CN1152887C - 脑蛋白水解活性物质、其制备方法、活性和序列 - Google Patents

Abstract

本发明公开了从脑蛋白初级水解液中分离和提纯活性物质的方法，并对所得的到活性物质进行了活性、纯度、分子量、氨基酸序列及末端分析，得到了高效凝胶排阻色谱、高效反相色谱法和高效毛细管电泳具有单一峰的一种高纯脑蛋白活性物质，进一步采用合成的方法，合成了上述脑蛋白活性物质，经分析证明，其组成、结构及氨基酸序列与分离得到的脑蛋白活性物质完全相同，本发明对于脑蛋白类新药的研究和开发，具有重要意义。

Description

脑蛋白水解活性物质、其制备方法、活性和序列

技术领域

本发明涉及一种脑蛋白水解活性物质，其制备方法以及其活性和序列，属于药物领域。

背景技术

长期以来脑疾病如早老性痴呆、脑卒中、脑缺血引起的并发症，一直困扰着人类。各国大批医学工作者积极投身于这项事业，做了大量的研究和工作，也取得了许多喜人的成就。许多药物相继问世。奥地利EBEWE药厂开发的脑活素便是其中之一。本定经过数年的开发和研究，研制出了脑活素类似产品一脑蛋白水解液。此项成果已经申请国家专利，专利号94104516，并投入了生产，产生了相当大的社会效益。

脑蛋白水解液是动物脑蛋白经人工控制的酶降解而产生的器官特异性氨基酸、肽复合物，由于其85％为氨基酸，且其氨基酸彼此间比例与正常脑中者相似，故仍保持其器官特异的“氨基酸”性。这些氨基酸包括：丙氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸、缬氨酸。其中15％由分子量小于1000d，不具有抗原性的小分子肽组成。

关于此药已有许多文章报道，其中最重要的作用是：它对中毒、缺氧、迷走神经刺激有保护作用。当低血糖昏迷时，它有唤醒作用，对脑细胞的成熟有促进作用。对于脑蛋白水解液作用机理，目前已有大量的研究。根皮甙中毒实验表明：静脉注射脑活素对动物中毒有保护作用。中毒后脑活素治疗组的临床恢复及脑电图正常化较快。窒息和缺氧实验中，脑活素能使之恢复较好。脑活素处理的年幼动物，脑毛细血管网生长较好。脑活素对核糖体有特异作用，刺激脑内蛋白质的合成，刺激间脑一垂体系统释放生长激素、甲状腺激素而加速动物的生长和发育。奥地利进行了有关临床前的研究，用极谱技术测量脑匀浆的耗氧量。当加脑活素时，其氧代谢明显受抑制。脑活素能够降低脑对氧的需要量，从而导致脑对缺氧的耐受性增加。另一方面它也增强需氧代谢，使细胞能完成能量依赖性工作，如：蛋白质、神经递质的合成，铁消耗功能。实验也显示：用脑活素处理动物后，动物学习成绩较好，且能保持好几天。本室所作的研究也证明了这点。

脑蛋白水解液中，大部分的氨基酸对脑损伤的恢复起着不可忽视的营养作用。另外，其中的肽类具有明显的生理活性。它们作用于呼吸链的某些环节，对脑细胞的氧代谢起着重要的调节作用；同时，它们也影响脑部细胞的蛋白质、多肽的合成，改善脑部的生理功能。许多脑肽的分子量不大，而且某些片段具有原来肽的全部或大部分生物活性；或某些新的强烈的中枢作用。对脑蛋白水解液中这些片段进行分离，研究其生物活性，具有一定理论和实用价值。

在国内外关于脑蛋白水解液的研究，大都集中在其生理活性和药理作用方面，未见分离纯化方面的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脑蛋白水解活性物质，该活性组份具有非常高的纯度。

本发明的次一个目的在于，采用现代仪器，对脑蛋白水解液初级产品中的活性成分进行分离，提供一种通过分离和纯化的方法制备组成单一、纯度极高的脑蛋白活性物质的方法。

本发明的另一个目的在于通过一系列测定，确定脑蛋白活性物质的纯度和序列。

本发明的再一个目的是采用合成的方法，合成上述脑蛋白活性物质，并进一步测定其纯度、序列和理化常数。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一.脑蛋白水解液的分离和纯化：

在蛋白质与多肽的分离化工作中，常采用的方法有多种，如液相柱层析、电泳法、沉淀法、离心法、薄层法等。其中液相柱层析法由于其分离条件温和、分辨率高、操作简单，而得到了广泛的应用。液相柱层析色谱法一般分为两类：经典液相色谱法和高效液相色谱法。在蛋白质和多肽的初级分离中，经典的离子交换法和凝胶过滤法常作为首选的方法。高效液相色谱法由于其极高的理论塔板数而应用于样品的精细分离，常作为后期纯化的有力工具。本发明主要采用液相层析法对脑蛋白水解液的活性组分进行分离纯化。分离采用的方法及过程见图1。

首先，测定丽宝公司提供的5组初级脑蛋白产品的活性，从中优选出活性最强的，进行下一步分离。

蛋白活性测定原理：

在细胞呼吸时，消耗O₂，同时放出CO₂。测量呼吸的方法有多种，如化学方法、容积方法、检压法、Carsesian浮沉子法及氧电极法。本发明采用检压法测量样品的活性。瓦氏呼吸仪可以测定组织或微生物进行代谢时所发生的气体变化。例如O₂的吸收和CO₂的排出。

瓦氏呼吸仪测压法是在定温和定容的条件下，用压力的变化来表示组织或细胞代谢时所发生的气体变化。由于在呼吸过程中吸收CO₂和产生氧气是同时进行的，所以压力计所观察到的压力变化是氧的吸收量和CO₂产生量的总结果。若在反应瓶中加入碱(如KOH)，则呼吸时所产生的CO₂被碱所吸收，由此可由压力的变化测定氧的吸收。本发明实验中以耗氧的多少决定供试品生物活性的高低。由测活结果可以看出，第三组样品的活性最强，因此以下实例中主要进行样品III的分离、纯化及进一步分析。

一)经典液相色谱法

尽管高效液相色谱法得到了迅速、广泛的应用，但主要应用于后期纯化。因为经典液相色谱法具有上样量大、流动相价格相当较低、对仪器、技术的要求相对不高等诸多优点因此本发明首先采用经典液相层析法，对样品进行粗分离；经典液相层析法中还包括离子交换法和分子筛凝胶法。

1、离子交换法分离：离子交换色谱是目前在蛋白质提纯中得到最广泛应用的方法之一。它利用蛋白质的带电部分与具有相反电荷的离子交换剂吸附强弱不同，采用不同的洗脱强度的流动相，分别将它们洗脱下来。离子交换介质如离子交换纤维素树酯有开放性的支持骨架，大分子能自由的进入和迅速扩散，因而对样品的吸附容量较大。离子交换纤维素上的交换基团排列松散，对蛋白、多肽的吸附不太牢固，用温和的条件使可将其洗脱下来，不至引起分子的变性。离子交换剂分离样品时，主要依靠增加缓冲溶液的离子强度或改变酸碱度来进行洗脱。由于不同蛋白质的电荷密度分布不同，电荷量不等，等电点的差异以及分子大小的区别，因而与离于交换剂的结合强度不同，利用一定的置换条件，可将它们逐一分开。本发明利用二乙胺基纤维素，即DEAE纤维素32对样品进行初步分离。由初步分离的样品的活性测定结果可以看出，DEAE离子交换法分离出的1#峰，即第一组样品DEAE1具有原样品的大部分活性，应该进一步分离该样品。

2.凝胶过滤法分离：分子筛指的是一些亲水性多孔介质。当含有不同大小的分子的混合物流经这一介质时，直径大于孔径的分子将不能进入麻胶内部，便直接从凝胶粒间隙流出，这称为全排出。较小分子物质能进入介质内部孔隙，绕道而行，在柱内的保留时间就比较长。这样，较大分子被先洗脱下来，而较小分子后被洗脱下来，从而达到分离的目的。这种作用被称为“分子筛”效应。具有这种效应的物质很多，其中效果较好的有葡聚糖凝胶，商品名称Sephadex、聚丙烯酰胺凝胶，又称生物胶-P及琼脂糖凝胶Agrose等。

葡聚糖凝胶是最常用的一种凝胶，由细菌葡聚糖，又称右旋糖酐，在糖的长链间用交联剂1-氯-2，3-环氧丙烷〔CH₂-CH-CH₂Cl表氯醇〕交联而成；其基本结构如图6所示；凝胶层析的简单原理见图7；图3a中首先将含有大小分子的样品液上柱；样品溶液流经层析柱，小分子通过扩散作用进入凝胶颗拉的微孔中，而大分子则被排阻于颗粒之外，因此，大小分子向下移动的速度发生差异，而将大小分子分离开来；向层析柱顶加入洗脱液，大小分子分开的距离增大，大分子物质行程较短，已流出层析柱，小分子物质尚在行进之中，由此达到分离的目的。本发明中，采用凝胶过滤法分离离子交换法分离得到的样品DEAE1，由测定及计算结果可以看出，2号峰的样品DEX2具有原样品大部分的活性，应该进一步分离该样品。

二)高压液相色谱法分离：

经过经典液相色谱法分离的样品，成分比初提液相对简单，组分性质已经很接近，应采用HPLC进一步分离。与经典液相色谱法相比，高效液相色谱法具有分离效率高：现已能达到每米10万理论塔板数、高速、高压、分析时间短：通常为几分钟至几十分钟间、检测灵敏度高：如紫外检测器，灵敏度为10^-9g/ml的特点。

1.高效离子交换液相色谱法分离(HPIEC)

原理：高效离子交换液相色谱的分离原理与经典离子交换色谱法原理基本相同。不同的是HPIEC填料能够耐高压，具有更高的分辨率。以亲水性高聚物凝胶为基质的IEC填料如TSKGELDEAE-5Pw、SP-5PW、CM-5PW等，是目前应用最广泛的产品。本发明可以采用上述各种填料，优选采用ProGel-TSK DEAE-5PW柱。采用高效离子交换液相色谱法分离采用凝胶过滤法分离得到的样品SEPHADEX II(即DEX II)，由测定及计算结果可以看出：TSK3号峰的样品具有原样品大部分的活性，应该进一步分离该样品。

2、高效凝胶液相色谱法分离(HPGC)

高效凝胶液相色谱法的分离原理与经典凝胶色谱法原理基本相似，即在一定离子强度的流动相下，样品通过凝胶柱时，洗脱顺序是分子量从大到小的预序。但由于HPGC填料中硅胶及键合相的电荷、极性的影响，其分离又具有独特性，具有更高的分辨率。本发明中采用岛津高压液相系统，分离样品TSK3，由测定及计算结果可以看出：PAK2号峰的样品具有原样品大部分的活性，应该进一步分离该样品。

3、高效反相色谱法分离(HPRPC)原理：高效反相色谱法又称非极性键合相色谱。键合相表面都是极性很小的烃基，如十八烷基、辛烷基、甲基、苯基等。最常用的是十八烷基硅烷键合硅胶，又称ODS。而洗脱液大都采用强极性溶液如水、醇、乙腈或无机盐的缓冲液。在这种键合相色谱中，极性大的化合物先洗脱(K′小)，极性小的化合物不易洗脱(K′大)。反相色谱在蛋白质、多肽的分离中已得到了广泛的应用，其主要原因是这个操作系统的简单性和灵活性。本发明中采用岛津高压液相系统，分离样品Pak2，由测定及计算结果可以看出：ZBX4号峰的样品具有原样品大部分的活性。

小结：五组样品经过测活，选出丽宝III号样品为活性最强者。经过DEAE纤维素离子交换、SePhadex凝胶过滤及高效液相色谱法的分离，分离出了活性产物ZBX4，达到了预期的目的。进一步对其进行进一步的分析，测定其氨基酸序列。

二.纯度及序列分析

一)纯度测定：

蛋白质、多肽分离纯化的目的，就是得到成分单一的样品。事实上，还没有一种完全纯度测定的方法，只有检测样品不纯或不均一的方法。纯度最终取决于所用的方法的类型和分辨力。用低分辨率的方法证明是纯的样品，改用高分辨率的方法时，就可能证明它不是纯的，而且每一种方法只能描述样品在某一方面的性质。例如，用高分辨率的SDS电泳法进行测定，得到一条带，这只能说明样品在分子量方面是均一的。因此，最好的纯度标准是：建立多种分析方法，从不同的角度：分子量、疏水性、带电性等方面测定样品的均一性。本发明利用液相色谱法多柱系统和毛细管电泳法测定纯度。

1、高效凝胶排阻色谱法(HPGC)

凝胶色谱法是基于分子尺寸进行分离的方法，本发明用凝胶过滤法检测样品在分子量方面的均一性。得到的凝胶过滤结果图和凝胶过滤三维色谱图都只给出一个单峰，说明得到纯度单一的样品。

2、高效反相色谱法(HPRPC)

高效反相色谱法是基于溶质、极性流动相和非极性固定相表面间的疏水效应而建立的一种色谱模式。本发明利用其检测样品极性的均一性。检测结果表明纯度良好。

3、高效毛细管电泳法(HPCE)

二)高效凝胶色谱法测定分子量

原理：高效凝胶液相色谱法的分离原理与经典凝胶色谱法原理基本相似，即在一定离子强度的流动相下，样品通过凝胶柱时，洗脱预序是分子量从大到小的顺序。洗脱时峰的位置和该物质的分子量有直接的定量关系。一根凝胶柱中，颗粒间自由空间所含溶液的体积称为外水体积V₀。不能进入凝胶的那些大分子，当洗脱体积为V。时，出现洗脱峰。凝胶颗粒内部孔隙的总体积称为内水体积Vi，能全部透入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为V₀+Ve时，出现洗脱峰。

将分子筛分配系数定义为：K＝Ve/Vi。若样品分子为球形，Stock半径为a，并且今凝胶的孔径是均一的圆锥体，底面的半径为r根据理论上的分析，在一定范围内，K与Loga/r呈直线关系。K＝-bLoga/r-c(b，c为常数)。由于分子量和Stock半径有正比关系，上式也可表示为：

                      K＝-b′logM+c′

由此可作出标准曲线，测定样品的分子量。

据文献报道，采用合适的柱条件和流动相，可测定的蛋白、多肽分子量的范围可以延伸到1000Dol。本发明中通过标样测定，得到标准方程为：

LogM＝-0.20087097X+5.34795

Dispersion：0.1297979

结合样品的高效凝胶色谱图，得到样品分子量计算结果：

MN＝10^{(-0.20087097×9.502+5.34795885)}＝2749.68

三)紫外光谱测定：

当一定波长范围的光连续照射分子或原子时，有一个或几个波长的光被吸收，这种光谱称为吸收光谱，所吸收的光处于紫外区则称为紫外光谱。

物质对紫外光的吸收，决定于其分子结构、分子中电子的分布和结合。从化学键来看，与吸收光谱有关电子的主要有三种：形成单键的σ电子，形成复键的π电子，和未共享的n电子。

多肽与蛋白质中含有肽键，是一种共轭体系，在210nm附近有强烈吸收。苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸由于含有苯环，在280nm附近有吸收峰。本实验利用水作为溶剂，测定样品的紫外吸收光谱。

四)N末端均一性测定：

原理：聚酰胺是一类化学纤维原料，又称尼龙。它对许多极性化合物有吸附作用，具有特异的分辨性能，可用于柱层析、薄层层析及薄膜层析。聚酰胺薄膜是将聚酰胺涂布于涤纶片上，形成质地均匀的紧密的多孔薄膜，层析性能十分优良。

由于聚酰胺的-C＝O基及-NH₂基可与被分离物质形成氢键，因而可以吸附酸类、酚类、醌类、硝基及氨基化合物等。由于各种物质与聚酰胺形成氢键的能力不同，即聚酰胺对各种物质的吸附能力不同，而且在层析过程中，展层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键，因此，选择适当的展层溶剂，可使各种待分离物质在聚酰胺表面与溶剂之间有不同的分配系数，经过吸附与解吸附的展层过程，各自按一定秩序分离开来。

荧光试剂Dansyl-Cl(二甲基氨基萘磺酰氯)可与氨基酸结合成带有荧光的Dansyl-氨基酸，反应原理见图24。

反应产物DNS一氨基酸在紫外线下具有强烈的绿色荧光，检测灵敏度可达10^-9--10^-10摩尔，比二硝基氟苯法高100倍，只需1纳摩尔样品便可进行分析。除DNS一脯氨酸经6MHCl于110℃水解过夜有70％被破坏、色氨酸及其DNS衍生物完全破坏外，DNS氨基酸是比较较稳的。

五)序列测定

酞的氨基酸顺序测定主要使用Edman化学降解法，此外还有酶解法、酶解一肽谱重叠法以及气谱一质谱联用法等。Edma n化学降解法是常用的测序方法。

原理：Edman化学降解法(Edman Degradation)是P.Edman于1950年首先提出来的。最初用于N末端分析，即苯异硫氰酸脂(PITC)法。Edman降解试剂(PITC)与多肽链的游离末端氨基作用，降解反应可分为三步。

第一步是偶联反应：

反应在弱碱性介质中进行，PITC只能与未质子化的氨基起作用。

第二步是环化断裂反应：

第一步反应中形成的PTC-肽在无水强酸介质如三氟乙酸中，是靠近PTC基的肽键将发生断裂，PTC-氨基酸残基环化成噻唑啉酮苯胺(aniline thiazolinine)衍生物。反应需在无水条件下进行，否则其它肽键将水解。

第三步是转化反应：

第二步反应中生成的ATZ不稳定，难于用来鉴定该氨基酸，因此在酸性水溶液中将它转变为PTH-氨基酸。转化反应实际又分为二步进行，首先水解生成PTC-氨基酸，然后环化成PTH-氨基酸。这是一个非常稳定的化合物。PTH-氨基酸在紫外区有强吸收，最大吸收值在268nm处。PTH-氨基酸可利用各种层析技术分离。由于PITC与肽链的游离α末端氨基结合后，只是减弱紧挨PTC基的末端残基羧基侧的肽键，因此在无水条件酸作用下，只切下与PITC反应的那个氨基酸残基。这时剩下的减少了一个残基的肽键便在它的N末端暴露出一个新的游离N末端，又可参加第二轮反应。然后再切下第二个残基，以此循环。这样如果n轮反应，就能测出n个残基的顺序。

利用Edman降解，一次能连续测出60-70个残基的肽段的顺序，也有报道一次测出90-100个残基I预序的。

经临床证明，脑蛋白水解波对脑缺血、脑损伤有明显的治疗效果。丽宝公司提供的5组样品，是经凝胶过滤初步分离得亚洲粗品。其保留时间依次增加。根据测活结果来看，其中第三组、第五组样品有活性。第一组、第二组、第四组样品没有活性。这说明这两组样品中所含的活性物质是不同的，即脑蛋白水解液中含有多组活性物质。这在以后的实验中得到了证实。用离子交换法分离到的4组组分中，有两组具有活性。用超细凝胶过滤分离时，亦有两组组分表现出活性。这都说明，在此药中含有多种活性成分。这些组分之间活性的强弱以及相互之间是否存在协同作用，仍需进一步探讨。至于其它组中有些活性为负，可能是因为样品本身具有抑制呼吸的作用。

在实验中发现，各活性组分作用与时间之间存在关系。第三组样在1.5小时之后，瓦氏呼吸仪测定发现活性有明显增加。而第五组样则没有明显的变化。其它3组与对照组没有明显差异。这说明第五组样品以一种直接的作用方式影响细胞的活性，而第三组样同时也存在一种深层次、间接的作用方式。它可能促进细胞表达某种产物。该产物可以促进细胞的抗缺氧反应，且具有更强的活性。如果这种推论正确的话，该物质应该是激素类或其它基因表达调控因子，而且其作用机理相当复杂，涉及多种生命过程。样品可以促进细胞对氧的利用，以保证对于细胞至关重要的生命过程得以顺利进行；同时它也抑制细胞中对细胞的生存具有次要作用的生命过程的氧消耗，以节省养分，保证胞能够在应急状态下得以生存。因此，该物质存在两种作用，一是正调控，激活或促进细胞合成应急状态下细胞生存所必须的蛋白质，从表现上看即细胞的氧耗增加。二是负调控作用，样品直接或通过激活细胞内的活性物质或促进细胞合成活性物质，抑制细胞非必须生命过程对氧的消耗。这是基因表达调控中一种普遍的机理。即通过一种或几种因子，在不同的分子层次，调控细胞的行为，以适应环境。

在葡聚糖凝胶过滤中，由于Sephadex具有一定的吸附作用，所以加入适当离子强度的盐是必要的，而且流动相的pH值对分离效果也有影响，在实验中，我们采用0.05M的磷酸盐缓冲液，即可以维持流动相PH值的稳定性，又使流动相的离子强度得到增加，避免凝胶基质对样品的吸附，以免影响样品的分离效果。

在反相色谱中，在流动相为水时，样品保留时间较短，各样品不能完全分开。所以我们加入了KH2PO4增加流动相的离子强度，使流动相的表面张力增加，产生疏溶剂化效应，从而增加样品的保留，但是峰扩展明显。因为有机溶剂可以改善峰形和保留时间，因此有加入了5％的甲醇。峰形良好。

多肽分子量的测定，对于大分子蛋白质来说，只要保持一定的离子强度，分离效果就比较理想，保留时间具有线性关系。但对于多肽小分子，还需要加入SDS或盐酸胍。加入盐酸胍时，溶剂的粘度比较大，流速不能太高。在实验中，不加SDS时，多肽标准出峰时间不存在线性关系。无法进行分子量的计算。  根据文献报道，我们加入了0.2％的SDS，分离效果良好。

三.脑蛋白活性物质的人工合成

采用合成方法合成上述经过分离得到的脑蛋白活性物质，测定其理化常数和序列结构，证明与上述脑蛋白活性物质相同。

本发明公开了脑蛋白水解液中分离和提纯活性物质的方法，并对所得的到活性物质进行了活性、纯度、分子量、氨基酸序列及末端分析，得到了一种单一、高纯的脑蛋白活性物质，进一步采用合成的方法，合成了上述脑蛋白活性物质，经分析证明，其组成、结构及氨基酸序列与分离得到的脑蛋白活性物质完全相同，对于脑蛋白类新药的研究和开发，具有重要意义。

附图说明

下面结合附图和具体实施例详细描述本发明。

附图说明如下：

图1.为本发明的蛋白的分离和纯化的流程

图2.为为丽宝公司5组样品的活性图

图3.为梯度洗脱装置图

图4.为DEAE离子交换法分离丽宝公司第三组样品洗脱液的分离色谱图

图5.为DEAE离子交换法分离丽宝公司第三组样品得到的四组样品的活性图

图6.葡聚糖凝胶的基本结构图

图7.凝胶层析的简单原理

图8.凝胶过滤分离样品DEAEI洗脱液的分离色谱图

图9.凝胶过滤分离样品DEAEI得到的四组样品的活性图

图10.高效离子交换液相色谱法分离SEPHADEX II洗脱液的分离色谱图

图11.高效离子交换液相色谱法分离SEPHADEX II洗脱峰的活性图

图12.高效凝胶液相色谱法分离样品TSK3流出液的分离色谱图

图13.高效凝胶液相色谱法分离样品TSK3流出样品的活性图

图14.高效反相色谱法分离样品Pak2流出液的分离色谱图

图15.高效反相色谱法分离样品Pak2流出样品的活性图

图16.样品ZBX4的凝胶过滤结果图

图17.样品ZBX4的凝胶过滤三维色谱图

图18.高效反相色谱图

图19.高效毛细管电泳法测定纯度的谱图

图20.标准多肽样品的高效凝胶色谱图

图21.多肽分子量标准曲线

图22.本发明样品的高效凝胶色谱图

图23.本发明样品的紫外光谱

图24.标准氨基酸的N-末端测定结果图

图25.样品的N-末端测定结果图

具体实施方式

              实施例一.丽宝公司初级脑蛋白产品5组样品活性测定

实验中采用瓦氏呼吸仪：Warburg系统12062型，由Braun-Melsungen生产；已标化无侧臂反应瓶；YQ-3型高速匀浆机；清洁级雄性豚鼠250±10；试剂采用10％氢氧化钾溶液，0.2M磷酸缓冲液：pH7.4。

样品：取丽宝公司提供样品I、II、III、IV、V，各称取50mg，溶于0.5ml蒸馏水，振荡混匀。迅速处死豚鼠，取肝，称量肝组织4g，加入24ml磷酸缓冲液，6000rpm匀浆30秒，过滤。称量胆酸钠5g，氯化钠23g分别溶解后合并。加入伊文思蓝100mg，加水定容至500ml，再加几滴香草酚酒精溶液防腐得Brodie液。

测定步骤：开电源，调搅拌速度，保持水浴温度为37±0.1℃。准备空白、对照品和供试品的反应瓶；按表1顺序加入溶液。打开压力计毛细管活塞，将锥形瓶连接到相应的压力计上；将锥形瓶完全浸入水浴，打开振荡马达，调频率为100转/分；反应瓶进行温度和压力补尝；20分钟后，利用旋钮调节每个压力计右侧管为150刻度处，记录A1。-密闭整个系统，反应15分钟，记录左侧管读数为E1；打开压力计活塞，重调压力计右侧管为150刻度处，记录A2；关上压力计活塞，重新启动装置，过去时5分钟，记录E2。-打开压力计活塞，重调压力计右侧管为150刻度处，记录A3；关上压力计活塞，重新启动装置，过去时5分钟，记录E3。

表1

                        空白         样品

缓冲液(ml)              1.3          1.1

供试品(ml)                           0.2

10％氢氧化钾(ml)        0.2          0.2

肝脏匀浆物(ml)          1.0          1.0

结果计算：

1、原理：通过压力计左侧毛细管读出液面水平，由液面高度差算出以mm表示的压力差，进而得出以μl表示的正常条件下的O₂消耗量，乘以锥形瓶常数所得的数值即为ΔO₂。

2、公式

ΔO₂＝(D1+D2+D3)×K

A1＝初始值(mm)

E2＝中间阶段值(mm)

D1＝A1-E1(mm)

A2＝中间阶段重新调整后的初始值(mm)

E2＝中间阶段值(mm)

D2＝A2-E2(mm)

余依此类推

K：锥形瓶常数

3、活力计算： $\frac{\mathrm{Rs}-B}{B}\×100\%$

其中Rs＝样品ΔO₂；B＝空白ΔO₂

通过上述计算，得出活力结果，选出活力最高者进行下一步液相分离。

结论：表2列出了丽宝公司5组样品的活性测定；表3.列出了活性计算结果。

表2

	空白    样品I    样品II   样品III  样品IV    样品V
		K	0.83    0.86     0.93     0.8      0.8       0.99
A1E1D1A2E2D2A3E3D3D1+D2+D3K×∑D	150       150    150      150      150       150102       102    106      52       98        8948        48     44       98       52        61150       150    150      150      150       150101       99     107      49       97        9049        51     43       101      53        60150       150    150      150      150       15099        99     108      50       97        8851        51     42       100      53        62148       150    134      351      158       183122.84    129    124.62   280.8    126.48    181.17

表3

样品I	样品II	样品III	样品IV	样品V
					5.49％	1.45％	128.59％	2.96％	47.48％

图2为丽宝公司5组样品的活性图。

                实施例二.经典液相色谱法分离脑蛋白水解液

实验材料：称取丽宝公司提供的脑蛋白水解液冻干品样品III500mg，溶于10ml蒸馏水；玻璃柱尺寸：14mm(ID)×95mm。试剂A液：pH9.0磷酸氢二钠溶液；B液：取A液500ml，加NaCl14.6g.

实验方法：取30g凝胶，悬浮于500ml水中，过夜；倾去上清悬液，如此反复3次，超声20分钟得到实验凝胶。向玻璃柱内缓缓加入凝胶悬液；柱下端流速控制为1ml/min。当凝胶层到达距上端3cm时，用一稠布盖住凝胶床的表面；连接蠕动泵、检测器及积分仪；以1ml/min纯水洗涤凝胶柱2小时；更换流动相为0.5M的NaOH；洗涤2小时，用水洗涤至中性后，再用0.5M的HCl洗涤平衡凝胶柱1小时；水洗过夜；用磷酸盐缓冲液平衡柱3小时；上样0.5ml，以1ml/min的流速梯度洗脱；检测波长280nm；梯度洗脱；图3为梯度洗脱装置，该装置由两个容器组成，一个是贮液瓶，一个是混合瓶。两个瓶通过上端连接管利用虹吸原理相通；混合瓶出口处同蠕动泵2相连，混合瓶内有电磁搅拌装置1，贮液瓶内装有B液，混合瓶内装有A液，两瓶内液体体积相等，液面相平。

按洗脱图，依次收集各组分峰；然后把各样品通过Seghadex G10柱脱盐、冻干、称量150mg，溶于1ml水，样品的分离色谱图见图4；采用前面的方法测定活性，样品四个峰测活结果见表4-5，DEAE离子交换法分离出的四组样品的活性图见图5。通过上述测定可见DEAE离子交换法分离出的1#峰，即第一组样品DEAEI具有原样品的大部分活性。

表4 DEAE离子交换法分离出的四组样品测活结果

	空白     空白     DEAE1     DEAE2    DEAE3  DEAE4
		k	0.83     0.86     0.93      0.8      0.8    0.99
A1E1D1A2E2D2A3E3D3D1+D2+D31×∑D	150      150      150       150      150    150115      116      82        116      108    11035       34       68        34       42     40150      150      150       150      150    150112      111      75        115      112    10838       39       75        35       38     42150      150      150       150      150    150120      119      79        118      110    11230       31       71        32       40     38103      104      214       101      120    12085.49    89.44    199.02    80.8     96     118.8

表5 DEAE离子交换法分离出的四组样品的活性计算结果

DEAE1	DEAE2	DEAE3	DEAE4
				127％	-7.6％	9.8％	36％

                    实施例三.分子筛凝胶法分离DEAEI

实验中采用离子交换洗脱样品DEAEI，玻璃柱尺寸：20mm(ID)×90cm；0.05mol/L，pH7.4磷酸盐缓冲液，0.05％NaN₃水溶液；0.2％蓝葡聚糖水溶液；称取本品3g，溶于是15ml水中作为蛋白水解液的流动相。

取SephadexG25凝胶50g，将凝胶悬浮于2000ml水，过夜；倾去上清悬液，如此反复3次。超声20分钟，装入玻璃柱内，柱下端流速控制为1m1/min；当凝胶层到达距主端3cm时，用一稠布盖住凝胶床的表面；连接蠕动泵、检测器及积分仪；以1ml/min纯水洗涤凝胶12小时，更换为0.05M磷酸盐缓冲液，平衡凝胶柱2小时，层析床应均匀，无纹路、气泡，加入蓝葡聚糖，色谱带应该应均匀、平整；向色谱柱上样0.5ml，以1ml/min的流速洗脱；检测波长280nm，分别收集洗脱液按顺序依次为DEX1、DEX2、DEX3、DEX4，样品分离色谱图见图8，重复上样，各取2ml用同前方法测活，结果见表6-6a及图9。由测定及计算结果可以看出，DEX2号峰的样品具有原样品大部分的活性。

表6凝胶过滤分离样品DEAEI得到的四组样品的测活结果

	空白    空白     DEX1      DEX2   DEX3   DEX4
		k	0.83    0.86     0.93      0.8    0.8    0.99
A1E1D1A2E2D2A3E3D3D1+D2+D3k∑D	150     150      150       150    150    150120     119      114       87     117    12330      31       36        63     33     27150     150      150       150    150    150118     118      115       90     116    12432      32       35        60     34     26150     150      150       150    150    150119     119      115.5     88     117    12231      31       34.5      62     33     2893      92       105.5     183    200    8177.19   79.12    98.115    148    80     80.19

表6a凝胶过滤分离样品DEAEI得到的四组样品的活性计算结果

DEX1	DEX2	DEX3	DEX4
				29.3％	89％	2.3％	2.6％

                   实施例四.高效离子交换液相色谱法分离

Sephadex凝胶过滤洗脱样品SEPHADEX II(即DEX II)；A液：0.1MTris-HCl缓冲液；B液：取A液500ml，加入氯化钠14.6g，两液均用0.45μm膜过滤。

仪器采用岛津高压液相系统，包括LC-10AT泵，SPD-MXA检测器，CTO-10A柱箱，FRC10A收集器，Progel TSK DEAE-5PW柱[4.6mm(ID)×25cm 5μm]

梯度程序：            A          B：

            0min      100％      0

            30min     0          100％

流速1ml/min，线性梯度。

分离时，以A液平衡柱30min，进样10μl，收集洗脱液，重复进样，色谱图见图10，分布收集洗脱液，按顺序依次为TSK1、TSK2、TSK3、TSK4、TSK5、TSK6、TSK7、TSK8、TSK9、TSK10，洗脱液用Sephdex G10柱脱盐，冻干；再各取10mg冻干品，溶于0.5ml水，方法同前测活，结果见表7-8和图11，由上述表和图可以看出：TSK3号峰的样品具有原样品大部分的活性。

表7高效离子交换液相色谱法分离SEPHADEX II所得样品的测活结果

	空白   TSK1     TSK2     TSK8     TSK4    T5K5      TSK6    TSK7    TSK8      TSK9     TSK10
		k	0.8    0.86     0.93     0.8      0.8     0.99      0.86    0.83    0.86      0.93     0.8
A1E1D1A2E2D2A3E3D3D1+D2+D3k∑D	150    150      150      150      150     150       150     150     150       150      150112    110      115      70       108     113       113     110     111       116      11438     40       35       80       42      37        37      40      39        34       36150    150      150      150      150     150       150     150     150       150      150113    109      116      71       109     115       112     111     111       117      12137     41       34       79       41      35        38      39      39        33       29150    150      150      150      150     150       110     150     150       150      150112    112      114      75       111     114       110     109     110       113      11038     38       36       75       39      36        40      41      40        37       40113    119      105      234      121     108       115     120     118       104      11590.4   102.34   97.65    187.2    96.8    106.92    98.9    99.6    101.48    96.72    92

表8高效离子交换液相色谱法分离SEPHADEX II所得样品的活性计算结果

TSK2	TSK1	TSK3	TSK4	TSK5	TSK6	TSK7	TSK8	TSK9	TSK10
										7.3％	13.2％	122.61％	7.08％	18.3％	0.55％	10.1％	4.42％	6.99％	1.77％

                     实施例五.高效凝胶液相色谱法分离(HPGC)

采用岛津高压液相系统，包括LC-10AT泵，SPD-MXA检测器，CTO-10A柱箱，FRC10A收集器，Protein-pak 60柱[7.8mm(ID)×300mm)；流动相为pH6.5、浓度0.05M、过0.45μm膜的磷酸盐缓冲液；样品为称取TSK3 60mg，溶于3ml水。

分离时用流动相平衡柱40min，进样50μl，反复进样，分步收集洗脱峰，依次为PAK1、PAK2、PAK3，分离色谱图见图12，各取2ml方法同前测活，结果见表9-10及图13；由上述表和图可以看出：PAK2号峰的样品具有原样品大部分的活性。

表9高效凝胶液相色谱法分离样品TSK3流出样品测活结果

	空白    PAK1      PAK2      PAK3
		kA1E1D1A2E2D2A3E3D3D1+D2+D3K∑D	0.8     0.83      0.86      0.93150     150       150       150109     110       75        11341      40        75        37150     150       150       150110     108       77        11440      42        73        36150     150       150       150108     111       75        11242      39        74        38123     121       222       11198.4    100.43    190.92    103.23

表10高效凝胶液相色谱法分离样品TSK3流出样品活性计算结果

PAK1	PAK2	PAK3
			2.06％	93.08％	4.9％

                  实施例六.高效反相色谱法分离(HPRPC)

本发明中采用岛津高压液相系统，包括LC-10AT泵，SPD-MXA检测器，CTO-10A柱箱，FRC1 0A收集器，样品：Pak2，柱：Zorbax 300SB-C18[4.6mm(ID)×150mm)，试剂0.05MKH₂PO₄、0.1％三氯乙酸、5％甲醇水混合溶液，超声20min，0.45μm膜过滤。

用流动相平衡柱40min，待基线走平稳，开始进样，进样量100μl，收集洗脱峰，分离色谱图见图14，反复进样，收集洗脱液，按顺序依次为ZBX1、ZBX2、ZBX3、ZBX4、ZBX5；将收集的样品冻干，各溶于1ml水，取0.5ml方法同前测活，结果见表11-12及图15；由上述表和图可以看出：ZBX4号峰的样品具有原样品大部分的活性。

表11高效反相色谱法分离样品Pak2流出样品测活结果

	空白     ZBX1     ZBX2    ZBX3    ZBX4      ZBX5
		k	0.83     0.86     0.8     0.8     0.93      0.99
A1E1D1A2E2D2A3E3D3D1+D2+D3k∑D	150      150      150     150     150       150119      120      123     117     94        12531       30       27      33      56        25150      150      150     150     150       150118      121      124     117     90        12332       29       26      33      60        27150      150      150     150     150       150120      121      122     118     92        12530       29       28      32      58        2593       88       81      98      174       7777.17    75.68    64.8    78.4    161.82    76.23

表12高效反相色谱法分离样品Pak2流出样品的活性计算结果

ZBX1	ZBX2	ZBX3	ZBX4	ZBX5
					-2％	-12.3％	1.21％	109.7％	-0.93％

               实施例七.高效凝胶排阻色谱法(HPGC)测定纯度

仪器采用岛津高压波相系统，包括LC-10AT泵，SPD-MXA检测器，CTO-10A柱箱；流动相为0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.0)；柱为Waters Protein-pak 60[7.8mm(ID)×300mm]；样品：ZBX4，流速：1ml/min，进样量：20μl；结果见图16-17，图中都只有一个单峰，说明得到纯度单一的样品。

                实施例八.高效反相色谱法(HPRPC)测定纯度

仪器采用岛津高压液相系统，包括LC-10AT泵，SPD-MXA检测器，CTO-10A柱箱，柱：YWG-C181[4.6mm(ID)×250mm]北京北分仪器技术公司，流动相：5％甲醇，柱温：35℃，流速：1ml/min，进样量：20μl；检测结果见图18，除在初期有一个小峰外，样品峰主要在保留时间为6.976MIN出现，证明纯度良好。

                      实施例九.高效毛细管电泳法测定纯度

仪器采用Waters Quanta 4000E毛细管电泳仪，柱：CEleet-P175 75μm(ID)×57.5cmSupelco，流动相：0.1M磷酸二氢钠—磷酸缓冲液，pH2.5，检测波长：214nm，上样量：10μl，结果见图19。

                 实施例十.高效凝胶色谱法(HPGC)测定分子量

仪器采用岛津高压及相系统，包括LC-IOAT泵，SPD-MXA检测器，CTO-10A柱箱，液动相：0.1M磷酸盐缓冲液0.2％SDS(pH7.0)，柱：TSK-GEL 2000SW[7.5mm(ID)×300mm]，流速：1ml/min，多肽标准：取多肽标准1μl，稀释20倍，上样4μl；样品：上样10μl。根据多肽标准品峰，见图20，得到标准曲线表，见表13，绘制标准曲线图21再结合高效凝胶色谱的测定结果，见图22，计算样品分子量为2749.68。

表13

	R.T.(min)	Molecular Weight
			1	5.120	26.625
2	5.636	16.950
			3	6.667	6.512
4	9.801	3.496
			5	10.486	1.423

                   实施例十一         紫外光谱测定利用水作为溶剂，采用日立3201紫外分光光度计测定样品的紫外吸收光谱。结果见图23。

                   实施例十二      N末端均一性测定

1、样品的Dansyl化：取样品0.1ml，加入DNS-Cl 0.6ml(2.5mg/ml)，用三乙胺调到ph9.0-9.1，混匀，塞好，于40℃烘箱中DNS化2小时。反应后取出，于真空干燥器中抽去丙酮。

2、DNS--样品的酸水解：向上述DNS化的样品中加入0.5ml 5.7M的盐酸溶液便之溶解，再转移到硬质玻璃的水解管中用火焰封管，110℃水解18小时。水解后除去封口，将水解液移出，放到5ml小管中，抽出盐酸，再加少量盐酸，再抽出盐酸至干。

3、加入0.5ml水溶解，再加1ml乙酸乙脂萃取，萃取2-3次，合并萃取液，蒸去乙酸乙脂，然后加入0.1ml丙酮溶解，备用。

4、标准氨基酸的DNS化：称取氨基酸标准品1ml(18种氨基酸)，溶于0.5ml 0.2M碳酸氢钠溶液中。加入0.5ml DNS-Cl丙酮溶液，40℃烘箱中DNS化1小时，于真空干燥器中抽出丙酮。然后，用1M盐酸溶液将DNS化的氨基酸酸化到PH2-3，再用乙酸乙脂萃取2-3次，每次用1ml，合并萃取液，蒸去乙酸乙脂，加入0.1ml丙酮溶解。

5、聚酰胺薄膜的剪裁：将聚酰胺薄膜剪裁成7厘米*7厘米大小两张。距两边0.5厘米处各划一直线，在点样处划一交叉十字。

6、点样：DNS-标准氨基酸、样品水解液分别用毛细管取样，于聚酰胺膜上点样。

7、展层：将聚酰胺薄膜的光面向外，聚酰胺面向内，箍一个尼龙条圈，置于小干燥器内的小培养皿中，培养皿中盛有层析溶剂1[85％甲酸∶水＝1.5∶100(V∶V)]。待溶剂前沿将达到膜边缘时，取出，用吹风机吹干。然后将薄膜换90°方向，于展层溶剂II[苯∶冰乙酸＝9∶1(V∶V)]中进行展层，待溶剂前沿将达到膜边缘时，取出，吹干。

8、检测：于紫外检测灯下观察。DNS-氨基酸为绿色，DNS-CI产物为蓝色荧光。用铅笔将各荧光区划下。确定样品N末端的数目及氨基酸种类，标准氨基酸的N-末端测定结果图见图25，样品的测定结果见图26，根据测试结果，可以认为所得样品只有一个N-末端，为精氨酸。

                     实施例十三     序列测定

仪器：LF3000 Protein Sequencer Beckman

                   实施例十四  脑蛋白活性物质的化学合成

采用多肽合成仪，按照测定的序列逐步合成脑蛋白活性物质，并测定所合成脑蛋白活性物质的理化常数和序列分步。

                  实施例十五  脑蛋白活性物质的化学合成

用合成的方法，合成上述脑蛋白活性物质，并测定所合成脑蛋白活性物质的理化常数和序列分步，与分离得到的活性物质基本相同。

综合以上描述，本发明所述的是一种脑蛋白水解活性肽，经脑蛋白水解液为原料提取得到，其分子量为2749.68D，只有一个N-末端，为精氨酸，并在HPGC、HPRPC、高效毛细管电泳谱图中分别有一单峰，吸收峰分别在t＝9.886、6.976、24min时出现。

Claims (3)

1、一种脑蛋白水解活性肽，以脑蛋白水解液为原料，经提取得到，其特征在于所述的活性肽分子量为2749.68D，只有一个N-末端，为精氨酸，并在HPGC、HPRPC、高效毛细管电泳谱图中分别有一单峰，吸收峰分别在t＝9.886、6.976、24min时出现。

2、权利要求1所述的肽的分离提纯方法，其特征在于：

(1)测定初级脑蛋白水解样品的活性；

(2)取初级脑蛋白水解样品中活性最高的样品用DEAE离子交换法分离，得到活性最高的样品DEAEI；

(3)用分子筛凝胶法分离DEAEI，得到活性最高的样品DEX2；

(4)用高效离子交换液相色谱法分离DEX2，得到活性最高的样品TSK3；

(5)用高效凝胶液相色谱法分离样品TSK3，得到活性最高的样品PAK2；

(6)用高效反相色谱法分离PAK2，得到具有原样品大部分活性的样品ZBX4为脑蛋白水解活性物质。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

(1)用瓦氏呼吸仪测压法测定初级脑蛋白水解样品的活性；

(2)DEAE离子交换法分离初级脑蛋白水解样品中活性最高的样品，上样0.5ml，以1ml/min的流速梯度洗脱，检测波长280nm；

(3)采用SephadexG25凝胶用分子筛凝胶法分离DEAEI，上样0.5ml，以1ml/min的流速洗脱，检测波长280nm，得到活性最高的样品DEX2；

(4)用Progel TSK DEAE-5PW柱高压液相系统，进样10ul的高效离子交换液相色谱法分离DEX2，得到活性最高的样品TSK3；

(5)用高效凝胶液相色谱法Protein-pak60柱高压液相系统，流动相为PH＝6.5、浓度0.05M的磷酸盐缓冲液，分离样品TSK3，得到活性最高的样品PAK2；

(6)用高效反相色谱法，Zorbax 300SB-C18柱高压液相系统、0.05M的KH₂PO₄溶液、0.1％三氯乙酸、5％甲醇水溶液分离PAK2，得到具有原样品大部分活性的样品ZBX4为脑蛋白水解活性物质。

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