CN1207303C - 从活性血多肽中分离的活性单肽、其制备工艺、活性及序列 - Google Patents

Abstract

本发明公开了从活性血多肽一小牛血去蛋白提取物中分离的活性单肽、其制备工艺、活性及序列检测；用建立的活性测定方法，对分离后的各组分进行活性筛选，并分析了生化性质；用现代液相色谱方法，经过凝胶色谱、C18及C4反相色谱、Silica及CN正相色谱，分离纯化出小牛血去蛋白提取物中的活性成分；用高效液相色谱、高效毛细管电泳、质谱鉴定其为一活性肽并测定了分子量，该活性肽主要用于治疗脑血管疾病。

Description

从活性血多肽中分离的活性单肽、其制备工艺、活性及序列

技术领域：

本发明公开了一种活性肽及其制备方法，特别是从活性血多肽-小牛血去蛋白提取物中分离的活性单肽及其制备方法、活性检测和序列分析以及该活性肽的用途。

背景技术：

肽是一类生物活性物质。它涉及激素神经细胞生长和生殖等多个领域，其重要性在于调节体内各系统、器官和细胞的功能活动。生物活性肽的研究是当前生物学研究中最活跃的领域之一。二十世纪六、七十年代，垂体和下丘脑的一些肽类激素分离纯化取得重大突破，七十年代中期内源性阿片肽的分离纯化取得成功，极大的推动了神经肽研究的发展。已经发现众多生物活性肽，如神经肽、脑肠肽、心房肽等等，广泛参与生物体的各种功能活动的调节，引起各相关学科的注意。在生物活性肽的研究中，极其重要而且必不可少的内容就是肽的分离纯化工作，但由于肽不但本身结构复杂，而且所处的环境往往是含有各种各样大分子的混合物，因此肽的分离纯化一直是生物学工作者十分关注长期研究的课题。

生物活性肽一般所处的环境往往是各种各样大小分子的混杂体，分离纯化的目的是为了进一步研究其组成、结构、生物活性、功能和作用机理等，并进一步通过人工合成的方法合成这种肽。肽含量非常低，因此至今没有一个单独或一套现成的方法能把任何一种多肽从复杂的混合物中提取出来。

在生物活性肽的分离纯化述程中，关键的步骤是建立自始至终都要用的生物活性测定方法，且该测活方法始终是可信的，以保证纯化出能在测活实验中给出信号的来西。分离纯化肽的基础主要是利用分子之间各种特性的差异，如分子的大小和形状、酸碱性质、溶解度、吸附性质和对其它分子的生物学亲和力。现用于纯化肽的分离纯化模式主要有三种：一是凝胶色谱，按肽分子的大小进行分离；二是离子交换色谱，按肽分子所具有的带电基因的性质数目进行分离；三是反相色谱，按肽分子的疏水强弱进行分离。从成分极其复杂的混合物中将肽分离出来，常常可利用化合物分子的不同特性(体积、带电性、疏水性)连续选用几种模式的色谱方法以达到有效的分离纯化。但是每一步的分离过程中总有部分样品不可避免地损失掉，如肽的浓度很低时应避免分离步骤过多。正确的实验设计是选用最少的分离步骤达到最佳的分离效果。所以对于多步骤的分离程序。要选择柱子的种类及使用顺序非常重要。对于每一种肽应该选择一套适当的分离纯化模式以获得高纯度高活性的纯品。例如在“高效液相色谱在生命科学中的应用，科学技术文献出版社，1998”中，公开了利用凝胶色谱、离子交换色谱和反相色谱在选择性上的差异，采用凝胶色谱(Bio-Rad250)、离子交换柱(SynChropakS300)、反相柱(SgnChropak RP-C18)，从兔骨路肌肌钙蛋白中完全分离出所需要的肽分子片段。

活性血多肽的种类很多，一般是从动物的血液中分离提纯出来的，如小牛血去蛋白提取物(Deproteinized Hemoderivation Calfblood)是以小牛血为原料，分子量小于5000道尔顿的小分子生物活性制剂。

小牛血去蛋白提取物(血活素)1955年由瑞士素高药厂(SOLCOBASLE A.G.)首先研制开发出来，在世界各国已广泛应用多年，目前主要上市产品有奥地利奈科明药厂(HAFSLUND NYCOMEDAG)爱维治(Actovegin)和瑞士素高药厂生产的素高捷疗(Solcoseryl)，以及由日本和我国的众多生产厂家生产的产品。其制剂有注射液、片剂、眼膏、冻膏等，注射液每毫升含有40-50mg小牛血去蛋白提取物。

小牛血去蛋白提取物的主要药理作用是促进细胞对氧和葡萄糖的摄取和利用(不依赖于胰岛素)，该作用在功能缺陷、代谢受抑的情况(低血氧、基质不足)下和能量需求增加时尤为突出，使葡萄糖的无氧代谢转向有氧代谢，促使能量物质生成增多，延长细胞生成时间，促进组织细胞代谢及功能恢复和组织修复。作为脑代谢复活剂，主要用于治疗老年性痴呆(包括Alzheimer病、多梗塞性痴呆等)、急、慢性脑血管疾病，特别是中风、颅脑外伤、脊髓的一些病症、脑创伤、脑器质性精神障碍、外周血管闭塞疾病，此外，也用于治疗各种类型的伤口、溃疡创面、烧伤、化学灼伤、放射性损伤等，具有良好的临床疗效。

小牛血去蛋白提取物的成分十分复杂，在其干物质中，主要为无机物和小分子有机物，包括氨基酸、糖类、小分子量多肽、核苷、酮酸和类脂代谢的中间产物等，不含抗原性物质、致热源和任何可传播的感染因子。与小牛血去蛋白提取物相关的资料见J Cell Physiol 1991 Jan，146(1)：681-5；Eksp Kiln Farmakol，1999，62(2)：61-3；Acta Physiol Hung 1996；84(1)：63-72；Neuropsychobiology 1998，37(1)：28-35；Angiology 1992 Jan；43(1)：47-58；Arzneimittelforschung 1996 Mar，47(3)：269-72；EP824，375；US4,866,033。

作为一种疗效确切的生化药品，将小牛血去蛋白提取物中起主要作用的活性成分——一种活性肽分离纯化出来，将有利于对其性质、功能、作用机理进行进一步的研究探讨，并且有可能按照分离的结构进行化学合成。但是自1955年小牛血去蛋白提取物面市以来，对其的研究大都集中在其药理作用及临床应用方面，未见从中分离纯化活性成分的报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种由活性血多肽，特别是小牛血去蛋白提取物分离纯化出的活性肽成分，进一步确定其活性、分子量、序列及其它理化性质。

本发明的另一个目的在于提供一种由活性血多肽，特别是小牛血去蛋白提取物分离纯化活性肽成分的方法。

本发明的再一个目的在于公开该活性肽在治疗脑血管和外伤等方面的用途。

近年来，真核细胞从细胞外到细胞内的信息传递的研究工作已取得了很大的进展。人们已经掌握了细胞内信息传递系统的基本结构，这些信息传递通道主要由特异性受体、G蛋白、释放第二信使的功能蛋白、一系列的蛋白激酶、靶向功能蛋白和多种调控蛋白等一系列环节组成。此外，细胞外信息(如基体激素类)还可通过离子通道或直接传入细胞内，作用于相应系统而引起细胞反应。通过对小牛血去蛋白提取物成分和药理作用机制的分析，估计其活性成分很有可能为活性肽，可能的机制是活性肽作用于细胞表面受体或其它感受器，细胞经过一系列转换系统传递给相应的反应系统，从而导致细胞内线粒体的能量代谢改变。

基于上述分析，本发明首先建立了瓦氏呼吸仪测压法测定活性，对脑代谢复活剂——小牛血去蛋白提取物原料进行活性筛选，确定适于分离的原料，本发明采用色谱的方法，经过凝胶色谱、C18及C4反相色谱、Silica及CN正相色谱多步液相色谱分离纯化，每一步分离物用瓦氏呼吸仪测压法跟踪活性测定，从小牛血去蛋白提取物注射液中得到了一生物活性肽，此活性肽肽能促进豚鼠肝细胞对氧的摄取和利用，是小牛血去蛋白水解液注射液中的有效成分，进一步采用高效毛细管电泳鉴定纯度，HPGC测定样品分子量，并测定了其紫外光谱和质谱。

本发明中首先采用瓦氏呼吸仪测压法测定奥地利Hsfslund Nycomed AG出品的“Actovegin注射液”、瑞士Solco Basle出品的“Socolseryl注射液”、锦州医学院出品的“促细胞生成素”、上海丽宝生物制药有限公司出品的“血活素注射液”等四种小牛血去蛋白提取物的生物活性。通过活性测定，筛选其中活性最高的样品作为用于分离纯化的原材料，经过凝胶色谱、C18及C4反相色谱、Silica及CN正相色谱分别进行分离提纯；上述每一步分离纯化后，得到的各级分样品在冷冻干燥、调整浓度后，进行活性的跟踪测定以确定活性组分，得到的活性最高的组分再进行下一步分离，至分离纯化出小牛血去蛋白提取物中的活性成分；用高效液相色谱、高效毛细管电泳鉴定其为一活性肽，质谱分析确定了其分子量，Edman降解法确定了其氨基酸序列。分离醇化的具体过程如图27所示。

瓦氏呼吸仪测压法是一种在定温定容的密闭系统中，利用气体压力的变化定量测定生物材料或某些化学反应中微量的气体交换的技术。在本发明中，利用豚鼠肝匀浆细胞呼吸时，消耗O₂，同时放出CO₂，而CO₂被反应瓶中所加入的KOH吸收，因此压力计的压力变化是由反应瓶中O₂的减少所产生的，由压力的变化量可测定O₂的吸收量，由此计算出样品或分离组分的活性。四种小牛血去蛋白提取物的活性测定，Actovegin注射液在四种样品中活性最高，决定采用Actovegin注射液作为分离纯化的原材料，另外，选择Actovegin注射液作为进一步分离原料的另一个原因是该样品中的其它辅料有利于分离纯化。

为了更好地选择分离纯化的模式和条件，本发明测定了作为分离纯化原材料的Actovegin注射液的分子量。凝胶色谱法和电泳法是实验室常用的分子量测定方法，但电泳法一般只能测定分子量5000道尔顿以上的化合物，因此本实验采用高效液相凝胶色谱法测定样品分子量；因Actovegin注射液为小分子复合物，故采用分离范围为分子量100～7000道尔顿的Superdex Peptide HR 10/300凝胶色谱柱测定其分子量。将已知分子量的标准物质，在同一凝胶色谱柱上以相同条件进行胶色谱层析。由于加入凝胶色谱柱的物质分子量不同，故洗脱体积也不相同。根据洗脱体积求出Kav值，而Kav值与分子量之间存在线性关系(Kav＝-blgMW+c)，因此，可以绘出一条标准曲线。然后，在同样条件下，由未知分子量物质的洗脱体积可求出其Kav值，以此值在标准曲线上就能求出其分子量。用高效液相凝胶色谱法测定分子量，具有测定速度快、样品用量少的优点。得到Actovegin注射液的分子量95％小于1500道尔顿。

为了进一步为分离纯化模式和条件的选择提供信息，本发明中利用高效毛细管区带电泳(HPCZE)分析对Actovegin注射液进行了多元定性分析。高效毛细管电泳(HPCE)分析是目前分辨率较高的分析手段。毛细管区带电泳(CZE)是指溶质在毛细管内的背景电极缓冲液中以不同速度迁移而形成一个独立的溶质带的电泳模式，其分离基础是各溶质在电极缓冲液中净电荷与质量比间的差异。CZE模式是HPCE中应用最广的一种操作模式。电极缓冲液的选择直接影响到溶质的迁移和最后的分离，其PH值至少必须比被分析物质的等电点高或低一个PH单位。一般地说，只要条件允许就尽可能采用酸性电极缓冲液，事实上所有的肽的等电点都大于PH4。

从分离的角度讲，多肽的每一步分离要尽可能找到最佳分离方法和分离条件，提高样品的处理量和回收率。但对于从复合物中分离纯化未知其生化性质的生物活性物质，并用活性测定的方法来监测分离组分时，更重要的是要注意活性成分不能分散在不同收集部分中，因为活性成分可能由两种或多种物质构成，最后分离比开始时省时省力：因此本发明采用如下的分离纯化方法：

1.中低压液相色谱(FPGC)分离小牛血去蛋白提取物：

在生化分离中，经常采用离子交换层析色谱法作为分离纯化的第一步，因为在制备性的纯化中使用大容量制备型离子交换柱十分方便而且效率较高，但对于本发明而言，由于Actovegin注射液中盐浓度太高(硝酸银滴定法测定氯离子浓度6mg/ml)，而且分子量太小无法使用凝胶过滤或透析等方法进行脱盐处理，故本实验采用中低压液相色谱仪(FPGC)及制备型的HiLoad 26/60 Superdex柱进行凝胶色谱分离作为Actovegin注射液分离纯化的第一步。凝胶色谱是根据化合物大小和形状的差别实现分离的一种技术。凝胶色谱的分离机制可以用立体排除机制来说明，即小分子和溶剂可以完全进入固定相填料的孔穴中，称为完全渗透，其分配系数K＝1；大分子完全不能进入，称为完全排除，其分配系数K＝0；对于中间大小的分子则属于选择性渗透，它可以进入填料的某些孔穴内，而不能进入另一些填料的较小孔中，故其分配系数K在0～1之间，这部分是凝胶色谱分离有效的范围，在这个范围内，如果分子量的指示正确且不考虑分子形状的影响，则分子量的对数与洗脱体积之间将是线性关系。

在凝胶色谱中，很重要的一点是选择合适的柱填料。柱填料的选择可以从以下几点来考虑：①应当根据被分离物质的分子量范围来选择合适的柱填料。不同大小的化合物，当它们的洗脱体积接近填料分离范围的中值时，有最好的分离。②选择具有合适孔体积分布的柱填料。孔体积越大峰容量越大，分离也越高，但孔体积太大时填料不耐压，如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶，耐压值小于0.3MPa，不适宜于HPLC上使用。③柱填料颗粒越细，大小越均匀，分辨率越高，但反压亦较高，对填料柱和系统的要求亦越高。④物理稳定性和化学稳定性。良好的物理稳定性才能承受高流速，同时保持柱床体积和结构稳定，提高色谱的重复性；高的化学稳定性即指能适应较宽的PH浓度及有机溶剂，其有利于开发分离条件和在位清洗。根据Actovegin注射液的性质，本发明中，首先选择了中低压液相系统和HiLoad 1.6/60 Superdex柱对Actovegin注射液进行第一步凝胶色谱。HiLoad 1.6/60 Superdex柱，柱体积120ml，颗粒大小22～44um，分离范围＜10000道尔顿，耐压值0.3Mpa，介质为葡聚糖共价交联琼脂糖，结合了葡聚糖的高选择性和琼脂糖的高物理稳定性，在高流速下不会变型，批处理重复性很好。实验结果表明，FPGC法分离得到的六种组分，其中F5组的相对活性大大高于其它组分，说明F5组分是活性成分主要存在的组分。因此本发明中，用分离出的活性最高的F5组继续进行分离。

2.高效反相液相色谱(HPRPC)分离F5组分：

HPRPC是分离小分子生化物质的最常用也是最有效的方法之一。因为它具有分辩率高、重复性好、采用有机溶剂作流动相比盐水体系易从样品中除去溶剂和后处理比较方便等特点。硅胶键合相填料是HPRPC最常用的固定相。硅胶基质的填料机械强度好，耐受压力高，适用于在HPLC。在HPRPC中常用的硅胶键合相填料有十八烷基硅胶(C18或ODS)、辛基硅胶(C8)、苄基硅胶(C4)等。本发明的第二步分离中，选择C18硅胶柱分离第一步得到的活性最高的组份。在条件固定时，键合链较长的有更大的色谱保留，但当健合链的碳数超过7时，碳数增加，保留时间并不变化。HPRPC多采用梯度洗脱方式来分离样品，流动相通常是由水相缓冲液和不同浓度的有机溶剂组成。有机溶剂中乙腈最常用，因为其在210～80nrn间无紫外吸收，易除去并且在分离生物活性物质时，有较高的生物活性和质量回收率。HPRPC的流动相中常加入三氟乙酸或七氟丁酸等离子对试剂，其一是增加化合物与键合相的疏水作用，调节保留；其二使流动相的PH值在2.5～5.0之间，防止固定相中残留的硅醇基在碱性条件下离子化而引起二次吸附。

本发明的第二步分离采用液相色谱仪，Zorbax 300SB-C18柱，实验结果表明HPRPC分离得到的各组分中的相对活性，其中I组分的相对活性为75.3％，高于其它组份，说明I组分是活性成分主要存在的组分，因此选择I组分进行第三步的分离。

3.I组分的高效反相液相色谱(HPRPC)分离

采用与第二步相同的液相色谱仪，Vydac 300SB-C4柱进行I组分的进一步分离，实验结果表明分离得到的6个组份中，Y4组份相对活性69.2％，大大高于其它组分，说明Y4组分是活性成分主要存在的组分，选择Y4组分进行第四步分离。

4.Y4组分的高效正相液相色谱(HPNPC)分离

HPNPC是以亲水性的填料作固定相，如在硅胶上键合羟基、氨基和氰基的极性固定相，以疏水性溶剂或混合物作流动相的液相色谱。HPNPC的分离决定于溶质和固定相及之间的分子间作用力，其中氢键力和静电力起着重要的作用。本发明中，用高效液相色谱仪、Zorbax 300SB-CN柱，梯度洗脱，得到六个组份Y，实验结果表明，分离出的六个组份中，Z3组分相对活性85.4％远远高于其它组分，说明Z3组分是活性成分主要存在的组分，可用于进行第五步的分离纯化。

5.Z3组分的高效正相液相色谱(HPNPC)纯化

用高效液相色谱仪，Zorbax RX-SIL柱梯度洗脱分离Z3组份，得到四组分离物Z，实验结果表明分离出来的组分中，W3组分相对活性为50.7％，活性高于其它组分，说明W3组分是活性成分主要存在的组分，用W3进行下一步的纯化。

6.W3组分的高效正相液相色谱(HPNPC)纯化

用高效液相色谱仪，Zorbax RX-SIL柱分离，得到三个组份，其中P2组分的相对活性为49.6％，高于其它组份，P2组分是活性成分主要存在部分。

从自原料小牛血去蛋白提取物开始，每一步分离的分离色谱图可以看出，随着分离的进行，得到的组份的纯度逐渐提高；谱图由多个重叠的峰，经分离后色谱图中的峰逐渐拉开，得到几个独立的峰，至最后一步分离，得到的谱图中，基本为一个主要的峰，只含有少量杂质；由于同时用瓦氏呼吸仪测压法跟踪测定分离纯化得到样品的活性，可以认为得到了小牛血去蛋白提取物中的一种活性肽。

本发明的上述方法也适用于从其它动物的活性血多肽中分离活性单肽。

本发明采用高效毛细管区带电泳(HPCZE)鉴定分离出的活性肽P2组份纯度大于95％；高效液相凝胶色谱法(HPGC)测定分子量为803道顿；氨基酸组成分析是测定肽序列的重要组成部分，它不仅为制定测序方案提供前提，而且为测序的准确性和效率起着作用，盐酸水解是目前水解蛋白质和肽应用最广泛的一种方法，盐酸水解使色氨酸全部破坏，苏氨酸和丝氨酸破坏5～10％，色氨酸被破坏的原因是氧化，若加入1％的苯酚，一般能达到70％的回收率，本发明采用盐酸水解、柱前衍生法分析法测定P2组分氨基酸组成。

本发明测量了活性肽P2组份在190～300nm的紫外吸收光谱。多肽中的共轭双键系统能吸收190-300nrn波长范围内的紫外光。不同的官能团有不同的吸收峰，因此，考查肽的整个吸收光谱可揭示关于肽的氨基酸组成和肽定量方面的有关信息。若知肽的氨基酸组成，则也许有可能通过检查光谱来评价它的纯度。在190-220urn的紫外光波长范围内，共轭双键如肽键有强列的吸收，其它的生物活物质如蛋白质和核酸也显示极强的吸收，因此用此波长范围内的紫外光检测生物活性质是比较适当的。但这不是特征的，其它的化合物如三氟乙酸在190-220nm也有类的吸收。

此外本发明经液相二级质谱测定，确定了分子量和碎片结构信息；并用Edman降解法经自动氨基酸测序仪测定其序列。上述分析测试进一步证明分离出的为一活性肽。

本发明的活性肽直接作用于细胞代榭，促进细胞对葡萄糖的摄取和利用(不依赖于胰岛素)，增加细胞氧的摄入率和利用率，从而使ATP的生成增加，使细胞能源量提高。这是一种不依赖器官的作用。通过这一作用引起细胞代谢的改善，从而改善细胞代谢及功能状态，这一作用在缺血缺氧状态下尤为显著。在功能缺陷、代谢受抑的情况(低血氧、基质不足)下和能量需求增加时，在细胞水平促进细胞能量代谢，改善细胞功能，使血液供应增加。另外，它与各种人类生长因子有协同效应，对组织有增殖作用。主要用于治疗老年性痴呆(包括Alzheimer病、多梗塞性痴呆等)、急、慢性脑血管疾病，特别是中风、颅脑外伤、脊髓的一些病症、脑创伤、脑器质性精神障碍、外周血管闭塞疾病，此外，也用于治疗各种类型的伤口、溃疡创面、烧伤、化学灼伤、放射性损伤等。

本发明用建立的活性测定方法——瓦氏呼吸仪测压法，对脑代谢复活剂——小牛血去蛋白提取物原料进行活性筛选，确定了适于分离提纯的原料，用现代液相色谱方法，经过凝胶色谱、C18及C4反相色谱、Silica及CN正相色谱，从中分离纯化出一活性成分，活性多肽，此多肽经活性测定证明，能促进豚鼠肝细胞对氧的摄取和利用，是小牛血去蛋白水解液注射液中的有效成分，本发明进一步用高效液相色谱、高效毛细管电泳鉴定其为一活性肽，质谱分析确定了其分子量，Edman降解法确定了其氨基酸序列，本发明的方法科学、可靠，所分离出的活性肽，对于进一步研究脑代谢复活剂——小牛血去蛋白提取物的功能、作用及治疗各种疾病的机理具有重要的意义；同时，为采用生物及化学方法合成该活性肽奠定了基础。分离纯化出的活性肽经测定氨基酸序列后，可以进行人工合成，如能应用于临床将有巨大的应用价值。

下面结合附图和具体实施例详细描述本发明，所述的实施例是用于描述本发明，而不是限制本发明。

附图说明：

图1为本发明的分子量标准混合溶液的HPGC图谱；

图2为本发明的分子量标准曲线；

图3为本发明Actovegin注射液的HPGC图谱；

图4为本发明Actovegin注射液的HPCZE分析图谱；

图5为本发明Actovegin注射液的FPGC分离图谱；

图6为本发明Actovegin注射液FPGC分离各收集组分比较图谱；

图7为本发明Superdex的结构图；

图8为本发明F5组分的HPRPC分离图谱；

图9为本发明F5组份HPRPC分离的各收集组分；

图10为本发明F5 FPGC分离的各收集组分比较；

图11为本发明I组分的HPRPC分离色谱图；

图12为本发明I组分经HPRPC分离后的各收集部分；

图13为本发明I组分的各分离部分相对体积、峰面积和活性的比较；

图14为本发明Y4组分的HPNPC分离色谱图；

图15为本发明Y4组分经HPNPC分离后的各收集部分；

图16为本发明Y4组分的各分离部分相对体积、峰面积和活性的比较；

图17为本发明Z3组分的HPNPC分离色谱图；

图18为本发明Z3组分经HPNPC分离后的各收集部分；

图19为本发明Z3组分的各分离部分相对体积、峰面积和活性的比较；

图20为本发明W3组分的纯化色谱图；

图21为本发明P2组分HPCZE纯度鉴定图谱(在PH值2.5的电极缓冲液中)；

图22为本发明P2组分HPCZE纯度鉴定图谱(在PH值8.0的电极缓冲液中)；

图23为本发明HPGC测定样品P2组分分子量图谱；

图24为本发明PTC-氨基酸标准色图谱；

图25为本发明P2组分的紫外吸收光谱；

图26为本发明P2组分的质谱图；

图27为本发明的由小牛血去蛋白提取物分离活性单肽的流程图；

图28为小牛血去蛋白提取物分离的流程图。

具体实施方式：

                            实施例1

本实施例涉及用瓦氏呼吸仪测压法测定分离纯化样品的活性。具体如下：

材料与仪器：瓦氏呼吸仪：Warburg系统12062型，德国Braun-Melsungen生产；己标化无侧臂反应瓶；高速匀浆机；动物为250±10g重的清洁级雄性豚鼠；四种小牛血去蛋白提取物为：奥地利Hafslund Nycomed AG生产的批号为152842的Actovegin注射液；瑞士Solco Basle生产的批号为414409的Socolseryl注射液；锦州医学院生产的批号为981216的促细胞生成素；上海丽宝生物制药有限公司生产的批号为990102的血活素注射液。试剂为：10％KOH溶液、0.2mol/ml PBS和Brodie测压液，小牛血去蛋白提取物的配制方法为：称取牛胆酸钠5g，NaCI 23g分别溶解后合并，加入伊文思蓝100mg，定容至500ml，加入几滴香草酚酒精溶液防腐。

实验方法：豚鼠禁食24小时后，颈部打击处死，迅速取出肝脏。称取肝组织4g，加入24ml 0.2mol/ml PBS，6000rpm匀浆30秒，多层纱布过滤，得到肝匀浆液，在预先洗净及干燥的反应瓶中按表1加入样品及试剂；将装好的反应瓶与相应的侧压管连接后，将反应瓶浸入37±1℃恒温水浴中，开动振荡器(100次/分钟)振荡20分钟，进行温度和压力补偿；将测压计右侧柱测压液面调至150mm处，记录左侧测压液读数(A₁)，关闭三向活塞，开动振荡器；15分钟后，关闭振荡器，利用旋钮调节测压计右侧柱测压液液面至150mm处，记录左侧测压液液面读数(E₁)；重复4、5过程两次，读数分别记录为A₂、E₂，A₃、E₃。

相对活性计算方法如下：

反应瓶常数K值的计算：

$K\left(O_2\right)=\frac{(V_1+V_2-3300)\×(273\÷300)+3300\×{0.0239}^{*}}{1000}$

其中：V₁为反应瓶体积(μl)；V₂为测压管体积(μl)；^*0.0239为37℃时O₂的溶解度。

耗氧量ΔO₂(μl)的计算：

ΔO₂＝[(A₁-E₁)+(A₂-E₂)+(A₃-E₃)]×K

相对活性(％)的计算：

由瓦氏呼吸仪测压法测定的四种样品的相对活性测定结果见表1--4。由表1--4可以看出，Actovegin注射液在四种样品中活性最高，决定采用Actovegin注射液作为进一步分离纯化的原材料，另外，Actovegin注射液中其它辅料，有利于分离纯化。

                             表1.促细胞生成素活性测定结果

编号              1         2         3          4          5          6          7

V₁(ml)           10.875    11.627    10.2       10.245     10.727     9.73       10.322

V₂(ml)K          1.386     1.477     1.536      1.492      1.323      1.338      1.295

(O₂)             0.865573  0.939811  0.819339   0.819427   0.846991   0.760512   0.808859

A1                150       151       150        152        150        150        152

E1                138       130       124        126        129        123        128

A2                150       151       150        152        151        151        151

E2                136       126       124        122        123        116        118

A3                150       151       150        152        150        152        151

E3                141       132       130        130        127        133        129

相对活性

                            96.04     89.32      110.38     95.71      97.69      105.07

(100％)

平均相对活性为99.04％

                            表2.血活素注射液活性测定结果

编号             1           2           3           4            5          6           7

V₁(ml)          10.875      11.627      10.2        10.245       10.727     9.73        10.322

V₂(ml)          1.386       1.477       1.536       1.492        1.323      1.338       1.295

K(O₂)           0.865573    0.939811    0.819339    0.819427     0.846991   0.760512    0.808859

A1               151         151         150         151          150        149         152

E1               139         124         117         121          121        114         120

A2               150         151         150         151          149        148         152

E2               123         105         114         114          109        112         112

A3               150         151         149         151          149        148         152

E3               141         127         121         130          125        118         126

相对活性

                             177.47      155.05      131.41       152.79     146.50      154.39

(100％)

平均相对活性为153.697％

                                    表3.Actovegin注射液活性测定结果

编号           1           2           3            4            5            6           7

V₁(ml)        10.875      11.627      10.2         10.245       10.727       9.73        10.322

V₂(ml)        1.386       1.477       1.536        1.492        1.323        1.338       1.295

K(O₂)         0.865573    0.939811    0.819339     0.819427     0.846991     0.760512    0.808859

A1             150         151         152          152          150          150         152

E1             136         112         108          110          109          106         109

A2             150         150         152          153          151          150         152

E2             136         106         106          109          107          106         110

A3             150         151         152          152          151          150         152

E3             138         112         114          110          111          108         112

相对活性

                           231.16      202.91       202.94       205.79       185.55      192.02

(100％)

平均相对活性为234.32％

                                  表4.Socolseryl注射液活性测定结果

编号          1            2           3            4            5            6           7

V₁(ml)       10.875       11.627      10.2         10.245       10.727       9.73        10.322

V₂(ml)       1.386        1.477       1.536        1.492        1.323        1.338       1.295

K(O₂)        0.865573     0.939811    0.819339     0.819427     0.846991     0.760512    0.808859

A1            150          150         152          152          151          151         151

E1            134          110         108          112          109          109         106

A2            150          150         151          152          150          151         151

E2            135          107         105          109          110          106         103

A3            150          150         151          152          150          150         151

E3            137          112         108          115          112          106         110

相对活性

              198.58       181.82      158.19       166.87       161.59       184.59

(100％)

平均相对活性为175.27％

在瓦氏呼吸测压法中，要注意的问题有：取豚鼠肝组织时，部位大小要合适，尤其是不能将胆剪破；匀浆前将肝组织剪成大小均匀并尽量小的小块，保证匀浆的均一；从取肝组织到测压开始这一段时间尽可能迅速并保持各次活性测定中时间一致等，这祥才能尽量减小各样品测定间误差。为保证活性测定准确性和精确度，瓦氏呼吸测压法实验每次检测同一样品必须设置三个平行样并设三个Actovegin注射液对照品平行样，且检测结果满足以下条件：①空白的耗氧量ΔO2≥20μl；②对照品的相对活性≥150％，否则无效。另外，虽然每次活性测定耗费较多的样品，但为了保证测定结果的正确性，对结果重复检定后才能确活性组分。

                                实施例2

本实施例涉及用高效液相凝胶色谱法(HPGC)测定作为进一步分离纯化的原材料的Actovegin注射液分子量，具体如下：

材料与仪器：高效液相色谱仪：Beckman 125NM泵，126NM检测器，工作站；Superdex Peptide HR 10/300柱：10mm×30cm，柱体积24ml，柱填料颗粒大小22～44um，分离范围100～7000道尔顿，耐压值1.5MPa，Pharmacia产品；流动相：0.05mol/L磷酸钠+0.1mol/L氯化钠的水溶液，PH7.0。

标样为：相对分子量13700道尔顿的二核糖核酸酶A，Pharmacia产品；相对分子量5180道尔顿的胰岛素，Fisherbrand产品；相对分子量1508道尔顿的生长抑素(14肽)；相对分子量560道尔顿的六肽，Biomol产品；样品为奥地利HafslundNycomed AG的批号为152842的Actovegin注射液。

方法：分别称取适量的核糖核酸酶A、胰岛素、14肽和六肽配制成分子量标准混合溶液：色谱条件：流速：1ml/min，柱温；室温，检测波长：214nm，进样量：20μl。

实验结果见图1-3，其中图1是核酸酶A、胰岛素、14肽、六肽分子量标准混合溶液的HPGC图谱，图2是分子量标准曲线，各标样的保留时间及对数分子量为：

                         Rt(min)             1gMW

核酸酶A                  13.93               4.1367

胰岛素                   14.93               3.7634

14肽                     16.87               3.1821

六肽                     18.6                2.7482

结果表明在此凝胶色谱条件下，分子量标准物质的分子量对数与保留时间基本呈线性关系(R＝0.9972)，结合Actovegin注射液的HPGC图谱，图3得到Actovegin注射液的分子量95％小于1500道尔顿。

                            实施例3

本实施例涉及Actovegin注射液的高效毛细管区带电泳(HPCZE)分析。

材料与仪器：毛细管电泳仪：Beckman P/ACE 5000，固定波长紫外检测器，工作站；熔凝石英毛细管柱：Beckman FS 75um×57cm(有效长度为50cm)；样品Actovegin注射液，批号同实施例1、2。

方法：配制电极缓冲液：取1.7ml85％磷酸，加入10ml乙腈，加水至250ml，1mol/lNaOH，调PH值至2.5，0.45um滤膜过滤，用前超声波处理。毛细管在使用前依次用1mol/lNaOH清洗5分钟，超纯水清洗5分钟，进样前用0.1mol/lNaOH清洗2分钟，超纯水清洗1分钟，电极缓冲液清洗2分钟。采用高压进样方式，进样时间为3秒，毛细管进样端为正极，检测端为负极，分离电压为20kv。检测波长为214nm，毛细管柱分离温度为25℃。

实验结果见图4，利用HPCZE进行复杂样品中的多元定性分析，目的是为分离纯化模式和条件的选择提供信息。

                           实施例4

本实施例涉及用中低压液相凝胶色谱(FPGC)分离Actovegin注射液。

材料与仪器：中低压液相色谱仪：AKTA Purifier 100，多波长紫外检测器，PH/电导检测器，自动进样器，工作站：HiLoad 16/60 Superdex柱：16mm×60cm，Pharmacia产品；样品Actovegin注射液同实施例1-3，真空冷冻干燥机。

方法：在系统稳定，柱饱和、平衡后进样，色谱条件为：流动相：10％乙腈+0.1％TFA的水溶液，流速为1.2ml/min，柱温为室温，检测波长为214nrn，用电导检测，自动加样器进样，进样量1.5ml，阀收集，按体积分段收集F3、F4、F5、F6、F7、F8各组分，各组分经低压抽去有机溶剂后，冷冻干燥后，各组分经适量稀释后，瓦氏呼吸仪测压法分别测定活性。图6为Superdex柱的结构。

结果分别见图5、图7，结果表明F3、F4、FS、F6、F7、F8组分的相对活性分别为9.1％、5.3％、97.5％、0.6％、-3.6％、-2.4％，F5组分的相对活性大大高于其它组分，说明F5组分是活性成分主要存在的组分。因此用F5组分进行下一步的分离。

                              实施例5

本实施例涉及F5组分的高效反相液相色谱(HPRPC)分离；

材料与仪器：高效液相色谱仪：Shimadzu LC-10ATvp泵，DGU-12A脱气机，CTO-10Asvp柱温箱，SPD-M10Avp检测器，FRC-10A收集器，SCL-10Avp控制器，工作站；Zorbax 300SB-C18柱：9.4mm×25cm，DuPont公司产品。流动相A液：0.1％TFA的水溶液，PH值2.5，0.45μm滤膜过滤，用前超声脱气；流动相B液：0.1％TFA+80％乙腈的水溶液，0.45μm滤膜过滤，用前超声脱气。F5组分：真空冷冻干燥后，用流动相A液稀释成50mg/ml左右，真空冷冻干燥机。

方法：色谱条件为：检测波长214nm，柱温37℃，进样体积500μl，梯度洗脱，按时间分段收集各组分，顺序编为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T，各组分经低压抽去有机溶剂后冷冻干燥，冷冻干燥后的各组分经适量稀释后，瓦氏呼吸仪测压法分别测定活性。洗脱梯度如下；

       时间(min)     流速(ml/min)       B％

       0.00          2.00               0

       10.00         2.00               10

       15.00         2.00               20

       53.00         2.00               100

       40.00         2.00               100

       50.00         2.00               0

结果分别见图8、图9、图10。结果表明A、B、C、D、E、F、G、H、I、J.K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T组分的相对活性分别为0.9％、10.2％、-7.2％、6.9％、0.2％、1.3％、9.4％、1.8％、75.3％、69％、-23.0％、2.5％、26.5％、-22.9％、0.3％、10.4％、4.7％、8.4％、4.5％、-9.3％。I组分相对活性大大高于其它组分，说明I组分是活性成分主要存在的组分，因此选用I组分进行进一步的分离提纯。

                         实施例6

本实施例涉及实施例5中得到的I组分的高效反相液相色谱(HPRPC)分离：

材料与仪器：采用实施例5的高效液相色谱仪，Vydac 300SB-C4柱：6mm×25cm，Vydac产品。流动相A液：0.1％TFA+20％乙腈的水溶液(PH值2.80)；流动相B液：0.1％TFA的乙腈溶液，流动相均用045μm滤膜过滤，用前超声脱气；样品：I组分真空冷冻干燥后，用流动相A液稀释成3.5mg/ml左右。

方法：色谱条件为；检测波长214nrn，柱温37℃，进样体积50μl，梯度洗脱，按时间分段收集各组分，顺序编为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6组分，各组分经低压抽去有机溶剂后，冷冻干燥，干燥后的各组分经适量稀释后，用瓦氏呼吸仪测压法分别测定活性。洗脱梯度：

                 时间(min)      流速(ml/min)    B％

                 0.00           1.00            0

                 5.00           1.00            0

                 15.00          1.00            55

                 25.00          1.00            65

                 30.00          1.00            65

                 35.00          1.00            100

                 40.00          1.00            100

结果分别见图11、图12、图13。表明Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6组分的相对活性分别为-14.5％、2.7％、64％、69.2％、22.1％、1.8％。Y4组分相对活性高于其它组分，说明Y4组分是活性成分主要存在的组分，因此选用Y4组分进行进一步分离提纯。

                           实施例7

本实施例涉及Y4组分的高效正相液相色谱(HPNPC)分离：

材料与仪器：高效液相色谱仪同前，Zorbax 300SB-CN柱：4.6mm×25cm，DoPont产品；流动相A液：10mM磷酸铵的水溶液(PH值7.0)；流动相B液：10mM磷酸按+60％乙腈的水溶液，流动相用0.45μm滤膜过滤，用前超声脱气。Y4组分真空冷冻干燥后，用流动相A液适量稀释。

方法：色谱条件为：检测波长、柱温和进样体积同实施例6，梯度洗脱，按时间分段收集，顺序编为Z1、Z2、Z3、Z4、ZS、Z6各组分，后处理及活性测定同实施例6。洗脱梯度；

            时间(min)    流速(ml/min)    B％

            0.00         0.8             0

            10.00        0.8             100

            15.00        0.8             100

            20.00        0.8             0

结果见图14、图15、图16。表明Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6组分的相对活性分别为6.7％、6.4％、85.4％、1.5％、-6.8％、-20.6％。Z3组分相对活性高于其它组分，说明Z3组分是活性成分主要存在的组分。用Z3组分进行进一步分离提纯。

                          实施例8

实施例7得到的Z3活性组分的高效正相液相色谱(HPNPC)分离提纯：

材料与仪器；高效液相色谱仪同前，Zorbax RX-SIL柱；46mm×15cm，DoPont产品；流动相A液：0.065％TFA+10％腈的水溶液(PH值2.9)，流动相B液：0.065％TFA+90％乙腈的水溶液，流动相用0.45μm滤膜过滤，用前超声脱气。Z3组分真空冷冻干燥后，用流动相A适量液稀释。

方法：色谱条件为：检测波长和柱温同实施例7，进样体积：20μl，梯度洗脱按时间分段收集，顺序编为W1、W2、W3、W4各组分，后处理及活性测试同实施例6、7，梯度洗脱：

               时间(min)    流速(ml/min)    B％

               0.00         0.8             0

               5.00         0.8             0

               10.00        0.8             10

               20.00        0.8             35

               30.00        0.8             100

               35.00        0.8             100

               45.00        0.8             0

结果分别见图17、图18、图19。表明W1、W2、W3、W4组分的相对活性分别为6.7％、6.4％、50.7％、-6.8％。W3组分相对活性高于其它组分，说明W3组分是活性成分主要存在的组分。选用W3组分进行进一步分离提纯。

                              实施例9

实施例8得到的W3活性组分的高效正相液相色谱(HPNPC)分离纯化：

材料与仪器：高效液相色谱仪同前，Zorbax RX-SIL柱：4.6mm×15cm，DoPont产品；流动相：正己烷/甲醇＝95/5，0.45μm滤膜过滤，用前超声脱气；W3组分真空冷冻干燥后，用流动相适量液稀释。

方法：色谱条件同实施例8，收集主峰前25％部分，主峰中间50％部分，主峰后25％部分及其它部分，分别编为P1，P2，P3组分，后处理及测活同上。

纯化色谱图见图20。活性测定结果表明P1组分的相对活性为20.9％，P2组分的相对活性为49.6％，P3组分的相对活性为14.7％，P2组分是活性成分主要存在部分。

从自原料小牛血去蛋白提取物开始，每一步分离的分离色谱图，即图5、8、11、14、17、20可以看出，随着分离的进行，得到的组份的纯度逐渐提高；图5显示多个重叠的峰，经分离后色谱图中的峰逐渐拉开，见图8、11，得到几个较为清楚的峰，峰的数量逐渐减少，至最后一步分离，得到的谱图20中，基本为一个主要的峰，只含有少量杂质；由于同时用瓦氏呼吸仪测压法跟踪测定分离纯化得到样品的活性，可以认为得到了小牛血去蛋白提取物中的一种活性肽。

                       实施例10

血活性成分，即的P2组分的鉴定：

1.高效毛细管区带电泳(HPCZE)鉴定纯度：

HPCZE方法和PH值2.5的电极缓冲液配制同前，另配制PH值8.0的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄电极缓冲液；取0.2mol/L Na₂HPO₄ 59.2ml，0.02mol/LNaH₂PO₄；3.3ml，混匀，调PH值至8.0，然后加水至250ml，用0.45μm滤膜过滤。P2组分稀释为150μg/ml，进样量为6秒，电泳电压20KV。实验结果见图21、图22。结果表明样品的纯度达到95％以上。

2.高效液相凝胶色谱法(HPGC)测定分子量

HPGC实验方法同前，结果见图23，测得P2组分分子量为803道顿。

3.柱前衍生法分析P2组分氨基酸组成

材料与仪器：高效液相色谱仪同前，Phenomonnex ODS(3)层析柱：4.6mm×25cm，17种标准氨基酸溶液；浓度约为100μg/ml P2组分。

试剂：0.1mol/L异硫氰酸苯酯(PITC)溶液：取PITCl2uL，加乙腈988μl，混匀；1mol/L三乙胺溶液：取三乙胺139μl，加入乙腈861μl，混匀；流动相A：称取30.3511g乙酸钠，加水3400mL溶解，乙酸调PH至6.5然后加水至3700mL，加乙腈300mL，加入丙酮10μl，用0.45um滤膜过滤，流动相B：乙腈/水＝4/1，用前超声脱气。

方法：取80μl P2组分放入样品小管内，将样品小管放入反应瓶，真空干燥后在反应瓶中加入含1％苯酚的6NHCL溶液200μl，将空气置换为氮气，将反应瓶放入恒温加热器，150℃加热1小时，取20μl标准氨基酸溶液放入样品小管内，标准液小管和样品小管分别加入100mmol/L异硫氰酸苯酯的己腈溶液10μl、三乙胺10uμl，放置1时，分别加入40μl正己烷，混匀。取下层液用0.45μm滤膜过滤，取1μl进样。

色谱条件为：检测波长254nrn，流速：1ml/min，柱温：40℃，进样体积：1μl。

         洗脱梯度：

            时间(min)     流速(ml/min)    B％

            0             1.00            0

            2             1.00            5

            3             1.00            7

            5             1.00            12

            11            1.00            15

            16            1.00            30

            16.01         1.00            100

            20            1.00            100

            20.01         1.00            0

            26            1.00            0

氨基酸标准图谱见图24，样品水解氨基酸色图谱略，实验结果样品为一小分子量肽，并确定了其氨基酸组成。

4.样品的紫外吸收光谱

将P2组分溶解于超纯水中，波度约为0.1mg/ml，以超纯水作空白对照，测量190～300nm的吸收光谱，光谱图见图25，由图25可以看出，紫外吸收光谱中190-220nm有强烈的吸收。

5.样品的质谱分析：

P2组分经液相二级质谱测定，确定了分子量和其它结构信息。质谱图见图26，碎片为589.2、545.2、403.1、346.1、244.2和187.2。

6.样品的Edman降解法测序：

P2组分采用Edman降解法经自动氨基酸测序仪测定其序列。序列图谱略。

总之，小牛血去蛋白提取物的主要适应症为老年痴呆和中风，大量的基础和临床研究表明，小牛血去蛋白提取对这些疾病的治疗是安全有效的，但小牛血去蛋白提取物的治疗机理尚需进一步的研究和探讨，本发明分离提纯小牛血去蛋白提取物的活性肽及其分离提纯方法，对于上述的研究和探讨是非常有意义的。

随着科学技术的发展，新生物活性多肽的发现速度日益增加。现在内分泌器官的概念扩大了，大量多肽结构的调节因子在医学上有潜在的重要性。从小牛血去蛋白提取物中分离纯化出的生物活性肽具有细胞调节因子可能性，有必要进行进一步的研究探讨。

Claims (10)

1、一种活性单肽，从小牛血去蛋白水解液注射液中提取，其特征在于高效毛细管区带电泳鉴定纯度大于95％，高效液相凝胶色谱法测定分子量为803道顿，紫外吸收光谱中190-220nm有强烈的吸收，液相二级质谱测定碎片为589.2、545.2、403.1、346.1、244.2和187.2amu，瓦氏呼吸仪测压法测得相对活性49.6％，能促进豚鼠肝细胞对氧的摄取和利用，是小牛血去蛋白水解液注射液中的有效成分。

2、权利要求1活性单肽的制备方法，其特征在于由小牛血去蛋白提取物经过中低压液相色谱、C18及C4反相色谱、CN及Silica正相色谱多步分离纯化，分离过程中每一步用瓦氏呼吸仪测压法跟踪测定分离样品的相对活性测定，取活性最大的成分进行进一步分离，得到活性血的活性单肽成分。

3、根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于中低压液相色谱分离过程中，采用中低压液相色谱仪，HiLoad 16/60 Superdex柱，流动相为10％乙腈+0.1％TFA的水溶液，流速为1.2mL/min，柱温为室温，检测波长为214nm。

4、根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于高效反相液相色谱分离过程中，采用高效液相色谱仪，Zorbax 300SB-C18柱，流动相A液：0.1％TFA的水溶液，pH值2.5，0.45um滤膜过滤，用前超声脱气；流动相B液：0.1％TFA+80％乙腈的水溶液，检测波长214nm，柱温37℃，进样体积500uL，梯度洗脱，按时间收集，

洗脱梯度：    时间min      流速ml/min         B％

              0.00         2.00               0

              10.00        2.00               10

              15.00        2.00               20

              53.00        2.00               100

              40.00        2.00               100

              50.00        2.00               0。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于高效反相液相色谱分离过程中采用高效液相色谱仪，Vydac 300SB-C4柱，流动相A液：0.1％TFA+20％乙腈的水溶液，PH值为2.80；流动相B液：0.1％TFA的乙腈溶液，检测波长214nm，柱温37℃，进样体积50μl，梯度洗脱，按时间分段收集

洗脱梯度：    时间min       流速ml/min       B％

              0.00          1.00             0

              5.00          1.00             0

              15.00         1.00             55

              25.00         1.00             65

              30.00         1.00             65

              35.00         1.00              100

              40.00         1.00              100。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于高效正相液相色谱HPNPC分离过程中采用高效液相色谱仪，Zorbax 300SB-CN柱流动相A液：10mM磷酸铵的水溶液，PH值为7.0；流动相B液：10mM磷酸按+60％乙腈的水溶液，梯度洗脱，按时间分段收集；

洗脱梯度：    时间min       流速ml/min        B％

              0.00          0.8               0

              10.00         0.8               100

              15.00         0.8               100

              20.00         0.8               0。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于高效正相液相色谱HPNPC分离提纯过程中采用高效液相色谱仪，Zorbax RX-SIL柱，流动相A液：0.065％TFA+10％乙腈的水溶液，PH值为2.9；流动相B液：0.065％TFA+90％乙腈的水溶液，梯度洗脱按时间分段收集

梯度洗脱：

              时间min       流速ml/min        B％

              0.00          0.8               0

              5.00          0.8               0

              10.00         0.8               10

              20.00         0.8               35

              30.00         0.8               100

              35.00         0.8               100

              45.00         0.8               0。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于高效正相液相色谱HPNPC分离纯化过程中采用高效液相色谱仪，Zorbax RX-SIL柱，流动相：正己烷/甲醇＝95/5。

9.根据权利要求1所述的活性单肽，其特征在于由小牛血去蛋白提取物经过中低压液相色谱、C18及C4反相色谱、CN及Silica正相色谱多步分离纯化，分离过程中每一步用瓦氏呼吸仪测压法跟踪测定分离样品的相对活性测定，取活性最大的成分进行进一步分离，得到活性多肽成分。

10.权利要求1所述活性单肽在制备治疗脑血管和外伤药物方面的用途。

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