CN1051317C - 用置换色谱纯化血红蛋白产物的方法 - Google Patents

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Abstract

通过两步置换色谱法从血红蛋白粗溶液中纯化血红蛋白以得到含至少99%预选血红蛋白的水溶液。步骤之一是在阴离子交换条件下完成的，而另一个则在阳离子交换条件下。在两步骤中，均使所述交换柱超载以便用与柱亲合性更强的杂质，并用不纯的血红蛋白溶液作为置换剂置换血红蛋白。通常首先完成阴离子交换，用比血红蛋白酸性更强的杂质从柱上置换所述血红蛋白，而其自身仍吸附在柱上，以达分离目的，然后完成阳离子交换过程，在该步骤中用来自第一步骤的洗脱液，在超载条件下，用碱性更强的杂质从柱上置换血红蛋白以得到基本上纯的血红蛋白溶液。

Description

用置换色谱纯化血红蛋白产物的方法
本发明涉及以商业规模经色谱纯化血红蛋白的方法，更具体地说，涉及纯化血红蛋白的层析过程，以得到其中血红蛋白占溶质至少99％的溶液。本发明还涉及作为血液替代品的具有意外的有益特征的新血红蛋白产物。
基于血红蛋白的血液替代品开发一直受到人们的关注，并且最近的发展表明：在适当修饰后，如分子内交联和在某些情况下聚合后，来自哺乳动物血液细胞的血红蛋白作为血液替代品，表现出广阔的前途。但正如已进行的研究，需要稳定提高血红蛋白的纯度。曾经认为血红蛋白只需无基质，通过洗涤并缓慢溶解红细胞，然后过滤溶胞产物即可达到所述状态。随后，发现在动物试验中，存在痕迹量条质如磷脂的情况下，会导致与产物发生更特异性的反应，如血管收缩。甚至在产物经数次透滤步骤后，仍含有不可接受的高痕量潜在有害杂质如红细胞酶、血红蛋白的修饰和变异体形式，磷脂和表面抗原。
在血替代品领域，特别是血红蛋白为基础的氧载体，最紧迫的任务之一是发展成本合算的方法，以商业规模高效并经济地纯化血红蛋白。它必须胜过作为血液替代品的其他潜在血液体积膨胀剂和携带氧的液体。
在分析分离中，分离和分析时间是很重要的，对于商业或半商业规模的使用，制备色谱中的重要参数有：
-在特定的纯度水平，每单位时间分离的物质量(生产率)；和
-方法的实用性，如柱大小，介质、缓冲液、设备、组分和试剂的再循环与再使用等等。
还没有报道过符合标准(即成本低、效率高的生产方法)的纯化血红蛋白的方法。
血红蛋白为基础的血液替代品必需是以单一血红蛋白形式，或者(如果不只一种形式存在，则)一种仔细控制的已知血红蛋白的组合物为基础。因此，一种成功的血红蛋白纯化方法必需能将一种血红蛋白形式与另一种分开，并能从污染的红细胞组分，如红细胞酶、蛋白质、磷脂和抗原中分离所需的血红蛋白形式。
已经用色谱法纯化血红蛋白溶液。美国专利4,925,474(Hsia等人)描述了用亲和色谱技术纯化血红蛋白，在所用的柱中，与血红蛋白的D PG位点表现有选择化学结合亲和性的配位体与该柱的固相结合。
也使用离子交换色谱技术完成血红蛋白的纯化。离子交换色谱技术的基本原理是已知的。将不同种混合物溶液用于适当制备的离子交换柱。每种混合物对于柱上的化学反应基有不同的亲和性。通过改变柱上的条件，如溶液的pH，可选择性地使每种结合或从柱上洗脱，以便从混合物单独地分离出一种。除用于小规模的操作与分析工作外，纯化蛋白质如血红蛋白技术的应用没有任何吸引力。若以制造规模纯化例如作为携带氧的恢复性液体(血液替代品)的血红蛋白，则常规使用的技术是行不通的。吸附并随后从色谱柱上洗脱的血红蛋白量非常大，以致对柱大小的要求变得难以想象的大且昂贵。
Christensen等人(J.Biochem.Phys.17(1988).143-154)报道了人血红蛋白的色谱纯化方法。所用的方法代表了一种标准的离子交换色谱方法，它不能提供实用的按比例扩大至生产水平的可能。
Winslow和Chapman(“Pilot-scale Preparatior ofHemoglobin Solutions”，Methods in Enzymology，”Vol.231，P3(1994)描述了用过期的人血为起始材料，纯化无基质血红蛋白(SFH)，高度纯化的血红蛋白AO和交联的血红蛋白的方法。过滤制备SFH。用强阴离子交换介质和离子强度梯度，通过生产规模色谱从SFH制备血红蛋白AO。
Christensen等人和Winslow等人均报告了在LettermanArmy Institute for Research(LAIR)(现称为Walter ReedArmy Institute of Research)所做的工作。
美国专利5,084,588 Rausch和Feola(Biopure)描述了标准的用于分离和纯化血红蛋白的阴离子和阳离子交换色谱法，就阴离子交换色谱而言，在该专利中列出了三种标准方法：
a)在提高的pH下结合Hb，然后用逐渐降低的pH梯度或较低pH的分极梯度洗脱；
b)在高pH，低离子强度下结合Hb，然后用盐梯度洗脱；
c)在血红蛋白不与阴离子交换器结合，而且通过柱子不会被卡住的pH条件下装料，杂质(更酸的污染物)被束缚在柱上。
方法a)和b)已经做了广泛的报道，但对于大规模生产而言并没有吸引力，原因在于低装料能力限制了充分分离血红蛋白产物。这些装料能力通常仅为20-30mg/ml，而无法得到用于商业规模纯化血红蛋白的大而昂贵的柱子。例如，一个50mg剂量的最终血红蛋白为基础的氧载体(HbOC)需要一个1.5-2.5升的柱子。
而方法(c)表面看来是最可行的，然而实际上，正常成年人、未修饰血红蛋白AO的某些主要杂质，如HbAlc的色谱特性并没有很大差别，而无法实际应用该方法。
对于哺乳动物血红蛋白阳离子交换色谱标准方法有相似的限制。
美国专利5,084,588还公开了牛血红蛋白溶液，其中99.9％以上的蛋白质是牛血红蛋白，但没有鉴别该蛋白质组分的资料。
本发明的一个目的是提供纯化血红蛋白的新色谱方法。
本发明的另一目的是提供以商业规模和可接受的实用方式，从含至少60％血红蛋白的其污染水溶液中得到纯度大于99％的血红蛋白水溶液的色谱生产方法。
本发明另一更具体的目的是提供商业量的血红蛋白或交联血红蛋白水溶液，其中血红蛋或交联血红蛋白占溶质的至少99％，并且是纯化状态的，作为血液替代品使用时，表现出此前未报道过的体内特性。
本发明提供一种生产方法，使预选择的血红蛋白，Hb水溶液(其中Hb占溶解物质的约60％到约99％)经两步骤的离子交换色谱。步骤之一是阴离子交换色谱，另一个是阳离子交换色谱可以任一顺序完成上述两种离子交换色谱。使预选择的血红蛋白，如HbAO粗溶液在所选的条件下经第一步色谱，如阴离子交换色谱以便所有的混合溶质先吸附在色谱柱的图相上。对于阴离子交换，要求相对高的pH。还要选择条件以便使柱(使用低离子强度的原料溶液)能够高效装料，从而使固体色谱介质上，基本所有的可通过位点均由原料溶液占据。该步骤收集的洗脱液没有蛋白质产物。通过加入另外体积的上述含水原料溶液，从而在所选择的条件下完成HbAO和与柱有较低亲和性的杂质的置换。由此得到的条件(本文称为一种过载条件)会导致与柱亲和性较大的杂质置换所选的Hb和从柱上洗脱下与柱亲和性较低的杂质。若第一步骤的色谱分离是阴离子交换色谱，酸性比所选Hb大的杂质被吸附在色谱柱的固相上，并由此从选择的Hb中被分离出来，Hb似乎与碱性更大的杂质一起均在洗脱液中。若选阳离子交换色谱为第一步，则与柱亲和性更大的碱性较强的杂质被分离，酸性更强的杂质和所选的血红蛋白出现在洗脱液中。
然后，在本发明的第二色谱步骤中，在不同pH条件下对从第一柱下来的洗脱液中含有的部分纯化的血红蛋白完成第二个离子交换色谱步骤，若从第一柱下来的洗脱液中含血红蛋白和碱性较强的成份，则第二步色谱是阳离子交换色谱，反之亦然。向第二柱重复注入所述不纯溶液直到饱和装料并超过，以便在柱中产生过载状态。在过载状态，于所选的条件下，由于杂质的亲和性更大，因此通过置换从柱中洗脱预选的血红蛋白，由此在第二柱的洗脱液中，收集了纯度很高的血红蛋白。因此本发明的方法可以被称为“两步自置换色谱法”。
结果，以特别纯的形式，通常大于99％的纯度和商业上引人注目的产率从柱上洗脱下Hb。比所选Hb酸性更大的杂质被吸附在一个柱的树脂上，比所选Hb碱性更大的杂质被吸附在另一个柱的树脂上。用常规清洗和再生方法。可以很容易地再生这些柱子。
特别是以大规模及生产规模成功操作本法的一个重要因素是选择性地使柱高度负载杂质及使Hb类洗脱。
若用本发明方法纯化人血红蛋白AO，则会产生一种具有迄今未报告过的组成和特性的新人血红蛋白。因此该血红蛋白是本发明的另一方面，与本文描述的纯化方法相提并论。该产物具有以前未见或报告过的关于人血红蛋白AO产物的非常令人满意的特性和特征，并且作为血液替代品主要成分特别有益。这些特性是基本上完全没有病毒颗粒，特别是脂包被的病毒颗粒，当体内施用时，基本没有产物表现的血管作用活性；与相似的施用其他血红蛋白制的相比，减少释放的乳酸脱氢酶说明在体外培养中，对内皮细胞没有毒性。另外，从作为血液替代品所需的血红蛋白的标准特性如没有内毒素和没有其他致热原来看，与其他已知血红蛋白制品相比，本发明的产物也有改善。
在附图中：
图1图示说明本发明优选方法的开始的阴离子交换部分。
图2相似地说明本发明优选方法的第二步阳离子部分。
图3是从下文实施例2和3的结果得到的分析阴离子交换色谱；
图4是从下文实施例4的结果得到的分析阴离子交换色谱；
图5是下文实施例8结果的图示。
图6是下文实施例13产物分析的纸导电聚焦带的拷贝。
图7是下文实施例13中报告的染色和印迹实验结果的拷贝。
图8是下文实施例14结果的图示。
图9和9A是下文实施例15结果的图示；和
图10是下文实施例16结果的图示。
正如它所命名的置换色谱，或置换洗脱是蛋白质分离领域中的已知技术。它是从色谱柱中回收样品的三模式之一。当用于从溶液蛋白质混合物中分离不同的蛋白质时，亲和性较大的蛋白质将置换基质上亲和性较小的蛋白质，以便亲和性逐渐降低的蛋白质被置于柱内，从入口到出口。当蛋白质置换其他蛋白质时，在各种之间通常不形成尖锐的分界线。因此禁止用该技术制备高度的单一蛋白质溶液。如果选择一种不同的、非蛋白质类置换，结果可能是色谱基质与这种有很高亲和性的物质结合，很难再生以便用于再使用。
在制备纯化的人血红蛋白AO(HbAo)方面，该方法显示了其主要的商业功用，并为了方便将参照其作具体描述。然而该方法并不限于HbAo纯化，它还适用于其他预选的血红蛋白类，如选择的交联的血红蛋白衍生物，牛血红蛋白变异体，其他血红蛋白变异体，如胎血红蛋白，镰刀细胞血红蛋白等，遗传工程方法生产的血红蛋白等。
对于以商业规模纯化血红蛋白HbAo，生产血液替代品，本发明的方法特别有实用性。它提供了非常高效的柱负载能力。结果，它可以利用相对小的柱纯化相对大体积的不纯血红蛋白溶液。可以分批或连续进行以纯化由标准技术从红细胞得到的批量血红蛋白溶液，所述溶液通常含80％的血红蛋白，且还有各种杂质，包括蛋白质和非蛋白质的。此外，用不纯的血红蛋白溶液本身作为置换介质。由此避免了不同置换剂的供应和使用，以及其附带的不便利、繁锁和昂贵。
本发明技术涉及的制备纯化HbAo溶液的总过程是由正常的成人红细胞开始的。收集它们并任选地经过滤除去白细胞。洗涤细胞以除去血清蛋白质，然后将其溶解以提取血红蛋白和其他细胞胞组分。过滤溶胞产物以除去细胞膜，然后将所得血红蛋白提取物透滤并浓缩。用一氧化碳处理不纯的血红蛋白提取物以形成CO-Hb复合物，然后加热灭菌，由此灭活溶液中的病毒杂质。然后将其离心并过滤以除去残余物和细胞残片。现在准备介绍本发明的自置换方法。
根据本发明的优选实施方案，第一步的色谱方法是阴离子交换过程，第二步是阳离子交换过程，首先，优选的在高pH，如pH7-10，优选的pH8.5-9.0以及低离子强度，即低导电率的条件下，完成阴离子交换过程。导电率适宜地低于3ms(毫西门子)，优选地低于1ms。上述条件涉及一种基本无盐的缓冲液。在这些条件下，所需的HbAo与其他种类一起，开始与柱介质结合。由于不纯的HbAo溶液不断注入柱内，因此与基质的亲和性比HbAo大的那些种类(通常为酸性更强的杂质)逐渐从柱上置换了HbAo和碱性更强的杂质。最终，达到柱的超载，以致置换了所有的HbAo和碱性更强的杂质，仅剩下与基质结合的酸性更强的杂质。在多数情况下，这是一种远超过制造商要求的柱负载。因此在该步完成酸性更强的杂质与HbAo的色谱分离。
以缓慢的线流速，不超过10cm/分，优选的以约1cm/分完成不纯血红蛋白溶液的供料。这样满足柱的动力平衡。原料浓度范围并不重要，但适宜地是在0.1-20％，优选的2-7％。
通过分析柱流出物来监测是否达到超载状态—若流出物的组分没有或仅有痕量的酸性杂质，则已达到了最大的实际柱负载。
附图1图示说明本发明的阴离子交换过程。用一种溶液给图1方法步骤A所示的含有化学基团：-N+R3(一般为阴离子交换树脂，但仅为举例)的离子交换柱供料，所述溶液含星号代表的酸性强的杂质，椭圆形代表HbAo，长方形代表的碱性更强的杂质的混合物，在容量负载，阶段B通过静电荷，基本上柱的所有活性化学基团N-R3均与混合物中的一种结合。
更多的相同溶液被供与有负载能力的柱以达到超载状态，如在图1C阶段中说明的。现在，所有碱性更强的杂质(长方形)和一些HbAo(由椭圆形代表的)均被酸性更强的杂质(由星号表示)(在这些条件下，与柱表现出更强的亲和性)置换。继续向超载柱加入更多的相同溶液，达到图1中说明的D阶段。在此阶段酸性物质基本上替代了全部柱中HbAo，因为在选择条件下有更大亲合性。到此，从柱上收集的流去物基础上不含有可检测量的酸性杂质。因此得到相当纯的HbAo溶液，但仍含一点碱性物质(杂质)。
本发明优选方法的第二步骤使用阳离子交换柱，用第一柱的洗脱液供料，以达到相似的超载状态。所需的HbAo和其他，不需的碱性更强的杂质被以超载量结合。用来自第一柱的部分纯化的血红蛋白溶液持续给第二柱供料。仍使用相对慢的供料速度，适宜的为10cm/分或更慢，优选的约1cm/分，以使固相和液相动力平衡。
在将洗脱液负载到阳离子交换柱上之前，将第一柱洗脱液的pH适当调至pH5-9的范围，优选的为pH6.5-8.5，最佳为pH7-8。使用低离子强度的溶液，即导电率低于3ms，优选的低于1ms。若使用很慢的流速和很高的原料稀释度，则只有2.5ms的导电率是合适的。仍使用超载状态。较高亲和性的蛋白质杂质(即比HbAo碱性强的那些)从柱上置换了HbAo，因此，以特别纯的形式洗脱并回收了HbAo。
附图2图示说明在与图1相似的方法，携带带SO3基的阳离子交换柱中发生的部分过程。适当调正pH后，用第一柱的洗脱液给该柱供料，开始，在A阶段，用与柱上化学基静电结合的HbAo(椭圆)和碱性更强的杂质(长方形)均达到最大负载。而这些是由磺基说明的，也可选用其他替代物如羧基。连续给柱加入洗脱剂以达到图2阶段B所说明的负载状态，其中由于在这些条件下，其与柱的亲和性更大，所以碱性较强的杂质取代了柱上的HbAo。由于连续给超载柱供料(如图2中的C阶段)因此在从该柱下来的洗脱液溶液中，置换并得到几乎100％纯的HbAo。因此，柱负载越高，则柱的纯化HbAo的回收百分比越高。监控洗脱液以检测洗脱液中的碱类(长方形)的存在。无法从柱子经置换再回收HbAo，此时定义为最大负载。
本文所用的术语碱性更强的杂质指以比洗脱HbAo更高的pH从柱上洗脱的那些杂质。相反，术语“酸性更强的杂质”指以比洗脱HbAo所要求的更低的pH从柱上洗脱的那些杂质。在本发明优选的方法中，首先完成阴离子交换色谱，在HbAo前洗脱碱性较强的杂质，在HbAo后洗脱酸性较强的杂质。根据色谱所用的离子交换介质，随洗脱顺序而出现的微小变化，可以观察到不同的洗脱曲线。
对于第一柱和第二柱，应根据不纯血红蛋白溶液浓度选择不纯血红蛋白溶液的最佳流速。对于浓度为2-7％的浓缩范围血红蛋白溶液，1cm/分或更低的线性流速是最佳的。2cm/分的流速可成功地用于更稀的溶液，例如低于1％的Hb。低负载能力的离子交换色谱的分辨能力通常对于线性流速不敏感；然而，对于本发明的方法，色谱过程中的动力平衡很依赖于流速。但供料浓度在两个步骤中均不重要。
用本发明的置换色谱法，先使用阴离子交换色谱除去酸性强的成分，然后用阳离子交换色谱除去碱性强的成分，人们可以以商业规模得到高产率的极纯的HbAo，完全没有可检测量的其他蛋白质如血清蛋白和膜蛋白。分析阴离交换色谱的检测纯度超过99％，通常超过99.5％。这些步骤的有效能力至少在数量级上大于普通色谱方法所观察到的能力。除除去蛋白质杂质外，本发明方法还基本上完全除去了修饰和其他未需形式的血红蛋白，剩下基本上纯的(＞99.5％)HbAo。此外，如下文更详细描述的，也可以基本上完全除去包被的病毒颗粒，活性的或失活的。
在下列表1中，列举了与用标准离子交换吸附/洗脱方法相比，本发明方法的各种优点。下文“自我置换”栏中的数字得自本发明方法的具体实施例。“吸附/洗脱”栏中的得自上述Winslow等人的文献。
         表1
用吸附/洗脱色谱对自我置换色谱纯化血红蛋白AO的操作参数
                           表1
    自我置换   吸附/洗脱
  柱体积柱容量负载的Hb克数回收率％收集的Hb克数洗脱用的缓冲液体积     5 and 3L200-300mg/ml1234811000132L     120L15mg/ml1818551000900L
+Winslow and Chapman，op.cit.
从这些数字清楚地看出：本发明的自我置换色谱法用相对小的柱可以运行得更快。可以在低压条件和常温下完成。使用相对小的柱体积可以得到是常规色谱方法所报告能力10-20倍的有效负载能力。这样可以降低水消耗，减少废水处理以及降低缓冲液的需求，所有这些均显著提高了该方法的商业实用性。
可将构成阳离子交换柱洗脱液的纯化血红蛋白溶液透滤至所选的缓冲液中，然后调至所需的HbAo浓度。
对于本发明方法中作为固相的离子交换凝胶物质没有特别的要求。选择是本领域熟知的技术。可以使用任何普通的、商业可得到的上述凝胶，只要在被分离物种所选的亲和条件下，成功地将其加以改变用于离子交换模式。离子交换介质支持物的一般类型包括大孔的、大网络和无孔型、二乙烯基苯—交联的聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸酯、聚亚烷基胺、纤维素、右旋糖、琼脂糖、硅石、陶瓷、玻璃、矾土和金属颗粒等。市售的支持物包括以商标POROS介质，Fractogel，HyperD，Dowex，Amberlite，Duolite，Bio-Rex，chelex，Sephadex，Sepharose，Toyopearl，Macro-prep，Bio-Protocal，Accell，Mono类等销售的。为离子交换目的附于上述支持物上的功能基团包括：磺酸盐(酯)、硫代丙基、羧甲基羧化物、二氧磷基，季铵、季氨基乙基，聚乙烯亚胺、三甲基氨基乙基、二乙基氨基乙基、二甲基氨基乙基、天冬酰胺等。
还可用本发明方法生产至少99.5％纯度的HbAo溶液，并且出人意料的，没有病毒颗粒(活性或失活的)，特别是脂包被的病毒如HIV，单纯性疱疹病毒(HSV)、牛腹泻病毒，在许多情形下，所述包被病毒是人丙型肝炎病毒的一种模式。这些是最危险并令人烦恼的污染血液的病毒。这是使用本发明而产生的一种显著的意外优点，在试验本方法并进行结果分析前，无法预测到这一点，而按上述，本发明优选的方法涉及在纯化前的灭菌步骤以使病毒失活，将病毒颗粒的除去作为纯化方法的一部是特别有益的。它从血液替代物中除去任何在灭菌后仍存活的活性病毒颗粒，以及任何残留的失活病毒颗粒。不用使用任何附加的具体病毒颗粒清除步骤，并不用加入任何用于病毒除去目的的特定试剂等即可达到所有上述目的。可以基本上完全除脂包被的病毒。也可使其他病毒的数量显著降低。
本发明的血红蛋白产物比任何以前报告的血红蛋白产物(迄今申请人所知的)有更高的纯度。可能由于其异常的纯度状态，或可能由于其他，还不能完全解释的因素，至少对于大规模生产的本发明产物表现出以前所报告的血红蛋白产物所没有的意想不到的并且非常有益的特性。
更具体地说，本发明的产物HbAo没有经等电聚焦和免疫印迹分析所确定的所有红细胞膜蛋白。经免疫吸附技术检测，存在痕迹量的人血清白蛋白(HSA)，至少低于4μg，且一般为2-4μg/100mgHb。在本发明产物中有时发现的其他可检测蛋白仅仅是血红蛋白的α和β球蛋白链残断。并且每100mg血红蛋白不超过1μg。在这样极高的纯度水平，本发明的产物是独一无二的，并表现出下述意想不到的特性。其中之一是已降低的或根本没有血管收缩活性。另一种是对培养内皮细胞没有毒性。
以前报告的高度纯化的血红蛋白(包括交联和未交联的)会导入对输注(1，2)的压力反应。由于显而易见，产物被高度纯化，因此目前的理论认为，一定是血红蛋白本身的一种内在特性造成了这种情况。具体地说，认为它是血红蛋白与造成这种结果的氧化氮结合的能力。氧化氮(也称为内皮衍生的释放因子)是一种强血管舒张剂，由内皮细胞通过氧化氮合成酶的中间产物合成的。由于血红蛋白分子以高亲和性与氧化氮结合，因此推测(并且目前也被接受)静脉内输注血红蛋白溶液，特别是非交联的血红蛋白溶液使氧化氮得到吸收，使血压升高，血管收缩。
从等体积交换和出血性休克看，发现本发明的产物没有血管升压活性完全是意想不到的，并与目前的理论及与血红蛋白内在特性有关的看法大相径庭。本发明认为并不完全是血红蛋白的内在特性造成了以前报告的其血管收缩活性，但至少部分应归因于其中极少量存在并此前未成功除去的杂质，尽管以前报道的血红蛋白有极高的纯度水平。
在使用一般申请的美国专利申请系列No.08/231,945(1994年4月21日申请)中描述的方法而由本发明产物制备的交联和聚合血红蛋白产物中，保持了本发明产物没有血管升压活性的好处。
另外，本发明产物在体外施用时，与以前报告的血红蛋白相比，对内皮细胞表现出大大降低了的毒性。对于对照的内皮细胞培养物培养基中的乳酸脱氢酶水平来说，用以前描述的氧血红蛋白(包括色谱纯化的血红蛋白)溶液所做的研究已表明有细胞损伤(由内皮细胞培养物培养基在乳酸脱氢酶方面有显著的提高而说明的)。乳酸脱氢酶是细胞损伤的标志。由于检测溶液含高纯化状态的氧血红蛋白，因此推测并接受这种毒性是氧血红蛋白的一种内在特性(3)。
意想不到的并有重要意义的是，已发现本发明的血红蛋白不会引起乳酸脱氢酶的释放。与本发明的血红蛋白相反，用由其他色谱方法纯化的无基质血红蛋白溶液培养内皮细胞会观察到乳酸脱氢酶释放的显著增加。
通常为人所接受，并且不言而喻，应充分纯化任何血液替代品及任何血液替代品的组分或原材料以便它不含有已知有害的杂质。以前承认的上述有害杂质包括细胞基质，内毒素和其他致热原，非血红蛋白蛋白质，磷脂等。已报告的现有血液替代品“基本上没有”一种或多种上述杂质。但术语“基本上没有”是一种相对的主观术语，其解释和限定取决于在相关现有资料中所用和描述的确定相关参数的方法。已有报告利用改进的纯化和分析技术得到血液替代品和纯度水平越来越高的血红蛋白产物。例如，现有技术文献包含有关一种或另一种形式的血红蛋白溶液的报告，其中99.9％的蛋白质是血红蛋白(参见前述的美国专利5,084,588，Rausch等人)。根据本发明，可推测甚至这样的纯度对于成功的血液替代品来说也是远远不够的，因为残留杂质的性质会引起血管收缩效应并表现有细胞毒性。
可以认为可从Walter Reed Army Research Institude(WRAIR)得到并一般被认为是工业标准纯度的无基质血红蛋白含有大量(＞10)不同的杂质蛋白质，它们之中许多只占总蛋白质的0.01％以下。表面上，这是很小的数量，但事实上以相对大的数量将作为血液替代品的血红蛋白施用给主体，那么施用的杂质的总量确定是否有害，而不是其在任何被施用混合物中的浓度。以血液替代品溶液为基础的一单位血红蛋白含25-50克的血红蛋白，那么0.01％的杂质即为2.5-5mg的杂质。在存在的各种蛋白质中，在此水平极其有害的可能是一种或两种。本发明提供一种血红蛋白产物，其中的非血红蛋白蛋白质的含量低于0.5％，优选的低于0.1％，推测起来但不是必然结果，所述产物没有可辨别的血管收缩作用并且对内皮细胞没有显著的毒性。本发明还提供一种方法，由此可以上述引人注目的商业规模制备上述的血红蛋白溶液。
本发明产物的另一显著优点是其降低的前凝血质活性。看起来与以前报告的可得到的其他无基质血红蛋白产物相比，在降低促使血液凝结的试剂的含量方面，本发明产物是非常有效的。
用下列非限制性实施例进一步描述本发明，仅为说明目的。
实施例1：制备粗Hb溶胞产物
收集96单位(约30L)同血型合在一起的红细胞(RBCs)，然后用24L0.9％盐溶液稀释，然后通过20μ和8μ的聚丙烯过滤器过滤该收集物以除去残留的白细胞。
将白细胞过滤后，用3.5m2的0.3μ的Sepracor聚醚砜空心纤维膜，在恒定体积的透滤中，用6体积0.9％的盐水洗涤RBCs，然后再50mMTris溶解缓冲液代替洗涤缓冲液，RBCs逐渐溶解于6体的该溶解缓冲液中。
收集粗溶胞产物，然后用30KMolecular Weight Cut off(MWCO)Millipore PTTK膜从约2.5％总血红蛋白(THb)浓缩至约9.0％THb。一旦浓缩后，将箱中充满CO气体以便将血红蛋白转变成COHb形式。在一有外套的箱中，于62±2℃，将溶解产物灭菌10小时。将灭菌的溶胞产物冷却，然后离心。通过Miuipore 0.8μ滤器进一步深度过滤，从而制备用于在另一Millipore30kPTTK膜上透滤的灭菌溶胞物。用5mM tris，pH8.9将该物质透滤直到其导电率＜0.3ms，pH为8.9±0.2。然后稀释到4.5-5％THb，在此时可准备将其用于随后的色谱纯化。
实施例2：在阴离子交换树脂上进行自置换色谱
用4个柱体积的1N NaCl洗涤用阴离子交换树脂PerSeptive Poros HQ-50填装的1×10cm柱，然后用5mM Tris缓冲液，pH8.8平衡。平衡后，将按实施例1描述制备的在5ml Tris，pH8.8中的50ml 3.0％(3g/100ml)粗血红蛋白溶胞产物(-85％HbAo)以0.78ml/分(1cm/分)负载到该柱上。与制造商说明的50mg/ml的负载能力相比，这会导致该柱的超载—每ml树脂负载200mg溶质。收集洗脱液。然后用2个柱体积的5mM Tris pH8.8缓冲液洗涤该柱，然后将该洗脱液与在装载过程中收集的洗脱液合在一起。然后用1N NaCl洗涤该柱以洗脱残留的蛋白质，然后扔掉该洗涤洗脱液。用3个柱体积的1M NaCl/HCl和4个柱体积的1M NaOH使柱再生。在下文实施例11中将更详细描述的使用pH梯度的分析阴离交换柱上，对从阴离子交换树脂上下来的血红蛋白洗脱液进行分析。柱上负载的HbAo的回收率为90％，含约95-96％HbAo，如图3所示。
实施例3；在阴离子交换树脂上的自置换色谱
用4个柱体积的1N NaCl洗涤用Merck Fractogel-TMAE装的1×10cm柱，然后用5mM Tris缓冲液，pH8.8平衡。平衡后，将按实施例1中描述制备的在5mM Tris中的50ml 3.0％(3g/100ml)粗血红蛋白溶胞产物以0.78mL/分(1cm/分)负载到柱上。同样，这会最终导致柱的超载。收集洗脱液。然后用2个柱体积的5mM Tris pH8.8缓冲液洗涤该柱，将该洗脱液与负载柱过程中收集的洗脱液合在一起。然后用1N NaCl洗涤该柱以洗脱保留的蛋白质，扔掉该洗脱液。用3个柱体积的0.5N HCl和4个柱体积的1M NaOH使柱再生。在按下文实施例11中更详述的，用pH梯度的分析阴离交换柱上，对从阴离子交换树脂上下来的血红蛋白洗脱液进行分析，经确定约为95-96％的HbAo，如图3所示，柱上负载的HbAo的回收率为73％。
实施例4：在阳离子交换树上的自置换色谱
用4个柱体积的1N NaCl洗涤用Per Septive Poros HS-50装填的1×10cm柱，用5mM Tris缓冲液，pH7.5平衡。平衡后，将按实施例2和3所述制备的，在5mM Tris，Ph7.5中的120ml2.0％(2g/100ml)阴离子交换纯化的血红蛋白(-95％HbAo)以0.78ml/分(1cm/分)负载到柱上。这最终会导致实际的柱超载，这是制造商说明的约5倍的范围。收集洗脱液。然后用2个柱体积的5mM Tris，pH7.5缓冲液洗涤该柱，并将该洗脱液与负载过程中收集的洗脱液合在一起。再用1N NaCl洗涤该柱以洗脱保留的蛋白质，然后将其扔掉。用3个柱体积的0.5N HCl和4个柱体积的1M NaCl使柱再生。在使用pH梯度的分析阴离交换柱上分析从阴离子交换树脂上下来的血红蛋白洗脱液，经确定是＞99％的HbAo，如图4所示，柱上负载的HbAor回收率为约90％。
实施例5
研究在阴离子交换树脂(第一步)上导电率对自我置换色谱的影响。
有效置换色谱主要取决于缓冲液和/或样品的离子强度，也就是由导电率决定。下列表2所总结的实验是将实施例1的溶胞产物供料到从Perseptive B iosystems Inc.得到的Poros HQ-50阴离子交换树脂而完成的。通过分析阴离子交换色谱分析来自柱的洗脱液。从1号操作中得到的部分完全没有可检测的酸性杂质，而甚至2号操作中的第一部分含有酸性杂质。
                            表2
操作次数  最大负载mg/ml    THb     pH     mS     柱(L×D)   缓冲液     流速(cm/分)   酸性杂质的去除
    12     200200     3.02.8     8.88.8     0.2/0.42.85   10×110×1     TrisTris     11     100％0％
实施例6：作为蛋白质负载函数的产率
使柱超载会得到较高的纯HbAo回收率。在下列表3报告的实验中，表明在10ml的阳离子交换Porso HS-50树脂树上很高的超载，确保所有的结合位点均被杂质占据，从而得到较高回收率的纯化HbAo。第一个实验中的超载是制造商说明的13.5倍(308mg蛋白质/mL)。在第二个实验中是制造商说明的约5倍。较高的超载会导致从柱上HbAo回收率的显著提高。
                       表3
负载(蛋白质mg/ml)    THb    pH   mS   柱(L×D)  缓冲液 流速cm/分 去除碱性杂质
  308216     3.12.9     7.57.4     0.50.6     9.5×19.5×1     TrisTris     0.60.6     100％88％回收率100％77％回收率
实施例7：小和大柱间的比较。
可以在大和小柱上使用本发明的置换色谱。依次使用阴离子交换树脂PorosHQ-50和阳离子交换Poros HS-50，分别用15和10升的柱与10ml柱完成比较。按实施例1中的描述制备用于Poros HQ-50柱的供料溶液。用HQ-50柱的洗脱液给HS-50柱供料。表4表明使用Poros HQ-50柱的条件和结果。表5表明使用Poros HS-50柱的结果。结果表明：本方法的两个步骤为了用于商业均可按比例扩大至至少10-15升柱。
                                 表4
  负载量 负载mg/ml   THb   pH 导电率mS   柱L×D   缓冲液   流速cm/分   回收的酸性更强杂质的％
    1.6g3.2kg     210200     5.64.7     8.98.8     0.50.3   10×110×45   TrisTris     11     100％100％
                             表5
负载量   负载mg/ml   THb   pH 导电率mS     柱L×D   缓冲液 流速cm/分 回收的碱性更强杂质的％
    2.4g1.7kg     308254     3.13.7   7.57.6     0.50.4   9.5×19.5×30   TrisTris   0.60.6     100％100％
实施例8：由等电聚焦(IEF)分析粗血红蛋溶胞产物和纯化的血红蛋白
用琼脂糖为基础的凝胶完成等电聚焦(IEF)分析，其中用市售两性电解质建立稳定的pH梯度。90％所用的两性电解质的pH为5-8，10％其pH为3.5-10。凝胶中琼脂糖的终浓度为1.25％，两性电解质的终浓度为约2％。为了估计纯度，粗略超载凝胶(每道负载1mg蛋白质)。以低电流设置完成电泳以确定保蛋白质迁移成一条均一的直带。达到稳定状态后，短时间内提高电压和电流以使带进一步变尖。电泳后，用三氯乙酸和硫代水杨酸溶液固定琼脂糖凝胶中的蛋白质，固定步骤后，用Comasie-blue染色以便肉眼观察蛋白质带。为了扫描，空气干燥凝胶，然后用激光密度测定仪以得到含粗血红蛋白溶胞产物和纯化血红蛋白的电聚焦带的痕迹。图5表示按实施例1中所述制备的粗血红蛋白溶胞产物与按本发明制备的纯化HbAo的IEF之间的比较。依次用实施例2所述的Poros HQ-50柱和实施例4中描述的Poros HS-50柱纯化血红蛋白溶液。
实施例9：免疫分析粗血红蛋白溶胞产物和纯化血红蛋白
为了分析在实施例1的粗血红蛋白溶胞产物中和按本发明方法制备的纯化血红蛋白中，各种杂质的量，使用免疫染色技术。在琼脂糖上将蛋白质电聚焦后，用毛细印迹将蛋白质转移到硝酸纤维素纸上。通过在水解的鱼明胶溶液中培养该印迹来阻断纸上剩余的未结合位点。培养后，用Tris缓冲的盐水(TBS)洗涤，然后与一级抗体一起培养。(一级抗体是抗被检测样品的抗体，如抗人血清白蛋白(抗-HSA)用于检测血红蛋白溶液中的HSA)。这次培养后，用TBS洗涤印迹；然后同与标记酶(如辣根过氧化物酶)共轭的二级抗体一起培养，所述二极抗体是抗一级抗体的抗体。与二级抗体一起培养后，再用TBS洗涤印迹，然后加入标记酶的底物。在二级抗体与一极抗体(己与其抗原结合)结合处将显出一彩色沉淀，因此表明在IEF凝胶上与一级抗体结合的抗原数量和位置。
结果列于下面表6，其中“++++++”表明强信号，“+”表示几乎没有可检测信号，“-”表示没有检测到信号。
                     表6
    所用抗体   粗Hb溶胞产物     血红蛋白
人血清白蛋白   +++++++++++     +a
红细胞(RBC)   +++++++     +b
RBC膜   +++++     -
人血浆   +++++++++++     +c
碳酸酐酶    I   +++      -
收缩蛋白   ++++      -
血型糖蛋白   ++      -
a.对于免疫印迹用HSA标准，估计纯化HbAo中的HSA量＜
5pg/mgHb(＜50ppm)。
b.检测与抗-RBC抗体交叉反应PI～5.2的痕量杂质。其他研究人员在其纯化的Hb溶液中也报告了相似的蛋白质(参见Christensen等人，在所引的书中)。
c.在抗-人血浆中存在的抗-HSA抗体检测纯化HbAo中的HSA。
实施例10：人血清白蛋白—免疫检测(HSA-ID)
用色谱方法测定血红蛋白溶液中HSA的数量。该方法使用与柱上基质共价结合的抗体(抗-HSA)。将样品注射到柱上时，除针对抗体(HSA)的抗原外，其他物质均在负载/洗涤步骤中通过。用洗脱缓冲液从柱上洗脱结合的抗原(HSA)，根据峰面积测定样品中的抗原量。
检测所用的ImmunoDetection*(ID)筒来自PerseptiveBiosystems。用于检测的流速为2ml/分。用负载缓冲液(10mM磷酸缓冲液+300mM NaCl，pH7.2)平衡筒形柱(1.6mmD×26mmL)，然后注入50μl样品。用负载缓冲液洗柱0.25分钟，然后用洗脱缓冲液(3.5分钟)洗脱柱中的结合HSA。用Beckmandiode array检测仪在220mm和414nm检测洗脱液。然后用用于下次注射的负载缓冲液再平衡该柱。用该方法，估算出纯化血红蛋白中HSA的量不超过0.0005％重(以血红蛋白计)。
*商标
实施例11：分析阴离子交换色谱
按下列色谱方法分析实施例2和4产物中血红蛋白的纯度。该检测以Huisman & Dozy(4)报告的方法为基础，在高pH(pH8.5)将样品负载到阴离交换柱上，使所有蛋白质均与柱结合，然后依次用pH8.5到pH6.5的pH梯度从柱上洗脱蛋白质。用这种色谱方法，可以分离很相似的蛋白质(如各种血红蛋白变异体。该检测使用PerSeptive Biosystems的4.6mm×100mm分析阴离子柱。所用缓冲液是A)25mM Tris+25mM Bis-tris，pH8.5和B)25mM Tris+25mM Bis-tris，pH6.5。以5ml/分的流速完成检测。用缓冲液B平衡柱后，将10μl样品(浓度10mgTHb/ml)注到柱上，开始进行梯度洗脱(25个柱体积以上的100％缓冲液A到100％缓冲液B)。用UV检测器在280nm监测洗脱液以确定蛋白质的峰。图3表示阴离子交换纯化的血红蛋白(实施例2产物)的色谱图，图4表示用该方法分析时，纯化的HbAo(实施例4产物)。
该方法是检测血红蛋白溶液纯度的标准检测方法。发现本发明的纯化在HbAo没有在无基质血红蛋白中观察到的所有杂质。在HbAo峰前偶尔观察到一个小凸起，这是HbAo的氧化形式(MetHbAo)造成的。用该分析法发现本发明的纯度一般大于99.5％。
实施例12：病毒的除去
检测本发明方法从粗血红蛋白中除去病毒的能力。
将活性形式的检测量下列病毒加到按实施例1所述制备的粗溶胞产物样品，和由阴离子柱部分纯化的血红蛋白溶液样品，即实施例2和3的产物中：
脊髓灰质炎病毒I型
人免疫缺陷病毒(HIV)
牛腹泻病毒(是人肝炎病毒的一种)
单纯性疱疹病毒I型(HSV-I)
将来自各柱的等份洗脱液加到检测细胞系统中。就脊髓灰质炎病毒，疱疹病毒和牛腹泻病毒而言，存在的活性病毒与检测细胞相互作用以产生噬菌斑。进行已知的标准检测。对于HIV而言，将样品(等份)加至组织培养基中。通过细胞系生长的变化来确定存在的病毒数量。这种变化为TCID50(半数组织培养感染量)。结果列于表7。
                                表7
                    通过色谱达到病毒的对数减少
病毒 脊髓灰质炎病毒1型 人免疫缺陷性病毒 牛腹泻病毒 单纯性疱疹病毒II型
基因组 RNA  RNA RNA RNA
包被的 无  有 有 有
检测系统 Vero细胞 MT-4细胞 EBTr细胞 Vero细胞
阴离子负载 1.4×107pfum/l  1.4×105TCID50/ml 1.7×105pfu/ml 5.3×106pfu/ml
阴离子洗脱物 8.5×106pfu/ml ＜3 TCID50ML ＜20pfu/ml ＜3pfu/ml
对数减少 ＜1 ＞5 ≥4 ＞6
阳离子负载 3.1×107pfu/ml  3.2×106TCID50/ML 2.8×105pfu/ml 2.0×106pfu/ml
阳离子洗脱液 7.5×106pfu/ml  5.6×102TCID50ml 2.1×104pfu/ml 4.1×103pfu/ml
对数减少 ＜1 ＞3 ＞1 ＞3
这些结果表明使用本发明的阴离子交换自置换或阳离子交换自置换步骤，脊髓灰质炎病毒的数量只有较小的降低，但对于HIV，HSV和牛腹泻病毒则有显著的降低，然后再用阴离子交换色谱和阳离子交换色谱可达到更小的范围。这完全是出乎意料的，但也表现出使用本发明的显著优点。
实施例13：等电聚焦和Western印迹的纯度分析
用Saravis和Zamcheck(5)的技术完成等电聚焦(IEF)实验。
用琼脂糖(1％的终浓度)浇涛IEF凝胶，用两性电解质(Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，N.J.)得到pH梯度，90％的两性电解质的pH在5-8，10％的pH范围为3.5-10。一般将10μl100mg/mlHb溶液负载到IEF凝胶上。蛋白质聚焦后，用10％三氯乙酸(TCA)固定凝胶，干燥，用Coomassie-Blue〔3〕染色。正常地，总蛋白质负载/道是1mg。
完成等电聚焦(IEF)分析以比较SFH和4种不同批量纯化的本发明HbAo的纯度。每道负载50μg总Hb或1mg总Hb。结果列于图6。道20表示以50μg总Hb负载的无基质血红蛋白，道22，24，26和28表示以相同负载量的不同批量的本发明化Hb。道30表示以1mg总负载的SFH，道32，34，36和38表示相同负载量的不同批量的本发明纯化Hb。50μg总Hb样品负载表明纯化HbAo和SFH的纯度相似。但，以1mg总Hb/道的大量红细胞蛋白质，无论血浆蛋白质或膜蛋白质均在SFH道中观察到，但在纯化HbAo道中没有。在纯化HbAo道中，干pI5.2附近观察到一个弱的蛋白质带，这可能是由于球蛋白链片段造成的。在50μg样品负载道中，HbAo带上方的带是由于在电聚焦过程中形成的，正电荷更多的MetHb类造成的。
等电聚焦后，用使用抗体染色(免疫染色)的Western印迹，进一步仔细研究本发明产物的纯度。因此，用毛细印迹，将来自IEF凝胶的蛋白质转移到硝酸纤维素纸上。通过与水解的鱼明胶(Hipure Liguid Gelatin，Norland Products Inc.，NewBrunswick，N.J)一起培养印迹，来阻断硝酸纤维素纸上剩余的游离位点。然后，将印迹与抗人血浆的兔抗体(Dako Corp.，SartaBarbara，CA，lot#010)(用Tris缓冲的盐水中以1∶500稀释抗体)一起培养。培养过夜后，然后用含1％鱼明胶的Tris-缓冲的盐水(TBS)洗涤，再与山羊—抗—兔TgG-辣根过氧化物酶(HRP)(用TBS以1∶1000稀释)一起培养。培养1小时后，再用含1％鱼明胶的TBS洗涤印迹。用4-氯-1-萘酚(30mg/20ml甲醇)和过氧化氢(100mlTBS中50μl)肉眼观察抗原—抗体-HRP复合物。深紫色沉淀带表明存在抗原，特别是血浆蛋白质。
将两份无基质血红蛋白，本发明Hb，本发明-IEF Hb，来自Walter Reed Army Fnstitute(WRAIR)的纯化Hb(按前述Winslow等人文献描述纯化的)，以及来自Sigma Corporation(在其目前的诊断试剂目录中以”Hemoglobin Ao，reference HO267描述的)的纯化Hb在IEF凝胶上聚焦。用Coomassie-Blue将一半的凝胶染色，将另一半印迹到硝酸纤维素纸上。然后将印迹染色以便肉眼观察人血浆一人血浆抗体复合物。
结果列于图7。在该图中，道40是无基质血红蛋白的IEFCoomassie Blue染色，道42，44和46分别是来自本发明HbAo，WRAIR Hb和Sigma Hb的相应道。道48是无基质血红蛋白的Western印迹—人血浆抗体检测，道50，52和54分别是本发明HbAo，WRAIR Hb和Sgma Hb的相应道。
在SFH中检测到显著量的血浆蛋白质。相反，在本发明的产物道中，仅检测到很小量的人血清白蛋白(HSA)。在本发明产物中，未检测到其他血浆蛋白质。在WRAIR HbAo中，未发现可检测水平的HSA，但在HbAo带的上方和下方，检测到大量其他血浆蛋白质。标准的Sigma HbAo含有包括显著浓度HSA的大量血浆杂质。
实施例14；在感染大鼠中急性血容量减少的研究
检测本发明产物的血管升压活性。
将Sprague-Dawley大鼠随机分成6组(n＝6)，适应四天，然后用Tabata和Chang(6)的技术完成慢性的套管插入术。经适当插管的动物接受静脉内注射肝素，150IU/kg。一个动脉套管与一个用于血压和心率的Stratham压力换能器相连。这些参数连续记录在Grass多路描记器上。记录到稳定的基线后，按Wiggers的方法引发致死性出血休克，包括在2步中，以0.5ml/分，通过其他动脉导管除去67％的总血体积。休克引发后马上，每只大鼠即以0.5ml/分的速率接受检测物质，即同源血，本发明HbAo(HbAo)，或本发明交联的HbAo(已与上述美国专利申请08/231,945，1994年4月21日申请，X3栏描述的邻—棉子糖交联剂反应过)。完全输注后，记录达30分钟的平均动脉压(MAP)和心率。每只大鼠返回不同的笼子，然后对体重、血细胞比容和存活监测14天。
结果图示于图8，根据时间给出MAP。
数据表明本发明产物是血红蛋白Ao的高度纯化形式，在知觉大鼠模型出血休克后，在恢复平均动脉压方面，本发明产物与全血一样有效。在全血和HbAo治疗组之间，于恢复动脉压或心率方面没有差异。
实施例15：大鼠中等容交换输注的血液动力效果
检测本发明HbAo对知觉大鼠等容交换输注的血液动力作用。经股骨区给大鼠的外髂静脉和动脉插管(参见Keipert和chang(8))。24小时恢复期后，使知觉动物经连续的50％等容交换输注。在交换输注过程中，从髂动脉除去的血液体积由检测溶液代替，用恒定流速的输注泵，以0.5ml/分经骼静脉输注。连续监测血压和心率；(1)交换前监测30分钟，(2)期间；和(3)交换后2-3小时。从血压图计算平均动脉压和心率。
一组大鼠(4只)用人血清白蛋白，HSA输注。对于另一组大鼠(6只)，无基质血红蛋白(SFH)是检测溶液。对于另一组大鼠(8只)，本发明产物HbAo是检测溶液。
结果示于图9和9a。
对于所有检测溶液，在交换输注过程中，平均动脉压提高10-20mmHg。用白蛋白对照溶液，平均动脉压在交换后监测期的其余时间后，降低在基线下15mmHg，并且在约2.5个小时的整个交换后监测期，均保持在降低的水平。(图9)这些结果与以前Keipert和Chang公开的观察结果一致(8)。
对于无基质血红蛋白，平均动脉压在交换期末降至基线，但在交换后监测期增高并在交换后30-40分钟升到基线上-15mm的最大值(图9a)。
相反，对于本发明HbAo，平均动脉压在交换后回到基线，并在交换后上升了不超过5mmHg，由此使MAP保持在正常范围内。
该研究结果表明：本发明中的HbAo没有与用无基质血红蛋白交换输注相关的强血管活性。
实施例16：在先暴露于血红蛋白制品的内皮细胞中检测氧化损伤的一种体外组织培养检测法
检测本发明HbAo的可诱导培养中内皮细胞氧化损伤的特性。培养基中乳酸脱氢酶活性的释放是细胞损伤和细胞毒性的标志。
培养来自猪胸主动脉的内皮细胞至汇合，在重复传代中，以1∶3比例次培养。在传代7次的48小时内，用细胞做试验。通过测量细胞释放到培养基中的乳酸脱氢酶的量，来评估细胞损伤。加入血红蛋白溶液前，除去培养基，然后用磷酸缓冲盐水将细胞洗涤两次。将细胞与血红蛋白(250μM原血红素)在完全EGM培养基中于37℃培养6或24小时(n＝4-6)。在完全EGM培养基中单独培养的细胞作为负对照。在培养期末，从各孔除50μl的培养基，由乳酸脱氢酶试验(Sigma)确定乳酸脱氢酶活性，将每孔中的乳酸脱氢酶活性与加入2％Triton X-100(总LDH释放)后从细胞中释放的相比较，并表达为总释放的百分比。
培养6小时后，在无基质血红蛋白SFH(74.4±4.2％，P＜0.005)存在的情况下，观察到乳酸脱氢酶的显著增加。用来自WalertReed Army Institute of Research的纯化血红蛋白观察到相似但较小的增加。与对照(37.5+/-2.2％)相比，用本发明的纯化HbAo没有观察到增加。在无基质血红蛋白(99.6±3.5％)存在的情况下，培养24小时后，乳酸脱氢酶的释放进一步增加，而与对照(34.1±2.6％)相比，用本发明的HbAo(41.6±4.6％)则没有变化。
将培养的内皮细胞与按本发明描述的方法而制备的HbAo-起培养不会引起乳酸脱氢酶活性(细胞损伤的标志)的释放。结果，对培养的内皮细胞的细胞毒性不是血红蛋白溶液的内在特性，HbAo的纯化除去了无基质血红蛋白中存在的细胞毒性成分。
实施例17：前凝血质活性的去除
检测本发明产物促进血液凝集作用试剂的含量。所用的方法是Biessls等人的方法(9)。
用HyponormTm麻醉豚鼠并将一硅橡胶插管插入颈动脉。插管后，取出30％的血体积(经计算为体重的2％)，然后用等体积检测溶液代替。以每小时2.5ml输注1％的人白蛋白溶液以保持插管的畅通。白蛋白输注的开始作为实验的开始。在输注Factor Xa(8-9mg/kg)(其本身不会引起凝结的剂量)之前和之后，测量纤维蛋白肽A(FDA)(已知是由血液凝结上的纤维蛋白原产生的)。将血液样品收集到肝素(1000U/ml)，trasylol(1000U/ml)和柠檬酸钠(3.8％)的抗凝结混合物中，分离并将血浆贮在冰上。
按Leessma，1984(10)的FPA检测法，处理血浆样品，用以前Gerrits(11)公开的RIA方法测量形成的FPA。用等体积40％PEG6000磷酸盐缓冲盐水沉淀血浆蛋白质。在沸水浴中加热上清溶液，离心，贮存以备检测。结果列于下列表8。
                                    表8
    检测样品     描述     AUC10 *
    SFH 在最初的10分钟内，FPA迅速短暂地从1.4ng/ml增加到13.8+/-3ng/ml然后在40分钟后降低到基线     87.6+/-12
    HSA  FPA从基线1.4ng/ml增加到5.5+/-1.5ng/ml最大值     45.7+/-8.2
    HbAo  FPA从1.4ng/ml增加到5.0+/-1.2ng/ml的最大值     31.8+/-2.9
*施用Fector Xa后，在开始的10分钟内曲线下的面积。
这些资料表明与无基质血红蛋白相比，本发明产物基本没有前凝血质活性。据认为上述前凝血质活性是很大程度上以含脂和磷脂检测溶液污染为基础。
实施例18：用ELISA技术确定污染的人血清蛋白量
用夹心ELISA技术测量本发明纯化血红蛋白产物中血清蛋白杂质的数量并与其他可得的血红蛋白的杂质进行比较。
在本实施例中，使用根据Butler，J.E(12)的常规方法和技术的夹心ELISA技术。
用固相山羊血清吸附的兔抗—人血清抗体(DakoCorporation，Santa Barbara，CA，Lot#072)(用Tris缓冲的盐水以1∶40稀释)覆盖Dynatech96孔，1mm的4个微滴定盘。在37℃培养2小时后，用Tris缓冲的盐水(TBS)洗涤所述盘，通过与水解的鱼明胶(Hipure Liguid Gelatin，Norland ProductsInc.，New Brunswick，N.J.)一起培养从而阻断盘上剩余的游离位点。培养1小时后，用TBS洗涤该盘，在两倍系列稀释度加入检测产物。培养1小时后，再用TBS洗涤该盘，并与含1％鱼明的固相兔血清色被的山羊抗—人血清抗体，IgG部分(AccurateChemical and Scientific Corporation，Westbury N.Y.，Lot#H036)(用TBS以1∶1000稀释)一起培养。培养1小时后，用TBS洗涤该盘，然后与亲和纯化的兔抗—山羊抗体，IgG部分(辣根过氧化物酶HRP共轭的)(Bio Rad Lot#75312)(用TBS以1∶250稀释)一起培养。培养2小时，用TBS洗涤该盘、用邻—苯基二胺—二氯化物(OPD-26mg/15ml柠檬酸，PH5.0)肉眼观察抗原—抗体-HRP复合物。淡黄色说明存在抗原，特别是血清蛋白。用Molecular Devices Thermomax Microplate阅读器在490nm读出吸收值。
检测两份来自Sigma Corporation纯化HbAo(H-0267)的正常人血清(Dimension Laboratories Inc.，Mississauga，Ontario，Lot#30317)，来自Walter Reed Army Institute ofResearch(WRAIR)的纯化HbAo(Lot#92092)和本发明的纯化HbAo。结果总结于表9。显然本发明产物仅有不到0.0004％的血清蛋白，而从这点看，其他检测样品至少高一个数量级。
                            表9
  样品 血清蛋白含量(wt％以Hb计) 每ml溶液的mg血清蛋白
本发明HbAo(8％总Hb的溶液) 0.0004％ 0.000328mg/ml
 WRAlR HbAo(6.7％总Hb的溶液) 0.0039％ 0.00263mg/ml
 SIGMA HbAo1.1％总Hb的溶液 0.0029％ 0.000328mg/ml
在进行的所有检测中，只有本发明产物中检测的血清蛋白是人血
清白蛋白。在其他样品中发现的血清蛋白—竞争性产物似乎是含
HSA和其他血清蛋白的异源混合物。
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Claims (10)

1.一种从含有污染蛋白质类物质的粗血红蛋白溶液中分离预选的血红蛋白的方法，所述方法包括：
在第一个色谱步骤中，向色谱柱提供粗溶液原料，并使其在比所述预选血红蛋白酸性更强的粗溶液组分有选择性结合亲合性的pH范围为7-10、原料溶液电导率小于3ms的阴离子交换条件下，或在比所述预选血红蛋白碱性更强的粗溶液组分，有选择性结合亲合性的pH范围为5-9、原料溶液电导率小于3ms的阳离子交换条件下进行色谱；
在第一色谱步骤中，继续供粗溶液直到基本上完全由血红蛋白和亲合性更大的成分负载了该柱，以便使柱超载并随后从其上置换血红蛋白；
在第二色谱步骤中，向色谱柱提供来自第一步骤含血红蛋白的洗脱液，并使其在不是所述第一步骤所选的阴离子交换条件或阳离子交换条件下进行色谱；
在第二色谱步骤中继续提供所述洗脱液直到在所述第二步骤条件下，基本上完全由血红蛋白和亲合性更大的组分负载该柱，以便使柱超载，并随后从其上置换血红蛋白。
2.权利要求1的方法，其中第一步骤是阴离子交换色谱，第二步骤是阳离子交换色谱。
3.权利要求2的方法，其中预选的血红蛋白是正常成人血红蛋白HbAo。
4.权利要求3的方法，其中第一步骤，阴离子交换过程是在pH8.5-9.0完成的，并使用导电率小于1ms的原料溶液。
5.权利要求2、3或4的方法，其中以不大于10cm/分的速率向柱提供原料溶液。
6.权利要求5的方法，其中原料溶液的浓度为0.1-20％。
7.权利要求2的方法，其中第二步骤的阳离子交换色谱是在pH6.5-8.5完成的。
8.权利要求7的方法，其中第二步骤的阳离子交换色谱是在pH7-8，使用电导率小于1ms的原料溶液完成的。
9.权利要求7或8的方法，其中以不大于10cm/分的速率将原料溶液提供给第二阶段的阳离子交换柱。
10.权利要求7或8的方法，其中用于第二步骤阳离子交换柱的原料溶液的浓度为从2-6％。
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