내지 475 mM, 25 mM 내지 450 mM, 25 mM 내지 425 mM, 25 mM 내지 400 mM, 25 mM 내지 375 mM, 25 mM 내지 550 mM, 25 mM 내지 325 mM, 25 mM 내지 300 mM, 25 mM 내지 275 mM, 25 mM 내지 250 mM, 25 mM 내지 225 mM, 25 mM 내지 200 mM, 25 mM 내지 175 mM, 25 mM 내지 150 mM, 25 mM 내지 125 mM, 25 mM 내지 100 mM, 25 mM 내지 90 mM, 25 mM 내지 80 mM, 25 mM 내지 70 mM, 25 mM 내지 60 mM, 25 mM 내지 50 mM, 25 mM 내지 40 mM, 또는 25 mM 내지 30 mM 중 약 임의의 농도 범위로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 제1 재생 완충액은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 또는 600 mM 중 약 임의의 것의 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 350 mM NaOAc를 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 제1 재생 완충액 및/또는 상기 제2 재생 완충액의 pH는 약 pH 2.0 내지 약 pH 7.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 제1 재생 완충액 및/또는 상기 제2 재생 완충액의 pH는 약 pH 2.0 내지 약 pH 6.5, 약 pH 2.0 내지 약 pH 6.0, 약 pH 2.0 내지 약 pH 5.5, 약 pH 2.0 내지 약 pH 5.0, 약 pH 2.0 내지 약 pH 4.5, 약 pH 2.0 내지 약 pH 4.0, 약 pH 2.0 내지 약 pH 3.5, 약 pH 2.0 내지 약 pH 3.0, 약 pH 2.0 내지 약 pH 2.5, 약 pH 2.5 내지 약 pH 7.0, 약 pH 3.0 내지 약 pH 7.0, 약 pH 3.5 내지 약 pH 7.0, 약 pH 4.0 내지 약 pH 7.0, 약 pH 4.5 내지 약 pH 7.0, 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0, 약 pH 5.5 내지 약 pH 7.0, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.0, 또는 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 pH 2.0, 약 pH 8.0, 약 pH 2.5, 약 pH 3.0, 약 pH 3.5, 약 pH 4.0, 약 pH 4.5, 약 pH 5.0, 약 pH 5.5, 약 pH 6.0, 약 pH 6.5, 또는 약 pH 7.0이다.
일부 구현예들에서, 상기 제1 재생 완충액은 약 40 mM NaOAc 및 약 pH 4.0이고, 상기 제2 재생 완충액은 약 350 mM NaOAc 및 약 pH 4.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 제1 재생 완충액은 약 40 mM NaOAc 및 약 pH 5.0이고, 상기 제2 재생 완충액은 약 350 mM NaOAc 및 약 pH 5.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 제1 재생 완충액은 약 350 mM NaOAc 및 약 pH 4.0이고, 상기 제2 재생 완충액은 약 40 mM NaOAc 및 약 pH 4.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 제1 재생 완충액은 약 350 mM NaOAc 및 약 pH 5.0이고, 상기 제2 재생 완충액은 약 40 mM NaOAc 및 약 pH 5.0이다.
일부 구현예들에서, 약 3 내지 약 12, 약 3 내지 약 11, 약 3 내지 약 10, 약 3 내지 약 9, 약 3 내지 약 8, 약 3 내지 약 7, 약 3 내지 약 6, 약 3 내지 약 5, 약 3 내지 약 4, 약 4 내지 약 12, 약 5 내지 약 12, 약 6 내지 약 12, 약 7 내지 약 12, 약 8 내지 약 12, 약 9 내지 약 12, 약 10 내지 약 12, 약 11 내지 약 12, 약 5 내지 약 12, 약 5 내지 약 10, 약 8 내지 약 12, 또는 약 9 내지 약 11 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 상기 제1 재생 완충액 및/또는 상기 제2 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12물질 부피(예컨대, 컬럼 부피) 중 약 임의의 상기 제1 재생 완충액/또는 상기 제2 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 10 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 제1 재생 완충액/또는 상기 제2 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다.
일부 구현예들에서, 상기 산 세척액은 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액은 인산을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액은 NaOAc 및 인산을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액 중 NaOAc의 농도는 0.1 M 내지 약 0.5 M 미만 중 약 임의의 것을 초과한다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액 중 NaOAc의 농도는 약 0.100 M, 0.120 M, 0.130 M, 0.140 M, 0.150 M, 0.160 M, 0.161 M, 0.162 M, 0.163 M, 0.164 M, 0.167 M, 0.168 M, 0.169 M, 0.170 M, 0.180 M, 0.190 M, 0.200 M, 0.250 M, 0.300 M, 0.350 M, 0.400 M, 0.450 M, 또는 0.500 M 중 임의의 것이다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액 중 인산의 농도는 약 0.10 M, 0.15 M, 0.20 M, 0.25 M, 0.30 M, 0.35 M, 0.40 M, 0.45 M, 0.50 M, 0.55 M, 또는 0.60 M 중 임의의 것이다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액은 약 0.167 M NaOAc 및 약 0.3 M 인산을 포함한다.
일부 구현예들에서, 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 4, 약 1 내지 약 3, 약1 내지 약 2, 약 2 내지 약 5, 약 2 내지 약 4, 약 2 내지 약 3, 약 3 내지 약 5, 약 3 내지 약 4, 약 4 내지 약 5 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 산 세척액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 1, 2, 3, 4 또는 5 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피) 중 약 임의의 것의 산 세척액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 3 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 산 세척액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다.
일부 구현예들에서, 상기 살균 완충액은 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 살균 완충액은 약 0.1 N 내지 약 1.0 N NaOH, 약 0.1 N 내지 약 0.9 N NaOH, 약 0.1 N 내지 약 0.8 N NaOH, 약 0.1 N 내지 약 0.7 N NaOH, 약 0.1 N 내지 약 0.8 N NaOH, 약 0.1 N 내지 약 0.6 N NaOH, 약 0.1 N 내지 약 0.5 N NaOH, 약 0.2 N 내지 약 1.0 N NaOH, 약 0.3 N 내지 약 1.0 N NaOH, 약 0.4 N 내지 약 1.0 N NaOH, 약 0.5 N 내지 약 1.0 N NaOH, 약 0.2 N 내지 약 0.8 N NaOH, 약 0.3 N 내지 약 0.7 N NaOH, 또는 약 0.4 N 내지약 0.6 N NaOH를 포함한다. 일부 구현예들에서, 살균 완충액은 0.1 N, 0.2 N, 0.3 N, 0.4 N, 0.5 N, 0.6 N, 0.7 N NaOH, 0.8 N, 0.9 N, 또는 1.0 N NaOH 중 약 임의의 것을 포함한다. 일부 구현예들에서, 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 살균 완충액은 NaOH 및 NaCl를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 살균 완충액은 약 0.1 N 내지 약 1.0 N NaOH, 약 0.1 N 내지 약 0.9 N NaOH, 약 0.1 N 내지 약 0.8 N NaOH, 약 0.1 N 내지 약 0.7 N NaOH, 약 0.1 N 내지 약 0.8 N NaOH, 약 0.1 N 내지 약 0.6 N NaOH, 약 0.1 N 내지 약 0.5 N NaOH, 약 0.2 N 내지 약 1.0 N NaOH, 약 0.3 N 내지 약 1.0 N NaOH, 약 0.4 N 내지 약 1.0 N NaOH, 약 0.5 N 내지 약 1.0 N NaOH, 약 0.2 N 내지 약 0.8 N NaOH, 약 0.3 N 내지 약 0.7 N NaOH, 또는 약 0.4 N 내지약 0.6 N NaOH를 포함한다. 일부 구현예들에서, 살균 완충액은 0.1 N, 0.2 N, 0.3 N, 0.4 N, 0.5 N, 0.6 N, 0.7 N NaOH, 0.8 N, 0.9 N, 또는 1.0 N NaOH 중 약 임의의 것을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 M 내지 약 1.5 M NaCl, 0.75 M 내지 약 1.5 M NaCl, 약 1.0 M NaCl 내지 약 1.5 M NaCl, 약 1.25 M NaCl 내지 약 1.5 M NaCl, 약 0.5 M NaCl 내지 약 1.25 M NaCl, 약 0.5 M NaCl 내지 약 1.0 M NaOH, 또는 약 0.5 M NaCl 내지 약 0.75 M NaCl을 포함한다. 일부 구현예들에서, 살균 완충액은 약 0.5 M, 0.75 M, 1.0 M, 1.25 M, 또는 1.5 M NaCl 중 약 임의의 것을 포함한다. 일부 구현예들에서, 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH 및 약 1 M NaCl를 포함한다.
일부 구현예들에서, 약 3 내지 약 12, 약 3 내지 약 11, 약 3 내지 약 10, 약 3 내지 약 9, 약 3 내지 약 8, 약 3 내지 약 7, 약 3 내지 약 6, 약 3 내지 약 5, 약 3 내지 약 4, 약 4 내지 약 12, 약 5 내지 약 12, 약 6 내지 약 12, 약 7 내지 약 12, 약 8 내지 약 12, 약 9 내지 약 12, 약 10 내지 약 12, 약 11 내지 약 12, 약 5 내지 약 12, 약 5 내지 약 10, 약 8 내지 약 12, 또는 약 9 내지 약 11 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피) 중 약 임의의 것의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 10 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. . 일부 구현예들에서, 약 4 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다.
일부 구현예들에서, 상기 저장 완충액은 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 저장 완충액은 약 0.05 N 내지 약 0.5 N NaOH, 0.05 N 내지 약 0.4 N NaOH, 0.05 N 내지 약 0.4 N NaOH, 0.05 N 내지 약 0.3 N NaOH, 0.05 N 내지 약 0.2 N NaOH, 0.05 N 내지 약 0.1 N NaOH, 0.1 N 내지 약 0.5 N NaOH, 0.2 N 내지 약 0.5 N NaOH, 0.3 N 내지 약 0.05 N NaOH, 또는 0.4 N 내지 약 0.5 N NaOH를 포함한다. 일부 구현예들에서, 저장 완충액은 0.05 N, 0.06 N, 0.07 N NaOH, 0.08 N, 0.09 N, 0.1 N, 0.2 N, 0.3 N, 0.4 N 또는 0.5 N NaOH 중 약 임의의 것을 포함한다. 일부 구현예들에서, 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 8, 약 1 내지 약 6, 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 4, 약 1 내지 약 3, 약 1 내지 약 2, 약 2 내지 약 10, 약 3 내지 약 20, 약 4 내지 약 10, 약 5 내지 약 10, 약 1 내지 약 7, 약 2 내지 약 6, 약 3 내지 약 5 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 저장 완충액에 저장된다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피) 중 약 임의의 것의 저장 완충액에 저장된다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 4 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 저장 완충액에 저장된다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 3 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 저장 완충액에 저장된다.
일부 양태들에서, 본 발명은 재사용을 위한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은: a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.3의 약 350 mM 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 c) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태들에서, 본 발명은 재사용을 위한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은: a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.3의 약 350 mM 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 c) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다.
일부 양태들에서, 본 발명은 재사용을 위한 양이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은: a) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.3의 약 350 mM 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 c) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태들에서, 본 발명은 재사용을 위한 양이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은: a) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.3의 약 350 mM 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 c) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 양태들에서, 본 발명은 재사용을 위한 음이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은: a) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.3의 약 350 mM 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 c) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태들에서, 본 발명은 재사용을 위한 음이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은: a) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.3의 약 350 mM 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 c) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 재사용을 위한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은: a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.0의 약 25 mM 트리스 및 약 85 mM 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 c) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 재사용을 위한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은: a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.0의 약 25 mM 트리스 및 약 85 mM 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 c) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 재사용을 위한 양이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은: a) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.0의 약 25 mM 트리스 및 약 85 mM 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 c) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 재사용을 위한 양이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은: a) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.0의 약 25 mM 트리스 및 약 85 mM 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 c) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 재사용을 위한 음이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은: a) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.0의 약 25 mM 트리스 및 약 85 mM 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 c) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 재사용을 위한 음이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은: a) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.0의 약 25 mM 트리스 및 약 85 mM 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 c) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; 및 g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계; f) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; 및 g) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계; f) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; 및 g) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥20 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; 및 g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥20 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계; f) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; 및 g) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥20 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계; f) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; 및 g) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; 및 g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 양이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계; f) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; 및 g) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 음이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계; f) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계; 및 g) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액은 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 20 mM 내지 약 100 mM, 약 30 mM 내지 약 100 mM, 약 40 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 90 mM, 약 10 mM 내지 약 80 mM, 약 10 mM 내지 약 70 mM, 약 10 mM 내지 약 60 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 40 mM, 약 10 mM 내지 약 70 mM, 약 20 mM 내지 약 60 mM, 또는 약 30 mM 내지 약 50 mM의 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액은 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 또는 100 mM 중 약 임의의 것의 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액의 pH는 약 4.0 내지 약 8.0, 약 5.0 내지 약 8.0, 약 6.0 내지 약 8.0, 약 7.0 내지 약 8.0, 약 4.0 내지 약 7.0, 약 4.0 내지 약 6.0, 약 4.0 내지 약 5.0, 약 4.0 내지 약 7.0, 약 4.5 내지 약 6.5, 또는 약 5.0 내지 약 6.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액의 pH는 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 또는 8.0 중 임의의 것이다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액의 pH는 약 5.5이다.
일부 구현예들에서, 약 3 내지 약 10, 약 3 내지 약 9, 약 3 내지 약 8, 약 3 내지 약 7, 약 3 내지 약 6, 약 3 내지 약 5, 약 3 내지 약 4, 약 4 내지 약 10, 약 5 내지 약 10, 약 6 내지 약 10, 약 7 내지 약 10, 약 8 내지 약 10, 약 9 내지 약 10, 약 3 내지 약 8, 약 4 내지 약 7, 또는 약 5 내지 약 6 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 평형 완충액은 상기 조성물을 로딩하기 전에 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피) 중 약 임의의 것의 평형 완충액은 상기 조성물을 로딩하기 전에 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 5 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 평형 완충액은 상기 조성물을 로딩하기 전에 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 물질은 충분한 양의 폴리펩티드가 분획에서 수집될 때까지 상기 조성물을 로딩한 후 평형 완충액으로 세척된다.
일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 50 내지 약 600 mM의 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 350 mM의 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 25 내지 약 75 mM 트리스 및 약 50 내지 약 100 mM의 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 50 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 4.0 내지 11.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 8.3이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 8.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.3에서 약 350 mM NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.0에서 약 50 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 약 3 내지 약 12 물질 부피의 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 10 물질 부피의 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다.
일부 구현예들에서, 상기 살균 완충액은 약 0.1 N 내지 약 1 N의 NaOH를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N의 NaOH를 포함한다. 일부 구현예들에서, 약 2 내지 약 12 물질 부피의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 10 물질 부피의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과한다.
일부 구현예들에서, 상기 저장 완충액은 약 0.05 N 내지 약 0.5 N의 NaOH를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 살균 완충액은 약 0.1 N의 NaOH를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 1 내지 5 물질 부피의 저장 완충액에 저장된다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장된다.
일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 ≤ 1000 g/L 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 ≤ 1000 g/L, ≤ 900 g/L, ≤ 800 g/L, ≤ 750 g/L, ≤ 700 g/L, ≤ 600 g/L, ≤ 500 g/L, ≤ 400 g/L, ≤ 300 g/L, ≤ 250 g/L, ≤ 200 g/L, ≤ 100 g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 20 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 50 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 100 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 200 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 250 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 300 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 400 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 500 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 600 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 700 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 750 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 800 g/L 내지 약 1000 g/L, 또는 약 900 g/L 내지 약1000 g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 20 g/L 내지 약 900 g/L, 약 20 g/L 내지 약 800 g/L, 약 20 g/L 내지 약 750 g/L, 약 20 g/L 내지 약 700 g/L, 약 20 g/L 내지 약 600 g/L, 약 20 g/L 내지 약 500 g/L, 약 20 g/L 내지 약 400 g/L, 약 20 g/L 내지 약 300 g/L, 약 20 g/L 내지 약 250 g/L, 약 20 g/L 내지 약 200 g/L, 약 20 g/L 내지 약100 g/L, 약 20 g/L 내지 약 75 g/L, 또는 약 20 g/L 내지 약 50 g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 ≥20g/L 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 ≥20g/L, ≥50g/L, ≥75g/L, ≥100g/L, ≥200g/L, ≥250g/L, ≥300g/L, ≥400g/L, ≥500g/L, ≥600g/L, ≥700g/L, ≥750g/L, ≥800g/L, ≥900g/L, ≥1000g/L, ≥1200g/L, ≥1400g/L, ≥1500g/L, ≥1750g/L, 또는 ≥2000g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 20 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 50 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 100 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 200 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 250 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 300 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 400 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 500 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 600 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 700 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 750 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 800 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 900 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 1000 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 1250 g/L 내지 약 2000 g/L, 또는 약 1500 g/L 내지 약 2000 g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 20 g/L 내지 약 1750 g/L, 약 20 g/L 내지 약 1500 g/L, 약 20 g/L 내지 약 1250 g/L, 약 20 g/L 내지 약 1200 g/L, 또는 약 20 g/L 내지 약 1100 g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 초과한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 2배(2-배), 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 75배, 80배, 90배, 또는 100배 중 약 임의의 것 만큼 초과한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 2배 내지 100배, 5배 내지 100배, 10배 내지 100배, 20배 내지 100배, 25배 내지 100배, 30배 내지 100배, 40배 내지 100배, 50배 내지 100배, 60배 내지 100배, 70배 내지 100배, 75배 내지 100배, 80배 내지 100배, 또는 90배 내지 100배 만큼 초과한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 2배 내지 100배, 2배 내지 75×, 2배 내지 50×, 2배 내지 25배, 2배 내지 20배, 2배 내지 15배, 2배 내지 14배, 2배 내지 13배, 2배 내지 12배, 2배 내지 11배, 2배 내지 10배, 2배 내지 9배, 2배 내지 8배, 2배 내지 7배, 2배 내지 6배, 2배 내지 5배, 2배 내지 4배, 또는 2배 내지 3배 만큼 초과한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 산 세척액을 통과시키는 단계, g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH 및 약 1 M NaCl을 포함하는 단계; 및 h) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 혼합형 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 캡토(Capto)™ 어드히어(Adhere) 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액은 약 50 mM 내지 약 100 mM, 약 55 mM 내지 약 100 mM, 약 60 mM 내지 약 100 mM, 약 65 mM 내지 약 100 mM, 약 70 mM 내지 약 100 mM, 약 75 mM 내지 약 100 mM, 약 80 mM 내지 약 100 mM, 약 85 mM 내지 약 100 mM, 약 90 mM 내지 약 100 mM, 약 95 mM 내지 약 100 mM, 약 50 mM 내지 약 95 mM, 약 50 mM 내지 약 90 mM, 약 50 mM 내지 약 85 mM, 약 50 mM 내지 약 80 mM, 약 50 mM 내지 약 75 mM, 약 50 mM 내지 약 70 mM, 약 50 mM 내지 약 65 mM, 약 50 mM 내지 약 60 mM, 또는 약 50 mM 내지 약 55 mM의 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액은 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM 또는 100 mM 중 약 임의의 것의 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액은 약 85 mM의 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액은 약 20 mM 내지 약 80 mM, 약 30 mM 내지 약 80 mM, 약 40 mM 내지 약 80 mM, 약 50 mM 내지 약 80 mM, 약 60 mM 내지 약 80 mM, 약 70 mM 내지 약 80 mM, 약 20 mM 내지 약 70 mM, 약 20 mM 내지 약 60 mM, 약 20 mM 내지 약 50 mM, 약 20 mM 내지 약 40 mM, 또는 약 20 mM 내지 약 30 mM의 트리스를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액은 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM 또는 70 mM 중 약 임의의 것의 트리스를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액은 약 50 mM의 트리스를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액은 약 50 mM 트리스 및 85 mM NaOAc를 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액의 pH는 약 6.0 내지 약 10.0, 약 7.0 내지 약 10.0, 약 8.0 내지 약 10.0, 내지 약 9.0 내지 약 10.0, 약 9.0 내지 약 9.0, 약 6.0 내지 8.0, 또한 약 6.0 내지 약 7.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액의 pH는 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 또는 10.0 중 약 임의의 것이다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액의 pH는 약 8.0이다. . 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액은 약 pH 8.0에서 약 50 mM 트리스 및 85 mM NaOAc를 포함한다.
일부 구현예들에서, 약 3 내지 약 10, 약 3 내지 약 9, 약 3 내지 약 8, 약 3 내지 약 7, 약 3 내지 약 6, 약 3 내지 약 5, 약 3 내지 약 4, 약 4 내지 약 10, 약 5 내지 약 10, 약 6 내지 약 10, 약 7 내지 약 10, 약 8 내지 약 10, 약 9 내지 약 10, 약 3 내지 약 8, 약 4 내지 약 7, 또는 약 5 내지 약 6 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 평형 완충액은 상기 조성물을 로딩하기 전에 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피) 중 약 임의의 것의 평형 완충액은 상기 조성물을 로딩하기 전에 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 5 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 평형 완충액은 상기 조성물을 로딩하기 전에 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 물질은 충분한 양의 폴리펩티드가 분획에서 수집될 때까지 상기 조성물을 로딩한 후 평형 완충액으로 세척된다. 일부 구현예들에서, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피) 중 약 임의의 것의 평형 완충액은 상기 조성물을 로딩하기 전에 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 10 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 평형 완충액은 상기 조성물을 로딩한 후에 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다.
일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 50 내지 약 600 mM의 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 NaOAc를 25 mM 내지 600 mM, 30 mM 내지 600 mM, 40 mM 내지 600 mM, 50 mM 내지 600 mM, 75 mM 내지 600 mM, 100 mM 내지 600 mM, 125 mM 내지 600 mM, 150 mM 내지 600 mM, 175 mM 내지 600 mM, 200 mM 내지 600 mM, 225 mM 내지 600 mM, 250 mM 내지 600 mM, 275 mM 내지 600 mM, 300 mM 내지 600 mM, 325 mM 내지 600 mM, 350 mM 내지 600 mM, 375 mM 내지 600 mM, 400 mM 내지 600 mM, 450 mM 내지 600 mM, 500 mM 내지 600 mM, 550 mM 내지 600 mM, 25 mM 내지 550 mM, 25 mM 내지 500 mM, 25 mM 내지 475 mM, 25 mM 내지 450 mM, 25 mM 내지 425 mM, 25 mM 내지 400 mM, 25 mM 내지 375 mM, 25 mM 내지 550 mM, 25 mM 내지 325 mM, 25 mM 내지 300 mM, 25 mM 내지 275 mM, 25 mM 내지 250 mM, 25 mM 내지 225 mM, 25 mM 내지 200 mM, 25 mM 내지 175 mM, 25 mM 내지 150 mM, 25 mM 내지 125 mM, 25 mM 내지 100 mM, 25 mM 내지 90 mM, 25 mM 내지 80 mM, 25 mM 내지 70 mM, 25 mM 내지 60 mM, 25 mM 내지 50 mM, 25 mM 내지 40 mM, 또는 25 mM 내지 30 mM 중 약 임의의 농도 범위로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 또는 600 mM 중 약 임의의 것의 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 350 mM의 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 40 mM의 NaOAc를 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 2.0 내지 약 pH 7.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 2.0 내지 약 pH 6.5, 약 pH 2.0 내지 약 pH 6.0, 약 pH 2.0 내지 약 pH 5.5, 약 pH 2.0 내지 약 pH 5.0, 약 pH 2.0 내지 약 pH 4.5, 약 pH 2.0 내지 약 pH 4.0, 약 pH 2.0 내지 약 pH 3.5, 약 pH 2.0 내지 약 pH 3.0, 약 pH 2.0 내지 약 pH 2.5, 약 pH 2.5 내지 약 pH 7.0, 약 pH 3.0 내지 약 pH 7.0, 약 pH 3.5 내지 약 pH 7.0, 약 pH 4.0 내지 약 pH 7.0, 약 pH 4.5 내지 약 pH 7.0, 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0, 약 pH 5.5 내지 약 pH 7.0, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.0, 또는 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 pH 2.0, 약 pH 8.0, 약 pH 2.5, 약 pH 3.0, 약 pH 3.5, 약 pH 4.0, 약 pH 4.5, 약 pH 5.0, 약 pH 5.5, 약 pH 6.0, 약 pH 6.5, 또는 약 pH 7.0이다. 일부 구현예들에서, 재생 완충액의 pH는 약 4.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 pH 4.0에서 약 350 mM의 NaOAc이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 pH 5.0에서 약 350 mM의 NaOAc이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 pH 4.0에서 약 40 mM의 NaOAc이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 pH 4.0에서 약 40 mM의 NaOAc이다.
일부 구현예들에서, 약 3 내지 약 12, 약 3 내지 약 11, 약 3 내지 약 10, 약 3 내지 약 9, 약 3 내지 약 8, 약 3 내지 약 7, 약 3 내지 약 6, 약 3 내지 약 5, 약 3 내지 약 4, 약 4 내지 약 12, 약 5 내지 약 12, 약 6 내지 약 12, 약 7 내지 약 12, 약 8 내지 약 12, 약 9 내지 약 12, 약 10 내지 약 12, 약 11 내지 약 12, 약 5 내지 약 12, 약 5 내지 약 10, 약 8 내지 약 12, 또는 약 9 내지 약 11 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피) 중 약 임의의 것의 상기 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 7 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다.
일부 구현예들에서, 상기 산 세척액은 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액은 인산을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액은 NaOAc 및 인산을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액 중 NaOAc의 농도는 0.1 M 내지 약 0.5 M 미만 중 약 임의의 것을 초과한다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액 중 NaOAc의 농도는 약 0.100 M, 0.120 M, 0.130 M, 0.140 M, 0.150 M, 0.160 M, 0.161 M, 0.162 M, 0.163 M, 0.164 M, 0.167 M, 0.168 M, 0.169 M, 0.170 M, 0.180 M, 0.190 M, 0.200 M, 0.250 M, 0.300 M, 0.350 M, 0.400 M, 0.450 M, 또는 0.500 M 중 임의의 것이다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액 중 인산의 농도는 약 0.10 M, 0.15 M, 0.20 M, 0.25 M, 0.30 M, 0.35 M, 0.40 M, 0.45 M, 0.50 M, 0.55 M, 또는 0.60 M 중 임의의 것이다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액은 약 0.167 M NaOAc 및 약 0.3 M 인산을 포함한다.
일부 구현예들에서, 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 4, 약 1 내지 약 3, 약1 내지 약 2, 약 2 내지 약 5, 약 2 내지 약 4, 약 2 내지 약 3, 약 3 내지 약 5, 약 3 내지 약 4, 약 4 내지 약 5 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 산 세척액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 1, 2, 3, 4 또는 5 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피) 중 약 임의의 것의 산 세척액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 3 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 산 세척액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다.
일부 구현예들에서, 상기 살균 완충액은 약 0.1 N 내지 약 1 N의 NaOH를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N의 NaOH를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 M 내지 약 1.5 M의 NaCl를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 M의 NaCl 내지 약 2 M의 NaCl를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 살균 완충액은 약 1.0 M의 NaCl를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH 및 약 1 M NaCl를 포함한다. 일부 구현예들에서, 약 1 내지 약 10 물질 부피의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 4 물질 부피의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다.
일부 구현예들에서, 상기 저장 완충액은 약 0.05 N 내지 약 0.5 N의 NaOH를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 살균 완충액은 약 0.1 N의 NaOH를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 1 내지 5 물질 부피의 저장 완충액에 저장된다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 3 물질 부피의 저장 완충액에 저장된다.
일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 ≤ 1000 g/L 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 ≤ 1000 g/L, ≤ 900 g/L, ≤ 800 g/L, ≤ 750 g/L, ≤ 700 g/L, ≤ 600 g/L, ≤ 500 g/L, ≤ 400 g/L, ≤ 300 g/L, ≤ 250 g/L, ≤ 200 g/L, ≤ 100 g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 20 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 50 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 100 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 200 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 250 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 300 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 400 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 500 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 600 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 700 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 750 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 800 g/L 내지 약 1000 g/L, 또는 약 900 g/L 내지 약1000 g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 20 g/L 내지 약 900 g/L, 약 20 g/L 내지 약 800 g/L, 약 20 g/L 내지 약 750 g/L, 약 20 g/L 내지 약 700 g/L, 약 20 g/L 내지 약 600 g/L, 약 20 g/L 내지 약 500 g/L, 약 20 g/L 내지 약 400 g/L, 약 20 g/L 내지 약 300 g/L, 약 20 g/L 내지 약 250 g/L, 약 20 g/L 내지 약 200 g/L, 약 20 g/L 내지 약100 g/L, 약 20 g/L 내지 약 75 g/L, 또는 약 20 g/L 내지 약 50 g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 ≥20g/L 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 ≥20g/L, ≥50g/L, ≥75g/L, ≥100g/L, ≥200g/L, ≥250g/L, ≥300g/L, ≥400g/L, ≥500g/L, ≥600g/L, ≥700g/L, ≥750g/L, ≥800g/L, ≥900g/L, ≥1000g/L, ≥1200g/L, ≥1400g/L, ≥1500g/L, ≥1750g/L, 또는 ≥2000g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 20 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 50 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 100 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 200 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 250 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 300 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 400 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 500 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 600 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 700 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 750 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 800 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 900 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 1000 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 1250 g/L 내지 약 2000 g/L, 또는 약 1500 g/L 내지 약 2000 g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 20 g/L 내지 약 1750 g/L, 약 20 g/L 내지 약 1500 g/L, 약 20 g/L 내지 약 1250 g/L, 약 20 g/L 내지 약 1200 g/L, 또는 약 20 g/L 내지 약 1100 g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 초과한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 2배(2-배), 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 75배, 80배, 90배, 또는 100배 중 약 임의의 것 만큼 초과한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 2배 내지 100배, 5배 내지 100배, 10배 내지 100배, 20배 내지 100배, 25배 내지 100배, 30배 내지 100배, 40배 내지 100배, 50배 내지 100배, 60배 내지 100배, 70배 내지 100배, 75배 내지 100배, 80배 내지 100배, 또는 90배 내지 100배 만큼 초과한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 2배 내지 100배, 2배 내지 75×, 2배 내지 50×, 2배 내지 25배, 2배 내지 20배, 2배 내지 15배, 2배 내지 14배, 2배 내지 13배, 2배 내지 12배, 2배 내지 11배, 2배 내지 10배, 2배 내지 9배, 2배 내지 8배, 2배 내지 7배, 2배 내지 6배, 2배 내지 5배, 2배 내지 4배, 또는 2배 내지 3배 만큼 초과한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 제1 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 제2 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 제2 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계; h) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 산 세척액을 통과시키는 단계; i) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; i) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 혼합형 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 캡토(Capto)™ 어드히어(Adhere) 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액은 약 50 mM 내지 약 100 mM, 약 55 mM 내지 약 100 mM, 약 60 mM 내지 약 100 mM, 약 65 mM 내지 약 100 mM, 약 70 mM 내지 약 100 mM, 약 75 mM 내지 약 100 mM, 약 80 mM 내지 약 100 mM, 약 85 mM 내지 약 100 mM, 약 90 mM 내지 약 100 mM, 약 95 mM 내지 약 100 mM, 약 50 mM 내지 약 95 mM, 약 50 mM 내지 약 90 mM, 약 50 mM 내지 약 85 mM, 약 50 mM 내지 약 80 mM, 약 50 mM 내지 약 75 mM, 약 50 mM 내지 약 70 mM, 약 50 mM 내지 약 65 mM, 약 50 mM 내지 약 60 mM, 또는 약 50 mM 내지 약 55 mM의 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액은 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM 또는 100 mM 중 약 임의의 것의 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액은 약 85 mM의 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액은 약 20 mM 내지 약 80 mM, 약 30 mM 내지 약 80 mM, 약 40 mM 내지 약 80 mM, 약 50 mM 내지 약 80 mM, 약 60 mM 내지 약 80 mM, 약 70 mM 내지 약 80 mM, 약 20 mM 내지 약 70 mM, 약 20 mM 내지 약 60 mM, 약 20 mM 내지 약 50 mM, 약 20 mM 내지 약 40 mM, 또는 약 20 mM 내지 약 30 mM의 트리스를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액은 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM 또는 70 mM 중 약 임의의 것의 트리스를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액은 약 50 mM의 트리스를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액은 약 50 mM 트리스 및 85 mM NaOAc를 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액의 pH는 약 6.0 내지 약 10.0, 약 7.0 내지 약 10.0, 약 8.0 내지 약 10.0, 내지 약 9.0 내지 약 10.0, 약 9.0 내지 약 9.0, 약 6.0 내지 8.0, 또한 약 6.0 내지 약 7.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액의 pH는 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 또는 10.0 중 임의의 것이다. 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액의 pH는 약 8.0이다. . 일부 구현예들에서, 상기 평형 완충액은 약 pH 8.0에서 약 50 mM 트리스 및 85 mM NaOAc를 포함한다.
일부 구현예들에서, 약 3 내지 약 10, 약 3 내지 약 9, 약 3 내지 약 8, 약 3 내지 약 7, 약 3 내지 약 6, 약 3 내지 약 5, 약 3 내지 약 4, 약 4 내지 약 10, 약 5 내지 약 10, 약 6 내지 약 10, 약 7 내지 약 10, 약 8 내지 약 10, 약 9 내지 약 10, 약 3 내지 약 8, 약 4 내지 약 7, 또는 약 5 내지 약 6 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 평형 완충액은 상기 조성물을 로딩하기 전에 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피) 중 약 임의의 것의 평형 완충액은 상기 조성물을 로딩하기 전에 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 5 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 평형 완충액은 상기 조성물을 로딩하기 전에 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 물질은 충분한 양의 폴리펩티드가 분획에서 수집될 때까지 상기 조성물을 로딩한 후 평형 완충액으로 세척된다. 일부 구현예들에서, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피) 중 약 임의의 것의 평형 완충액은 상기 조성물을 로딩한 후에 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 10 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 평형 완충액은 상기 조성물을 로딩한 후에 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다.
일부 구현예들에서, 상기 제1 재생 완충액 및/또는 상기 제2 재생 완충액은 약 50 내지 약 600 mM NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 제1 재생 완충액 및/또는 상기 제2 재생 완충액은 NaOAc를 25 mM 내지 600 mM, 30 mM 내지 600 mM, 40 mM 내지 600 mM, 50 mM 내지 600 mM, 75 mM 내지 600 mM, 100 mM 내지 600 mM, 125 mM 내지 600 mM, 150 mM 내지 600 mM, 175 mM 내지 600 mM, 200 mM 내지 600 mM, 225 mM 내지 600 mM, 250 mM 내지 600 mM, 275 mM 내지 600 mM, 300 mM 내지 600 mM, 325 mM 내지 600 mM, 350 mM 내지 600 mM, 375 mM 내지 600 mM, 400 mM 내지 600 mM, 450 mM 내지 600 mM, 500 mM 내지 600 mM, 550 mM 내지 600 mM, 25 mM 내지 550 mM, 25 mM 내지 500 mM, 25 mM 내지 475 mM, 25 mM 내지 450 mM, 25 mM 내지 425 mM, 25 mM 내지 400 mM, 25 mM 내지 375 mM, 25 mM 내지 550 mM, 25 mM 내지 325 mM, 25 mM 내지 300 mM, 25 mM 내지 275 mM, 25 mM 내지 250 mM, 25 mM 내지 225 mM, 25 mM 내지 200 mM, 25 mM 내지 175 mM, 25 mM 내지 150 mM, 25 mM 내지 125 mM, 25 mM 내지 100 mM, 25 mM 내지 90 mM, 25 mM 내지 80 mM, 25 mM 내지 70 mM, 25 mM 내지 60 mM, 25 mM 내지 50 mM, 25 mM 내지 40 mM, 또는 25 mM 내지 30 mM 중 약 임의의 농도 범위로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 제1 재생 완충액은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 또는 600 mM 중 약 임의의 것의 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 350 mM의 NaOAc를 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 제1 재생 완충액 및/또는 상기 제2 재생 완충액의 pH는 약 pH 2.0 내지 약 pH 7.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 제1 재생 완충액 및/또는 상기 제2 재생 완충액의 pH는 약 pH 2.0 내지 약 pH 6.5, 약 pH 2.0 내지 약 pH 6.0, 약 pH 2.0 내지 약 pH 5.5, 약 pH 2.0 내지 약 pH 5.0, 약 pH 2.0 내지 약 pH 4.5, 약 pH 2.0 내지 약 pH 4.0, 약 pH 2.0 내지 약 pH 3.5, 약 pH 2.0 내지 약 pH 3.0, 약 pH 2.0 내지 약 pH 2.5, 약 pH 2.5 내지 약 pH 7.0, 약 pH 3.0 내지 약 pH 7.0, 약 pH 3.5 내지 약 pH 7.0, 약 pH 4.0 내지 약 pH 7.0, 약 pH 4.5 내지 약 pH 7.0, 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0, 약 pH 5.5 내지 약 pH 7.0, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.0, 또는 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 재생 완충액은 약 pH 2.0, 약 pH 8.0, 약 pH 2.5, 약 pH 3.0, 약 pH 3.5, 약 pH 4.0, 약 pH 4.5, 약 pH 5.0, 약 pH 5.5, 약 pH 6.0, 약 pH 6.5, 또는 약 pH 7.0이다.
일부 구현예들에서, 상기 제1 재생 완충액은 약 40 mM NaOAc 및 약 pH 4.0이고, 상기 제2 재생 완충액은 약 350 mM NaOAc 및 약 pH 4.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 제1 재생 완충액은 약 40 mM NaOAc 및 약 pH 5.0이고, 상기 제2 재생 완충액은 약 350 mM NaOAc 및 약 pH 5.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 제1 재생 완충액은 약 350 mM NaOAc 및 약 pH 4.0이고, 상기 제2 재생 완충액은 약 40 mM NaOAc 및 약 pH 4.0이다. 일부 구현예들에서, 상기 제1 재생 완충액은 약 350 mM NaOAc 및 약 pH 5.0이고, 상기 제2 재생 완충액은 약 40 mM NaOAc 및 약 pH 5.0이다.
일부 구현예들에서, 약 3 내지 약 12, 약 3 내지 약 11, 약 3 내지 약 10, 약 3 내지 약 9, 약 3 내지 약 8, 약 3 내지 약 7, 약 3 내지 약 6, 약 3 내지 약 5, 약 3 내지 약 4, 약 4 내지 약 12, 약 5 내지 약 12, 약 6 내지 약 12, 약 7 내지 약 12, 약 8 내지 약 12, 약 9 내지 약 12, 약 10 내지 약 12, 약 11 내지 약 12, 약 5 내지 약 12, 약 5 내지 약 10, 약 8 내지 약 12, 또는 약 9 내지 약 11 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 상기 제1 재생 완충액 및/또는 상기 제2 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12물질 부피(예컨대, 컬럼 부피) 중 약 임의의 상기 제1 재생 완충액/또는 상기 제2 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 10 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 제1 재생 완충액/또는 상기 제2 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다.
일부 구현예들에서, 상기 산 세척액은 NaOAc를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액은 인산을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액은 NaOAc 및 인산을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액 중 NaOAc의 농도는 0.1 M 내지 약 0.5 M 미만 중 약 임의의 것을 초과한다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액 중 NaOAc의 농도는 약 0.100 M, 0.120 M, 0.130 M, 0.140 M, 0.150 M, 0.160 M, 0.161 M, 0.162 M, 0.163 M, 0.164 M, 0.167 M, 0.168 M, 0.169 M, 0.170 M, 0.180 M, 0.190 M, 0.200 M, 0.250 M, 0.300 M, 0.350 M, 0.400 M, 0.450 M, 또는 0.500 M 중 임의의 것이다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액 중 인산의 농도는 약 0.10 M, 0.15 M, 0.20 M, 0.25 M, 0.30 M, 0.35 M, 0.40 M, 0.45 M, 0.50 M, 0.55 M, 또는 0.60 M 중 임의의 것이다. 일부 구현예들에서, 상기 산 세척액은 약 0.167 M NaOAc 및 약 0.3 M 인산을 포함한다.
일부 구현예들에서, 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 4, 약 1 내지 약 3, 약1 내지 약 2, 약 2 내지 약 5, 약 2 내지 약 4, 약 2 내지 약 3, 약 3 내지 약 5, 약 3 내지 약 4, 약 4 내지 약 5 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 산 세척액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 1, 2, 3, 4 또는 5 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피) 중 약 임의의 것의 산 세척액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 3 물질 부피(예컨대, 컬럼 부피)의 산 세척액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다.
일부 구현예들에서, 상기 살균 완충액은 약 0.1 N 내지 약 1 N의 NaOH를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N의 NaOH를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 M 내지 약 1.5 M의 NaCl를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 살균 완충액은 약 1.0 M의 NaCl를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH 및 약 1 M NaCl를 포함한다. 일부 구현예들에서, 약 1 내지 약 10 물질 부피의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 구현예들에서, 약 4 물질 부피의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과한다.
일부 구현예들에서, 상기 저장 완충액은 약 0.05 N 내지 약 0.5 N의 NaOH를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 살균 완충액은 약 0.1 N의 NaOH를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 1 내지 5 물질 부피의 저장 완충액에 저장된다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 3 물질 부피의 저장 완충액에 저장된다.
일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 ≤ 1000 g/L 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 ≤ 1000 g/L, ≤ 900 g/L, ≤ 800 g/L, ≤ 750 g/L, ≤ 700 g/L, ≤ 600 g/L, ≤ 500 g/L, ≤ 400 g/L, ≤ 300 g/L, ≤ 250 g/L, ≤ 200 g/L, ≤ 100 g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 20 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 50 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 100 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 200 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 250 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 300 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 400 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 500 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 600 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 700 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 750 g/L 내지 약 1000 g/L, 약 800 g/L 내지 약 1000 g/L, 또는 약 900 g/L 내지 약1000 g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 20 g/L 내지 약 900 g/L, 약 20 g/L 내지 약 800 g/L, 약 20 g/L 내지 약 750 g/L, 약 20 g/L 내지 약 700 g/L, 약 20 g/L 내지 약 600 g/L, 약 20 g/L 내지 약 500 g/L, 약 20 g/L 내지 약 400 g/L, 약 20 g/L 내지 약 300 g/L, 약 20 g/L 내지 약 250 g/L, 약 20 g/L 내지 약 200 g/L, 약 20 g/L 내지 약100 g/L, 약 20 g/L 내지 약 75 g/L, 또는 약 20 g/L 내지 약 50 g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 ≥20g/L 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 ≥20g/L, ≥50g/L, ≥75g/L, ≥100g/L, ≥200g/L, ≥250g/L, ≥300g/L, ≥400g/L, ≥500g/L, ≥600g/L, ≥700g/L, ≥750g/L, ≥800g/L, ≥900g/L, ≥1000g/L, ≥1200g/L, ≥1400g/L, ≥1500g/L, ≥1750g/L, 또는 ≥2000g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 20 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 50 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 100 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 200 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 250 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 300 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 400 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 500 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 600 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 700 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 750 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 800 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 900 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 1000 g/L 내지 약 2000 g/L, 약 1250 g/L 내지 약 2000 g/L, 또는 약 1500 g/L 내지 약 2000 g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 20 g/L 내지 약 1750 g/L, 약 20 g/L 내지 약 1500 g/L, 약 20 g/L 내지 약 1250 g/L, 약 20 g/L 내지 약 1200 g/L, 또는 약 20 g/L 내지 약 1100 g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 초과한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 2배(2-배), 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 75배, 80배, 90배, 또는 100배 중 약 임의의 것 만큼 초과한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 2배 내지 100배, 5배 내지 100배, 10배 내지 100배, 20배 내지 100배, 25배 내지 100배, 30배 내지 100배, 40배 내지 100배, 50배 내지 100배, 60배 내지 100배, 70배 내지 100배, 75배 내지 100배, 80배 내지 100배, 또는 90배 내지 100배 만큼 초과한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 2배 내지 100배, 2배 내지 75×, 2배 내지 50×, 2배 내지 25배, 2배 내지 20배, 2배 내지 15배, 2배 내지 14배, 2배 내지 13배, 2배 내지 12배, 2배 내지 11배, 2배 내지 10배, 2배 내지 9배, 2배 내지 8배, 2배 내지 7배, 2배 내지 6배, 2배 내지 5배, 2배 내지 4배, 또는 2배 내지 3배 만큼 초과한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.3의 약 350 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.3의 약 350 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 ≤ 1000 g/L, ≤ 900 g/L, ≤ 800 g/L, ≤ 750 g/L, ≤ 700 g/L, ≤ 600 g/L, ≤ 500 g/L, ≤ 400 g/L, ≤ 300 g/L, ≤ 250 g/L, ≤ 200 g/L, ≤ 100 g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.3의 약 350 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.3의 약 350 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 ≤ 1000 g/L, ≤ 900 g/L, ≤ 800 g/L, ≤ 750 g/L, ≤ 700 g/L, ≤ 600 g/L, ≤ 500 g/L, ≤ 400 g/L, ≤ 300 g/L, ≤ 250 g/L, ≤ 200 g/L, ≤ 100 g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.3의 약 350 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.3의 약 350 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 ≤ 1000 g/L, ≤ 900 g/L, ≤ 800 g/L, ≤ 750 g/L, ≤ 700 g/L, ≤ 600 g/L, ≤ 500 g/L, ≤ 400 g/L, ≤ 300 g/L, ≤ 250 g/L, ≤ 200 g/L, ≤ 100 g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥ 약 20 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.3의 약 350 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥ 약 20 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.3의 약 350 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 ≥20g/L, ≥50g/L, ≥70g/L, ≥100g/L, ≥200g/L, ≥250g/L, ≥300g/L, ≥400g/L, ≥500g/L, ≥600g/L, ≥700g/L, ≥750g/L, ≥800g/L, ≥900g/L, ≥1000g/L, ≥1200g/L, ≥1400g/L, ≥1500g/L, ≥1750g/L, 또는 ≥2000g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥ 약 20 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.3의 약 350 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥ 약 20 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.3의 약 350 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 ≥20g/L, ≥50g/L, ≥70g/L, ≥100g/L, ≥200g/L, ≥250g/L, ≥300g/L, ≥400g/L, ≥500g/L, ≥600g/L, ≥700g/L, ≥750g/L, ≥800g/L, ≥900g/L, ≥1000g/L, ≥1200g/L, ≥1400g/L, ≥1500g/L, ≥1750g/L, 또는 ≥2000g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥ 약 20 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.3의 약 350 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥ 약 20 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.3의 약 350 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 ≥20g/L, ≥50g/L, ≥70g/L, ≥100g/L, ≥200g/L, ≥250g/L, ≥300g/L, ≥400g/L, ≥500g/L, ≥600g/L, ≥700g/L, ≥750g/L, ≥800g/L, ≥900g/L, ≥1000g/L, ≥1200g/L, ≥1400g/L, ≥1500g/L, ≥1750g/L, 또는 ≥2000g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.3의 약 350 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.3의 약 350 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 2배 내지 100배 만큼 초과한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 약 10배 만큼 초과한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 양이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.3의 약 350 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 양이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.3의 약 350 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 2배 내지 100배 만큼 초과한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 약 10배 만큼 초과한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 음이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.3의 약 350 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 음이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.3의 약 350 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 2배 내지 100배 만큼 초과한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 약 10배 만큼 초과한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.0의 25 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.0의 약 25 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 ≤ 1000 g/L, ≤ 900 g/L, ≤ 800 g/L, ≤ 750 g/L, ≤ 700 g/L, ≤ 600 g/L, ≤ 500 g/L, ≤ 400 g/L, ≤ 300 g/L, ≤ 250 g/L, ≤ 200 g/L, ≤ 100 g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.0의 약 25 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.0의 약 25 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 ≤ 1000 g/L, ≤ 900 g/L, ≤ 800 g/L, ≤ 750 g/L, ≤ 700 g/L, ≤ 600 g/L, ≤ 500 g/L, ≤ 400 g/L, ≤ 300 g/L, ≤ 250 g/L, ≤ 200 g/L, ≤ 100 g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.0의 약 25 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.0의 약 25 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 ≤ 1000 g/L, ≤ 900 g/L, ≤ 800 g/L, ≤ 750 g/L, ≤ 700 g/L, ≤ 600 g/L, ≤ 500 g/L, ≤ 400 g/L, ≤ 300 g/L, ≤ 250 g/L, ≤ 200 g/L, ≤ 100 g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥ 약 20 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.0의 25 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥ 약 20 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.0의 약 25 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 ≥20g/L, ≥50g/L, ≥70g/L, ≥100g/L, ≥200g/L, ≥250g/L, ≥300g/L, ≥400g/L, ≥500g/L, ≥600g/L, ≥700g/L, ≥750g/L, ≥800g/L, ≥900g/L, ≥1000g/L, ≥1200g/L, ≥1400g/L, ≥1500g/L, ≥1750g/L, 또는 ≥2000g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥ 약 20 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.0의 약 25 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥ 약 20 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.0의 약 25 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 ≥20g/L, ≥50g/L, ≥70g/L, ≥100g/L, ≥200g/L, ≥250g/L, ≥300g/L, ≥400g/L, ≥500g/L, ≥600g/L, ≥700g/L, ≥750g/L, ≥800g/L, ≥900g/L, ≥1000g/L, ≥1200g/L, ≥1400g/L, ≥1500g/L, ≥1750g/L, 또는 ≥2000g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥ 약 20 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.0의 약 25 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥ 약 20 g/L인 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.0의 약 25 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 약 ≥20g/L, ≥50g/L, ≥70g/L, ≥100g/L, ≥200g/L, ≥250g/L, ≥300g/L, ≥400g/L, ≥500g/L, ≥600g/L, ≥700g/L, ≥750g/L, ≥800g/L, ≥900g/L, ≥1000g/L, ≥1200g/L, ≥1400g/L, ≥1500g/L, ≥1750g/L, 또는 ≥2000g/L 중 임의의 것의 크로마토그래피 물질이다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.0의 약 25 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.0의 약 25 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 2배 내지 100배 만큼 초과한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 약 10배 만큼 초과한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 양이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.0의 약 25 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 양이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.0의 약 25 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 2배 내지 100배 만큼 초과한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 약 10배 만큼 초과한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 음이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.0의 약 25 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은: a) 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 평형 완충액으로 평형화시키는 단계로서, 상기 평형 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는 단계; b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 음이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 초과하는 단계; c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계; d) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계; e) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 약 pH 8.0의 약 25 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함하는 단계; f) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 약 10 물질 부피의 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및 g) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 2배 내지 100배 만큼 초과한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물의 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량을 약 10배 만큼 초과한다.
본원에 기재된 방법들 중 임의의 것의 일부 구현예들에서, 상기 크로마토그래피 물질은 이온 교환 물질(예컨대, 양이온 교환 물질 또는 음이온 교환 물질)이다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 물질은 크로마토그래피 칼럼(예컨대, 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼 또는 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼) 내에 있다.
일부 구현예들에서, 상기 양이온 교환 물질은 음전하로 하전되고 고체상을 통과하는 수용액에서 양이온과 교환을 위한 유리 양이온을 갖는 상기 고체상이다. 본원에 기재된 방법들 중 임의의 것의 일부 구현예들에서, 상기 양이온 교환 물질은 막, 단일체 또는 수지일 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 양이온 교환 물질은 수지이다. 상기 양이온 교환 물질은 카르복실산 작용기 또는 술폰산 작용기, 예컨대, 제한없이 술포네이트, 카르복실산, 카르복시메틸 술폰산, 술포이소부틸, 술포에틸, 카르복실, 술포프로필, 술포닐, 술폭시에틸, 또는 오르토인산염을 포함한다. 상기 중 일부 구현예들에서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 수지이다. 상기 중 일부 구현예들에서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 막이다. 본 발명의 일부 구현예들에서, 상기 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 물질이 아니다. 일부 구현예들에서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 대규모 정제; 예컨대, 항체 또는 이의 단편과 같은 폴리펩티드의 제조 규모의 생산에서 사용된다.
본원에 기재된 방법들 중 임의의 것의 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 물질은 통상적인 크로마토그래피 물질 또는 대류 크로마토그래피 물질을 사용할 수 있다. 상기 통상적인 크로마토그래피 물질은 예를 들어, 살포성 물질(예컨대, 폴리(스티렌-디비닐벤젠)수지) 및 확산 물질(예컨대, 가교 결합된 아가로스 수지)을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 폴리(스티렌-디비닐벤젠)수지는 포로스(Poros)™ 수지일 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 가교 결합된 아가로스 수지는 설포프로필-세파로스® 패스트 플로우("SPSFF") 수지일 수 있다. 상기 대류 크로마토그래피 물질은 막(예컨대, 폴리에테르설폰) 또는 단일체 물질(예컨대, 가교 결합된 중합체)일 수 있다. 폴리에테르술폰 막은 무스탕일 수 있다. 가교 결합된 중합체 단일체 물질은 가교 결합된 폴리(글리시딜 메타크릴레이트-코-에틸렌 디메타크릴레이트)일 수 있다.
양이온 교환 물질의 예는 당해 분야에 공지되어 있고, 무스탕(Mustang)® S, 사르토바인드(Sartobind)® S, SO3 모노리스(Monolith), S 세라믹(Ceramic) 하이퍼(HyperD)™, 포로스(Poros)™ XS, 포로스™ HS50, 포로스™ HS20, SPSFF, SP-세파로오스(Sepharose)® XL(SPXL), CM 세파로오스® 패스트 플로우(Fast Flow), 캡도(Capto)™ S, 프락토젤(Fractogel)® Se HiCap, 프락토젤® SO3 또는 프락토젤® COO를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 방법들 중 임의의 것의 일부 구현예들에서, 상기 양이온 교환 물질은 포로스(Poros)™ HS50이다. 일부 구현예들에서, 포로스™ HS 수지는 포로스™ HS 50 μm 또는 포로스™ HS 20 μm 입자일 수 있다.
본 발명의 일부 구현예들에서, 상기 음이온 교환 물질은 양전하로 하전되고 고체상을 통과하는 수용액에서 음이온과 교환을 위한 유리 음이온을 갖는 상기 고체상이다. 본원에 기재된 방법들 중 임의의 것의 일부 구현예들에서, 상기 음이온 교환 물질은 막, 단일체 또는 수지일 수 있다. 한 구현예에서, 상기 음이온 교환 물질은 수지이다. 일부 구현예들에서, 상기 음이온 교환 물질은 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민 또는 4차 암모늄 이온 작용기, 폴리아민 작용기, 또는 디에틸아미노에틸 작용기를 포함한다. 상기 중 일부 구현예들에서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼이다. 상기 중 일부 구현예들에서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 막이다. 음이온 교환 물질의 예는 당해 분야에 공지되어 있고, 포로스™ HQ 50, 포로스™ PI 50, 포로스™ D, 무스탕® Q, Q 세파로오스® FF, 및 DEAE 세파로오스®를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 혼합형 이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 혼합형 크로마토그래피 물질은 하기의 기능성들 중 하나 이상을 수행할 수 있는 작용기를 포함한다: 음이온 교환, 양이온 교환, 수소 결합 및 소수성 상호 작용. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 혼합형 양이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 양이온 교환 혼합형 물질의 예는 캡토(Capto) MMC™, 캡토 MMC™ 임프레스(ImpRes), 누비아(Nuvia)™ c프라임(Prime)™, 및 토요펄(Toyopearl) MX Trp-650M을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 혼합형 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 음이온 교환 혼합형 물질의 예는 캡토 어드히어™ 및 캡토 어드히어™ 임프레스를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 다중 폴리펩티드 생성물을 정제하기 위해 사용된다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 다중 항체 생성물을 정제하기 위해 사용된다. 일부 구현예들에서, 세정 방법 후 캐리오버는 <0.25 mg/mL 총 단백질, <1 ppm IgG 단편, <1 ppm IgG 응집체, <1 ppm 침출된 단백질 A, <1 μg/mL CZE LIF, <1 ppm CHOP 및 <1 pg/mL CHO DNA 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피는 폴리펩티드의 정제에서 하나 이상의 다른 크로마토그래피 절차와 조합된다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피는 항체의 정제에서 하나 이상의 다른 크로마토그래피 절차와 조합된다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 대규모 정제; 예컨대, 항체 또는 이의 단편과 같은 폴리펩티드의 제조 규모의 생산에서 하나 이상의 다른 크로마토그래피 절차와 조합된다. 일부 구현예들에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 대규모 정제; 예컨대, 항체 또는 이의 단편과 같은 폴리펩티드의 제조 규모의 생산에서 하나 이상의 다른 크로마토그래피 절차와 조합된다. 일부 구현예들에서, 상기 하나 이상의 다른 크로마토그래피 절차는 상기 과부하 이온 교환 크로마토그래피 전에 실시한다. 일부 구현예들에서, 상기 하나 이상의 다른 크로마토그래피 절차는 상기 과부하 이온 교환 크로마토그래 후에 실시한다. 일부 구현예들에서, 하나 이상의 다른 크로마토그래피 절차는 상기 과부하 이온 교환 크로마토그래피 전에 실시하고, 하나 이상의 다른 크로마토그래피 절차는 상기 과부하 이온 교환 크로마토그래 후에 실시한다. 일부 구현예들에서, 상기 과부하 이온 교환 크로마토그래피는 혼합형 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 친화성 크로마토그래피, 및 크기 배제 크로마토그래피로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 다른 크로마토그래피 절차와 조합된다.
일부 구현예들에서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피는 폴리펩티드의 정제에서 하나 이상의 다른 크로마토그래피 절차와 조합된다. 일부 구현예들에서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피는 항체의 정제에서 하나 이상의 다른 크로마토그래피 절차와 조합된다. 일부 구현예들에서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 대규모 정제; 예컨대, 항체 또는 이의 단편과 같은 폴리펩티드의 제조 규모의 생산에서 하나 이상의 다른 크로마토그래피 절차와 조합된다. 일부 구현예들에서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 대규모 정제; 예컨대, 항체 또는 이의 단편과 같은 폴리펩티드의 제조 규모의 생산에서 하나 이상의 다른 크로마토그래피 절차와 조합된다. 일부 구현예들에서, 상기 하나 이상의 다른 크로마토그래피 절차는 상기 과부하 양이온 교환 크로마토그래피 전에 실시한다. 일부 구현예들에서, 상기 하나 이상의 다른 크로마토그래피 절차는 상기 과부하 양이온 교환 크로마토그래피 후에 실시한다. 일부 구현예들에서, 하나 이상의 다른 크로마토그래피 절차는 상기 과부하 양이온 교환 크로마토그래피 전에 실시하고, 하나 이상의 다른 크로마토그래피 절차는 상기 과부하 양이온 교환 크로마토그래 후에 실시한다. 일부 구현예들에서, 상기 과부하 양이온 교환 크로마토그래피는 혼합형 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 추가의 양이온 교환 크로마토그래피로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 크로마토그래피 절차와 조합된다.
단일클론 항체에 대한 2000 L 정제 공정의 예는 공급스트림을 생성하기 위해 상기 항체를 생성하는 CHO 세포를 회수하는 것을 포함한다. 상기 공급스트림을 결합 및 용출 모드에서 ≤ 30 g/L 수지의 부하 밀도로 단백질 A 친화성 크로마토그래피(예컨대, 맙셀렉트 슈어™)로 처리하고, 결합 및 용출 모드에서 ≤ 85 g/L 수지의 부하 밀도로 단백질 A 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피(예컨대, 포로스™ XS)로 처리하고, 상기 양이온 교환 용출액을 통과 모드에서 ≤ 100 g/L 수지의 부하 밀도로 혼합형 음이온 교환 크로마토그래피(예컨대, Q-세파로오스® FF)로 처리하며, 상기 혼합형 음이온 교환 분획을 한외여과/투석여과(예컨대, 펠리콘(Pellicon)® 3)로 처리하여 50 g/L의 최종 농도에서 상기 항체를 제형화한다.
단일클론 항체에 대한 2000 L 정제 공정의 다른 예는 공급스트림을 생성하기 위해 상기 항체를 생성하는 CHO 세포를 회수하는 것을 포함한다. 상기 공급스트림을 결합 및 용출 모드에서 ≤ 30 g/L 수지의 부하 밀도로 단백질 A 친화성 크로마토그래피(예컨대, 맙셀렉트 슈어™)로 처리하고, 결합 및 용출 모드에서 ≤ 41 g/L 수지의 부하 밀도로 단백질 A 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피(예컨대, 포로스™ HS)로 처리하고, 상기 양이온 교환 용출액을 통과 모드에서 ≤ 100 g/L 수지의 부하 밀도로 혼합형 음이온 교환 크로마토그래피(예컨대, Q-세파로오스® FF)로 처리하고, 상기 혼합형 음이온 교환 분획을 필터로 처리하여 1.2-2.6 kg/m2에서 바이러스(예컨대, 1:1 비레솔브(Viresolve)® 프로쉴드(ProShield)/비레솔브® 프로)를 제거하며, 공급스트림을 한외여과/투석여과로 처리하여 50 g/L의 최종 농도에서 상기 항체를 제형화한다.
단일클론 항체에 대한 12000 L 제조 규모의 정제 공정의 예는 공급스트림을 생성하기 위해 상기 항체를 생성하는 CHO 세포를 회수하는 것을 포함한다. 상기 공급스트림을 계면활성 바이러스 비활성화 단계(예컨대, 트리톤(Triton)-CG110)로 처리하고, 상기 공급스트림을 결합 및 용출 모드에서 ≤ 40 g/L 수지의 부하 밀도로 단백질 A 친화성 크로마토그래피(예컨대, 맙셀렉트 슈어™)로 처리하고, 과부하 모드에서 ≤ 1000 g/L 수지의 부하 밀도로 단백질 A 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피(예컨대, 포로스™ HS)로 처리하고, 상기 양이온 교환 용출액을 통과 모드에서 ≤ 350 g/L 수지의 부하 밀도로 혼합형 음이온 교환 크로마토그래피(예컨대, 캡토™ 어드히어)로 처리하며, 상기 혼합형 음이온 교환 분획을 한외여과/투석여과(예컨대, 펠리콘(Pellicon)® 3)로 처리하여 60 g/L의 최종 농도에서 상기 항체를 제형화한다.
단일클론 항체에 대한 12000 L 제조 규모의 정제 공정의 다른 예는 공급스트림을 생성하기 위해 상기 항체를 생성하는 CHO 세포를 회수하는 것을 포함한다. 상기 공급스트림을 결합 및 용출 모드에서 ≤ 35 g/L 수지의 부하 밀도로 단백질 A 친화성 크로마토그래피(예컨대, 맙셀렉트 슈어™)로 처리하고, 과부하 모드에서 ≤ 800 g/L 수지의 부하 밀도로 단백질 A 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피(예컨대, 포로스™ HS)로 처리하고, 상기 양이온 교환 용출액을 통과 모드에서 ≤ 250 g/L 수지의 부하 밀도로 혼합형 음이온 교환 크로마토그래피(예컨대, 캡토™ 어드히어)로 처리하고, 상기 혼합형 음이온 교환 분획을 필터로 처리하여 9-10 kg/m2에서 바이러스(예컨대, 1:1 비레솔브(Viresolve)® 프로쉴드(ProShield)/비레솔브® 프로)를 제거하며, 공급스트림을 한외여과/투석여과로 처리하여 100 g/L의 최종 농도에서 상기 항체를 제형화한다.
본 발명의 일부 양태들에서, 상기 과부하 양이온 교환 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피 물질과 조합하여 사용된다. 친화성 크로마토그래피 물질의 예는 단백질 A 및/또는 단백질 G로 유도체화된 크로마토그래피 물질을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 친화성 크로마토그래피 물질의 예는 프로셉(Prosep)®-VA, 프로셉®-VA 울트라 플러스(Ultra Plus), 단백질 A 세파로오스® 패스트 플로우, 토요펄(Toyopearl)® 단백질 A, 맙셀렉트, 맙셀렉트 슈어™ 및 맙셀렉트 슈어™ LX, 단백질 L , FcXL, 단백질 XL, 카파 크로마토그래피, 및 카파XL 크로마토그래피를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 상기 중 일부 구현예들에서, 상기 친화성 크로마토그래피 물질은 친화성 크로마토그래피 컬럼이다. 상기 중 일부 구현예들에서, 상기 친화성 크로마토그래피 물질은 친화성 크로마토그래피 막이다.
본 발명의 일부 양태들에서, 상기 과부하 양이온 교환 크로마토그래피(예컨대, 과부하 양이온 교환 크로마트그래피)는 혼합형 크로마토그래피 물질과 조합하여 사용된다. 본원에 기재된 방법들 중 임의의 것의 일부 구현예들에서, 상기 크로마토그래피 물질은 하기의 기능성들 중 하나 이상을 수행할 수 있는 작용기를 포함한다: 음이온 교환, 양이온 교환, 수소 결합 및 소수성 상호 작용. 일부 구현예들에서, 상기 혼합형 물질은 음이온 교환 및 소수성 상호 작용을 수행할 수 있는 작용기를 포함한다. 상기 혼합형 물질은 리간드로서 N-벤질-N-메틸 에탄올 아민, 4-메르캅토-에틸-피리딘, 헥실아민 또는 페닐프로필아민을 함유하거나, 또는 가교 결합된 폴리알릴아민을 함유할 수 있다. 혼합형 물질의 예는 캡토™ 어드히어 수지, QMA 수지, 캡토™ MMC 수지, MEP 하이퍼셀(HyperCel)™ 수지, HEA 하이퍼셀™ 수지, PPA 하이퍼셀™ 수지, 크로마솝(ChromaSorb)™ 막 또는 사르토바인드(Sartobind)® STIC를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 혼합형 물질은 캡토(Capto)™ 어드히어(Adhere) 수지이다. 상기 중 일부 구현예들에서, 상기 혼합형 물질은 혼합형 크로마토그래피 컬럼이다. 상기 중 일부 구현예들에서, 상기 혼합형 물질은 혼합형 크로마토그래피 막이다.
본 발명의 일부 양태들에서, 상기 과부하 양이온 교환 크로마토그래피(예컨대, 과부하 양이온 교환 크로마트그래피)는 음이온 교환 크로마토그래피 물질과 조합하여 사용된다. 일부 구현예들에서, 상기 음이온 교환 물질은 양전하로 하전되고 고체상을 통과하는 수용액에서 음이온과 교환을 위한 유리 음이온을 갖는 상기 고체상이다. 본원에 기재된 방법들 중 임의의 것의 일부 구현예들에서, 상기 음이온 교환 물질은 막, 단일체 또는 수지일 수 있다. 한 구현예에서, 상기 음이온 교환 물질은 수지이다. 일부 구현예들에서, 상기 음이온 교환 물질은 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민 또는 4차 암모늄 이온 작용기, 폴리아민 작용기, 또는 디에틸아미노에틸 작용기를 포함한다. 상기 중 일부 구현예들에서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼이다. 상기 중 일부 구현예들에서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 막이다.
본 발명의 일부 양태들에서, 상기 과부하 양이온 교환 크로마토그래피(예컨대, 과부하 양이온 교환 크로마트그래피)는 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질과 조합하여 사용된다. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 소수성에 따라 생체 분자를 분리하는 액체 크로마토그래피 기술이다. HIC 크로마토그래피 물질의 예는 토요펄(Toyopearl)® 헥실 650, 토요펄® 부필 650, 토요펄® 페닐 650, 토요펄® 에테르 650, 소스(Source), 리소스(Resource), 세파로오스® 하이-트랩(Hi-Trap), 옥틸(Octyl) 세파로오스®, 페닐 세파로오스®를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 상기 중 일부 구현예들에서, 상기 HIC 크로마토그래피 물질은 HIC 크로마토그래피 컬럼이다. 상기 중 일부 구현예들에서, 상기 HIC 크로마토그래피 물질은 HIC 크로마토그래피 막이다.
본 발명의 일부 양태들에서, 상기 과부하 양이온 교환 크로마토그래피(예컨대, 과부하 양이온 교환 크로마트그래피)는 수산화인회석(HA) 크로마토그래피 물질과 조합하여 사용된다. 수산화인회석 크로마토그래피 물질의 예는 HA 울트라겔(Ultrogel)® 및 CHT 수산화인회석을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 상기 중 일부 구현예들에서, 상기 HA 크로마토그래피 물질은 HA 크로마토그래피 컬럼이다. 상기 중 일부 구현예들에서, 상기 HA 크로마토그래피 물질은 HA 크로마토그래피 막이다.
일부 구현예들에서, 상기 과부하 이온 교환 크로마토그래피는 컬럼 내에서 실시된다(즉, 컬럼 크로마토그래피). 일부 구현예들에서, 상기 하나 이상의 다른 크로마토그래피 절차는 컬럼 내에서 실시된다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 알칼리 안정 크로마토그래피 물질; 예컨대, 알칼리 안정 크로마토그래피 컬럼을 세척하거나 재생하는 방법을 제공한다.
본원에 기재된 방법들 중 임의의 것의 일부 구현예들에서, 유속은 50 물질 부피/시간, 40 물질 부피/시간, 또는 30 물질 부피/시간 중 약 임의의 것 미만이다. 상기 유속은 5 물질 부피/시간 내지 50 물질 부피/시간, 10 물질 부피/시간 내지 40 물질 부피/시간, 또는 18 물질 부피/시간 내지 36 물질 부피/시간 중 약 임의의 것일 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 유속은 9 물질 부피/시간, 18 물질 부피/시간, 25 물질 부피/시간, 30 물질 부피/시간, 36 물질 부피/시간, 또는 40 물질 부피/시간 중 약 임의의 것이다.
일부 구현예들에서, 상기 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 칼럼 내에 있다. 본원에 기재된 방법들 중 임의의 것의 일부 구현예들에서, 상기 유속은 50 컬럼 부피(CV)/hr, 40 CV/hr, 또는 30 CV/hr, 20 CV/hr, 또는 15 CV/hr 중 약 임의의 것 미만이다. 상기 유속은 약 5 CV/hr 내지 50 CV/hr, 10 CV/hr 내지 40 CV/hr, 또는 15 CV/hr 내지 20 CV/hr 중 약 임의의 것일 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 유속은 10 CV/hr, 15 CV/hr, 20 CV/hr, 25 CV/hr, 30 CV/hr, 또는 40 CV/hr 중 약 임의의 것이다. 본원에 기재된 방법들 중 임의의 것의 일부 구현예들에서, 상기 유속은 100 cm/hr, 75 cm/hr, 또는 50 cm/hr 중 약 임의의 것 미만이다. 일부 구현예들에서, 상기 유속은 25 cm/hr 내지 150 cm/hr, 25 cm/hr 내지 100 cm/hr, 50 cm/hr 내지 100 cm/hr, 또는 65 cm/hr 내지 85 cm/hr 중 약 임의의 것이다.
층(bed)의 높이는 사용된 크로마토그래피 물질의 높이이다. 본원에 기재된 방법 중 임의의 것의 일부 구현예들에서, 상기 층의 높이는 3 cm, 10 cm 또는 15 cm 중 약 임의의 것보다 크다. 상기 층의 높이는 3 cm 내지 35 cm, 5 cm 내지 15 cm, 3 cm 내지 10 cm, 또는 5 cm 내지 8 cm 중 약 임의의 것일 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 층의 높이는 3 cm, 5 cm, 10 cm, 15 cm, 20 cm, 25 cm, 또는 30 cm 중 약 임의의 것이다. 일부 구현예들에서, 층의 높이는 부하 내 폴리펩티드 또는 오염물의 양에 기초하여 결정된다. 일부 구현예들에서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 대규모 정제; 예컨대, 항체 또는 이의 단편과 같은 폴리펩티드의 제조 규모의 생산에서 사용되는 컬럼 내에 있다. 일부 구현예들에서, 상기 제조 규모의 크로마토그래피 물질은 10 cm, 15 cm, 20 cm, 25 cm 또는 30 cm의 약 임의의 것의 층 높이를 갖는다.
층의 직경은 사용된 크로마토그래피 물질의 직경이다. 본원에 기재된 방법 중 임의의 것의 일부 구현예들에서, 상기 층의 직경은 80 cm, 100 cm 또는 120 cm 중 약 임의의 것보다 크다. 일부 구현예들에서, 상기 층의 직경은 50 cm, 60 cm, 70 cm, 80 cm, 90 cm, 100 cm, 110 cm, 120 cm, 130 cm, 140 cm, 150 cm, 160 cm, 170 cm, 180 cm, 190 또는 200 cm 중 약 임의의 것이다. 일부 구현예들에서, 층의 직경은 부하 내 폴리펩티드 또는 오염물의 양을 기준으로 결정된다. 일부 구현예들에서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 대규모 정제; 예컨대, 항체 또는 이의 단편과 같은 폴리펩티드의 제조 규모의 생산에서 사용되는 컬럼 내에 있다. 일부 구현예들에서, 상기 제조 규모의 크로마토그래피 물질은 50 cm, 60 cm, 70 cm, 80 cm, 90 cm, 100 cm, 110 cm, 120 cm, 130 cm, 140 cm, 150 cm, 160 cm, 170 cm, 180 cm, 190, or 200 cm 중 약 임의의 것의 층 높이를 가졌다.
일부 구현예들에서, 상기 크로마토그래피는 약 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 75 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL, 1 L, 2 L, 3 L, 4 L, 5 L, 6 L, 7 L, 8 L, 9 L, 10 L, 25 L, 50 L, 100 L, 200 L, 300 L, 400 L, 500 L, 600 L, 700 L, 800 L, 900 L 또는 1000 L 초과의 부피를 갖는 컬럼 또는 용기 내에 있다. 일부 구현예들에서, 상기 용기는 14 cm의 층 높이 및 80 cm의 층 부피, 예컨대 대규모 단백질 A 컬럼을 갖는다. 일부 구현예들에서, 상기 용기는 19 cm의 층 높이 및 100 cm의 층 부피, 예컨대 대규모 음이온 교환 컬럼을 갖는다. 일부 구현예들에서, 상기 용기는 30 cm의 층 높이 및 120 cm의 층 부피, 예컨대 대규모 이온 교환 컬럼을 갖는다.
본원에서 사용된 부하는 크로마토그래피 물질 상에 로딩된 조성물이다. 일부 구현예들에서, 상기 부하는 상이한 폴리펩티드를 단리하기 위해 이전에 사용되었던 크로마토그래피 물질 상에 로딩된 폴리펩티드이다. 로딩 완충액은 관심 생성물을 포함하는 조성물을 크로마토그래피 물질 상에 로딩하는데 사용되는 완충액이다. 상기 크로마토그래피 물질은 정제될 조성물을 로딩하기 전에 평형 완충액으로 평형화될 수 있다. 일부 예들에서, 세척 완충액은 상기 조성물을 크로마토그래피 물질 상에 로딩한 후 및 고체상으로부터 관심 폴리펩티드의 용출 전에 사용된다. 일부 구현예들에서, 상기 세척 완충액은 부하 완충액과 동일하다. 일부 구현예들에서, 관심 생성물의 일부, 예컨대 폴리펩티드는 상기 세척 완충액에 의해 크로마토그래피 물질로부터 제거될 수 있다(예컨대, 과부하 모드).
본원에서 사용된 용출은 상기 크로마토그래피 물질로부터의 상기 생성물, 예컨대 폴리펩티드의 제거이다. 본 발명의 일부 구현예들에서, 상기 용출은 마지막 세척 절차 이후에 단백질이 로딩되지 않았던 크로마토그래피 물질에 용출 절차가 적용되는 "모의 용출"이다. 본 발명의 일부 구현예들에서, 상기 모의 용출 절차는 본원에 기재된 세척 절차 중 임의의 하나에 따라 크로마토그래피 물질에 적용된다. 일부 구현예들에서, 상기 모의 용출은 실제 생성 실행 중에 캐리오버 물질(예컨대, 오염 물질)이 있을 수 있는지 여부를 결정하기 위한 노력에서 상기 물질에 적용될 단백질을 용출하는 데 사용될 용출을 모방한다. 모의 용출은 상기 세척 절차의 효율성을 평가하는 수단으로서 사용할 수 있다.
용출 완충액은 크로마토그래피 물질로부터 폴리펩티드 또는 다른 관심 생성물을 용출하는데 사용되는 완충액이다. 많은 경우에서, 용출 완충액은 부하 완충액과 상이한 물리적 특성을 갖는다. 예를 들어, 상기 용출 완충액은 부하 완충액과 상이한 전도성 또는 부하 완충액과 상이한 pH를 가질 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 용출 완충액은 부하 완충액보다 낮은 전도성을 갖는다. 일부 구현예들에서, 상기 용출 완충액은 부하 완충액보다 높은 전도성을 갖는다. 일부 구현예들에서, 상기 용출 완충액은 부하 완충액보다 낮은 pH를 갖는다. 일부 구현예들에서, 상기 용출 완충액은 부하 완충액보다 높은 pH를 갖는다. 일부 구현예들에서, 상기 용출 완충액은 부하 완충액과 상이한 전도성 및 상이한 pH를 갖는다. 상기 용출 완충액은 더 높거나 낮은 전도성 및 더 높거나 낮은 pH의 임의의 조합을 가질 수 있다.
전도성은 수용액이 두 전극 사이에 전류를 전도하는 능력을 지칭한다. 용액에서, 상기 전류는 이온 수송에 의해 흐른다. 따라서, 상기 수용액 내에 존재하는 이온의 양이 증가함에 따라 상기 용액은 더 높은 전도성을 갖게 된다. 전도성 측정의 기본 단위는 지멘스(또는 mho), mho(mS/cm)이며, 오리온(Orion) 전도성 계량기의 다양한 모델과 같은 전도성 계량기를 사용하여 측정할 수 있다. 전해질 전도성은 전류를 운반하기 위한 용액 내 이온의 용량이기 때문에, 용액의 전도성은 용액 내의 이온 농도를 변경함으로써 변경될 수 있다. 예를 들어, 상기 용액 내에서 완충제의 농도 및/또는 염(예컨대, 염화나트륨, 아세트산나트륨 또는 염화칼륨)의 농도는 원하는 전도성을 달성하기 위해 변경될 수 있다. 바람직하게는, 다양한 완충액의 염 농도는 원하는 전도성을 달성하도록 변경된다.
오염 물질
본 발명은 폴리펩티드의 대규모 정제; 예컨대, 항체 또는 이의 단편과 같은 폴리펩티드의 제조 규모의 생산에서 사용하기 위한 크로마토그래피 물질의 재사용을 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 다중 폴리펩티드 생성물에 대한 크로마토그래피 물질의 다중 용도를 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 사용하여, 제1 항체를 크로마토그래피 물질 상에서 산업적 규모로 정제할 수 있고, 이후 본원에 기재된 크로마토그래피 물질을 세척/재생하는 방법, 이어서 제2 항체 생성물을 산업적 규모로 정제할 수 있다. 일부 구현예들에서, 본 발명의 방법은 상기 크로마토그래피 물질을 사용하여 정제되었던 이전 생성물의 "잔여물"을 감소시키는 데 사용된다. 일부 구현예들에서, 상기 잔여 오염물질은 전체 항체, IgG 단편, Fc, Fc 단편, 및 항체 응집체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 방법들 중 임의의 것의 일부 구현예들에서, 상기 적어도 하나의 오염 물질은 CHO와 같은 숙주 세포 물질; 침출된 단백질 A; 핵산; 원하는 폴리펩티드의 변이체, 단편, 응집체 또는 유도체; 다른 폴리펩티드; 내독소; 바이러스 오염 물질; 세포 배양 배지 성분, 카르복시펩티다아제 B, 겐타마이신 등을 포함한다. 일부 예들에서, 상기 오염 물질은 예를 들어, 제한없이 세균 세포, 예컨대 대장균 세포, 곤충 세포, 원핵 세포, 진핵 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 조류 세포, 진균 세포로부터의 숙주 세포 단백질(HCP)일 수 있다.
침출된 단백질 A는 결합된 고체상으로부터 분리되거나 세척된 단백질 A이다. 예를 들어, 침출된 단백질 A는 단백질 A 크로마토그래피 물질로부터 침출될 수 있다. 단백질 A의 양은, 예를 들어 ELISA에 의해 측정될 수 있다. 본원에 기재된 방법들 중 임의의 것의 일부 구현예들에서, 침출된 단백질 A의 양은 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 중 약 임의의 것을 초과한 만큼 감소된다. 침출된 단백질 A의 양은 10% 내지 99%, 30% 내지 95%, 30% 내지 99%, 50% 내지 95%, 50% 내지 99%, 75% 내지 99%, 또는 85% 내지 99% 중 약 임의의 것 만큼 감소될 수 있다. 일부 구현예들에서, 침출된 단백질 A의 양은 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 약 임의의 것 만큼 감소된다. 일부 구현예들에서, 상기 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 중 침출된 단백질 A의 양을 정제 단계(들) 이전의 조성물 중 침출된 단백질 A의 양과 비교함으로써 결정된다.
숙주 세포 단백질(HCP)은 폴리펩티드가 생성되었던 세포로부터의 단백질이다. 예를 들어, CHOP는 숙주 세포로부터의 단백질, 즉 중국 햄스터 난소 단백질이다. CHOP의 양은 효소 결합 면역흡착 분석법("ELISA") 또는 메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery, "MSO")에 의해 측정될 수 있다. 본원에 기재된 방법들 중 임의의 것의 일부 구현예들에서, 용출액 중 HCP(예컨대, CHOP)의 양은 모의 용출액에서 최소이다. 일부 구현예들에서, 모의 용출로부터의 용출액 내에서 숙주 세포 단백질의 수준은 세척 방법이 있거나 없는 경우 또는 세척 방법 전과 후에 비교된다.
숙주 세포 DNA와 같은 DNA를 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며 실시예 섹션에 기재된다. 본원에 기재된 방법들 중 임의의 것의 일부 구현예들에서, DNA의 양은 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 중 약 임의의 것을 초과한 만큼 감소된다. DNA의 양은 10% 내지 99%, 30% 내지 95%, 30% 내지 99%, 50% 내지 95%, 50% 내지 99%, 75% 내지 99%, 또는 85% 내지 99% 중 약 임의의 것 만큼 감소될 수 있다. DNA의 양은 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 중 약 임의의 것 만큼 감소될 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 중 DNA의 양을 정제 단계(들) 이전의 조성물 중 DNA의 양과 비교함으로써 결정된다.
단편 폴리펩티드는 저분자량(LMW) 단백질일 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 단편화된 폴리펩티드는 관심 폴리펩티드의 단편이다. LMW 단백질의 예는 Fab(단편 항원 결합), Fc(단편, 결정화 가능) 영역 또는 둘 다의 조합 또는 관심 항체의 임의의 무작위 단편화된 부분을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 단편화된 단백질(예컨대, LMW 단백질)을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며 실시예 섹션에 기재된다. 본원에 기재된 방법들 중 임의의 것의 일부 구현예들에서, LMW 단백질의 양은 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 약 임의의 것을 초과한 만큼 감소된다. LMW 단백질의 양은 10% 내지 99%, 30% 내지 95%, 30% 내지 99%, 50% 내지 95%, 50% 내지 99%, 75% 내지 99%, 또는 85% 내지 99% 중 약 임의의 것 만큼 감소될 수 있다. LMW 단백질의 양은 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 약 임의의 것 만큼 감소될 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 중 단편화된 단백질(예컨대, LMW 단백질)의 양을 정제 단계(들) 이전의 조성물 중 단편화된 단백질(예컨대, LMW 단백질)의 양과 비교함으로써 결정된다.
응집된 폴리펩티드는 고분자량(HMW) 단백질일 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 응집된 폴리펩티드는 관심 폴리펩티드의 다량체이다. 상기 HMW 단백질은 이량체, 최대 8x 단량체, 또는 관심 폴리펩티드의 더 큰 것일 수 있다. 응집된 단백질(예컨대, HMW 단백질)을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예들에서, 모의 용출에서 HMW의 수준은 최소이고; 예컨대 약 5 ppm 미만, 약 4 ppm 미만, 약 3 ppm 미만, 약 2 ppm 미만 또는 약 1 ppm 미만이다. 본원에 기재된 방법들 중 임의의 것의 일부 구현예들에서, 응집된 단백질의 양은 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 약 임의의 것을 초과한 만큼 감소된다. 응집된 단백질의 양은 10% 내지 99%, 30% 내지 95%, 30% 내지 99%, 50% 내지 95%, 50% 내지 99%, 75% 내지 99%, 또는 85% 내지 99% 중 약 임의의 것 만큼 감소될 수 있다. 응집된 단백질의 양은 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 약 임의의 것 만큼 감소될 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 중 응집된 단백질(예컨대, HMW 단백질)의 양을 정제 단계(들) 이전의 조성물 중 응집된 단백질(예컨대, HMW 단백질)의 양과 비교함으로써 결정된다.
세포 배양 배지 성분은 세포 배양 배지 내에 존재하는 성분을 지칭한다. 세포 배양 배지는 세포를 회수할 때의 세포 배양 배지일 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 세포 배양 배지 성분은 겐타마이신이다. 겐타마이신의 양은 ELISA로 측정할 수 있다. 본원에 기재된 방법들 중 임의의 것의 일부 구현예들에서, 세포 배양 배지 성분의 양은 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 중 약 임의의 것을 초과한 만큼 감소된다. 세포 배양 배지 성분의 양은 10% 내지 99%, 30% 내지 95%, 30% 내지 99%, 50% 내지 95%, 50% 내지 99%, 75% 내지 99%, 또는 85% 내지 99% 중 약 임의의 것 만큼 감소될 수 있다. 일부 구현예들에서, 세포 배양 배지 성분의 양은 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 중 약 임의의 것 만큼 감소된다. 일부 구현예들에서, 상기 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 중 세포 배양 배지 성분의 양을 정제 단계(들) 이전의 조성물 중 세포 배양 배지 성분의 양과 비교함으로써 결정된다.
오염 물질을 검출하는 방법
본 발명은 재사용 가능한 크로마토그래피 물질의 세척 효과를 평가하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 폴리펩티드가 이전에 로딩되었고 적어도 한 번 용출되었던 크로마토그래피 물질은 상기 기재된 본 발명의 방법들 중 하나로 세척된다. 그런 다음, 세척 절차 후 상기 물질 상에 그 어떤 추가 폴리펩티드도 로드되지 않았던 물질에 대해 모의 용출을 실행한다. 상기 모의 용출은 이전에 상기 물질에 로딩되었던 폴리펩티드에 사용된 용출 절차를 따를 수 있거나, 또는 용출 절차는 세척 절차 후에 정제될 폴리펩티드에 대한 용출 절차를 따를 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 모의 용출 전에 상기 물질에 모의 로딩이 실행된다. 모의 로딩은 상기 폴리펩티드가 상기 로딩에 포함되지 않는다는 점을 제외하고 상기 물질에 폴리펩티드를 로딩하기 위해 동일한 절차를 사용한다. 일부 구현예들에서, 상기 모의 용출로부터의 용출액은 하나 이상의 분획으로 수집된다. 일부 구현예들에서, 상기 모의 용출의 용출액은 단일 분획으로 수집된다. 일부 구현예들에서, 상기 용출액 또는 상기 용출액의 샘플은 크로마토그래피 물질, IgG 단편, 침출된 단백질 A, CHOP 및 CHO DNA의 이전 로딩으로부터의 잔여 폴리펩티드를 포함하는 오염 물질에 대해 분석된다.
폴리펩티드 정량화
단일클론 항체(mAb)와 같은 폴리펩티드의 농도는 UV 가시광선 분광광도계(8453 모델 G1103A; 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies); 미국 캘리포니아 산타 클라라 소재) 또는 나노드롭(NanoDrop)™ 1000 모델 Nd-1000(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 미국 매사추세츠주 월섬 소재)를 사용하여 280 및 320 nm에서의 흡광도를 통해 결정할 수 있다. 재사용 가능한 크로마토그래피 물질 상에 이전에 로딩된 폴리펩티드 또는 본 발명의 방법에 의해 세척된 물질 상에 로딩된 폴리펩티드 이외의 종(즉, 불순물)은 농도가 너무 낮아 UV 흡광도에 주목할 만한 영향을 미치지 않을 수 있다. 필요에 따라, 샘플은 0.1~1.0 흡광도 단위 범위의 적절한 비간섭 희석제로 희석할 수 있다. 샘플 제조 및 UV 측정을 이중으로 실시하고 평균값을 기록한다. MAb 흡수 계수는 1.42 내지 1.645/mg·ml·cm 범위일 수 있다.
총 단백질은 모세관 영역 전기영동/레이저 유도 형광 검출 분석에 의해 결정될 수 있다.
IgG 검출
원형 인간 IgG 및 인간 IgG 단편은 원형 인간 IgG 특이성 또는 IgG 단편 특이적 ELISA를 사용하여 검출할 수 있다. 인간 Fc는 인간 Fc 특이적 ELISA를 사용하여 검출할 수 있다.
IgG 응집체
IgG 응집체는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 검출할 수 있다. IgG 응집체는 일반적으로 원형 IgG보다 크다.
CHO 숙주 세포 단백질(CHOP) 정량화
ELISA는 CHOP라고 하는 CHO 숙주 세포 단백질의 수준을 정량화하는 데 사용할 수 있다. 항 CHOP 항체는 미세역가 플레이트 웰 상에 고정된다. CHOP, 표준 및 대조군을 함유하는 샘플의 희석액을 웰에서 배양한 다음, 서양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP)와 접합된 항 CHOP 항체와 함께 배양한다. HRP 효소 활성은 o-페닐렌디아민으로 검출할 수 있으며 상기 CHOP는 미세역가 플레이트 판독기에서 490 nm에서의 흡광도를 판독하여 정량화된다. 샌드위치 ELISA의 원리에 따라, 퍼옥시다아제의 농도는 CHOP 농도에 해당한다. 상기 ELISA의 분석 범위는 일반적으로 분석 내 변동성이 <10%인 5-320 ng/ml이다. CHOP 값은 ng/ml 단위로 보고될 수 있다. 대안적으로, CHOP 값은 폴리펩티드 농도로 나누어질 수 있고 결과는 PPM(백만분율; 예컨대 CHOP의 ng/폴리펩티드의 mg)으로 보고될 수 있다. CHOP ELISA는 샘플의 총 CHOP 수준을 정량화하는 데 사용할 수 있지만, 개별 단백질의 농도는 정량화하지 않는다.
CHO DNA 정량화
생성물 샘플의 CHO DNA는 실시간 PCR(타크만(TaqMan) PCR)을 사용하여 정량화할 수 있다. 샘플 및 대조군의 DNA는 먼저 키아겐(Qiagen)의 바이러스 바이오로봇(Virus Biorobot) 키트를 사용하여 추출할 수 있다. 추출된 샘플, 대조군 및 표준 DNA는 ABI의 서열 검출 시스템을 갖춘 96웰 플레이트에서 PCR 프라이머 및 프로브를 사용하여 타크만 실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 거친다. 상기 프라이머는 크리세툴루스 그리세우스( Cricetulus griseus ) 유전체에서 반복적인 DNA 서열의 110개 염기쌍 분절로 정의된다. 상기 프로브는 5' 말단에 형광 리포터 염료 및 3' 말단에 소광제 염료로 표시된다. 상기 프로브가 손상되지 않은 경우, 상기 리포터의 방출 스펙트럼은 상기 소광제에 의해 억제된다. 중합효소의 5' 뉴클레아제 활성은 상기 프로브를 가수분해하고 상기 보고를 발표하여 형광 방출을 증가시킨다. 서열 검출기는 DNA 증폭 동안 지속적으로 측정된 형광 방출의 증가에 정비례하여 증폭된 생성물을 정량화한다. DNA가 역치(CT)를 넘어 증폭되었던 주기 수는 표준 곡선에 대해 계산된다. 1 pg/mL-10,000 pg/mL 범위의 표준 곡선이 생성될 수 있으며, 이는 샘플의 DNA를 정량화하는 데 사용된다.
침출된 단백질 A 정량화
단백질 A 풀에서 침출된 단백질 A의 수준은 샌드위치 단백질 A ELISA로 결정할 수 있다. 닭 항포도상구균 단백질 A 항체는 미세역가 플레이트 웰에 고정된다. 샘플 처리 절차는 샌드위치 ELISA에서 샘플을 실행하기 전에 전처리 단계로 마이크로웨이브 보조 가열을 사용하여 샘플 희석 및 단백질 A/IgG 복합체의 해리를 포함할 수 있다. 단백질 A는, 샘플 내에 존재하는 경우, 코팅된 항체에 결합할 수 있다. 결합된 단백질 A는 서양고추냉이 퍼옥시다아제 접합된 항 단백질 항체를 사용하여 검출된다. 서양고추냉이 퍼옥시다아제 효소 활성은 비색 신호를 생성하는 2성분 TMB 기질 용액으로 정량화된다.
폴리펩티드
본 발명의 방법은 다중 폴리펩티드의 정제에 사용되는 크로마토그래피 물질을 세척하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 크로마토그래피 물질은 항체 또는 이의 단편과 같은 폴리펩티드의 대규모; 예컨대, 제조 규모의 생산에서 사용된다. 일부 구현예들에서, 크로마토그래피 물질은 제1 항체와 같은 제1 폴리펩티드의 정제에 사용되며, 이어서 상기 물질은 본 발명의 방법에 의해 세척된 다음, 상기 크로마토그래피 물질은 제2 폴리펩티드, 예컨대 제2 항체를 정제하는데 사용될 수 있다. 일부 양태들에서, 세척은 제2 정제된 폴리펩티드를 포함하는 제제에 상기 제1 폴리펩티드가 본질적으로 없도록 하는 데 효과적이다. 일부 구현예들에서, 상기 제2 정제된 폴리펩티드(예컨대, 제2 항체)를 포함하는 제제는 1 ppm 미만의 제1 폴리펩티드(예컨대, 제1 항체)를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 제2 정제된 폴리펩티드는 상기 제1 폴리펩티드의 1 ppm, 2 ppm, 3 ppm, 4 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm 또는 100 ppm 중 어느 하나의 미만을 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 방법은 치료용 폴리펩티드를 정제하는데 사용되는 크로마토그래피 물질을 재사용하는 데 사용된다. 일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는 길항제이다. 일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는 작용제이다. 일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는 항체이다. 일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는 태그된 에피토프이다. 일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 보유한다. 일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는 길항제이다. 일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는 보체 의존성 세포독성을 개시한다. 일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는 항체 또는 면역부착소이다.
일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드, 상기 제1 폴리펩티드 및/또는 상기 제2 폴리펩티드는 5,000 달톤, 10,000 달톤, 15,000 달톤, 25,000 달톤, 50,000 달톤, 75,000 달톤, 100,000 달톤, 125,000 달톤, 또는 150,000 달톤 중 약 임의의 것을 초과한 분자량을 갖는다. 상기 폴리펩티드는 50,000 달톤 내지 200,000 달톤 또는 100,000 달톤 내지 200,000 달톤 중 약 임의의 것의 분자량을 갖는다. 대안적으로, 본원에서 사용하기 위한 폴리펩티드는 약 120,000 달톤 또는 약 25,000 달톤의 분자량을 가질 수 있다.
pI는 등전점이며 특정 분자 또는 상기 분자의 표면이 순 전하를 운반하지 않는 pH이다. 본원에 기재된 방법들 중 임의의 것의 일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드, 예컨대 상기 제1 폴리펩티드 및/또는 상기 제2 폴리펩티드의 pI는 약 6 내지 10, 7 내지 9, 또는 8 내지 9 중 약 임의의 것일 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는 6, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 또는 10 중 약 임의의 것의 pI를 갖는다.
본원에 기재된 방법에 의해 세척된 재사용 가능한 크로마토그래피 물질을 사용하여 정제될 폴리펩티드는 일반적으로 재조합 기술을 사용하여 생성된다. 재조합 단백질을 생성하는 방법은 예컨대, 구체적으로 본원에 원용된 미국 특허 제5,534,615호 및 제4,816,567호에 기재되어 있다. 일부 구현예들에서, 관심 단백질은 CHO 세포에서 생성된다(예컨대, WO 94/11026을 참조). 재조합 기술을 사용할 때, 상기 폴리펩티드는 세포내에서 생산되거나, 원형질막주위 공간에서 생성되거나, 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다.
본원에 기재된 방법에 의해 세척된 재사용 가능한 크로마토그래피 물질을 사용하여 정제될 폴리펩티드는 배양 배지 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 상기 폴리펩티드의 발현에 사용되는 세포는 동결-해동 순환, 초음파 처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제와 같은 다양한 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴될 수 있다. 폴리펩티드가 세포내에서 생산되면, 제1 단계로서, 미립자 조직파편(숙주 세포 또는 용해된 단편)이 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)은 대장균의 주변세포질 공간으로 분비되는 폴리펩티드를 단리하는 절차를 기재한다. 간략하게는, 세포 덩어리를 아세트산 나트륨(pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)의 존재하에 약 30분에 걸쳐서 해동시킨다. 세포 파편은 원심 분리로 제거할 수 있다. 폴리펩티드가 배지 내로 분비되는 경우, 이런 발현 시스템으로부터 상층액은 일반적으로 먼저, 상업적으로 입수 가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 단위를 이용하여 농축된다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제는 단백질 분해를 억제하기 위한 전술한 단계들 중 임의의 것에 포함될 수 있고, 항생제는 우발적인 오염물질의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
본원에 기재된 방법에 의해 세척된 재사용가능한 크로마토그래피 물질을 사용하여 정제될 수 있는 폴리펩티드의 예는 면역글로불린, 면역부착소, 항체, 효소, 호르몬, 융합 단백질, Fc 함유 단백질, 면역접합체, 사이토카인 및 인터류킨을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 폴리펩티드의 예는 포유류 단백질들, 예컨대, 예를 들어 레닌; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 포함한 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자들, 예컨대 VIIIC 인자, IX 인자, 조직 인자, 및 폰 빌레브란트 인자; 항응고 인자들, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성인자, 예컨대 우로키나아제 또는 인간 소변 또는 조직 유형 플라스미노겐 활성인자(t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나아제; RANTES(활성화 시에 조절된 정상적으로 T 세포 발현 및 분비된); 인간 대식세포 염증성 단백질(MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러리안 억제 물질; 릴랙신 A-사슬; 릴랙신 B-사슬; 프로릴랙신; 마우스 성선자극호르몬 관련 펩티드; 효소; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마아제; DN 분해효소; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원(CTLA), 예컨대 CTLA-4; 억제 호르몬; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자(VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스성 인자; 신경영양 인자, 예컨대 골 유래 신경영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6(NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-b; 혈소판 유래 성장 인자(PDGF); 섬유모세포 성장 인자, 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자(EGF); 전환 성장 인자(TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5를 포함한 TGF-베타; 인슐린 유사 성장 인자-I 및 -II(IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-I), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBPs); 사이토카인; CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 뼈 유도성 인자; 면역독소; 융합 폴리펩티드, 즉 2개 이상의 이종 폴리펩티드 또는 이의 단편에 포함되고 재조합 핵산에 의해 부호화되는 폴리펩티드; Fc 함유 폴리펩티드, 예를 들어 제2 폴리펩티드에 융합된 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질; 면역접합체; 뼈 형성 단백질(BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 집락 자극 인자(CSFs), 예컨대 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터류킨(ILs), 예컨대 IL-1 내지 IL-10; 초과산화물 디스무타아제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예컨대 예를 들어, AIDS 외피의 부분; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련 항원, 예컨대 Ca125(난소 암 항원) 또는 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 면역부착소; 및 상기 열거된 단백질들 중 임의의 것의 단편 및/또는 변이체들 뿐만 아니라, 예를 들어 상기 열거된 단백질 중 임의의 것을 포함한 단백질에 결합하는 항체 단편을 포함하는 항체들을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
항체
본원에 기재된 방법들 중 임의의 것의 일부 구현예들에서, 본원에 기재된 방법에 의해 세척된 재사용 가능한 크로마토그래피 물질을 사용하여 정제될 수 있는 폴리펩티드, 예컨대 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드 또는 임의의 후속 폴리티이드는 항체이다.
항체에 대한 분자 표적은 CD 단백질 및 하기와 같은 이의 리간드를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: (i) CD3, CD4, CD8, CD19, CD11a, CD20, CD22, CD34, CD40, CD79α(CD79a) 및 CD79β(CD79b); (ii) ErbB 수용체 군의 구성요소, 예컨대 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; (iii) 세포 접착 분자, 예컨대 이의 알파 또는 베타 하위단위(예컨대, 항 CD11a, 항 CD18 또는 항 CD11b 항체)를 포함한 LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 αv/β3 인테그린; (iv) VEGF와 같은 성장 인자; IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만(OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C, BR3, c-met, 조직 인자, β7 등; 및 (v) 미국 특허 제7,521,541호에 기재된 것과 같은 세포 표면 및 막관통 종양 관련 항원(TAA).
다른 예시적인 항체는 항 CD20 항체, 항 CD40 항체, 항 HER2 항체, 항 IL6 항체, 항 IgE 항체, 항 IL13 항체, 항 Flu A 항체, 항 TIGIT 항체, 항 PD-L1 항체, 항 VEGF-A 항체, 항 VEGF-A/ANG2 항체, 항 CD79b 항체, 항 ST2 항체, 항인자 D 항체, 항인자 IX 항체, 항인자 X 항체, 항 a베타 항체, 항 타우 항체, 항 CEA 항체, 항 CEA/CD3 항체, 항 CD20/CD3 항체, 항 FcRH5/CD3 항체, 항 Her2/CD3 항체, 항 FGFR1/KLB 항체, FAP-4-1 BBL 융합 단백질, FAP-IL2v 융합 단백질, 항에스트로겐 수용체 항체, 항프로게스테론 수용체 항체, 항 p53 항체, 항EGFR 항체, 항카텝신 D 항체, 항 Bcl-2항체,항 E-카드헤린 항체,항 CA125 항체, 항 CA15-3 항체, 항 CA19-9 항체,항 c-erbB-2 항체, 항 P-당단백질 항체, 항 CEA 항체, 항망막모세포 단백질 항체, 항 ras 종양단백질 항체, 항 루이스 X 항체, 항 Ki-67 항체, 항 PCNA 항체, 항 CD3 항체, 항 CD4 항체, 항 CD5 항체, 항 CD7 항체, 항 CD8 항체, 항 Cd9/p24 항체, 항 CD10 항체, 항 CD11a 항체, 항 CD11c항체, 항 CD13 항체, 항 CD14항체, 항 CD15항체, 항 CD19 항체, 항 CD22 항체, 항 CD23 항체, 항 CD30 항체, 항 CD31 항체, 항 CD33 항체, 항 CD34 항체, 항 CD35 항체, 항 CD38 항체, 항 CD41 항체, 항 LCA/CD45 항체, 항 CD45RO 항체, 항 CD45RA 항체, 항 CD39 항체, 항 CD100 항체, 항 CD95/Fas 항체, 항 CD99 항체, 항 CD106 항체, 항 유비퀴틴 항체, 항 CD71 항체, 항 c-myc 항체, 항 사이토케라틴 항체, 항 비멘틴 항체, 항 HPV 단백질 항체, 항 카파 경쇄 항체, 항 람다 경쇄 항체, 항 멜라노솜 항체, 항 전립선 특이적 항원 항체, 항 S-100 항체, 항 타우 항원 항체, 항 피브린 항체, 항 케라틴 항체 및 항 Tn-항원 항체로부터 선택된 것들을 제한없이 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 항체는 오크렐리주맙, 퍼투주맙, 트라스투주맙, 토실리주맙, 파리시맙, 폴라투주맙, 간테네루맙, 시비사타맙, 크레네주맙, 모수네투주맙, 티라골루맙, 베바시주맙, 리툭시맙, 아테졸리주맙, 오비누투주맙, 람팔리주맙, 레브리키주맙, 오말리주맙 라니비주맙, 에미시주맙, 셀리크렐루맙, 프라시네주맙, RO6874281, 및 RO7122290으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다중클론 항체
일부 구현예들에서, 상기 항체는 다중클론 항체이다. 다중클론 항체들은 바람직하게는 관련 항원 및 보조제의 다중 피하(sc) 또는 복강 내(ip) 주사에 의해 동물에서 발생한다. 이는 2작용성 또는 유도체화 작용제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르(시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드(리신 잔기를 통해), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR(여기서, R 및 R1은 상이한 알킬 기임)를 이용하여 면역화될 종에서 면역원성인 폴리펩티드, 예컨대 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 콩 트립신 저해제에 유관한 항원을 접합하는 데 유용할 수 있다.
동물은, 예컨대 100 μg 또는 5 μg의 폴리펩티드 또는 접합체(각각, 토끼 또는 마우스의 경우)를 3 부피의 프로인드 완전 보조제와 조합하고 용액을 복수 부위에서 피내 주사함으로써, 항원, 면역원성 접합체, 또는 유도체에 대항하여 면역화된다. 1개월 후 상기 동물들은 다수의 부위에서 피하 주사에 의해 프로인트 완전 보조제 내 펩티드 또는 접합체의 최초 양의 1/5 내지 1/10로 강화(boost)된다. 7 내지 14일 후 상기 동물들을 채혈하고 혈청을 항체 역가에 대하여 검정한다. 동물들은 역가가 정체 상태를 유지할 때까지 강화된다. 일부 구현예들에서, 상기 동물은 동일한 항원의 접합체로 강화되지만, 상이한 폴리펩티드에 및/또는 상이한 가교결합 시약을 통해 접합된다. 접합체들은 또한 폴리펩티드 융합으로서 재조합 세포 배양에서 제조할 수 있다. 또한, 응집제, 예컨대 명반은 면역 반응을 증진시키기 위해 적합하게 사용된다.
단일클론 항체
일부 구현예들에서, 본 발명의 방법에 의해 세척된 재사용 가능한 크로마토그래피 물질 상에서 정제된 항체는 단일클론 항체이다. 단일클론 항체는 실질적으로 동종 항체 군으로부터 수득된다. 즉, 상기 군을 포함하는 개별 항체는 예컨대, 단일클론 항체의 생성 중에 발생하는 가능한 변이체(상기 변이체는 일반적으로 미량으로 존재함)를 제외하고는 동일하고 및/또는 동일한 에피토프에 결합한다. 따라서, 수식어 “단일클론”은 구별된 또는 다중클론 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특징을 나타낸다.
예를 들어, 단일클론 항체는 Kohler et al., Nature 256:495 (1975)에 의해 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다(미국 특허 제4,816,567호).
상기 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터는 면역화에 이용된 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 또는 생성할 수 있는 림프구를 이끌어 내기 위해 본원에 기재된 바와 같이 면역화된다. 대안적으로, 림프구는 시험관내 면역화될 수 있다. 그런 다음, 림프구는 하이브리도마 세포를 형성하기 위해, 적합한 융합 작용제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 골수종 세포주와 융합된다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).
이렇게 제조된 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 분주 및 성장한다. 예를 들어, 상기 모 골수종 세포가 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 전달효소(HGPRT 또는 HPRT)를 결여하면, 하이브리도마에 대한 배양 배지는 전형적으로, 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT 배지)을 포함할 것인데, 이들 물질은 HGPRT 결여 세포의 성장을 예방한다.
일부 구현예들에서, 상기 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체 생성 세포에 의한 항체의 안정된 높은 수준 생산을 뒷받침하고, 배지, 예컨대 HAT 배지에 민감한 것이다. 무엇보다도, 일부 구현예들에서, 모 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대, 미국 캘리포니아 주 샌디에고 소재의 살크 인스티튜트 세포 분배 센터(Salk Institute Cell Distribution Center)로부터 입수 가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 세포주, 및 미국 메릴랜드주 록빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수 가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 또한 인간 단일클론 항체의 생성에 대해 기재되었다(Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 항원에 대해 지향된 단일클론 항체의 생성에 대해 분석된다. 일부 구현예들에서, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역침강 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사선면역검정(RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 결정될 수 있다.
단일클론 항체의 결합 친화도는, 예를 들어 Munson et al., Anal. Biochem. 107:220 (1980)의 스케쳐드(Scatchard) 분석에 의해 결정될 수 있다.
원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론은 제한 희석 절차에 의해 하위클로닝되고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 상기 목적으로 적합한 배양 배지는 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 상기 하이브리도마 세포는 동물 내에서 복수(ascite) 종양으로서 생체 내에서 성장할 수 있다.
하위클론에 의해 분비된 단일클론 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 절차, 예컨대 예를 들어, 폴리펩티드 A-세파로오스, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기이동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수 유체 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
단일클론 항체를 부호화하는 DNA는 쉽게 단리되고(예컨대, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 부호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 종래의 절차를 사용하여 서열분석될 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 공급원으로서 작용한다. 일단 단리되면, 상기 DNA는 발현 벡터 내로 위치할 수 있고, 그런 다음 그렇지 않으면 면역글로불린 폴리펩티드를 생성하지 않는 대장균 세포, 시미안 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염되어, 재조합 숙주 세포에서 원하는 단일클론 항체를 합성한다. 상기 항체를 부호화하는 DNA의 박테리아 내 재조합 발현에 관한 검토 논문은 Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262 (1993) and Pl
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ckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)를 포함한다.
추가의 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)에 기재된 기술을 이용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)은 파지 라이브러리를 사용하여 각각 뮤린 및 인간 항체의 분리를 설명한다. 후속 간행물은 사슬 셔플링(Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992))에 의한 고친화성(nM 범위) 인간 항체의 생성 뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 구성하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합을 기재한다(Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). 따라서, 상기 기술은 단일클론 항체의 분리를 위한 전통적인 단일클론 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행 가능한 대안이다.
DNA는 또한, 예를 들어 동종 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 부호화 서열을 대체함으로써(미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)) 또는 비면역글로불린 폴리펩티드에 대한 부호화 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 부호화 서열에 공유 결합함으로써 변형될 수 있다.
전형적으로, 상기 비면역글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인에 대해 치환되거나, 또는 항체의 하나의 항원 결합 부위의 가변 도메인에 대해 치환되어 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원 결합 부위 및 상이한 항원에 특이성을 갖는 다른 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성한다.
본원에 기재된 방법들 중 임의의 것의 일부 구현예들에서, 상기 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM이다. 일부 구현예들에서, 상기 항체는 IgG 단일클론 항체이다.
인간화 항체
일부 구현예들에서, 상기 항체는 인간화 항체이다. 비인간 항체를 인간화하는 방법이 당업계에 기재되어 있다. 일부 구현예들에서, 인간화 항체는 비인간인 공급원으로부터 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입된다. 상기 비인간 아미노산 잔기는 “이입” 잔기로서 종종 지칭되는데, 이들은 전형적으로 “이입” 가변 도메인으로부터 수득된다. 인간화는 본질적으로 인간 항체의 상응하는 서열을 초가변 영역 서열로 치환함으로써 Winter 및 동료(Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988))의 방법에 따라서 실시될 수 있다. 이에 따라, 상기 “인간화” 항체는 원형 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적은 부분이 비인간 종으로부터 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체(미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체 내에서 유사한 부위로부터 잔기에 의해 치환되는 인간 항체이다.
인간화 항체를 만드는 데 이용되는 인간 가변 도메인(경쇄 및 중쇄 둘 모두)의 선택은 항원성을 감소시키는 데 매우 중요하다. 소위 “최고 적합” 방법에 따라서, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 선별검사된다. 이후, 설치류의 것과 가장 가까운 인간 서열은 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 영역(FR)으로서 받아들여진다(Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987)). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 이용한다. 동일한 프레임워크가 몇 개의 상이한 인간화 항체에 사용될 수 있다(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)).
항체가 항원에 대한 높은 친화성 및 다른 우호적인 생물학적 성질을 유지하면서 인간화되는 것이 또한 중요하다. 상기 목적을 달성하기 위해, 상기 방법의 일부 구현예들에서, 인간화 항체는 부모 서열, 그리고 부모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모형을 이용한 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석의 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 입수 가능하고 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태 구조를 예시하고 전시하는 컴퓨터 프로그램이 입수 가능하다. 상기 전시의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 예상 역할의 분석, 즉 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용체 및 이입 서열로부터 선택되고 조합되어, 원하는 항체 특징, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화성이 달성될 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 직접적으로 및 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 미치는데 관여한다.
인간 항체
일부 구현예들에서, 항체는 인간 항체이다. 인간화의 대안으로서 인간 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 면역화 시에 내인성 면역글로불린 생성의 부재에서 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생성할 수 있는 유전자도입 동물(예컨대, 마우스)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역(JH) 유전자의 동형접합성 결실은 내인성 항체 생성의 완전한 억제를 유발하는 것으로 설명되었다. 상기 생식계열 돌연변이체 마우스 내에 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 공격 시에 인간 항체의 생성을 유발할 것이다. 예컨대, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993); 및 미국 특허 제 5,591,669호; 제5,589,369호; 및 제5,545,807호를 참조한다.
대안적으로, 파지 디스플레이 기술(McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990))을 사용하여 면역되지 않은 공여자의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관내에서 인간 항체 및 항체 단편을 생성할 수 있다. 상기 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자는 M13 또는 fd와 같은 사상 박테리오파지의 주요 또는 보조 코트 폴리펩티드 유전자로 프레임 내 클로닝되고 파지 입자의 표면에 기능적 항체 단편으로 표시된다. 실모양 입자는 파지 유전체의 단일 가닥 DNA 복제를 포함하기 때문에, 항체의 기능적 특성에 기초한 선택은 또한 이러한 특성을 나타내는 항체를 부호화하는 유전자의 선택을 유발한다. 따라서, 상기 파지는 B 세포의 일부 특성을 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 형식으로 실시될 수 있고; 이의 검토를 위해, 예컨대 Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)를 참조한다. V 유전자 분절의 여러 공급원은 파지 디스플레이에 사용할 수 있다. Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)은 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 다양한 일련의 옥사졸론 항체를 분리하였다. 면역되지 않은 인간 공여자로부터 V 유전자의 레퍼토리를 구성할 수 있고 다양한 일련의 항원(자가 항원 포함)에 대한 항체를 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), or Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)에서 기재한 기술에 따라 본질적으로 분리할 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,565,332호 및 제5,573,905호를 참조한다.
인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다(미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호를 참조).
항체 단편
일부 구현예들에서, 상기 항체는 항체 단편이다. 항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 상기 단편은 원형 항체의 단백질분해 소화를 통해 유래되었다(예컨대, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) 및 Brennan et al., Science 229:81 (1985)를 참조). 하지만, 상기 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 대장균으로부터 직접적으로 회수될 수 있고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성한다(Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편의 생성을 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 다른 구현예들에서, 선택된 항체는 단일 사슬 Fv 단편(scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 제5,571,894호; 및 미국 특허 제5,587,458호를 참조한다. 항체 단편은 또한, 예를 들어 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같이 “선형 항체”일 수 있다. 상기 선형 항체는 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
일부 구현예들에서, 본원에 기재된 항체의 단편이 제공된다. 일부 구현예들에서, 상기 항체 단편은 항원 결합 단편이다. 일부 구현예들에서, 상기 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab’)2 단편, scFv, 디-scFv, 비-scFv, 탠덤(디, 트리)-scFv, Fv, sdAb, 3작용성 항체, BiTE, 디아바디 또는 트리아바디로 이루어진 군에서 선택된다.
이중특이적 항체
일부 구현예들에서, 상기 항체는 이중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이중특이적 항체는 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 대안적으로, 이중특이적 항체의 결합 팔은 백혈구 상의 유발 분자, 예컨대 T 세포 수용체 분자(예컨대, CD2 또는 CD3) 또는 FcγRI(예컨대, CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)와 같은 IgG(FcγR)에 대한 Fc 수용체에 결합하는 팔과 조합하여 세포 방어 메커니즘을 세포에 집중시킨다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예컨대, F(ab')2 이중특이적 항체)로서 제조될 수 있다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법들은 당해 분야에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 생성은 두 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현에 기반하며, 상기 두 사슬은 상이한 특이성을 갖는다(Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 배열 때문에, 상기 하이브리도마(쿼드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생성하며, 이들 중 오직 하나만 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 보통 친화성 크로마토그래피 단계에 의하여 실시되는, 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생성물 산출량이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829, 및 Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)에 개시되어 있다.
상이한 접근법에 따르면, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인들(항체-항원 결합 부위)은 면역글로불린 불변 도메인 서열들에 융합된다. 일부 구현예들에서, 상기 융합은 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 갖고, 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 융합들 중 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)을 갖는다. 상기 면역글로불린 중쇄 융합 및, 원하는 경우, 상기 면역글로불린 경쇄를 부호화하는 DNA는 별개의 발현 벡터 내로 삽입되고, 적합한 숙주 유기체에 공동 형질감염된다. 이는 구성에 사용된 3개의 폴리펩티드 사슬의 불균등 비가 최적의 수율을 제공하는 경우 구현예들에서 상기 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정함에 있어 큰 가요성을 제공한다. 하지만, 균등 비에서 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현이 고수율을 산출하는 경우, 또는 상기 비가 특별한 유의성이 없는 경우, 한 발현 벡터에서 2개 또는 3개 모두의 폴리펩티드 사슬에 대한 부호화 서열을 삽입하는 것이 가능하다.
상기 접근법의 일부 구현예들에서, 상기 이중특이적 항체들은 하나의 팔에 제1 결합 특이성을 가진 하이브리드 면역글로불린 중쇄 및 다른 팔에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제2 결합 특이성을 제공)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 단지 1/2 내의 면역글로불린 경쇄의 존재가 분리의 용이한 방법을 제공하므로, 상기 비대칭 구조는 원치않는 면역글로불린 사슬 조합으로부터의 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 상기 접근법은 WO 94/04690에 개시된다. 이중특이적 항제의 생성에 관한 추가적인 세부 사항은, 예를 들어 Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)을 참조한다.
미국 특허 제5,731,168호에 기재된 다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 계면은 재조합 세포 배양으로부터 회수된 이종이량체의 비율을 최대화하도록 조작될 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄는 더욱 큰 측쇄(예컨대, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 측쇄(들)에 동일한 또는 유사한 크기의 보상성 “공동”은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄(예컨대, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 제2 항체 분자의 계면에서 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종 생성물에 비하여 이종이량체 수율을 증가시키기 위한 기전을 제공한다.
이중특이적 항체들은 가교 결합된 또는 "이종 접합체” 항체를 포함한다. 예를 들어, 상기 이종 접합체 내 항체들 중 하나가 아비딘에 커플링되고, 다른 항체가 비오틴에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체들은 원치 않는 세포들에 대하여 면역계 세포들을 표적하기 위해(미국 특허 제4,676,980호), 그리고 HIV 감염을 치료하기 위해(WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089) 제안되었다. 이종 접합체 항체들은 임의의 편리한 가교결합 방법들을 사용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교 결합제들은 당해 분야에 일반적으로 공지되어 있으며, 다수의 가교결합 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.
항체 단편들로부터 이중특이적 항체들을 생성하기 위한 기술들이 또한 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체들은 화학적 연결을 사용하여 제조할 수 있다. Brennan et al., Science 229: 81 (1985)은 원형 항체가 F(ab')2 단편을 생성하기 위하여 단백질가수분해적으로 절단되는 절차를 기재한다. 상기 단편들은 이웃한 디티올을 안정화하고 분자간 이황화 형성을 방지하기 위하여 디티올 착화제 아비산나트륨의 존재 하에서 환원된다. 그런 다음, 생성된 Fab’ 단편들은 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환된다. 그런 다음, Fab’-TNB 유도체 중 하나는 메르캅토에틸아민과의 환원에 의하여 Fab’-티올로 재전환되고, 등몰량의 다른 Fab’-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 상기 생성된 이중특이적 항체들은 효소의 선택적 고정화를 위한 제제로서 사용될 수 있다.
재조합 세포 배양물로부터 직접 유래한 이중특이적 항체 단편들을 제조하고 분리하는 다양한 기술이 또한 기재되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체들은 류신 지퍼를 사용하여 생성되었다. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992). Fos 및 Jun 단백질 유래의 류신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab’ 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체들은 힌지 영역에서 환원되어 단량체들을 형성한 후, 재-산화되어 항체 이종이량체들을 형성하였다. 상기 방법은 또한 항체 동종이량체들의 생성을 위하여 이용될 수 있다. “디아바디” 기술은 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)에 의하여 기재되며, 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대안적인 기전을 제공하였다. 상기 단편들은 동일한 사슬 상의 두 도메인 간 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VH)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 이에 따라, 한 단편의 VH 및 VL 도메인이 또 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 쌍을 형성하도록 유도되어 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일 사슬 Fv(sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 다른 전략이 또한 보고되었다. See Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)을 참조한다.
2개를 초과하는 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).
다가 항체
일부 구현예들에서, 상기 항체는 다가 항체이다. 다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 더 빨리 내재화(및/또는 이화)될 수 있다. 본원에 제공된 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위(예컨대, 4가 항체)를 갖는 다가 항체(IgM 부류가 아님)일 수 있으며, 이는 항체의 폴리펩티드 사슬을 부호화하는 핵산의 재조합 발현에 의해 용이하게 생성될 수 있다 . 상기 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함(또는 이들로 구성)한다. 상기 시나리오에서, 상기 항체는 Fc 영역 및 상기 Fc 영역에 아미노 말단인 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 본원에서 바람직한 다가 항체는 3개 내지 약 8개, 하지만 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위를 포함(또는 이들로 구성)한다. 상기 다가 항체는 적어도 하나의 폴리펩티드 사슬(및 바람직하게는 2개의 폴리펩티드 사슬)을 포함하고, 여기서 폴리펩티드 사슬(들)은 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드 사슬(들)은 VD1-(X1)n-VD2-(X2) n-Fc를 포함할 수 있으며, 여기서 VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 하나의 폴리펩티드 사슬이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내며, n은 0 또는 1이다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬(들)은 하기를 포함할 수 있다: VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 사슬; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 사슬. 본원의 다가 항체는 바람직하게는 적어도 2개(바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본원의 다가 항체는 예를 들어, 약 2 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 여기서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 선택적으로 CL 도메인을 추가로 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 항체는 다중특이적 항체이다. 다중특이적 항체의 예는 VHVL 단위가 폴리에피토프 특이성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체, 2개 이상의 VL 및 VH 도메인을 갖고 각각의 VHVL 단위는 상이한 에피토프에 결합하는 항체, 2개 이상의 단일 가변 도메인을 갖고 각각의 단일 가변 도메인은 상이한 에피토프에 결합하는 항체, 전장 항체, 항체 단편, 예컨대 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디, 트리아바디, 3작용성 항체, 공유 또는 비공유 결합으로 연결된 항체 단편을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 폴리에피토프 특이성; 예를 들어 동일하거나 상이한 표적(들) 상에서 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는다. 일부 구현예들에서, 상기 항체는 단일특이적이고; 예를 들어, 하나의 에피토프에만 결합하는 항체이다. 일 구현예에 따라서, 상기 다중특이적 항체는 각 에피토프에 5 mM 내지 0.001 pM, 3 mM 내지 0.001 pM, 1 mM 내지 0.001 pM, 0.5 mM 내지 0.001 pM, 또는 0.1 mM 내지 0.001 pM의 친화성으로 결합하는 IgG 항체이다.
다른 항체 변형들
예컨대, 항체의 항원 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 향상시키기 위해 작동체 기능과 관련하여 본원에 제공된 항체를 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 상기 항체의 Fc 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 시스테인 잔기(들)는 Fc 영역 내에 도입되어 상기 영역에서 사슬간 이황화 결합 형성을 허용할 수 있다. 이렇게 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체 매개 세포 사멸 및 항체 의존성 세포 독성(ADCC)을 가질 수 있다. Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes, B. J., Immunol. 148:2918-2922 (1992)를 참조한다. 향상된 항종양 활성을 갖는 동종이량체 항체는 또한 Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)에 기재된 바와 같이 이종이작용성 가교제를 사용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 이중 Fc 영역을 갖고 이에 의해 강화된 보체 매개 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있는 항체가 조작될 수 있다. Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)을 참조한다.
상기 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 미국 제2006/0067930호에 기재된 바와 같이 항체에서 아미노산 변경이 이루어질 수 있으며, 이는 그 전체가 본원에 원용된다.
폴리펩티드 변이체 및 변형
본원에 기재된 항체를 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열 변형(들)은 본원에 기재된 방법에 의해 세척된 재사용 가능한 크로마토그래피 물질에 사용될 수 있다.
변이체 폴리펩티드
"폴리펩티드 변이체"는 폴리펩티드, 바람직하게는 상기 폴리펩티드의 전장 자연 서열, 신호 펩티드가 결여된 폴리펩티드 서열, 상기 신호 펩티드가 있거나 없는 폴리펩티드의 세포외 도메인과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 본원에 정의된 활성 폴리펩티드를 의미한다. 상기 폴리펩티드 변이체는, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 잔기가 자연 아미노산 서열의 N 또는 C 말단에 부가되거나 결실된 폴리펩티드를 포함한다. 일반적으로, TAT 폴리펩티드 변이체는 전장 자연 서열의 폴리펩티드 서열, 신호 펩티드가 결여된 폴리펩티드 서열, 상기 신호 펩티드가 있거나 없는 폴리펩티드의 세포외 도메인과 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 동일성 중 적어도 약 임의의 것을 가질 것이다. 선택적으로, 변이체 폴리펩티드는 자연 폴리펩티드 서열과 비교하여 1개 이하의 보존적 아미노산 치환, 대안적으로 자연 폴리펩티드 서열과 비교하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 중 약 임의의 것 이하의 보존적 아미노산 치환을 가질 것이다.
변이체 폴리펩티드는 N 말단 또는 C 말단에서 절단될 수 있거나, 또는 예를 들어 전장 자연 폴리펩티드와 비교할 때 내부 잔기가 결여될 수 있다. 특정 변이체 폴리펩티드는 원하는 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 부족할 수 있다. 절단, 결실 및 삽입을 갖는 상기 변이체 폴리펩티드는 다수의 통상적인 기술 중 임의의 것에 의해 제조될 수 있다. 원하는 변이체 폴리펩티드는 화학적으로 합성될 수 있다. 다른 적합한 기술은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 원하는 변이체 폴리펩티드를 부호화하는 핵산 단편을 분리 및 증폭하는 것을 수반한다. 핵산 단편의 원하는 말단을 정의하는 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머에서 사용된다. 바람직하게는, 변이체 폴리펩티드는 본원에 개시된 자연 폴리펩티드와 적어도 하나의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 공유한다.
아미노산 서열 삽입은 1개 잔기로부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 길이의 범위를 갖는 아미노 및/또는 카르복실 말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 복수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N 말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩티드에 대한 항체의 N 또는 C 말단에 대한 융합을 포함한다.
예를 들어, 상기 폴리펩티드의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질을 향상시키는 것이 바람직할 수 있다. 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체들은 적절한 뉴클레오티드 변화를 항체 핵산에 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조된다. 상기 변형은, 예를 들어 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열로부터 결실 및/또는 상기 서열 내로의 삽입 및/또는 상기 서열 내에 잔기의 치환을 포함한다. 최종 작제물이 원하는 특징을 소유한다면, 최종 작제물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 만들어진다. 아미노산 변화는 또한 폴리펩티드(예컨대, 항체)의 번역후 과정, 예컨대 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변경할 수 있다.
원하는 활성에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 어떤 아미노산 잔기가 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는지 결정하는데 있어서의 지침은 상기 폴리펩티드의 서열을 동종의 공지된 폴리펩티드 분자의 서열과 비교하고 높은 상동성 영역에서 만들어진 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 찾을 수 있다.
돌연변이유발을 위해 바람직한 위치인 폴리펩티드(예컨대, 항체)의 특정 잔기 또는 영역을 확인하기 위한 유용한 방법은 Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)에 기재된 바와 같이 “알라닌 스캐닝 돌연변이유발”로 불린다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기들의 군(예컨대, 하전된 잔기, 예컨대 Arg, Asp, His, Lys, 및 Glu)이 식별되고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어, 항원과 아미노산의 상호작용에 영향을 미친다. 그런 다음, 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치는 치환 부위에 또는 치환 부위에 대한 추가 또는 다른 변이체를 도입함으로써 정제된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하는 부위는 미리 정해져 있지만, 돌연변이 자체의 성질은 미리 정해져 있을 필요는 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 성능을 분석하기 위해, 표적 코돈 또는 영역에서 ala 선별검사 또는 무작위 돌연변이유발을 실시하고 원하는 활성에 대해 발현된 항체 변이체를 선별검사한다.
다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 상기 변이체는 항체 분자에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 잔기로 대체된다. 치환 돌연변이유발에 대한 가장 큰 관심 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변경도 고려된다. 보존적 치환들은 하기 표 1에 “바람직한 치환”이라는 제목으로 나타낸다. 상기 치환이 생물학적 활성의 변화를 초래하는 경우, 표 1에서 "예시적 치환"으로 표시된 또는 아미노산 부류와 관련하여 아래에서 추가로 설명되는 보다 실질적인 변화가 도입될 수 있으며 생성물을 선별검사할 수 있다.
원래 잔기 예시적 치환 바람직한 치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신 Leu
Leu (L) 노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신 Leu
예시적 아미노산 치환
폴리펩티드의 생물학적 성질들에 있어서 실질적 변형은 (a) 치환 부위에서 폴리펩티드 골격의 구조를, 예를 들어, 시트 또는 이중나선 입체구조로서, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지시키는 것에 대한 효과가 유의적으로 상이한 치환들을 선택함으로써 이루어진다. 아미노산은 측쇄 특성의 유사성에 따라 분류될 수 있다(A. L. Lehninger, Biochemistry second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)):
(1) 비극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 비하전 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 산성: Asp (D), Glu (E)
(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H)
대안적으로, 자연 발생 잔기들은 공통 측쇄 성질을 기준으로 하기와 같은 군으로 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 측쇄 방향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존성 치환들은 이들 분류 중 하나의 구성원을 또 다른 분류로 교환하게 할 것이다.
항체의 적절한 형태를 유지하는 데 관여하지 않는 모든 시스테인 잔기는 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화 안정성을 개선하고 비정상적인 가교 결합을 방지할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)은 그 안정성(특히, 항체가 항체 단편, 예컨대 Fv 단편인 경우)을 개선하기 위해 상기 항체에 추가될 수 있다.
치환 변이체의 특히 바람직한 한 유형은 모 항체(예컨대, 인간화 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가 개발을 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 이들이 생성되는 모 항체에 비해 개선된 생물학적 특성을 가질 것이다. 상기 치환성 변이체를 생성시키는 간편한 방법은 파지 디스플레이를 사용한 친화성 성숙을 수반한다. 간단히 말해서, 여러 초가변 영역 부위(예컨대, 6-7 부위)가 돌연변이되어 각 부위에서 가능한 모든 아미노 치환을 생성한다. 이와 같이 생성된 항체 변이체는 각각의 입자 내 팩키징된 M13의 유전자 III 생성물로의 융합부로서 실모양 파지 입자로부터의 1가 양상으로 나타난다. 파지 디스플레이된 변이체는 이어서 이들의 생물학적 활성(예컨대, 결합 친화성)에 대해 선별검사된다. 변형을 위한 후보 초가변 영역을 동정하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발은 항원 결합에 유의적으로 기여하는 초가변 영역 잔기들을 동정하기 위해 실시될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 항체와 이의 표적 간의 접촉점을 동정하는 것이 이로울 수 있다. 상기 접촉 잔기들 및 이웃하는 잔기들은 본원에서 고안된 기술에 따른 치환을 위한 후보물이다. 상기 변이체가 생성되면, 변이체 패널은 본원에 기재된 선별검사에 적용하고 하나 이상의 관련 분석에서 우수한 성질을 갖는 항체는 추가적인 개발을 위해 선택될 수 있다.
폴리펩티드의 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체의 원래 글리코실화 패턴을 변경한다. 폴리펩티드는 비아미노산 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드는 글리코실화될 수 있다. 상기 글리코실화는 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 폴리펩티드가 발현되는 동안 자연적으로 발생할 수 있거나, 또는 인간의 개입으로 인해 발생하는 의도적인 변형일 수 있다. 변경은 폴리펩티드에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 결실시키고/거나 폴리펩티드에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 추가하는 것을 의미한다.
폴리펩티드의 당화는 전형적으로 N 연결 또는 O 연결된다. N 연결은 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착되는 것을 의미한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착하기 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드에 상기 트리펩티드 서열들 중 어느 하나의 존재는 가능한 당화 부위를 생성한다. O 연결된 당화는 히드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌으로의 당 N 아세틸갈락토사민, 갈락토오스 또는 자일로스의 부착을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신이 또한 사용될 수 있다.
폴리펩티드에 대한 당화부위의 첨가는 전술된 트리펩티드 서열들(N 연결 당화 부위의 경우) 중 하나 이상을 함유하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 용이하게 달성된다. 상기 변경은 원래 항체의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 추가하거나 치환함으로써 이루어질 수도 있다(O 연결된 글리코실화 부위의 경우).
폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 또는 글리코실화의 표적으로 작용하는 아미노산 잔기를 부호화하는 코돈의 돌연변이 치환에 의해 달성될 수 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 부분의 효소적 절단은 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다아제를 사용하여 달성할 수 있다.
다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기를 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기 메틸화, N 말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C 말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.
키메라 폴리펩티드
본원에 기재된 폴리펩티드는 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다. 일부 구현예들에서, 키메라 분자는 항 태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 폴리펩티드의 융합을 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 폴리펩티드의 아미노 또는 카르복실 말단에 위치한다. 상기 에피토프 태깅된 형태의 폴리펩티드의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 또한, 에피토프 태그의 제공은 항 태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 다른 유형의 친화성 기질을 사용한 친화성 정제에 의해 폴리펩티드를 용이하게 정제할 수 있게 한다.
대안적인 구현예에서, 키메라 분자는 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정 영역과 폴리펩티드의 융합을 포함할 수 있다. 상기 키메라 분자의 2가 형태는 "면역부착소"라고도 한다.
본원에서 사용된 용어 “면역부착소”는 이종 폴리펩티드의 결합 특이성을 면역글로불린 불변 도메인의 작동체 기능과 조합하는 항체 유사 분자를 명명한다. 구조적으로, 면역부착소는 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 아닌(즉, “이종성”) 원하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열, 및 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합을 포함한다. 면역부착소 분자의 부착소 부분은 전형적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 면역부착소 내의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로불린, 예컨대 IgG-1, IgG-2, IgG-3, 또는 IgG-4 하위유형, IgA(IgA-1 및 IgA-2를 포함), IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다.
Ig 융합은 바람직하게는 Ig 분자 내에 적어도 하나의 가변 영역을 대신하여 가용성(막관통 도메인 결실 또는 비활성화) 형태의 폴리펩티드의 치환을 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 면역글로불린 융합은 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다.
폴리펩티드 접합체
폴리펩티드 제형에 사용하기 위한 폴리펩티드는 세포독성제, 예컨대 화학요법제, 성장 억제제, 독소(예컨대, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 이들의 단편) 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성접합체)에 접합될 수 있다.
상기 접합체의 생성에 유용한 화학요법제가 사용될 수 있다. 또한, 사용될 수 있는 효소 활성 독소 또는 이의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬(녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모디카 차란티아(momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 저해제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 다양한 방사성 핵종은 방사성접합된 폴리펩티드의 생성을 위해 입수 가능하다. 예는 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 및 186Re를 포함한다. 폴리펩티드 및 세포독성제의 접합체는 다양한 2작용성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 2작용성 유도체(예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르(예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드(예컨대, 글루타렐데하이드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예컨대, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 만들어질 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)에서 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지화된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 폴리펩티드에 방사성뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다.
칼리케아미신, 메이탄시노이드, 트리코텐, 및 CC1065와 같은 폴리펩티드와 하나 이상의 소분자 독소의 접합체, 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체가 또한 본원에서 고려된다.
메이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목인 Maytenus serrata에서 처음으로 분리되었다. 그 후, 특정 미생물도 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르와 같은 메이탄시노이드를 생성한다는 것이 발견되었다. 합성 메이탄시놀 및 이의 유도체 및 유사체가 또한 고려된다. 예를 들어, 미국 특허 제5,208,020호에 개시된 바를 포함하여 폴리펩티드-메이탄시노이드 접합체를 만들기 위해 당업계에 공지된 많은 연결기가 있다. 상기 연결기는 상기 확인된 특허에 개시된 바와 같이 이황화기, 티오에테르기, 산 불안정기, 광불안정기, 펩티다아제 불안정기 또는 에스테라아제 불안정기를 포함하며, 이황화물 및 티오에테르기가 바람직하다.
링커는 연결 유형에 따라 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 결합은 통상적인 커플링 기술을 사용하여 히드록실기와의 반응에 의해 형성될 수 있다. 상기 반응은 히드록실기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실기로 변형된 C-15 위치, 및 히드록실기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 연결은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
다른 관심 접합체는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 접합된 폴리펩티드를 포함한다. 칼리케아미신 계열의 항생제는 피코몰 미만 농도에서 이중 가닥 DNA의 절단을 생성할 수 있다. 칼리케아미신 계열의 접합체 제조를 위해, 예컨대 미국 특허 제5,712,374호를 참조한다. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체는 γ1 I, α2 I, α3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θ1 I를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 상기 항체가 접합될 수 있는 다른 항종양 약물은 항엽산인 QFA이다. 칼리케아미신 및 QFA는 모두 세포 내 작용 부위를 가지고 있으며 원형질막을 쉽게 통과하지 않는다. 따라서, 폴리펩티드(예컨대, 항체) 매개 내재화를 통한 상기 제제의 세포 흡수는 세포독성 효과를 크게 향상시킨다.
본원에 기재된 폴리펩티드에 접합될 수 있는 다른 항종양제는 BCNU, 스트렙토조이신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 집합적으로 LL-E33288 복합체로 공지된 제제 계열, 및 에스페라미신을 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드와 핵분해 활성을 갖는 화합물(예컨대, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예컨대 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이의 접합체일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 폴리펩티드(예컨대, 항체)는 종양 사전 표적화에서의 이용을 위해 "수용체"(예컨대, 스트렙타비딘)에 접합될 수 있으며, 여기서 상기 폴리펩티드 수용체 접합체는 환자에게 투여되고, 이어서 정화제를 사용한 순환으로부터 결합되지 않은 접합체를 제거한 후, 세포독성제(예컨대, 방사성뉴클레오티드)에 접합된 "리간드"(예컨대, 아비딘)을 투여한다.
일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는 전구약물(예컨대, 펩티딜 화학요법제)을 활성 항암 약물로 전환시키는 전구약물 활성화 효소에 접합될 수 있다. 면역접합체의 효소 성분은 전구약물을 보다 활성인 세포독성 형태로 전환시키는 방식으로 전구약물에 작용할 수 있는 임의의 효소를 포함한다.
유용한 효소는 인산염 함유 전구약물을 유리 약물로 전환하는데 유용한 알칼리성 포스파타아제; 황산염 함유 전구약물을 유리 약물로 전환하는데 유용한 아릴설파타제; 무독성 5-플루오로시토신을 항암제인 5-플루오로우라실로 전환하는데 유용한 시토신 데아미나아제; 펩티드 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 세라티아 프로테아제, 써모리신, 서브틸리신, 카르복시펩티다아제 및 카텝신(예컨대, 카텝신 B 및 L)과 같은 프로테아제; D-아미노산 치환기를 함유하는 전구약물 전환에 유용한 D-알라닐카르복시펩티다아제; 글리코실화된 전구약물을 유리 약물로 전환하는데 유용한 β-갈락토시다아제 및 뉴라미니다아제와 같은 탄수화물 절단 효소; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 β-락타마아제; 및 각각 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 기로 아민 질소에서 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환하는 데 유용한 페니실린 V 아미다아제 또는 페니실린 G 아미다아제와 같은 페니실린 아미다아제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 대안적으로, 당업계에 "아브자임"으로도 공지된 효소 활성을 갖는 항체를 사용하여 전구약물을 유리 활성 약물로 전환할 수 있다.
기타
폴리펩티드의 공유결합 변형의 다른 유형은 폴리펩티드를 다양한 비단백질성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중 하나에 연결하는 것을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 또한 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 각각 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합(예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐)에 의해 제조된 마이크로캡슐 또는 마크로에멀젼 내에 포집될 수 있다. 상기 기술은 Remington’s Pharmaceutical Sciences 18th edition, Osol, A. Ed. (1990)에서 개시된다.
제형 및 방법에 사용하기 위한 폴리펩티드의 획득
본원에 기재된 방법에 의해 세척된 재사용 가능한 크로마토그래피 물질을 사용하여 정제될 폴리펩티드는 재조합 방법을 포함한 당업계에 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 다음 섹션에서는 상기 방법에 대한 지침을 제공한다.
폴리뉴클레오티드
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다.
폴리펩티드를 부호화하는 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드 mRNA를 보유하고 이를 검출가능한 수준으로 발현하는 것으로 여겨지는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 임의의 공급원으로부터 수득할 수 있다. 이에 따라, 폴리펩티드를 부호화하는 폴리뉴클레오티드는 인간 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 편리하게 수득할 수 있다. 폴리펩티드 부호화 유전자는 또한 유전체 라이브러리로부터 또는 공지된 합성 절차(예컨대, 자동화 핵산 합성)에 의해 수득할 수 있다.
예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 경쇄 또는 중쇄와 같은 전체 면역글로불린 분자 사슬을 부호화할 수 있다. 완전한 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH)뿐만 아니라 일반적으로 3개의 불변 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역(CH)을 포함한다: CH1, CH2 및 CH3; 및 "힌지" 영역. 일부 상황들에서는, 불변 영역의 존재가 바람직하다.
폴리뉴클레오티드에 의해 부호화될 수 있는 다른 폴리펩티드는 단일 도메인 항체("dAbs"), Fv, scFv, Fab' 및 F(ab')2 및 "미니바디"와 같은 항원 결합 항체 단편을 포함한다. 미니바디는 (일반적으로)CH1 및 CK 또는 CL 도메인이 절제된 2가 항체 단편이다. 미니바디는 통상적인 항체보다 작기 때문에 임상/진단 용도에서 더 나은 조직 침투를 달성해야 하지만 2가이므로 dAb와 같은 1가 항체 단편보다 더 높은 결합 친화성을 유지해야 한다. 이에 따라, 문맥에서 달리 지시하지 않는 한, 본원에서 사용된 용어 "항체"는 전체 항체 분자뿐만 아니라 상기 논의된 유형의 항원 결합 항체 단편도 포함한다. 바람직하게는 부호화된 폴리펩티드 내에 존재하는 각각의 프레임워크 영역은 상응하는 인간 수용체 프레임워크에 대해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함할 것이다. 따라서, 예를 들어, 상기 프레임워크 영역은 수용체 프레임워크 영역에 비해 총 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
적합하게는, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 단리 및/또는 정제될 수 있다. 일부 구현예들에서, 폴리뉴클레오티드는 단리된 폴리뉴클레오티드이다.
용어 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 분자가 그의 정상 또는 자연 환경으로부터 제거 또는 분리되거나 정상 또는 자연 환경에 존재하지 않는 방식으로 생성되었음을 나타내기 위한 것이다. 일부 구현예들에서, 폴리뉴클레오티드는 정제된 폴리뉴클레오티드이다. 정제된이라는 용어는 최소한 일부 오염 분자 또는 물질이 제거되었음을 나타내기 위한 것이다.
적합하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 관련 폴리뉴클레오티드가 조성물 내에 존재하는 우세한(즉, 가장 풍부한) 폴리뉴클레오티드를 구성하도록 실질적으로 정제된다.
폴리뉴클레오티드의 발현
하기 설명은 주로 폴리펩티드 부호화 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 세포를 배양함으로써 폴리펩티드를 생성하는 것에 관한 것이다. 물론, 당업계에 일반적으로 공지된 대안적인 방법을 사용하여 폴리펩티드를 제조할 수 있음이 또한 고려된다. 예를 들어, 적절한 아미노산 서열 또는 이의 부분은 고체상 기술을 사용하여 직접적인 펩티드 합성에 의해 생성될 수 있다(예컨대, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis W.H. Freeman Co., San Francisco, Calif. (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)를 참조). 시험관 내 단백질 합성은 수동 기술을 사용하거나 자동화를 통해 실시할 수 있다. 자동화된 합성은, 예를 들어 제조사의 지침을 사용하여 어플라이드 바이오시스템즈 펩티드 합성기(Applied Biosystems Peptide Synthesizer, 캘리포니아 포스터 시티 소재)를 사용하여 달성할 수 있다. 폴리펩티드의 다양한 부분은 개별적으로 화학적으로 합성될 수 있고 원하는 폴리펩티드를 생성하기 위해 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 조합될 수 있다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드의 생성을 위한 발현 벡터 내로 삽입된다. 용어 "조절 서열"은 특정한 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 제어 서열은 프로모터(예컨대, 자연 연관 또는 이종 프로모터), 신호 서열, 인핸서 요소, 및 전사 종결 서열을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
폴리뉴클레오티드는 이것이 다른 폴리뉴클레오티드 서열과 기능적 관계로 놓이는 경우, "작동가능하게 연결된" 것이다. 예를 들어, 전구서열 또는 분비 리더에 대한 핵산은 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구단백질로서 발현되는 경우에 폴리펩티드에 대한 핵산에 작동 가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 부호화 서열에 작동 가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 촉진시키도록 위치할 경우에 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 핵산 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우 인접하며 해독 단계에 있음을 의미한다. 하지만, 인핸서는 인접할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성된다. 그와 같은 부위가 존재하지 않으면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커는 종래의 실시에 따라 사용된다.
항체의 경우, 경쇄 및 중쇄는 동일하거나 상이한 발현 벡터 내에서 클로닝될 수 있다. 면역글로불린 사슬을 부호화하는 핵산 분절은 면역글로불린 폴리펩티드의 발현을 보장하는 발현 벡터(들)의 조절 서열에 작동가능하게 연결된다.
폴리뉴클레오티드 서열(예컨대, 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 부호화 서열 및 임의의 발현 조절 서열)을 함유하는 벡터는 세포 숙주의 유형에 따라 가변되는 일반적으로 공지된 방법에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, 염화칼슘 형질감염은 일반적으로 원핵 세포에 사용되는 반면, 인산칼슘 처리, 전기천공, 리포펙션, 유전자총법(biolistics) 또는 바이러스 기반 형질감염은 다른 세포 숙주에 사용될 수 있다. (일반적으로 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989)를 참조). 포유류 세포를 변형시키는 데 사용되는 다른 방법은 폴리브렌, 원형질체 융합, 리포솜, 전기천공 및 미세주입의 사용을 포함한다. 형질전환 동물의 생성을 위해, 형질전환 유전자는 수정된 난모세포에 미세주입되거나, 또는 배아줄기세포의 유전체 내로 통합될 수 있으며, 상기 세포의 핵은 핵이 제거된 난모세포로 이전될 수 있다.
벡터
용어 "벡터"는 발현 벡터 및 형질전환 벡터 및 셔틀 벡터를 포함한다.
"발현 벡터"라는 용어는 생체내 또는 시험관내 발현이 가능한 작제물을 의미한다.
"형질전환 벡터"라는 용어는 한 개체에서 다른 개체로 전달될 수 있는 작제물을 의미하며, 이는 종일 수도 있고 다른 종일 수도 있다. 상기 작제물이 한 종에서 다른 종으로(예컨대 대장균 플라스미드에서 바실러스 속과 같은 박테리아로) 전달될 수 있는 경우 형질전환 벡터는 때때로 "셔틀 벡터"라고 불린다. 이는 심지어 대장균 플라스미드에서 아그로박테리움으로 식물로 옮겨질 수 있는 작제물일 수도 있다.
벡터는 폴리펩티드의 발현을 제공하기 위해 하기에 기재된 바와 같이 적합한 숙주 세포 내로 형질전환될 수 있다. 다양한 벡터가 공개적으로 입수 가능하다. 벡터는, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태일 수 있다. 적절한 핵산 서열은 다양한 절차에 의해 벡터 내로 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내로 삽입된다. 이들 성분들 중 하나 이상을 함유하는 적합한 벡터의 구축은 당업자에게 공지된 표준 결찰 기술을 사용한다.
벡터는, 예를 들어 복제 기점이 제공되는 플라스미드, 바이러스 또는 파지 벡터, 선택적으로 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 프로모터 및 선택적으로 상기 프로모터의 조절인자일 수 있다. 벡터는 당업계에 일반적으로 공지된 하나 이상의 선택 가능한 표지 유전자를 포함할 수 있다.
상기 발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 일부로서 복제가능하다.
숙주 세포
숙주 세포는, 예를 들어 박테리아, 효모 또는 다른 진균 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 또는 포유동물 세포일 수 있다.
유전자 조작된 형질전환 다세포 숙주 유기체를 사용하여 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 상기 유기체는 예를 들어, 형질전환 포유동물 유기체(예컨대, 형질전환 염소 또는 마우스 계통)일 수 있다.
적합한 원핵생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 대장균과 같은 장내세균과 같은 진정 세균을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 다양한 대장균 균주, 예컨대 대장균 K12 균주 MM294(ATCC 31,446); 대장균 X1776(ATCC 31,537); 대장균 균주 W3110(ATCC 27,325) 및 K5 772(ATCC 53,635)가 공개적으로 입수 가능하다. 다른 적합한 원핵 숙주 세포는 장내세균, 예컨대 대장균, 엔테로박터, 에르위니아, 클렙시엘라, 프로테우스, 살모넬라, 예컨대 살모넬라 티피무리움, 세라티아, 예컨대 세라티아 마르세스칸스, 및 시겔라 뿐만 아니라 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리체니포르미스(예컨대, 바실러스 리체니포르미스 41P), 슈도모나스, 예컨대 녹농균 및 스트렙토마이세스를 포함한다. 상기 예들은 제한적이기보다 예시적이다. 균주 W3110은 재조합 폴리뉴클레오티드 생성물 발효를 위한 공통 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주 중 하나이다. 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110은 숙주에 내인성인 폴리펩티드를 부호화하는 유전자에서 유전적 돌연변이를 수행하도록 변형될 수 있으며, 상기 숙주의 예는 완전한 유전자형 tonA를 갖는 대장균 W3110 균주 1A2; 완전한 유전자형 tonA ptr3을 갖는 대장균 W3110 균주 9E4; 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan’을 갖는 대장균 W3110 균주 27C7(ATCC 55,244); 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan'을 갖는 대장균 W3110 균주 37D6; 비카나마이신 내성 degP 결실 돌연변이를 갖는 균주 37D6인 대장균 W3110 균주 40B4; 및 돌연변이 주변세포질 프로테아제를 갖는 대장균 균주를 포함한다. 대안적으로, 시험관내 클로닝 방법, 예컨대 PCR 또는 기타 핵산 중합효소 반응이 적합하다.
이러한 원핵생물 숙주에서, 전형적으로 숙주 세포(예컨대, 복제 기점)와 양립가능한 발현 조절 서열을 함유할 발현 벡터를 만들 수 있다. 또한, 락토오스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마아제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템과 같은 임의의 수의 다양한 일반적으로 공지된 프로모터가 존재할 것이다. 상기 프로모터는 전형적으로 선택적으로 작동자 서열과 함께 발현을 제어할 것이고, 전사 및 번역을 개시하고 완료하기 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 가질 것이다.
진핵 미생물이 발현에 사용될 수 있다. 진핵 미생물, 예컨대 실모양 균류 또는 효모가 폴리펩티드 부호화 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)는 일반적으로 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 기타에는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예컨대 K. 락티스(K. lactis, MW98-8C, CBS683, CBS4574), K. 프라길리스(K. fragilis, ATCC 12,424), K. 불가리쿠스(K. bulgaricus, ATCC 16,045), K. 위케라미이(K. wickeramii, ATCC 24,1758), K. 월티(K, waltii, ATCC 56,500), K. 드로소필룸(K. drosophilarum, ATCC 36,906), K. 테르모톨레란스(K. thermotolerans) 및 K. 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia, EP 402,226); 피치아 파스토리스(Pichia pastoris); 칸디다(Candida); 트리코더마 레시아(Trichoderma reesia); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 쉬반니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis)와 같은 쉬반니오마이세스; 및 실모양 진균, 예컨대 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 A. 니둘란스(A. nidulans) 및 A. 니제르(A. niger)와 같은 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주를 포함한다. 메틸로트로픽(methylotropic) 효모가 본원 적합하고, 한세눌라(Hansenula), 칸디다(Candida), 클로에케라(Kloeckera), 피치아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 토룰롭시스(Torulopsis) 및 로도토룰라(Rhodotorula)로 이루어진 속으로부터 선택된 메탄올 상에서 성장할 수 있는 효모를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 사카로마이세스는 바람직한 효모 숙주로서, 발현 조절 서열(예컨대, 프로모터), 복제 기점, 종결 서열 등을 원하는 대로 갖는 적합한 벡터를 갖는다. 전형적인 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나아제 및 기타 해당 효소를 포함한다. 유도성 효모 프로모터는 무엇보다도 알코올 탈수소효소, 이소시토크롬 C, 말토오스 및 갈락토오스 이용을 담당하는 효소의 프로모터를 포함한다.
미생물에 더하여, 포유동물 조직 세포 배양은 또한 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 발현 및 생성하는 데 사용될 수 있으며 일부 경우들에는 바람직하다(예컨대, Winnacker, From Genes to Clones VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987). 일부 구현예들의 경우, 진핵 세포가 바람직할 수 있는데, 이는 이종 폴리펩티드(예컨대, 원형 면역글로불린)를 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 당업계에서 개발되었고 CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 바람직하게는 골수종 세포주, 또는 형질전환된 B 세포 또는 하이브리도마를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 포유류 숙주 세포는 CHO 세포이다.
일부 구현예들에서, 상기 숙주 세포는 척추동물 숙주 세포이다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 라인(현탁 배양에서 성장을 위해 하위클로닝된 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO 세포 또는 CHO-DP-12 라인); 마우스 세르톨리 세포; 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 라인(Hep G2)이다.
제제 및 제제의 제조 방법
또한, 본원에 기재된 방법에 의해 정제된 폴리펩티드(예컨대, 항체)를 포함하는 제제 및 제제의 제조 방법이 본원에 제공된다. 예를 들어, 상기 정제된 폴리펩티드는 약학적으로 허용가능한 담체와 조합될 수 있다.
일부 구현예들에서 폴리펩티드 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 폴리펩티드를 임의의 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수용액 형태로 저장을 위해 제조될 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)).
본원에서 사용된 "담체"는 이용된 투여량 및 농도에서 이에 노출된 세포 또는 포유동물에 비독성인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함한다. 생리학적으로 허용가능한 담체는 종종 수성 pH 완충액이다.
허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 이용된 용량과 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충액, 예컨대 인산염, 구연산염 및 다른 유기 산; 아스코르빈산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 그리고 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물(예컨대, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
일부 구현예들에서, 폴리펩티드 제제 내의 폴리펩티드는 기능적 활성을 유지한다.
생체내 투여에 사용될 제제는 멸균이어야 한다. 이는 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
본원의 제제는 또한 치료되는 특정 징후에 대해 필요에 따라 1개 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에 부정적으로 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 함유할 수도 있다. 예를 들어, 폴리펩티드에 더하여, 하나의 제제에 추가 폴리펩티드(예컨대, 항체)를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 조성물은 화학요법제, 세포독성제, 사이토카인, 성장 억제제, 항호르몬제, 및/또는 심장보호제를 추가로 포함할 수 있다. 이와 같은 분자는 의도하는 목적에 효과적인 양으로 병용하여 적절히 존재한다.
제조 물품
본원에 기재된 방법에 의해 정제된 폴리펩티드 및/또는 본원에 기재된 방법에 의해 정제된 폴리펩티드를 포함하는 제제는 제조 물품 내에 함유될 수 있다. 상기 제조 물품은 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 제제를 함유하는 용기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 제조 물품은 (a) 용기 내에 본원에 기재된 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 제제를 포함하는 조성물을 포함하는 용기; 및 (b) 피험자에게 제제를 투여하기 위한 지침이 포함된 패키지 삽입물.
제조 물품은 용기 및 상기 용기 위의 또는 상기 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 상기 용기는 제제를 유지하거나 함유하고 무균 접속 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘이 뚫을 수 있는 마개를 가진 정맥 용액 주머니 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 적어도 한 가지 활성 제제는 폴리펩티드이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 제공되는 폴리펩티드 및 기타 약물의 투여량 및 간격에 관한 특정 지침과 함께 대상체에서 조성물의 사용을 나타낸다. 제조 물품은 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질들을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 용기는 주사기이다. 일부 구현예들에서, 상기 주사기는 주사 장치 내에 추가로 포함된다. 일부 구현예들에서, 인간 주사 장치는 자기주사기이다.
"패키지 삽입물"은 적응증, 사용법, 투여량, 투여, 금기사항, 포장된 제품과 조합될 기타 치료 제품, 및/또는 상기 치료 제품의 사용에 관한 경고에 관한 정보를 함유하는 치료 제품의 상업적 패키지 내에 통상적으로 포함된 지침을 지칭하기 위해 사용된다.
예시적인 구현예
본 발명은 하기의 예시적인 구현예들을 제공한다.
구현예 1. 재사용을 위한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은:
a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨(NaOAc)을 포함하는 단계;
b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및
c) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 2. 구현예 1에 있어서,
상기 재생 완충액은 약 50 내지 약 600 mM NaOAc를 포함하는, 방법.
구현예 3. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서,
상기 재생 완충액은 약 350 mM NaOAc를 포함하는, 방법.
구현예 4. 구현예 1 내지 구현예 3 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 4.0 내지 11인, 방법.
구현예 5. 구현예 1 내지 구현예 4 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 8.3인, 방법.
구현예 6. 구현예 1 내지 구현예 5 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 3 내지 약 12 물질 부피의 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하는, 방법.
구현예 7. 구현예 1 내지 구현예 6 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 10 물질 부피의 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하는, 방법.
구현예 8. 구현예 1 내지 구현예 7 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 2 내지 약 12 물질 부피의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하는, 방법.
구현예 9. 구현예 1 내지 구현예 8 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 10 물질 부피의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과하는, 방법.
구현예 10. 구현예 1 내지 구현예 9 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 1 내지 5 물질 부피의 저장 완충액에 저장되는, 방법.
구현예 11. 구현예 1 내지 구현예 10 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장되는, 방법.
구현예 12. 재사용을 위한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은:
a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계;
b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 산 세척액을 통과시키는 단계;
c) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH 및 약 1 M NaCl를 포함하는 단계; 및
d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 13. 구현예 12에 있어서,
상기 재생 완충액 및 제2 재생 완충액은 약 25 내지 약 600 mM NaOAc를 포함하는, 방법.
구현예 14. 구현예 12 또는 구현예 13에 있어서,
상기 재생 완충액은 약 350 mM NaOAc를 포함하는, 방법.
구현예 15. 구현예 12 또는 구현예 13에 있어서,
상기 재생 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는, 방법.
구현예 16. 구현예 12 내지 구현예 15 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 2.0 내지 7.0인, 방법.
구현예 17. 구현예 12 내지 구현예 16 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 4.0인, 방법.
구현예 18. 구현예 12 내지 구현예 17 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 3 내지 약 12 물질 부피의 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하는, 방법.
구현예 19. 구현예 12 내지 구현예 18 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 7 물질 부피의 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하는, 방법.
구현예 20. 구현예 12 내지 구현예 19 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 산 세척액은 약 167 M NaOAc 및 약 0.3 M 인산인, 방법.
구현예 21. 구현예 12 내지 구현예 20 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 1 내지 약 5 물질 부피의 산 세척액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하는, 방법.
구현예 22. 구현예 12 내지 구현예 21 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 3 물질 부피의 산 세척액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하는, 방법.
구현예 23. 구현예 12 내지 구현예 22 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 2 내지 약 12 물질 부피의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하는, 방법.
구현예 24. 구현예 12 내지 구현예 23 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 4 물질 부피의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과하는, 방법.
구현예 25. 구현예 12 내지 구현예 24 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 1 내지 5 물질 부피의 저장 완충액에 저장되는, 방법.
구현예 26. 구현예 12 내지 구현예 25 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 3 물질 부피의 저장 완충액에 저장되는, 방법.
구현예 27. 재사용을 위한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 세척 방법으로서, 상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고, 상기 방법은:
a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 트리스 및 아세트산 나트륨을 포함하는 단계;
b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및
c) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 28. 구현예 27에 있어서,
상기 재생 완충액은 약 25 내지 약 75 mM 트리스 및 약 50 내지 약 100 mM NaOAc를 포함하는, 방법.
구현예 29. 구현예 27 또는 구현예 28에 있어서,
상기 재생 완충액은 약 50 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함하는, 방법.
구현예 30. 구현예 27 내지 구현예 29 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 7 내지 9인, 방법.
구현예 31. 구현예 27 내지 구현예 30 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 8.0인, 방법.
구현예 32. 구현예 27 내지 구현예 31 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 3 내지 약 12 물질 부피의 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하는, 방법.
구현예 33. 구현예 27 내지 구현예 32 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 10 물질 부피의 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하는, 방법.
구현예 34. 구현예 27 내지 구현예 33 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 2 내지 약 12 물질 부피의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하는, 방법.
구현예 35. 구현예 27 내지 구현예 34 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 10 물질 부피의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과하는, 방법.
구현예 36. 구현예 27 내지 구현예 35 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 1 내지 5 물질 부피의 저장 완충액에 저장되는, 방법.
구현예 37. 구현예 27 내지 구현예 36 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장되는, 방법.
구현예 38. 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은:
a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계;
b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계;
c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계;
d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계;
e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계;
f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및
g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 39. 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은:
a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계;
b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥ 20 g/L인 단계;
c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계;
d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계;
e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계;
f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및
g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 40. 구현예 39에 있어서,
상기 부하 밀도는 ≥ 70 g/L인, 방법.
구현예 41. 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은:
a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계;
b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 상기 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피의 동적 결합 용량을 초과하는 단계;
c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계;
d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계;
e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계;
f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및
g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 42. 구현예 41에 있어서,
상기 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량의 약 2배 이상인, 방법.
구현예 43. 구현예 42에 있어서,
상기 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량의 약 2배 내지 약 100배인, 방법.
구현예 44. 구현예 42에 있어서,
상기 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량의 약 10배인, 방법.
구현예 45. 구현예 38 내지 구현예 44 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 평형 완충액은 약 20 mM 내지 약 60 mM의 아세트산 나트륨을 포함하는, 방법.
구현예 46. 구현예 38 내지 구현예 45 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 평형 완충액은 약 40 mM의 아세트산 나트륨을 포함하는, 방법.
구현예 47. 구현예 38 내지 구현예 46 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 평형 완충액의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.0인, 방법.
구현예 48. 구현예 38 내지 구현예 47 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 평형 완충액의 pH는 약 pH 5.5인, 방법.
구현예 49. 구현예 38 내지 구현예 48 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 3 내지 7 물질 부피의 평형 완충액으로 세척되는, 방법.
구현예 50. 구현예 38 내지 구현예 49항 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 5 물질 부피의 평형 완충액으로 세척되는, 방법.
구현예 51. 구현예 38 내지 구현예 50 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 재생 완충액은 약 50 내지 약 600 mM의 NaOAc를 포함하는, 방법.
구현예 52. 구현예 38 내지 구현예 51 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 재생 완충액은 약 350 mM의 NaOAc를 포함하는, 방법.
구현예 53. 구현예 38 내지 구현예 52 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 4.0 내지 11인, 방법.
구현예 54. 구현예 38 내지 구현예 53 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 8.3인, 방법.
구현예 55. 구현예 38 내지 구현예 54 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 3 내지 약 12 물질 부피의 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하는, 방법.
구현예 56. 구현예 38 내지 구현예 55 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 10 물질 부피의 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하는, 방법.
구현예 57. 구현예 38 내지 구현예 56 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 2 내지 약 12 물질 부피의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하는, 방법.
구현예 58. 구현예 38 내지 구현예 57 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 10 물질 부피의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과하는, 방법.
구현예 59. 구현예 38 내지 구현예 58 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 1 내지 5 물질 부피의 저장 완충액에 저장되는, 방법.
구현예 60. 구현예 38 내지 구현예 59 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장되는, 방법.
구현예 61. 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은:
a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계;
b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 상기 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피의 동적 결합 용량을 초과하는 단계;
c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계;
d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계;
e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 아세트산 나트륨을 포함하는 단계;
f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 산 세척액을 통과시키는 단계;
g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH 및 약 1 M NaCl를 포함하는 단계; 및
h) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 62. 구현예 61에 있어서,
상기 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인, 방법.
구현예 63. 구현예 61 또는 구현예 62에 있어서,
상기 부하 밀도는 ≥ 약 20 g/L인, 방법.
구현예 64. 구현예 61 내지 구현예 63 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 부하 밀도는 ≥ 약 70 g/L인, 방법.
구현예 65. 구현예 61에 있어서,
상기 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량의 약 2배 이상인, 방법.
구현예 66. 구현예 61에 있어서,
상기 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량의 약 2배 내지 약 100배인, 방법.
구현예 67. 구현예 61에 있어서,
상기 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량의 약 10배인, 방법.
구현예 68. 구현예 61 내지 구현예 67 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 평형 완충액은 약 50 mM 내지 약 100 mM NaOAc 및 약 25 mM 내지 약 75 mM 트리스를 포함하는, 방법.
구현예 69. 구현예 61 내지 구현예 68 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 평형 완충액은 약 85 mM 아세트산 나트륨 및 약 50 mM 트리스를 포함하는, 방법.
구현예 70. 구현예 61 내지 구현예 69 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 평형 완충액의 pH는 약 pH 6.0 내지 약 pH 10.0인, 방법.
구현예 71. 구현예 61 내지 구현예 70 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 평형 완충액의 pH는 약 pH 8.0인, 방법.
구현예 72. 구현예 61 내지 구현예 71 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 5 내지 약 15 물질 부피의 평형 완충액으로 세척되는, 방법.
구현예 73. 구현예 61 내지 구현예 72 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 10 물질 부피의 평형 완충액으로 세척되는, 방법.
구현예 74. 구현예 61 내지 구현예 73 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 재생 완충액은 약 25 내지 약 600 mM NaOAc를 포함하는, 방법.
구현예 75. 구현예 61 내지 구현예 74 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 재생 완충액은 약 350 mM NaOAc를 포함하는, 방법.
구현예 76. 구현예 61 내지 구현예 74 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 재생 완충액은 약 40 mM NaOAc를 포함하는, 방법.
구현예 77. 구현예 61 내지 구현예 76 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 2.0 내지 7.0인, 방법.
구현예 78. 구현예 61 내지 구현예 77 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 4.0인, 방법.
구현예 79. 구현예 61 내지 구현예 78 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 3 내지 약 12 물질 부피의 상기 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하는, 방법.
구현예 80. 구현예 61 내지 구현예 79 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 7 물질 부피의 상기 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하는, 방법.
구현예 81. 구현예 61 내지 구현예 80 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 산 세척액은 약 167 M NaOAc 및 약 0.3 M 인산인, 방법.
구현예 82. 구현예 61 내지 구현예 81 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 1 내지 약 5 물질 부피의 산 세척액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하는, 방법.
구현예 83. 구현예 61 내지 구현예 82 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 3 물질 부피의 산 세척액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하는, 방법.
구현예 84. 구현예 61 내지 구현예 83 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 2 내지 약 12 물질 부피의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하는, 방법.
구현예 85. 구현예 61 내지 구현예 84 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 4 물질 부피의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과하는, 방법.
구현예 86. 구현예 61 내지 구현예 85 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 1 내지 5 물질 부피의 저장 완충액에 저장되는, 방법.
구현예 87. 구현예 61 내지 구현예 86 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 3 물질 부피의 저장 완충액에 저장되는, 방법.
구현예 88. 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은:
a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계;
b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계;
c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계;
d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계;
e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 트리스 및 아세트산 나트륨을 포함하는 단계;
f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및
g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 89. 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은:
a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계;
b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥ 20 g/L인 단계;
c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계;
d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계;
e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 트리스 및 아세트산 나트륨을 포함하는 단계;
f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및
g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 90. 구현예 89에 있어서,
상기 부하 밀도는 ≥ 70 g/L인, 방법.
구현예 91. 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고, 상기 방법은:
a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계;
b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 상기 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피의 동적 결합 용량을 초과하는 단계;
c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계;
d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계;
e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액은 트리스 및 아세트산 나트륨을 포함하는 단계;
f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액은 약 0.5 N NaOH를 포함하는 단계; 및
g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액은 약 0.1 N NaOH를 포함하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 92. 구현예 91에 있어서,
상기 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량의 약 2배 이상인, 방법.
구현예 93. 구현예 91에 있어서,
상기 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량의 약 2배 내지 약 100배인, 방법.
구현예 94. 구현예 91에 있어서,
상기 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량의 약 10배인, 방법.
구현예 95. 구현예 94에 있어서,
상기 평형 완충액은 약 20 mM 내지 약 60 mM 아세트산 나트륨을 포함하는, 방법.
구현예 96. 구현예 88 내지 구현예 95 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 평형 완충액은 약 40 mM 아세트산 나트륨을 포함하는, 방법.
구현예 97. 구현예 88 내지 구현예 96 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 평형 완충액의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.0인, 방법.
구현예 98. 구현예 88 내지 구현예 97 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 평형 완충액의 pH는 약 pH 5.5인, 방법.
구현예 99. 구현예 88 내지 구현예 98 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 3 내지 7 물질 부피의 평형 완충액으로 세척되는, 방법.
구현예 100. 구현예 88 내지 구현예 99 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 5 물질 부피의 평형 완충액으로 세척되는, 방법.
구현예 101. 구현예 88 내지 구현예 100 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 재생 완충액은 약 25 내지 약 75 mM 트리스 및 약 50 내지 약 100 mM NaOAc를 포함하는, 방법.
구현예 102. 구현예 88 내지 구현예 101 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 재생 완충액은 약 50 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함하는, 방법.
구현예 103. 구현예 88 내지 구현예 102 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 7 내지 9인, 방법.
구현예 104. 구현예 88 내지 구현예 103 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 재생 완충액의 pH는 약 pH 8.0인, 방법.
구현예 105. 구현예 88 내지 구현예 104 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 3 내지 약 12 물질 부피의 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하는, 방법.
구현예 106. 구현예 88 내지 구현예 105 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 10 물질 부피의 재생 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하는, 방법.
구현예 107. 구현예 88 내지 구현예 106 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 2 내지 약 12 물질 부피의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하는, 방법.
구현예 108. 구현예 88 내지 구현예 107 중 어느 한 구현예에 있어서,
약 10 물질 부피의 살균 완충액은 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과하는, 방법.
구현예 109. 구현예 88 내지 구현예 108 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 1 내지 5 물질 부피의 저장 완충액에 저장되는, 방법.
구현예 110. 구현예 88 내지 구현예 109 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장되는, 방법.
구현예 111. 구현예 1 내지 구현예 110 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 칼럼 내에 있는, 방법.
구현예 112. 구현예 1 내지 구현예 111 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 물질인, 방법.
구현예 113. 구현예 1 내지 구현예 112 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 지지체 기질에 연결된 술포프로필 모이어티를 포함하는, 방법.
구현예 114. 구현예 113에 있어서,
상기 지지체 기질은 가교 결합된 폴리(스티렌디비닐벤젠)을 포함하는, 방법.
구현예 115. 구현예 1 내지 구현예 114 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 포로스(POROS)™ HS50 물질인, 방법.
구현예 116. 구현예 1 내지 구현예 115 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 혼합형 양이온 교환 물질인, 방법.
구현예 117. 구현예 116에 있어서,
상기 혼합형 양이온 교환 물질은 캡토(Capto) MMC™, 캡토 MMC™ 임프레스(ImpRes), 누비아(Nuvia)™ c프라임(Prime)™, 또는 토요펄(Toyopearl) MX Trp-650M인, 방법.
구현예 118. 구현예 1 내지 구현예 111 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 물질인, 방법.
구현예 119. 구현예 1 내지 구현예 111 중 어느 한 구현예 또는 구현예 118에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 지지체 기질에 연결된 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민 또는 4차 암모늄 이온 작용기, 폴리아민 작용기, 또는 디에틸아미노에틸 작용기를 포함하는, 방법.
구현예 120. 구현예 1 내지 구현예 111 중 어느 한 구현예, 구현예 118 또는 구현예 119에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 혼합형 음이온 교환 물질인, 방법.
구현예 121. 구현예 120에 있어서,
상기 혼합형 음이온 교환 물질은 캡토 어드히어(Capto Adhere)™ 또는 캡토 어드히어™ 임프레스인, 방법.
구현예 122. 구현예 1 내지 구현예 121 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 상기 폴리펩티드의 대규모 생산에 이용되는, 방법.
구현예 123. 구현예 1 내지 구현예 122 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 폴리펩티드는 항체, 면역부착소, Fc 함유 단백질 또는 면역접합체인, 방법.
구현예 124. 구현예 123에 있어서,
상기 폴리펩티드는 항체인, 방법.
구현예 125. 구현예 124에 있어서,
상기 항체는 단일클론 항체인, 방법.
구현예 126. 구현예 125에 있어서,
상기 단일클론 항체는 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체인, 방법.
구현예 127. 구현예 125 또는 구현예 126에 있어서,
상기 단일클론 항체는 IgG 단일클론 항체인, 방법.
구현예 128. 구현예 124 내지 구현예 127 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 항체는 항원 결합 단편인, 방법.
구현예 129. 구현예 128에 있어서,
상기 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv, 디-scFv, 비-scFv, 탠덤(디, 트리)-scFv, Fv, sdAb, 3작용성 항체, BiTE, 디아바디 또는 트리아바디인, 방법.
구현예 130. 구현예 124 내지 구현예 129 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 항체는 이중특이적 항체인, 방법.
구현예 131. 구현예 124 내지 구현예 127 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 항체는 항 CD20 항체, 항 CD40 항체, 항 HER2 항체, 항 IL6 항체, 항 IgE 항체, 항 IL13 항체, 항 플루 A 항체, 항 TIGIT 항체, 항 PD-L1 항체, 항 VEGF-A 항체, 항 VEGF-A/ANG2 항체, 항 CD79b 항체, 항 ST2 항체, 항 인자 D 항체, 항 인자 IX 항체, 항 인자 X 항체, 항 아베타 항체, 항 타우 항체, 항 CEA 항체, 항 CEA/CD3 항체, 항 CD20/CD3 항체, 항 FcRH5/CD3 항체, 항 Her2/CD3 항체, 항 FGFR1/KLB 항체, FAP-4-1 BBL 융합 단백질, 및 FAP-IL2v 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
구현예 132. 구현예 124 내지 구현예 127 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 항체는 오크렐리주맙, 퍼투주맙, 트라스투주맙, 토실리주맙, 파리시맙, 폴라투주맙, 간테네루맙, 시비사타맙, 크레네주맙, 모수네투주맙, 티라골루맙, 베바시주맙, 리툭시맙, 아테졸리주맙, 오비누투주맙, 람팔리주맙, 레브리키주맙, 오말리주맙 라니비주맙, 에미시주맙, 셀리크렐루맙, 프라시네주맙, RO6874281, 및 RO7122290로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
구현예 133. 구현예 124 내지 구현예 132 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 폴리펩티드는 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하기 전에 친화성 크로마토그래피 물질을 사용하여 정제되고, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 물질인, 방법.
구현예 134. 구현예 133에 있어서,
상기 친화성 물질은 단백질 A 크로마토그래피, 단백질 G 크로마토그래피, 단백질 A/G 크로마토그래피, 단백질 L 크로마토그래피, FcXL 크로마토그래피, 단백질 XL 크로마토그래피, 카파 크로마토그래피, 및 카파XL 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
구현예 135. 구현예 134에 있어서,
상기 단백질 A 친화성 물질은 맙셀렉트(MabSelect) 물질, 맙셀렉트 슈어(SuRe)™ 물질 또는 맙셀렉트 슈어™ LX 물질인, 방법.
구현예 136. 구현예 1 내지 구현예 135 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 완충액은 약 15 내지 20 물질 부피/시간으로 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하는, 방법.
구현예 137. 구현예 1 내지 구현예 136 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 재생 완충액은 약 10 물질 부피/시간으로 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하는, 방법.
구현예 138. 구현예 1 내지 구현예 137 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 폴리펩티드는 숙주 세포 내에서 생성되는, 방법.
구현예 139. 구현예 138에 있어서,
상기 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인, 방법.
구현예 140. 구현예 1 내지 구현예 139 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 불순물은 IgG 단편, 숙주 세포 단백질, 또는 숙주 세포 핵산 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
구현예 141. 구현예 140에 있어서,
상기 폴리펩티드는 CHO 세포에서 생성되고 상기 불순물은 CHO 숙주 세포 단백질(CHOP) 및/또는 CHO 핵산을 포함하는, 방법.
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각 기능은 동일한, 등가의, 또는 유사한 목적에 적합한 대체 기능으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 개시된 각 특징은 등가이거나 유사한 일반적인 일련의 특징들의 예일 뿐이다.
본 발명의 추가 세부사항은 하기 비제한적 실시예에 의해 예시된다. 본 명세서의 모든 참고문헌의 개시 내용은 본원에 명시적으로 원용된다.
실시예
하기 실시예는 순전히 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 따라서 본 발명을 어떤 식으로든 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 하기의 예 및 상세한 설명은 제한이 아니라 예시를 위해 제공된다.
실시예 1. 양이온 교환 과부하 재생 세척 단계의 개발
과부하 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 살균하는 동안 오염을 줄이고 크로마토그래피 실행 사이의 불순물 캐리오버를 최소화하기 위해 재생 단계가 개발되었다.
재료 및 방법
공급원료
본 연구는 CHO 세포주를 사용하여 400 L 파일럿 플랜트 실행에서 유래된 조정된 항체 맙셀렉트 슈어(MabSelect SuRe)™(MSS) 풀을 사용하여 실시하였다. 400 L 세포 배양 생성물은 연속(밀폐) 원심분리에 이어 심층 여과 및 최종 멸균 등급(0.2 μm) 여과를 통해 회수하였다.
완충액
표 2에 나열된 완충액은 본 포로스(POROS)™ 50HS(OL) 크로마토그래피 공정에 사용하였다.
완충액 pH 전도도
(mS/cm)
평형화/세척액40 mM 아세트산 나트륨 5.5 ± 0.10 2.7 ± 0.3
CEX OL 재생 세척액50 mM 트리스, 85 mM 아세트산 나트륨 8.00 ± 0.10 8.6 ± 0.7
CEX OL 재생 세척액350 mM 아세트산 나트륨 8.30 ± 0.10 20 ± 2
살균0.5 M NaOH 해당 없음 1:1 이후 55 ± 5
물로 희석
저장0.1 N NaOH 해당 없음 22 ± 5
포로스™ 50HS(OL) 크로마토그래피 완충액
기기
모든 실험실 규모 크로마토그래피 개발 작업은 GE 헬스케어(Healthcare)
Figure pct00004
KTA™ 에이반트(Avant) 150 및 옴니피트(Omnifit)® 0.66 cm 직경 컬럼을 사용하여 실시하였다.
정제 방법
포로스™ 50HS(과부하 모드) 및 캡토™ 어드히어 단계에 대한 방법은 아래 표에 나타내였다. 가능한 한 축척과 무관한 매개변수를 제공하였다.
양이온 교환 과부하(OL) 크로마토그래피(포로스™ 50 HS)
포로스™ 50HS 크로마토그래피는 공급원료가 pH 5.5에서 로딩된 후 동일한 평형 완충액으로 로딩 후 세척이 이루어지는 과부하 모드에서 작동하였다. 상기 과부하 모드는 수율 손실을 상쇄하기 위해 높은 부하 밀도를 필요로 하기 때문에 수산화나트륨을 이용해 살균 및 보관하기 전에 임의의 결합된 단백질 불순물을 씻어내기 위해 아세트산나트륨을 이용한 더 높은 pH 및 전도도의 재생 단계가 필요하다. 상기 과부하 모드를 사용할 때, 포로스™ 50HS 수지는 mAb의 동적 결합 용량을 초과하는 최적의 결합 용량으로 로딩하였다. 그 결과 단백질 관련 불순물(예컨대, vHMWS 및 HMWS) 및 공정 관련 불순물(예컨대, CHOP)이 상기 수지에 경쟁적으로 결합하면서 mAb가 통과하게 된다. 따라서, 상기 통과물은 과부하 풀로 수집된다. 부하 밀도를 높이면 회수 수율이 증가한다.
포로스™ 50HS 크로마토그래피 대상 매개변수, 단계 정보 및 실행 조건은 표 3에 기재되어 있다. 도 2는 대표적인 포로스 과부하 크로마토그램을 나타낸다.
수지 포로스™ 50HS
모드 과부하
부하 밀도 ≤ 1000 g/L
부하 조절된 맙셀렉트 슈어™ 풀, pH 5.5
유속 15-20 CV/hr(재상 단계에서는 10 CV/hr)
층 높이 20 cm
풀링 조건 0.5 - 0.5 OD
단계 완충액 CVs
평형화 40 mM 아세트산 나트륨, pH 5.5 5
부하 조절된 맙셀렉트 슈어™ 풀, pH 5.5 --
세척액 40 mM 아세트산 나트륨, pH 5.5 5
재생 완충액 평가:1.) 50 mM 트리스, 85 mM 아세트산 나트륨, pH 8.0
2.) 350 mM 아세트산 나트륨, pH 8.3		 10
살균 0.5 N NaOH 10
저장 0.1 N NaOH 4
포로스™ 50HS 크로마토그래피 공정, 단계 정보 및 실행 조건
분석 방법
생성물 단백질 농도
MAb 농도는 280 nm 및 320 nm에서 석영 큐벳을 갖춘 애질런트 8453 분광 광도계를 사용하여 결정하였다. 샘플을 정제수(PW)로 희석하여 280 nm에서 흡광도가 0.1 내지 1.0 AU에 도달하도록 한다. 하기의 방정식을 사용하여 단백질 농도를 계산하였다.
단백질 농도 = (A280-A320)/(소광 계수*경로 길이) × 희석 인자
총 단백질(mg) = 단백질 농도
Figure pct00005
풀 부피(ml)
크기 변이체에 대한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)
초고분자량 종(vHMWS), 고분자량 종(HMWS), 총 응집체(vHMWS + HMWS), 단량체 및 단편의 상대 비율은 TSK G3000SWXL(7.8 x 300 mm) 분석용 HPLC 컬럼(토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience))을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC)에 의해 결정하였다. 실행 조건은 하기의 표 4에 나열되어 있다. 컬럼을 상기 표에 나열된 실행 완충액에서 30분 동안 0.5 mL/분으로 실행하고 280 nm에서 모니터링하였다. 자동 샘플 챔버는 2-8°C의 범위에서 5°C로 설정한다. 하지만, 컬럼 구획은 주변 온도로 설정한다. 샘플은 25-50 μg의 목표 질량 부하로 깔끔하게 주입하였다. 상기 분석에 사용된 HPLC 시스템은 애질런트 1100/1200이다.
칼럼 TSK G3000SWXL (7.8 x 300 mm)
공급자 토소 바이오사이언스(파트# 08541, VWR 카달로그# 100368-358)
유속 0.5 mL/min
온도 주위
실행 시간 30분
실행 모드 등용매
이동상 0.20 M 인산 칼륨, 0.25 M 염화 칼륨, pH 6.2 ± 0.1
UV 검출 280 nm
표적 주입 25-50 μg
SEC 실행 조건
분석 작업 검정
공정 개발 및 실행 분석 동안 하기의 분석을 실시하였다.
타크만(Taqman) PCR에 의한 CHO DNA
모세관 영역 전기영동/레이저 유도 형광(CZE-LIF)에 의한 잔류
그람 음성 박테리아 내독소의 검출을 위한 운동 분석에 의한 내독소.
재생 세척 단계의 개발
mAb1 포로스™ 50HS(OL) 컬럼 재생 단계 및 캐리오버 연구
CEX 과부하 크로마토그래피 작업은 포로스™ 50 HS 수지로부터 임의의 결합된 불순물, 구체적으로 응집체를 효과적으로 제거하기 위한 재생 단계를 포함한다. 상기 불순물을 효과적으로 제거하기 위해 두 가지 재생 완충액을 평가하였다: 350 mM 아세트산나트륨, pH 8.3; 및 50 mM 트리스, 85 mM 아세트산나트륨, pH 8.0.
재생 완충액 평가 중에, 2개의 CEX 과부하 실행을 최대 1000 g/L레진까지 로드하였고 2개의 재생 단계(각 완충액에 5 CV 지속 시간)를 통합하였다; 하지만, 각 실행에서 재생 완충액의 순서는 가변하였다. 다음은 시험된 재생 완충액의 순서에 따라 두 가지 평가를 실행한 것이다:
평가 실행 A:
재생 단계 1: 50 mM 트리스, 85 mM NaOAc, pH 8.0
재생 단계 2: 350 mM NaOAc, pH 8.3
평가 실행 B:
재생 단계 1: 350 mM NaOAc, pH 8.3
재생 단계 2: 50 mM 트리스, 85 mM NaOAc, pH 8.0
일반적인 산출물을 분석하였고(KPI, 불순물 제거 및 생성물 품질); 두 실행 모두 유사한 성능을 수득하였다. 하지만, 상기 산출물에 더하여, 제1 재생 단계 동안 컬럼 유출물을 수집하고 컬럼으로부터의 응집물 제거 평가를 위해 SEC에서 분석하였으며, 이는 도 3에 요약하였다(제1 재생 단계 컬럼 유출물의 SEC 크로마토그램 오버레이). 도 3은 350 mM NaOAc pH 8.3 완충액을 사용한 단계는 더 *?*높은 수준의 vHMWS를 갖고 있음을 도시하며, 이는 컬럼에서 더 많은 응집물을 제거하였고, 따라서 더 나은 재생 세척 완충액임을 나타낸다. 두 재생 완충액을 사용해서는 컬럼 오염이 관찰되지 않았다.
평가 실행 크로마토그램을 분석할 때(도 4, 평가 실행 A의 크로마토그램, 및 도 5, 평가 실행 B의 크로마토그램), 350 mM NaOAc pH 8.3 재생 완충액을 사용한 후 재생 단계 2에서 OD 피크가 관찰되지 않았으며, 이는 사용한 후 컬럼에 잔류 단백질이 없음을 나타낸다. 재생 완충액을 사용하는 과정에서 압력 스파이크가 관찰되지 않았다. 분석적 관찰 검정에 의해 잔류 단백질 캐리오버가 관찰되지 않았다(표 5).
캐리오버 데이터 총 단백질
(μg/ml)		 CHO DNA
(pg/ml)		 내독소
(EU/ml)
실험실 규모의 컬럼(11번의 실행 후) <0.25 < 1 시험되지 않음
파일럿 플랜트 컬럼(2번의 실행 후) <0.25 < 1 <0.1
단백질 캐리오버 결과
mAb2 포로스™ 50HS(OL) 컬럼 재생 단계 및 캐리오버 연구
CEX 컬럼 재생 단계는 포로스™ 50HS 수지로부터 불순물을 효과적으로 제거하고 살균 단계 중에 실행 간 캐리오버 및 수지 오염을 방지하도록 최적화하였다. 두 개의 재생 완충액을 시험하였다. 50 mM 트리스, 85 mM 아세트산나트륨, pH 8.0 및 350 mM 아세트산나트륨, pH 8.3. 재생 완충액 평가 중에, 2개의 CEX 과부하 실행을 최대 800 g/L레진까지 로드하였고 2개의 재생 단계(각 완충액에 5 CV 지속 시간)를 통합하였다; 하지만, 각 실행에서 재생 완충액의 순서는 가변한다. 다음은 시험된 재생 완충액의 순서에 따라 두 가지 평가를 실행한 것이다:
평가 실행 A:
재생 단계 1: 50 mM 트리스, 85 mM NaOAc, pH 8.0
재생 단계 2: 350 mM NaOAc, pH 8.3
평가 실행 B:
재생 단계 1: 350 mM NaOAc, pH 8.3
재생 단계 2: 50 mM 트리스, 85 mM NaOAc, pH 8.0
평가 실행 크로마토그램을 분석할 때(도 6, 평가 실행 A의 크로마토그램, 및 도 7, 평가 실행 B의 크로마토그램), 350 mM NaOAc pH 8.3 재생 완충액을 사용한 후 재생 단계 2에서 OD 피크가 관찰되지 않았으며, 이는 사용한 후 컬럼에 잔류 단백질이 없음을 나타낸다. 재생 완충액을 사용하는 과정에서 압력 스파이크가 관찰되지 않았다.
세척 절차를 확인하기 위해, 각 재생 완충액을 사용하여 하나의 생성물 접촉 실행을 실시하였다. 표 6에 상술된 절차를 사용하여 생성물 접촉 실행 후에 모의 실행(부하 단계 없이 실시된 실행)을 실시하였다. 모의 실행의 경우, 두 개의 재생 완충액을 이전 단백질 접촉 실행에서 교대로 사용하여 단백질 캐리오버를 평가하였다. 다음은 평가를 위한 실행 순서를 요약한 것이다:
1.) 50 mM 트리스, 85 mM NaOAc, pH 8.0 재생 단계를 사용한 단백질 접촉 실행
2.) 350 mM NaOAc, pH 8.3 재생 단계를 사용한 모의 실행
3.) 350 mM NaOAc, pH 8.3 재생 단계를 사용한 단백질 접촉 실행
4.) 50 mM 트리스, 85 mM NaOAc, pH 8.0 재생 단계를 사용한 모의 실행
단계 단계 기간(CV) 완충액
평형화 5 40 mM NaOAc, pH 5.5
용출(모의 풀)* 4 500 mM NaOAc, pH 5.5
평형화 4 40 mM NaOAc, pH 5.5
재생 5 350 mM NaOAc, pH 8.3
살균 4 0.5 N NaOH
저장 3 0.1 N NaOH
포로스™ 50HS 모의 실행 세척 절차
* 시험된 2개의 재생 완충액에 대한 모의 풀을 수집하여 Y:99(총 단백질) 및 Y:77(CHO DNA) 분석을 위해 제출하였다.
단백질 접촉 실행 및 모의 실행 모두의 재생 단계를 수집하고 SEC에서 실행하였다(도 8a 및 도 8b). 모의 풀을 수집하고 CHO DNA(Y:77) 및 총 단백질(Y:99)에 대해 분석하였다.
표 7에 나열된 결과는 두 재생 완충액 모두에 대해 유사한 성능을 보여주었다; CHO DNA 및 총 단백질은 컬럼에서 실행된 생성물 접촉 후 ≤ LOQ로 감소하였다. 단백질 접촉 및 모의 실행을 위한 재생 용액의 SEC 분석은 350 mM NaOAc, pH 8.3이 단백질 접촉 실행 동안 50 mM 트리스, 85 mM NaOAc, pH 8.0보다 더 효과적으로 결합된 단백질을 용출할 수 있음을 보여주었다. 50 mM 트리스, 85 mM NaOAc, pH 8.0을 사용하는 경우, 후속 모의 실행에서 350 mM NaOAc, pH 8.3을 사용할 때 용출되는 추가 단백질에 의해 표시된 바와 같이 단백질 접촉 실행은 여전히 컬럼에 결합된 단백질을 잔류시켰다(도 8a 및 도 8b).
완충액 CHO DNA, Y:77
(pg/mL)		 총 단백질, Y:99*
(μg/mL)
50 mM 트리스, 85 mM NaOAc, pH 8.0 ≤1 ≤0.25
350 mM NaOAc, pH 8.3 ≤1 ≤0.25
포로스™ 50HS 모의 실행 ‘캐리오버’ 세척 결과
* 캐리오버(Y99) 샘플은 분석 전에 샘플 수집 후 30분 이내에 0.1% PS20으로 처리하고 ≤-70°C에서 보관하였다.
결론
350 mM NaOAc pH 8.3 및 50 mM 트리스, 85 mM NaOAc, pH 8.0 재생은 mAb2 및 mAb1에 대한 포로스™ 50HS 수지 오염을 효과적으로 완화하였다. 두 버퍼 중 하나를 사용한 살균 단계에서 최소 압력 증가를 관찰하였다. 350 mM NaOAc 재생 완충액은 50 mM 트리스 NaOAc pH 8.0 완충액보다 우선하여 CEX 과부하 크로마토그래피용 플랫폼 재생 완충액으로 선택하였다.
실시예 2 복합 음이온 교환 과부하 재생 세척 단계의 개발
과부하 복합 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 살균하는 동안 오염을 줄이고 크로마토그래피 실행 사이의 불순물 캐리오버를 최소화하기 위해 재생 단계가 개발되었다.
재료 및 방법
공급원료
본 연구는 CHO 세포주를 사용하여 400 L 파일럿 플랜트 실행에서 유래된 조정된 항체 맙셀렉트 슈어(MabSelect SuRe)™(MSS) 풀을 사용하여 실시하였다. 400 L 세포 배양 생성물은 연속(밀폐) 원심분리에 이어 심층 여과 및 최종 멸균 등급(0.2 μm) 여과를 통해 회수하였다.
과부하(OL) 크로마토그래피(캡토™어드히어)
"과부하" 작업 동안 컬럼은 생성물과 불순물이 모두 강한 결합을 나타내는 조건(로그 Kp > 2.0)하에서 로딩되며, 이 지점에서 통과한 단백질이 발생하기 시작한다. 불순물이 생성물 단백질보다 더 강하게 결합할 때(즉, 불순물 로그 Kp > mAb 로그 Kp) 최적의 성능이 실현되어 생성물 단백질이 불순물에 의한 변위를 경험하게 된다. 통과 이후, 생성물이 풍부하고 불순물이 고갈된 용출액이 생성된다.
캡토™어드히어 과부하 크로마토그래피 연구의 경우, 공급원료는 도 9에 도시된 바와 같이 높은 로그 Kp(결합 조건)인 pH 8.0에서 로딩된다. 로드 단계 다음에는 평형 완충액을 사용한 로딩 후 세척이 이어진다. 공정 조건은 표 8 및 9에 제시한다. 시험된 재생 완충액은 표 10에 나열한다.
모든 실험실 규모 크로마토그래피 개발 작업은 GE 헬스케어(Healthcare)
Figure pct00006
KTA™ 에이반트(Avant) 150 및 옴니피트(Omnifit)® 0.66 cm 직경 컬럼을 사용하여 실시하였다.
수지 캡토™ 어드히어
모드 과부하
로드 밀도 300 g/L
로드 조절된 맙셀렉트 슈어 풀, pH 8.0
유속 150 cm/hr
층 높이 20 cm
풀링 조건 0.5 - 0.5 OD
포로스™ 어드히어 크로마토그래피 공정, 단계 정보 및 실행 조건
단계/상 완충액 컬럼 부피(CV)
평형화 50 mM 트리스, 85 mM 아세트산 나트륨, pH 8.0 5
로드 조절된 맙셀렉트 슈어 풀, pH 8.0 필요에 따라
세척액 50 mM 트리스, 85 mM 아세트산 나트륨, pH 8.0 10
재생 세척액 1 완충액 평가:350 mM 아세트산 나트륨, pH 8.3
40 mM NaOAc pH 4.0
40 mM NaOAc pH 5.0
350 mM/40°C/pH 4.0
350 mM/40°C/pH 5.0		 7
재생 세척액 2 상세한 내용은 상기 완충액 목록 및 표 3.1-1을 참조. 5
산 세척액 0.167 M 아세트산, 0.3 M 인산 3
살균 0.5 N NaOH, 1M NaCl 4
저장 0.1 N NaOH 3
재생 세척 완충액 pH 전도도(mS/cm)
350 mM 아세트산 나트륨 8.3 ± 0.1 20.0 ± 3
40 mM 아세트산 나트륨 4.0 ± 0.1 1.0 ± 1.0
40 mM 아세트산 나트륨 5.0 ± 0.1 2.6 ± 1.0
350 mM 아세트산 나트륨 4.0 ± 0.1 6.6 ± 5
350 mM 아세트산 나트륨 5.0 ± 0.1 18.0 ± 5
캡토™ 어드히어 재생 세척 완충액
분석 방법
생성물 단백질 농도
MAb 농도는 278 nm에서 SoloVPE를 사용하여 결정하였다. 하기의 방정식을 사용하여 단백질 농도를 계산하였다.
단백질 농도 = (A280-A320)/(소광 계수*경로 길이) × 희석 인자
총 단백질(mg) = 단백질 농도
Figure pct00007
풀 부피(ml)
재생 세척 단계의 개발
MAB3 캡토™ 어드히어(OL) 컬럼 재생 연구의 개요
과부하 크로마토그래피 작업은 임의의 결합된 불순물을 효과적으로 제거하기 위한 재생 단계를 포함한다. 평가된 재생 완충액은 표 10에 기재되어 있다. 재생 완충액의 평가를 위해, 컬럼을 300 g/L레진으로 로딩하고 두 개의 재생 단계를 통합하였다. 각 실행에서, 재생 완충액의 순서는 가변되었다. 시험된 재생 완충액의 순서는 표 11에 요약되어 있으며 하기에 자세히 설명되었다.
재생 완충액 실행 A 실행 B 실행 C 실행 D 실행 E
350 mM NaOAc, pH 8.3 mS/cm* 1
40 mM/40°C/pH 4.0 2 1 2
350 mM/40°C/pH 4.0 2 1
40 mM/40°C/pH 5.0 1 2
350 mM/40°C/pH 5.0 2 1
재생 세척 단계에 사용되는 완충액의 순서. 숫자는 재생 완충액이 사용된 순서를 나타낸다.
* 7CV 대신 5CV 단계 지속 시간이 사용됨.
평가 실행 A:
재생 단계 1: 350 mM 아세트산 나트륨, pH 8.3
재생 단계 2: 40 mM 아세트산 나트륨, pH 4.0
평가 실행 B:
재생 단계 1: 40 mM 아세트산 나트륨, pH 4.0
재생 단계 2: 350 mM 아세트산 나트륨, pH 4.0
평가 실행 C:
재생 단계 1: 40 mM 아세트산 나트륨, pH 5.0
재생 단계 2: 350 mM 아세트산 나트륨, pH 5.0
평가 실행 D:
재생 단계 1: 350 mM 아세트산 나트륨, pH 4.0
재생 단계 2: 40 mM 아세트산 나트륨, pH 4.0
평가 실행 E:
재생 단계 1: 350 mM 아세트산 나트륨, pH 5.0
재생 단계 2: 40 mM 아세트산 나트륨, pH 5.0
결과
재생 완충액의 효과를 결정하기 위해, 단계 및 압력 프로파일에 걸친 질량 균형(% 단백질 회수율)을 비교하였다. 재생 완충액 단계에서 더 높은 % 회수율은 더 효과적인 재생 완충액을 나타낸다. 표 12는 각 실행에 대한 단계별 질량 균형의 요약을 보여준다. 주요 실험 비교는 하기에 요약되어 있다.
실행 질량 균형(% 단백질 회수율) 총 질량 균형
풀 재생
세척액 1		 재생
세척액 2		 산
세척액		 살균
세척액		 % 단백질 회수
A 75.9 6.7 21.3 0.2 0.2 104.3
B 72.3 28.1 0.2 0.1 0.2 100.9
C 72.3 27.2 0.4 0.7 0.2 100.8
D 72.6 27.7 0.0 0.1 0.1 100.5
E 72.1 26.6 0.6 0.6 0.1 100.0
질량 균형 요약(% 단백질 회수율)
평가 실행 A:
350 mM NaOAc pH 8.3 완충액은 가장 덜 효과적인 재생 세척액이다. 소량의 단백질이 용출된 반면 후속 재생 완충액(40 mM NaOAc, pH 4.0)은 단계에서 더 높은 회수율(%)로 나타낸 바와 같이 더 효과적이었다. 제2 재생 단계 후 컬럼 내에 최소한의 단백질이 남아 있다. 도 10a에 도시된 바와 같이 컬럼 오염이 관찰되지 않았다(압력 스파이크 없음).
평가 실행 B 대 실행 D: 40 mM 트리스 대 350 mM NaOAc pH 4.0
40 mM 및 350 mM NaOAc pH 4.0 완충액은 동등한 효과를 보였다. 두 가지 재생 세척 완충액은 제1 재생 세척 단계로서 사용된 유사한 단백질 회수율을 보였다. 제1 재생 단계 후에 최소한의 단백질이 컬럼 내에 남아 있다. 도 10b 및 도 10a에 도시된 바와 같이 컬럼 오염이 관찰되지 않았다(압력 스파이크 없음).
평가 실행 C 대 실행 E: 40 mM NaOAc 대 350 mM NaOAc pH 5.0
40 mM NaOAc pH 5.0 완충액은 350 mM NaOAc pH 5.0과 비교하여 컬럼에서 단백질을 용출하는 데 개선된 효과를 보였다. 350 mM NaOAc pH 5.0을 재생 세척 1(실행 E)로 사용할 때 재생 세척액 2 동안 더 많은 잔류 단백질이 용출된다. 재생 세척 2에서 증가된 UV 신호가 관찰된다(도 4.5). 도 10c 및 도 10e에 도시된 바와 같이 컬럼 오염이 관찰되지 않았다(압력 스파이크 없음).
평가 실행 B 대 실행 C: pH 4.0 대 pH 5.0
pH 4.0과 5.0은 모두 풀링 단계 후 남아 있는 결합된 단백질을 잘 용출한다; 하지만, pH 4.0 재생 완충액은 결합된 단백질을 용출할 때 pH 5.0보다 더 효과적이다. 크로마토그램을 비교하여 나타낸 바와 같이 pH 4.0 조건에서 재생 후 단계 2에서 잔류 단백질 용출이 더 적다(도 10b-10e).
결론
캡토™ 어드히어 재생 완충액은 pH가 낮을수록 더 효과적이다. 40 mM 및 350 mM pH 4.0 및 5.0은 350 mM NaOAc pH 8.3에 비해 캡토 어드히어 재생 세척 완충액이 더 효과적이다. 40 mM 및 350 mM NaOAc pH 4.0 재생 완충액은 상기 평가에서 가장 효과적인 재생 완충액이었다. 이는 mAB3에 대해 더 낮은 pH에서 수지에 대한 감소된 단백질 결합 및 더 높은 pH에서 증가된 결합(즉, 감소된 단백질 용출 효과)을 나타내는 결합 등온선 데이터와 일치한다(도 9). 살균 단계에서 최소 압력 증가를 관찰하였다. 향후 재생 완충액 연구를 위해 살균 단계 이전에 컬럼에서 단백질을 용출하기 위해 재생 세척 완충액의 수를 확장할 가능성이 있다.

Claims (141)

  1. 재사용을 위한 이온 교환 크로마토그래피 물질을 세척하는 방법이며,
    상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고,
    a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액이 아세트산 나트륨(NaOAc)을 포함하는 것인 단계,
    b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액이 약 0.5 N NaOH를 포함하는 것인 단계, 및
    c) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액이 약 0.1 N NaOH를 포함하는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 재생 완충액이 약 50 내지 약 600 mM NaOAc를 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 재생 완충액이 약 350 mM NaOAc를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재생 완충액의 pH가 약 pH 4.0 내지 11인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재생 완충액의 pH가 약 pH 8.3인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 약 3 내지 약 12 물질 부피의 재생 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 통과되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10 물질 부피의 재생 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 통과되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2 내지 약 12 물질 부피의 살균 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 통과되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10 물질 부피의 살균 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 약 1 내지 5 물질 부피의 저장 완충액에 저장되는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장되는 것인 방법.
  12. 재사용을 위한 이온 교환 크로마토그래피 물질을 세척하는 방법이며,
    상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고,
    a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액이 아세트산 나트륨을 포함하는 것인 단계,
    b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 산 세척액을 통과시키는 단계,
    c) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액이 약 0.5 N NaOH 및 약 1 M NaCl를 포함하는 것인 단계, 및
    d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액이 약 0.1 N NaOH를 포함하는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 재생 완충액 및 제2 재생 완충액이 약 25 내지 약 600 mM NaOAc를 포함하는 것인 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 재생 완충액이 약 350 mM NaOAc를 포함하는 것인 방법.
  15. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 재생 완충액이 약 40 mM NaOAc를 포함하는 것인 방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재생 완충액의 pH가 약 pH 2.0 내지 7.0인 방법.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재생 완충액의 pH가 약 pH 4.0인 방법.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 약 3 내지 약 12 물질 부피의 재생 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 통과되는 것인 방법.
  19. 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 약 7 물질 부피의 재생 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 통과되는 것인 방법.
  20. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산 세척액이 약 167 M NaOAc 및 약 0.3 M 인산인 방법.
  21. 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 내지 약 5 물질 부피의 산 세척액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 통과되는 것인 방법.
  22. 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 약 3 물질 부피의 산 세척액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 통과되는 것인 방법.
  23. 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2 내지 약 12 물질 부피의 살균 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 통과되는 것인 방법.
  24. 제12항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 약 4 물질 부피의 살균 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과하는 것인 방법.
  25. 제12항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 약 1 내지 5 물질 부피의 저장 완충액에 저장되는 것인 방법.
  26. 제12항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 약 3 물질 부피의 저장 완충액에 저장되는 것인 방법.
  27. 재사용을 위한 이온 교환 크로마토그래피 물질을 세척하는 방법이며,
    상기 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 정제에서 과부하 모드로 사용되고,
    a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액이 트리스 및 아세트산 나트륨을 포함하는 것인 단계,
    b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액이 약 0.5 N NaOH를 포함하는 것인 단계, 및
    c) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액이 약 0.1 N NaOH를 포함하는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 재생 완충액이 약 25 내지 약 75 mM 트리스 및 약 50 내지 약 100 mM NaOAc를 포함하는 것인 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 재생 완충액이 약 50 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함하는 것인 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재생 완충액의 pH가 약 pH 7 내지 9인 방법.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재생 완충액의 pH가 약 pH 8.0인 방법.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 약 3 내지 약 12 물질 부피의 재생 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 통과되는 것인 방법.
  33. 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10 물질 부피의 재생 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 통과되는 것인 방법.
  34. 제27항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2 내지 약 12 물질 부피의 살균 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 통과되는 것인 방법.
  35. 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10 물질 부피의 살균 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과하는 것인 방법.
  36. 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 약 1 내지 5 물질 부피의 저장 완충액에 저장되는 것인 방법.
  37. 제27항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장되는 것인 방법.
  38. 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법이며,
    상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고,
    a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계,
    b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩(loading)하는 단계로서, 부하 밀도(load density)는 ≤ 약 1000 g/L인 단계,
    c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계,
    d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계,
    e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액이 아세트산 나트륨을 포함하는 것인 단계,
    f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액이 약 0.5 N NaOH를 포함하는 것인 단계, 및
    g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액이 약 0.1 N NaOH를 포함하는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  39. 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법이며,
    상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고,
    a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계,
    b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥ 20 g/L인 단계,
    c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계,
    d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계,
    e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액이 아세트산 나트륨을 포함하는 것인 단계,
    f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액이 약 0.5 N NaOH를 포함하는 것인 단계, 및
    g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액이 약 0.1 N NaOH를 포함하는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 부하 밀도가 ≥ 70 g/L인 방법.
  41. 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법이며,
    상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고,
    a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계,
    b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 상기 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피의 동적 결합 용량을 초과하는 것인 단계,
    c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계,
    d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계,
    e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액이 아세트산 나트륨을 포함하는 것인 단계,
    f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액이 약 0.5 N NaOH를 포함하는 것인 단계, 및
    g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액이 약 0.1 N NaOH를 포함하는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 부하 밀도가 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량의 약 2배 이상인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 부하 밀도가 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량의 약 2배 내지 약 100배인 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 부하 밀도가 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량의 약 10배인 방법.
  45. 제38항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평형 완충액이 약 20 mM 내지 약 60 mM의 아세트산 나트륨을 포함하는 것인 방법.
  46. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평형 완충액이 약 40 mM의 아세트산 나트륨을 포함하는 것인 방법.
  47. 제38항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평형 완충액의 pH가 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.0인 방법.
  48. 제38항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평형 완충액의 pH가 약 pH 5.5인 방법.
  49. 제38항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 약 3 내지 7 물질 부피의 평형 완충액으로 세척되는 것인 방법.
  50. 제38항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 약 5 물질 부피의 평형 완충액으로 세척되는 것인 방법.
  51. 제38항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재생 완충액이 약 50 내지 약 600 mM NaOAc를 포함하는 것인 방법.
  52. 제38항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재생 완충액이 약 350 mM NaOAc를 포함하는 것인 방법.
  53. 제38항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재생 완충액의 pH가 약 pH 4.0 내지 11인 방법.
  54. 제38항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재생 완충액의 pH가 약 pH 8.3인 방법.
  55. 제38항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 약 3 내지 약 12 물질 부피의 재생 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 통과되는 것인 방법.
  56. 제38항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10 물질 부피의 재생 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 통과되는 것인 방법.
  57. 제38항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2 내지 약 12 물질 부피의 살균 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 통과되는 것인 방법.
  58. 제38항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10 물질 부피의 살균 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과하는 것인 방법.
  59. 제38항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 약 1 내지 5 물질 부피의 저장 완충액에 저장되는 것인 방법.
  60. 제38항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장되는 것인 방법.
  61. 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법이며,
    상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고,
    a) 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계,
    b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 상기 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피의 동적 결합 용량을 초과하는 것인 단계,
    c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계,
    d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계,
    e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액이 아세트산 나트륨을 포함하는 것인 단계,
    f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 산 세척액을 통과시키는 단계,
    g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액이 약 0.5 N NaOH 및 약 1 M NaCl를 포함하는 단계, 및
    h) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액이 약 0.1 N NaOH를 포함하는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 부하 밀도가 ≤ 약 1000 g/L인 방법.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 상기 부하 밀도가 ≥ 약 20 g/L인 방법.
  64. 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부하 밀도가 ≥ 약 70 g/L인 방법.
  65. 제61항에 있어서, 상기 부하 밀도가 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량의 약 2배 이상인 방법.
  66. 제61항에 있어서, 상기 부하 밀도가 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량의 약 2배 내지 약 100배인 방법.
  67. 제61항에 있어서, 상기 부하 밀도가 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량의 약 10배인 방법.
  68. 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평형 완충액이 약 50 mM 내지 약 100 mM NaOAc 및 약 25 mM 내지 약 75 mM 트리스를 포함하는 것인 방법.
  69. 제61항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평형 완충액이 약 85 mM 아세트산 나트륨 및 약 50 mM 트리스를 포함하는 것인 방법.
  70. 제61항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평형 완충액의 pH가 약 pH 6.0 내지 약 pH 10.0인 방법.
  71. 제61항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평형 완충액의 pH가 약 pH 8.0인 방법.
  72. 제61항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 약 5 내지 약 15 물질 부피의 평형 완충액으로 세척되는 것인 방법.
  73. 제61항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 약 10 물질 부피의 평형 완충액으로 세척되는 것인 방법.
  74. 제61항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재생 완충액이 약 25 내지 약 600 mM NaOAc를 포함하는 것인 방법.
  75. 제61항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재생 완충액이 약 350 mM NaOAc를 포함하는 것인 방법.
  76. 제61항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재생 완충액이 약 40 mM NaOAc를 포함하는 것인 방법.
  77. 제61항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재생 완충액의 pH가 약 pH 2.0 내지 7.0인 방법.
  78. 제61항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재생 완충액의 pH가 약 pH 4.0인 방법.
  79. 제61항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 약 3 내지 약 12 물질 부피의 상기 재생 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 통과되는 것인 방법.
  80. 제61항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 약 7 물질 부피의 상기 재생 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 통과되는 것인 방법.
  81. 제61항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산 세척액이 약 167 M NaOAc 및 약 0.3 M 인산인 방법.
  82. 제61항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 내지 약 5 물질 부피의 산 세척액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 통과되는 것인 방법.
  83. 제61항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 약 3 물질 부피의 산 세척액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 통과되는 것인 방법.
  84. 제61항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2 내지 약 12 물질 부피의 살균 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 통과되는 것인 방법.
  85. 제61항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 약 4 물질 부피의 살균 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과하는 것인 방법.
  86. 제61항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 약 1 내지 5 물질 부피의 저장 완충액에 저장되는 것인 방법.
  87. 제61항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 약 3 물질 부피의 저장 완충액에 저장되는 것인 방법.
  88. 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법이며,
    상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고,
    a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계,
    b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≤ 약 1000 g/L인 단계,
    c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계,
    d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계,
    e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액이 트리스 및 아세트산 나트륨을 포함하는 것인 단계,
    f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액이 약 0.5 N NaOH를 포함하는 것인 단계, 및
    g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액이 약 0.1 N NaOH를 포함하는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  89. 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법이며,
    상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고,
    a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계,
    b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 부하 밀도는 ≥ 20 g/L인 단계,
    c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계,
    d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계,
    e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액이 트리스 및 아세트산 나트륨을 포함하는 것인 단계,
    f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액이 약 0.5 N NaOH를 포함하는 것인 단계, 및
    g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액이 약 0.1 N NaOH를 포함하는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 부하 밀도가 ≥ 70 g/L인 방법.
  91. 이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하여 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법이며,
    상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 재사용에 적합하고,
    a) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 평형화시키는 단계,
    b) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 상기 조성물을 로딩하는 단계로서, 상기 부하 밀도는 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피의 동적 결합 용량을 초과하는 것인 단계,
    c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 분획들을 수집하는 단계,
    d) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 평형 완충액으로 세척하는 단계,
    e) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 재생 완충액이 트리스 및 아세트산 나트륨을 포함하는 것인 단계,
    f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 살균 완충액을 통과시키는 단계로서, 상기 살균 완충액이 약 0.5 N NaOH를 포함하는 것인 단계, 및
    g) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 저장 완충액에 저장하는 단계로서, 상기 저장 완충액이 약 0.1 N NaOH를 포함하는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  92. 제91항에 있어서, 상기 부하 밀도가 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량의 약 2배 이상인 방법.
  93. 제91항에 있어서, 상기 부하 밀도가 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량의 약 2배 내지 약 100배인 방법.
  94. 제91항에 있어서, 상기 부하 밀도가 상기 폴리펩티드에 대한 이온 교환 크로마토그래피 물질의 동적 결합 용량의 약 10배인 방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 평형 완충액이 약 20 mM 내지 약 60 mM 아세트산 나트륨을 포함하는 것인 방법.
  96. 제88항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평형 완충액이 약 40 mM 아세트산 나트륨을 포함하는 것인 방법.
  97. 제88항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평형 완충액의 pH가 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.0인 방법.
  98. 제88항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평형 완충액의 pH가 약 pH 5.5인 방법.
  99. 제88항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 약 3 내지 7 물질 부피의 평형 완충액으로 세척되는 것인 방법.
  100. 제88항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 약 5 물질 부피의 평형 완충액으로 세척되는 것인 방법.
  101. 제88항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재생 완충액이 약 25 내지 약 75 mM 트리스 및 약 50 내지 약 100 mM NaOAc를 포함하는 것인 방법.
  102. 제88항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재생 완충액이 약 50 mM 트리스 및 약 85 mM NaOAc를 포함하는 것인 방법.
  103. 제88항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재생 완충액의 pH가 약 pH 7 내지 9인 방법.
  104. 제88항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재생 완충액의 pH가 약 pH 8.0인 방법.
  105. 제88항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 약 3 내지 약 12 물질 부피의 재생 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 통과되는 것인 방법.
  106. 제88항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10 물질 부피의 재생 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 통과되는 것인 방법.
  107. 제88항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2 내지 약 12 물질 부피의 살균 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 통과되는 것인 방법.
  108. 제88항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10 물질 부피의 살균 완충액이 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 재생 완충액을 통과하는 것인 방법.
  109. 제88항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 약 1 내지 5 물질 부피의 저장 완충액에 저장되는 것인 방법.
  110. 제88항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 약 4 물질 부피의 저장 완충액에 저장되는 것인 방법.
  111. 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 크로마토그래피 칼럼 내에 있는 것인 방법.
  112. 제1항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 양이온 교환 크로마토그래피 물질인 방법.
  113. 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 지지체 기질에 연결된 술포프로필 모이어티를 포함하는 것인 방법.
  114. 제113항에 있어서, 상기 지지체 기질이 가교 결합된 폴리(스티렌디비닐벤젠)을 포함하는 것인 방법.
  115. 제1항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 포로스(POROS)™ HS50 물질인 방법.
  116. 제1항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 혼합형 양이온 교환 물질인 방법.
  117. 제116항에 있어서, 상기 혼합형 양이온 교환 물질이 캡토(Capto) MMC™, 캡토 MMC™ 임프레스(ImpRes), 누비아(Nuvia)™ c프라임(Prime)™, 또는 토요펄(Toyopearl) MX Trp-650M인 방법.
  118. 제1항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 음이온 교환 크로마토그래피 물질인 방법.
  119. 제1항 내지 제111항 중 어느 한 항 또는 제118항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 지지체 기질에 연결된 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민 또는 4차 암모늄 이온 작용기, 폴리아민 작용기, 또는 디에틸아미노에틸 작용기를 포함하는 것인 방법.
  120. 제1항 내지 제111항, 제118항 및 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 혼합형 음이온 교환 물질인 방법.
  121. 제120항에 있어서, 상기 혼합형 음이온 교환 물질이 캡토 어드히어(Capto Adhere)™ 또는 캡토 어드히어™ 임프레스인 방법.
  122. 제1항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 상기 폴리펩티드의 대규모 생산에 이용되는 것인 방법.
  123. 제1항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 항체, 면역부착소, Fc 함유 단백질 또는 면역접합체인 방법.
  124. 제123항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 항체인 방법.
  125. 제124항에 있어서, 상기 항체가 단일클론 항체인 방법.
  126. 제125항에 있어서, 상기 단일클론 항체가 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체인 방법.
  127. 제125항 또는 제126항에 있어서, 상기 단일클론 항체가 IgG 단일클론 항체인 방법.
  128. 제124항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 항원 결합 단편인 방법.
  129. 제128항에 있어서, 상기 항원 결합 단편이 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv, 디-scFv, 비-scFv, 탠덤(디, 트리)-scFv, Fv, sdAb, 3작용성 항체, BiTE, 디아바디 또는 트리아바디인 방법.
  130. 제124항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 이중특이적 항체인 방법.
  131. 제124항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 항 CD20 항체, 항 CD40 항체, 항 HER2 항체, 항 IL6 항체, 항 IgE 항체, 항 IL13 항체, 항 플루 A 항체, 항 TIGIT 항체, 항 PD-L1 항체, 항 VEGF-A 항체, 항 VEGF-A/ANG2 항체, 항 CD79b 항체, 항 ST2 항체, 항 인자 D 항체, 항 인자 IX 항체, 항 인자 X 항체, 항 아베타 항체, 항 타우 항체, 항 CEA 항체, 항 CEA/CD3 항체, 항 CD20/CD3 항체, 항 FcRH5/CD3 항체, 항 Her2/CD3 항체, 항 FGFR1/KLB 항체, FAP-4-1 BBL 융합 단백질, 및 FAP-IL2v 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  132. 제124항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 오크렐리주맙, 퍼투주맙, 트라스투주맙, 토실리주맙, 파리시맙, 폴라투주맙, 간테네루맙, 시비사타맙, 크레네주맙, 모수네투주맙, 티라골루맙, 베바시주맙, 리툭시맙, 아테졸리주맙, 오비누투주맙, 람팔리주맙, 레브리키주맙, 오말리주맙, 라니비주맙, 에미시주맙, 셀리크렐루맙, 프라시네주맙, RO6874281, 및 RO7122290로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  133. 제124항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통과하기 전에 친화 크로마토그래피 물질을 사용하여 정제되고,
    상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 양이온 교환 크로마토그래피 물질인
    방법.
  134. 제133항에 있어서, 상기 친화성 물질이 단백질 A 크로마토그래피, 단백질 G 크로마토그래피, 단백질 A/G 크로마토그래피, 단백질 L 크로마토그래피, FcXL 크로마토그래피, 단백질 XL 크로마토그래피, 카파 크로마토그래피, 및 카파XL 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  135. 제134항에 있어서, 상기 단백질 A 친화성 물질이 맙셀렉트(MabSelect) 물질, 맙셀렉트 슈어(SuRe)™ 물질 또는 맙셀렉트 슈어™ LX 물질인 방법.
  136. 제1항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충액이 약 15 내지 20 물질 부피/시간으로 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 통과되는 것인 방법.
  137. 제1항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재생 완충액이 약 10 물질 부피/시간으로 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 통해 통과되는 것인 방법.
  138. 제1항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 숙주 세포 내에서 생성되는 것인 방법.
  139. 제138항에 있어서, 상기 숙주 세포가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인 방법.
  140. 제1항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불순물이 IgG 단편, 숙주 세포 단백질, 또는 숙주 세포 핵산 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  141. 제140항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 CHO 세포에서 생성되고,
    상기 불순물이 CHO 숙주 세포 단백질(CHOP) 및/또는 CHO 핵산을 포함하는 것인 방법.
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