CN1163489C - 人丙种球蛋白亲和配位体及其用途 - Google Patents

人丙种球蛋白亲和配位体及其用途 Download PDF

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本发明提供了一类新的可作为丙种球蛋白亲和配位体的化合物,该化合物的制备方法,以及这类新亲和配位体在纯化生产丙种球蛋白(尤其是人丙种球蛋白)的应用。本发明还提供了新的用于纯化丙种球蛋白的亲和介质和方法。本发明可高效率、低成本的大规模生产人免疫球蛋白,尤其是高纯度的丙种球蛋白(抗体)的医用级产品。

Description

人丙种球蛋白亲和配位体及其用途
本发明涉及生物技术和生物医药领域,更具体地,本发明涉及一类新的丙种球蛋白亲和配位体,其制备方法,以及这类新亲和配位体在纯化生产丙种球蛋白(尤其是人丙种球蛋白)的应用。本发明还涉及新的纯化丙种球蛋白的方法。
免疫球蛋白(Immunoglobulins)是重要的免疫球蛋白,缺乏时人体的防御机能低下。免疫球蛋白至少有五种:IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。每个IgG分子都有四条对称的多肽链组成:两条重链、两条轻链,链间由二硫键相连。正常人的免疫球蛋白又称丙种球蛋白,也可称为多价免疫球蛋白,是从大量的混合血浆或胎盘血中分离制得的免疫球蛋白浓缩剂。要求IgG的含量在90%以上,至少90%的蛋白应具有单体和二聚体的分子量,裂解物和多聚体(>二聚体)相加不能超过10%。
免疫球蛋白的作用机理是被动免疫,主要用来预防一些病毒性感染,如用于甲肝、丙型肝炎、麻疹等疾病的预防以及丙种球蛋白缺乏症。
                  表1  免疫蛋白制剂的适应症
适用病症 作用 对象
甲型肝炎 推荐预防 家庭接触者,热带或不卫生条件下的旅行者
丙型肝炎 选择性预防 皮肤或粘膜接触
风疹 选择性预防 在妊娠早期暴露的妇女
麻疹 推荐预防 1岁以下婴儿或在前6天内接触急性病例的免疫抑制者
目前,医用免疫球蛋白主要从健康人血浆中分离。所用的生产技术主要采用低温乙醇沉淀法。这种工艺已经有50年的历史了。这类传统方法操作步骤多,产品种类有限,血浆中的很多其他有效物质被浪费掉了。比如,生产灭毒合格的白蛋白和抗体,需要10步操作。这种工艺生产的白蛋白和抗体,产品纯度不够高,虽然生产过程中使用了病毒灭活步骤,但潜在病毒的遗传物质(DNA和RNA)和组成蛋白并没有去除干净,在某些条件下仍然有危险。
虽然近年来发展出了以离子交换和凝胶过滤为中心的层析法生产工艺,但是生产灭毒合格的白蛋白和抗体仍需要10步左右的操作。使用这种工艺,产品的纯度有所提高,但生产成本并没有降低,产品种类也没有增加,血浆中许多其它含量较少的宝贵蛋白质仍被浪费掉了。
低温乙醇法的操作相对简单,产量高,适宜工业化规模生产。低温乙醇法还有保持蛋白质天然性质的优点:乙醇沉淀血浆蛋白在接近血浆溶液冰点温度下进行,能使蛋白质变性降至最低限度,保持其天然状态。此外,低温乙醇法分离过程中有抑菌作用。近年来的研究证明,适当的低温乙醇工艺(6+9法、Kistler和Nitschmann法)有杀灭和清除艾滋病毒的作用,增强了制品的安全性。乙醇作为主要原材料,价格低廉,易于获得。但低温乙醇法的应用,应具备低温冷室及连续冷冻离心机等设备条件,需要相当的资金。另外,工作人员需在相对低温条件下操作。产品的纯度有限,最终产品种难免含有微量的杂质和变性产品,易于引起负反应。
近年来,层析法被越来越广泛地应用于生物制剂的纯化制备。Curling等人1978年发表了应用离子交换层析(Ion-Exchange chromatography)分离免疫球蛋白的方法。Suomela等人描述了小规模离子交换层析分离免疫球蛋白。将凝胶过滤(Gelfiltration,又称分子筛层析)与离子交换及超滤技术相结合,用于大量血浆蛋白的分离是可行的。然而,虽然柱层析法制备的产品纯度高,能很好的保持蛋白质的天然性质而且产品收获率也较高,但是生产成本偏高,生产效率低。
制备免疫球蛋白的其它的方法还有盐析法(硫酸铵盐析)、利凡诺(Rivanol)沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、热乙醇/PEG法等。但是,由于各种因素和缺点,这些方法都无法得到广泛采用。
因此,本领域迫切需要开发高效率、低成本的大规模生产人免疫球蛋白的方法和材料。
本发明的一个目的是提供一类新的化合物,这类化合物可作为免疫球蛋白的亲和配位体,因而用于免疫球蛋白的亲和纯化。
本发明的另一目的是提供这类化合物的制备方法。
本发明的另一目的是提供固定有该化合物的亲和介质。
本发明的另一目的是提供一种低成本、高效率的大规模生产人免疫球蛋白的亲和技术工艺。
在本发明的第一方面,提供了一种式(I)化合物,
Figure C9911993600071
式中,
R选自:无、H、卤原子、C1-C6烷基、氨基、C1-C6烷基单取代和双取代的氨基、羟基、羧基、巯基、含羟基的聚合物、多糖、琼脂糖、或纤维素;
R1选自苯甲脒、苯乙酮、苯二甲酰肼、和蒽醌基团;
R2选自苯硼酸、苯甲酸、苯磺酸、苯胺、酪氨酸和精氨酸基团;
X1、X2、X3、X4、X5各自独立地选自:碳原子、氧原子、氮原子或硫原子;而且X1、X2、X3、X4、X5为线性结构,或者X2、X3、X4与选自N、O、C的原子一起构成5元、6元或7元环,
附加条件是当X1、X2、X3、X4、X5为线性结构时,R不是无或H。
较佳地,该化合物具有式(Ia)结构:
式中,
R′选自:H、卤原子、C1-C6烷基、氨基、C1-C6烷基单取代和双取代的氨基、羟基、羧基、巯基、含羟基的聚合物、多糖、琼脂糖、或纤维素;
R1选自苯甲脒、苯乙酮、苯二甲酰肼、和蒽醌基团;
R2选自苯硼酸、苯甲酸、苯磺酸、苯胺、酪氨酸和精氨酸基团;
X2和X4为碳原子,且X1和X5为NH。
在本发明的另一方面,提供了式(I)化合物的用途,它被用作丙种球蛋白的亲和配位体而用于丙种球蛋白的亲和纯化。
在本发明的另一方面,提供了一种分离纯化丙种球蛋白的方法,在该方法中包括用亲和分离丙种球蛋白的步骤,而且在该亲和分离步骤中,使用权利要求1所述的化合物作为丙种球蛋白亲和配位体。
较佳地,在该亲和分离步骤中,在亲和分离步骤中,亲和介质吸附丙种球蛋白的条件为pH5.0-9.0,离子强度为0.0-0.1M的缓冲液;洗脱条件为pH2.0-4或9-12,离子强度为0.1-0.8M的缓冲液。
更佳地,在亲和分离步骤之后,该方法还包括进一步的精制步骤,该精制步骤选自下组:
用阴离子交换柱吸附除去丙种球蛋白中残留的杂质,较佳地在pH5.8-6.2条件下用DEAE-Sepharose离子交换柱进行;
用阳离子交换柱吸附除去丙种球蛋白中残留的杂质,较佳地在pH5.4-5.8条件下用SP-Sepharose离子交换柱进行。
用凝胶过滤层析除去丙种球蛋白中残留的杂质;
用超滤除去丙种球蛋白中残留的杂质;或
它们的组合。
本发明还提供了一种新的可用于分离纯化丙种球蛋白的亲和介质,该介质包括固相载体和固定在固相载体上的本发明的亲和配位体。
本发明人经过多年研究,发现了以下一类新的式(I)化合物,
式中,
R选自:无、H、卤原子、C1-C6烷基、氨基、C1-C6烷基单取代和双取代的氨基、羟基、羧基、巯基、含羟基的聚合物、多糖、琼脂糖、或纤维素;
R1选自苯甲脒、苯乙酮、苯二甲酰肼、和蒽醌基团;
R2选自苯硼酸、苯甲酸、苯磺酸、苯胺、酪氨酸和精氨酸基团;
X1、X2、X3、X4、X5各自独立地选自:碳原子、氧原子、氮原子或硫原子;而且X1、X2、X3、X4、X5为线性结构,或者X2、X3、X4与选自N、O、C的原子一起构成5元、6元或7元环,
附加条件是当X1、X2、X3、X4、X5为线性结构时,R不是无或H。
本发明的化合物可作为分离人或底物丙种球蛋白的亲和配位体,因而具有极大的应用价值,例如用于亲和层析。
亲和层析,又称为生物选择性吸附层析,已经成为纯化生物大分子活性物质不可缺少的分离技术。随着对生物制品中活性成分的纯度和需求量的增加,杂质含量的降低,传统分离技术如凝胶过滤和离子交换层析技术再也不能满足工业生产和学术研究的要求。
与其它方法相比,亲和层析方法具有以下几个明显的特点。亲和层析介质允许对生物分子选择地吸附和解离,可以取得很高的纯化倍数,常常为1000多倍。此外,蛋白在纯化过程中不仅得到浓缩,当结合到亲和配位体上时,蛋白的性质也更加稳定;其结果又提高了目标产品的活性回收率。因此,亲和分离技术非常适用于处理体积大,浓度低的生物活性物质。
在大规模生产的纯化工艺中,采用亲和层析技术可以大大减少纯化过程的步骤,从而减少了合格产品的生产时间和成本。当下游生产成本占总生产成本的80%时显得更加重要。在纯化过程的任何环节都可以使用亲和层析技术,但采用的越早,获得的经济效益越大。J.Bonnerjea(Biotechnology,4,954-958,1986)对生物制品生产工艺调查的结果显示,在所有被考察的工艺中,一步纯化效果最佳的单元操作中,有45%是利用亲和步骤获得的。
亲和分离介质的关键是亲和配位体(也可称为“亲和配基”)。亲和配位体必须能够选择性地和可逆地吸附生物大分子。传统的亲和配位体为亲和介质的成功使用奠定的基础。然而,在工业生产中,天然的亲和配位体,如抗体、辅酶、氨基酸、多肽、蛋白、凝集素,具有不可克服的缺点:最突出的因素是成本昂贵,生物和化学性质不稳定,生产中难于维持结合活性,也不能经受在线清洁和消毒,因此,还可能被其它物质,如病毒和内毒素污染。针对根据丙种球蛋白的结构和性质,本发明人专门设计和合成了一系列化合物;这些化合物固定于层析介质上后,不仅能够提供高效的纯化倍数、重复性的结果,而且配基极少脱落。更适合工业化、大规模生产医用和试剂用丙种球蛋白。
本发明化合物的结构特征是:化学基团R1和R2通过任何5个原子X1、X2、X3、X4、X5所构成的骨架连接起来,从而形成的本发明的化合物。X1、X2、X3、X4、X5可分别为氧、氮、碳、硫。连接的化学键可以是单键,双键或三键。骨架可以是包含全部或部分的X1、X2、X3、X4、X5的线性或环形结构;R1可以是苯甲脒、苯乙酮、苯二甲酰肼、和蒽醌基团;R2可以是苯硼酸、苯甲酸、苯磺酸、苯胺、酪氨酸和精氨酸基团。更佳地,R1可以是对苯甲脒、对苯乙酮和苯二甲酰肼;R2可以是邻苯硼酸、对苯磺酸和间苯胺。
较佳地,X2、X3、X4与选自N、O、C的原子一起构成6元环。更佳地,该化合物具有式(Ia)结构:
Figure C9911993600091
式中,
R′选自:H、卤原子、C1-C6烷基、氨基、C1-C6烷基单取代和双取代的氨基、羟基、羧基、巯基、含羟基的聚合物、多糖、琼脂糖、或纤维素;
X2和X1为碳原子,且X1和X5为NH。
如本文所用,烷基通常含有约1-8个碳原子,较佳地1-6个碳原子,更佳地1-4个碳原子,它可以是直链、支链或环状的饱和脂族烃基。合适的烷基例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基等。合适的环状脂族基团例子通常含有3-8个碳原子,而且包括环戊基和环己基。
在通式(I)和(Ia)中,R或R′是连接基团或分子,用于将本发明的亲和配位体固定在固相载体上,从而形成亲和层析基质。本领域已知的各种连接基团或连接分子都可用作本发明的R或R′基团。合适的例子包括(但并不限于):H、卤原子、C1-C6烷基、氨基、C1-C6烷基单取代和双取代的氨基、羟基、羧基、巯基、含羟基的聚合物、多糖、琼脂糖、或纤维素。较佳地,R或R′基团选自:卤原子、氨基、羟基或羧基、巯基、含羟基的聚合物、多糖、琼脂糖、纤维素。
在通式(I)和(Ia)中,R1或R2是能与丙种球蛋白发生相互作用,从而产生亲和力的基团。较佳地,R1选自苯甲脒、苯乙酮、苯二甲酰肼、和蒽醌基团;而R2选自苯硼酸、苯甲酸、苯磺酸、苯胺、酪氨酸和精氨酸基团。此外,R1和R2还可以被一个或多个C1-C4烷基或卤原子等取代。
R1和R2之间宜通过任何5个原子X1、X2、X3、X4、X5所构成的骨架而连接,其中X1、X2、X3、X4、X5可分别为氧、氮、碳、硫。
在制备本发明化合物时,可用常规的有机合成方法,依次将R1和R2连接于X1、X2、X3、X4、X5所构成的骨架。可选用的方法包括(但并不限于):亲核取代反应、缩合反应等。
在本发明范围内的一些具体化合物如下:
具有式(II)所示结构的化合物:
Figure C9911993600101
具有式(III)所示结构的化合物:
具有式(IV)所示结构的化合物:
具有式(V)所示结构的化合物:
具有式(VI)所示结构的化合物:
具有式(VII)所示结构的化合物:
具有式(VIII)所示结构的化合物:
较佳地,该化合物是具有式(II)、(III)或(VIII)所示结构的化合物。
本发明的新的式(I)化合物,因为与免疫球蛋白具有极高的亲和力,因此非常适合作为丙种球蛋白的亲和配位体,用于丙种球蛋白的亲和纯化。此外,本发明的亲和配位体很稳定,可以耐受医药生产中必需的现场在线清洗和消毒,可以方便地满足GMP(Good Manufacturing Practice)标准。
本发明还提供了一种新的分离纯化丙种球蛋白的方法,其中用式(I)化合物作为亲和配位体进行亲和纯化。各种常规的亲和纯化技术都可用于本发明,不同点仅在于用本发明的式(I)化合物作为亲和配位体。
本发明还提供了一种新的可用于分离纯化丙种球蛋白的亲和介质,该介质包括固相载体和固定在固相载体上的本发明的亲和配位体。在制备本发明亲和介质时,可以将用常规方法本发明的式(I)化合物固定在常规的合适载体上,从而形成亲和介质。
可用本发明纯化方法提纯的原料包括(但并不限于):采集的人血浆、胎盘血、基因工程菌或细胞和动物生物反应器表达的人免疫球蛋白的发酵液或细胞培养液。
这种亲和技术工艺,由于利用丙种球蛋白和亲和配位体之间的高亲和力,因此经一步亲和纯化处理就可获得高纯度的产品,可以在大规模生产和实验室中经济高效地制备高纯度的人免疫球蛋白,成本和生产效率可以与低温乙醇法相当,产品的纯度和质量与层析法相同。此外,这个生产工艺能够提高人免疫球蛋白的生产效率,降低生产成本,提高产品质量。
在附图中,图1是从SDS-PAGE检测人血浆一步纯化抗体的效果的电泳图。其中图1A是8%的非还原SDS-PAGE检测亲和层析纯化后抗体纯度的电泳图,图1B是12%的还原SDS-PAGE检测亲和层析纯化后抗体纯度的电泳图。
下面结合实施例进一步详细地阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于阐述目的,而不用于限制本发明范围。
实施例1
式(II)化合物的制备
Figure C9911993600141
该化合物是用如下方法合成的:
将3-氨基-苯硼酸(21.00mmol,1.05eq)溶于碳酸氢钠溶液(0.5M,10ml)。在搅拌下滴加入三氯三氮嗪(20.0mmol,1eq)的丙酮∶冰水(1∶1)悬浮液。用碳酸氢钠溶液(0.5M)保持反应体系的pH在6到7之间。反应进行大约两小时后,用TLC(硅胶,溶剂:甲醇/乙酸,95/5)和Ehrlich′s试剂检测不到芳香胺时,用旋转蒸发器除去丙酮。再用乙酸酸化水相,沉淀析出得到白色粉末,过滤,干燥得到产物II-I(C9H7N4O2BCl2),4.7g(产率84%)。
用元素分析法测得化学组成(%)C,37.87;H,2.52;N,19.53;
C9H7N4O2BCl2的理论值(%):C,37.94;H,2.48;N,19.67。
将对氨基苯甲脒盐酸盐(20mmol,1eq)溶解于碳酸氢钠溶液(0.5M,10ml)形成的溶液与产物II-I(3.24g,20mmol,1eq)溶解于NaHCO3(0.5M,15ml)形成的溶液,在pH6到7混合,并用NaHCO3(0.5M)维持pH在6-7,60℃保温过夜。当用TLC(硅胶,溶剂:甲醇/乙酸,5/95)和Ehrlich′s试剂检测不到芳香胺时停止反应,旋转蒸发浓缩后,用醋酸调节pH到9.5,析出灰色沉淀,得到式(II)化合物(C16H15N7O2BCl),产量为5.7g(75%)。
用元素分析法测得化学组成为(%):C,49.94;H,4.02;N,25.49;
C16H15N7O2BCl理论值为(%):,C,50.09;H,3.94;N:25.57%;)
实施例2
式(II)化合物的亲和层析介质的制备和亲和纯化丙种球蛋白
将实施例1制得的式(II)化合物(2g),溶解于50ml Na2CO3(0.5M,pH11.0),加入到氨基Sepharose 6B(100ml)中,90℃摇振过夜。然后取出Sepharose,经0.5M醋酸(50ml),0.1M NaOH(50ml)和蒸馏水(200ml)分别洗涤后,得到亲和层析介质,命名为puk9,加入用20%乙醇储存待用。
将亲和层析介质puk9(20ml),装入层析柱(5.0×10.0cm)中。用200mlTris·HCl(20mM,pH7.2)平衡后,把7ml人血浆(Tris.HCl,20mM,pH7.2)加到柱上。用70ml Tris·HCl(20mM,pH7.2)洗去未吸附的物质后,再用2ml醋酸溶液(0.1M)洗脱,收集洗脱组份。用12%的SDS-PAGE检测抗体的纯度。丙种球蛋白的一步纯化的回收率>93%,纯度大于79%。
实施例3
式(III)化合物的制备
Figure C9911993600151
该化合物是用如下方法合成的:
将对氨基苯磺酸(21.00mmol,1.05eq)溶于碳酸氢钠溶液(0.5M,10ml),在搅拌下滴加入三氯三氮嗪(20.0mmol,1eq)的丙酮∶冰水(1∶1)悬浮液。用碳酸氢钠溶液(0.5M)保持反应体系的pH在6到7之间。反应进行大约两小时后,用TLC(硅胶,溶剂:乙酸)和Ehrlich′s试剂检测不到芳香胺时,用旋转蒸发器除去丙酮。再用乙酸酸化水相,沉淀析出得到白色粉末,过滤,干燥得到产物III-I(C9H6N4O3Cl2S),产量为4.5g(产率70%)。
用元素分析法测得化学组成为(%):C,33.52;H,1.93;N,17.42;
C9H6N4O3Cl2S的理论值(%):C,33.66;H,1.88;N,17.45。
将对氨基苯乙酮(20mmol,1eq)溶解于丙酮/碳酸氢钠溶液(0.5M,10ml)(1/1,v/v)的溶液,与产物III-I(20mmol,1eq)溶解于NaHCO3(0.5M,15ml)的溶液在pH6到7混合,并用NaHCO3(0.5M)维持pH在6-7,60℃保温过夜。当用TLC(硅胶,溶剂:甲醇/氨水,95/5)和Ehrlich′s试剂检测不到芳香胺时停止反应,旋转蒸发浓缩后,用醋酸调节pH到2.5,析出无定型沉淀,得到式(III)化合物(C17H14N5O4ClS),产量为5.0g(60%)。
用元素分析法测得化学组成为(%):C,48.56;H,3.47;N,16.59;
C17H14N5O4ClS的理论值(%):C,48.63;H,3.36;N:16.68。
实施例4
式(III)化合物的亲和层析介质的制备和亲和纯化丙种球蛋白
将实施例3制得的式(III)化合物(2.4g),溶解于50ml Na2CO3(0.5M,pH11.0),加入到氨基Sepharose 6B(100ml)中,90℃摇振过夜。然后取出Sepharose,经0.5M醋酸(50ml),0.1M NaOH(50ml)和蒸馏水(200ml)分别洗涤后,得到亲和层析介质,命名为Af7-11,加入用20%乙醇储存待用。
将亲和层析介质Af-7-11(20ml),装入层析柱(5.0×10.0cm)中。用200mlTris·HCl(20mM,pH7.2)平衡后,把7ml人血浆(Tris·HCl,20mM,pH7.2)加到柱上。用70ml Tris·HCl(20mM,pH7.2)洗去未吸附的物质后,再用2ml醋酸溶液(0.1M)洗脱,收集洗脱组份。用12%的SDS-PAGE检测抗体的纯度。丙种球蛋白的一步纯化的回收率>30%,纯度大于78%。
实施例5
式(VIII)化合物的制备
该化合物是用如下方法合成的:
将4-氨基苯乙酮(21.00mmol,1.05eq)溶于碳酸氢钠溶液(0.5M,10ml),在搅拌下滴加入三氯三氮嗪(20.0mmol,1eq)的丙酮∶冰水(1∶1)悬浮液。用碳酸氢钠溶液(0.5M)保持反应体系的pH在6到7之间。反应进行大约两小时后,用TLC(硅胶,溶剂:乙酸)和Ehrlich′s试剂检测不到芳香胺时,用旋转蒸发器除去丙酮。再用乙酸酸化水相,沉淀析出得到白色粉末,过滤,干燥得到产物VIII-I(C11H8N4OCl2),产量为4.4g(产率78%)。
用元素分析法测得化学组成为(%):C,33.08;H,2.04;N,14.02;
C11H8N4OCl2的理论值(%):C,33.12;H,2.02;N,14.05。
将酪氨酸(20mmol,1eq)溶解于丙酮/NaHCO3(0.5M)(1/1,v/v)的溶液,与产物VIII-I(10mmol,1eq)溶解于50ml丙酮/NaHCO3(0.5M)(1/1,v/v)的溶液在pH6到7混合,并用NaHCO3(0.5M)维持pH在6-7,60℃保温过夜。当用TLC(硅胶,溶剂:甲醇/氨水,95/5)和Ehrlich′s试剂检测不到芳香胺时停止反应,旋转蒸发浓缩后,用醋酸调节pH到2.5,析出元定型沉淀,得到式(VIII)化合物(C17H15N8O2Cl),产量为3.8g(89%)。
用元素分析法测得化学组成为(%)C,60.17;H,4.55;N,17.53;
C17H15N8O2Cl的理论值(%):C,60.22;H,4.55;N:17.56
实施例6
式(VIII)化合物的亲和层析介质的制备和亲和纯化丙种球蛋白
将实施例5制得的式(VIII)化合物(3.1g),溶解于50ml Na2CO3(0.5M,pH11.0),加入到氨基Sepharose 6B(100ml)中,90℃摇振过夜。然后取出Sepharose,经0.5M醋酸(50ml),0.1M NaOH(50ml)和蒸馏水(200ml)分别洗涤后,得到亲和层析介质,命名为Af11-3,加入用20%乙醇储存待用。
将亲和层析介质Af11-3(20ml)装入层析柱(5.0×10.0cm)中。用200mlTris·HCl(20mM,pH8.0)平衡后,把7ml人血浆(Tris·HCl,pH8.0,20mM)加到柱上。用70ml Tris·HCl(20mM,pH8.0)洗去未吸附的物质后,再用20ml Na2CO3(0.1M)洗脱,收集洗脱组份。用8%的非还原和12%的还原SDS-PAGE检测抗体的纯度,结果如图1所示,其中图1A是8%的非还原SDS-PAGE检测抗体纯度的电泳图,图1B是12%的还原SDS-PAGE检测抗体纯度的电泳图。丙种球蛋白的一步纯化的回收率>83%,纯度大于95%。
实施例7
对亲和纯化后的丙种球蛋白进行精制
将实施例2中的丙种球蛋白的洗脱液,调节pH到pH 6.0,离子强度0.02,洗涤后直接上到DEAE-Sepharose离子交换柱(2×5cm),收集洗脱液。检测表明丙种球蛋白回收率>90%,纯度大于97%。
调节流穿液pH到5.5,离子强度0.01,后再上到SP-Sepharose柱(2×5cm),收集流穿液,丙种球蛋白的总回收率>85%,纯度大于99%。
应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种化合物,其特征在于,该化合物具有式(Ia)结构:
式中,
R′选自:H、卤原子、C1-C6烷基、氨基、C1-C6烷基单取代和双取代的氨基、羟基、羧基、巯基、含羟基的聚合物、多糖、琼脂糖、或纤维素;
R1选自苯甲脒、苯乙酮、苯二甲酰肼、和蒽醌基团;
R2选自苯硼酸、苯甲酸、苯磺酸、苯胺、酪氨酸和精氨酸基团;
X2和X4为碳原子,且X1和X5为NH。
2.按权利要求1所述的化合物,其特征在于,该化合物是具有式(II)、(III)或(VIII)所示结构的化合物:
Figure C991199360002C2
3.一种如权利要求1所述化合物的用途,其特征在于,它被用于丙种球蛋白的亲和纯化。
4.如权利要求3所述的用途,其特征在于,该化合物是具有式(II)、(III)或(VIII)所示结构的化合物:
Figure C991199360003C2
5.一种分离纯化丙种球蛋白的方法,在该方法中包括用亲和分离丙种球蛋白的步骤,其特征在于,在该亲和分离步骤中,使用权利要求1所述的化合物作为丙种球蛋白亲和配位体。
6.按权利要求5所述的方法,其特征在于,在亲和分离步骤中,亲和介质吸附丙种球蛋白的条件为pH5.0-9.0,离子强度为0.0-0.1M的缓冲液;洗脱条件为pH2.0-4或9-12,离子强度为0.1-0.8M的缓冲液。
7.按权利要求5所述的方法,其特征在于,在亲和分离步骤之后,该方法还包括进一步的精制步骤,该精制步骤选自下组:
用阴离子交换柱吸附除去丙种球蛋白中残留的杂质;
用阳离子交换柱吸附除去丙种球蛋白中残留的杂质;
用凝胶过滤层析除去丙种球蛋白中残留的杂质;
用超滤除去丙种球蛋白中残留的杂质;
或它们的组合。
8.如权利要求5-7中任一权利要求所述的方法,其特征在于,该丙种球蛋白是人的丙种球蛋白。
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