CN109400677A - 一种麒麟菜降血脂四肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种麒麟菜降血脂四肽及其应用，属于降血压寡肽技术领域，该麒麟菜降血脂寡肽的氨基酸序列为Phe‑Tyr‑Lys‑Ala(FYKA)，具有较好的降脂活性。上述麒麟菜降血脂四肽可应用于制备降血脂药品、保健产品以及食品添加剂。本发明麒麟菜降血脂四肽可以显著降低由油酸诱导的肝细胞的脂肪堆积量，显著降低肝细胞内甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)水平，具有良好的降血脂活性，其可用于降血脂相关的药品、保健产品，以及特殊医用食品的开发。
Description
技术领域
本发明属于降血脂寡肽技术领域，具体涉及一种麒麟菜降血脂四肽及其应用。
背景技术
脂肪代谢或运转异常使血浆一种或多种脂质高于正常值称为高脂血症。目前，国内一般以成年人空腹血清总胆固醇超过5.72毫摩尔/升，甘油三酯超过1.70毫摩尔/升，诊断为高脂血症。将总胆固醇在5.2～5.7毫摩尔/升者称为边缘性升高。高脂血症可分为原发性和继发性两类。原发性与先天性和遗传有关，多数由于单基因缺陷或多基因缺陷，使参与脂蛋白转运和代谢的受体、酶或载脂蛋白异常所致，或由于环境因素(饮食、营养、药物)。继发性多发生于代谢性紊乱疾病(糖尿病、高血压、黏液性水肿、甲状腺功能低下、肥胖、肝肾疾病、肾上腺皮质功能亢进)，或与其他因素年龄、性别、季节、饮酒、吸烟、饮食、体力活动、精神紧张、情绪活动等有关。血脂过高很容易导致血压高、动脉粥样硬化、心肌功能的紊乱、冠心病、心绞痛、肝功能损伤。高血脂的治疗常用他汀类药物，如洛伐他丁、辛伐他汀、普伐他汀、美伐他等汀。他汀类药物对肝脏存在比较大的损害，对患者产生不利影响。因此，开发疗效显著、毒性较低的药物或者功能产品用于高血脂症的治疗具有积极的意义。
麒麟菜(Eucheuma muricatum)，红藻纲，红翎菜科。藻体呈圆柱形或扁平，紫红色，具刺状或圆锥形突起，基部有盘状固着器。属于热带和亚热带海藻，分布以赤道为中心并向南北伸延。中国见于海南岛、西沙群岛及台湾等地沿海。目前，海藻多肽的研究主要集中在蓝藻中的螺旋藻和红藻中的紫球藻及紫菜等，而对麒麟菜多肽的研究报道较少。研究证明藻蛋白具有抗氧化、抗肿瘤、调节免疫功能等多种生物活性。然而，蛋白质稳定性较差，易发生沉淀和变性，进而导致生物活性的丧失；且蛋白质分子量较大，不易于人体的消化吸收，从而限制了藻蛋白在保健品和药品领域的进一步开发利用。利用酶解方式可以释放存在于蛋白质氨基酸长链中的生物活性肽，从而发挥其特有的生物活性。因此，酶解麒麟菜藻蛋白获取活性肽以提升蛋白的利用率和活性价值，对麒麟菜的深度综合开发利用具有重要意义。目前以麒麟菜为原料，利用酶解技术制备麒麟菜降血脂寡肽的工艺研究处于空白阶段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以显著降低由油酸诱导的肝细胞的脂肪堆积量，显著降低肝细胞内甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)水平，具有良好的降血脂活性的麒麟菜降血脂四肽，其可用于降血脂相关的药品、保健产品，以及特殊医用食品的开发。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
本发明提供一种麒麟菜降血脂四肽，其氨基酸序列为Phe-Tyr-Lys-Ala(FYKA)，ESI-MS测定分子量为527.50Da，具有较好的降脂活性。本发明所提供的麒麟菜降血脂寡肽Phe-Tyr-Lys-Ala(FYKA)麒麟菜四肽Phe-Tyr-Lys-Ala(FYKA)可以显著降低由油酸诱导的肝细胞的脂肪堆积量，显著降低肝细胞内甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)水平，表明Phe-Tyr-Lys-Ala(FYKA)具有较好的降脂活性。因此，Phe-Tyr-Lys-Ala(FYKA)具有良好的降血脂活性，可用于降血脂相关的药品、保健产品，以及特殊医用食品的开发。
本发明还提供一种麒麟菜降血脂四肽的制备方法，包括麒麟菜藻蛋白的制备、麒麟菜藻蛋白的酶解、麒麟菜抗氧化寡肽的制备，其中麒麟菜藻蛋白的制备步骤提取溶剂为浓度为0.1-0.5％(W/V)CaCl2溶液，CaCl2溶液含有CaCl2重量2.5-3.0％的乳酸依沙吖啶和15.0-16.0％的硝酸钾。上述提取溶剂中合适浓度的钙离子使得细胞能够比较容易的吸收和释放物质，即细胞通透性变大，细胞壁变薄，有利于蛋白流出，有助于超声波法破壁处理蓝藻细胞，同时在蛋白质分子结构中，钙离子影响其电荷分布与分子构象，导致蛋白质分子充分与钙离子结合，在这些改变的作用下，蛋白质分子的吸附行为得到提高，乳化液的稳定性也有明显提升，藻蛋白在钙溶液的条件下保持稳定状态。超声有效作用区域为一环形，在提取罐的周壁存在形成超声空白区的隐患，CaCl2溶液中乳酸依沙吖啶和硝酸钾的存在能够通过范德华力吸附在细胞壁表面，进而破坏细胞壁的多糖类物质，产生细小的裂孔，促进麒麟菜藻细胞快速吸水，撑破细胞壁，即使在超声空白区也能使藻细胞内的蛋白类物质溶出，不影响超声波提取麒麟菜藻蛋白的效率，同时能够大大减少超声波提取的时间，节约能耗。此外能够促进溶出的藻蛋白分子中氢键与水结合速度，在藻蛋白表面迅速形成水化膜，避免蛋白质在超声波的影响下变性，提高藻蛋白在提取溶剂中的稳定性，最终提高麒麟菜藻蛋白的得率。
作为优选，麒麟菜藻蛋白的制备步骤为：取麒麟菜粉末，按照料液比1g:100mL加入提取溶剂浸泡8～12h后，在室温下用频率50～60kHz超声提取30～60min，提取液离心，取上清液加入硫酸铵至饱和度达到10％的，充分搅拌20～25min后冷冻离心，取上清液继续加入硫酸铵使之饱和度达到60％，充分搅拌20～25min后冷冻离心，沉淀透析、冻干，即为麒麟菜藻蛋白。
作为优选，麒麟菜藻蛋白的酶解步骤为：取上述麒麟菜藻蛋白，按料液比1g:10～15mL加入蒸馏水，调节pH值至6.5～7.5，加入麒麟菜藻蛋白重量0.5～1.5％木瓜蛋白酶，在50～60℃下酶解4～6h，灭酶，冷却至室温后离心，收集上清液，即麒麟菜藻蛋白酶解液。
作为优选，麒麟菜抗氧化寡肽的制备步骤为：将麒麟菜藻蛋白酶解液超滤，收集截留分子量小于1kDa组分，配成80～100mg/mL溶液，然后按照体积比1mL:10～15mL加入到装有大孔吸附树脂柱中，洗脱，收集乙醇洗脱部分，冻干，纯化，得到麒麟菜降血脂四肽。
更为优选，纯化包括凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，具体步骤为：
凝胶柱层析：将所述冻干酶解物溶于双蒸水配成浓度为50～70mg/mL的溶液，离心，上清液按照体积比1mL:10～15mL加入到葡聚糖凝胶Sephadex G-25层析柱中，用超纯水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，降血脂活性最强组分为凝胶层析酶解物；
反相高效液相色谱纯化：将所述凝胶层析酶解物用双蒸水配成20～30μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化，进样为15～20μL，流动相为35％乙腈，洗脱速度为1.0～1.5mL/min，紫外检测波长为215nm，根据各组分降血脂活性筛选获得降血脂六肽。
本发明还提供一种麒麟菜降血脂四肽在制备降血脂药品、保健产品以及食品添加剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明所提供的麒麟菜降血脂寡肽Phe-Tyr-Lys-Ala(FYKA)麒麟菜四肽Phe-Tyr-Lys-Ala(FYKA)可以显著降低由油酸诱导的肝细胞的脂肪堆积量，显著降低肝细胞内甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)水平，表明Phe-Tyr-Lys-Ala(FYKA)具有较好的降脂活性。因此，Phe-Tyr-Lys-Ala(FYKA)具有良好的降血脂活性，可用于降血脂相关的药品、保健产品，以及特殊医用食品的开发；本发明麒麟菜降血脂寡肽的制备方法用提取溶剂能够大大减少超声波提取的时间，节约能耗，同时可避免蛋白质在超声波的影响下变性，提高藻蛋白在提取溶剂中的稳定性，最终提高麒麟菜藻蛋白的得率。
本发明采用了上述技术方案提供一种麒麟菜降血脂四肽及其应用，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
附图说明
图1为本发明实施例1中不同麒麟菜藻蛋白酶解产物的DPPH自由基清除活性；
图2为本发明实施例1中麒麟菜藻蛋白ZD60酶解产物超滤组分的DPPH自由基清除活性；
图3为本发明实施例1中大孔吸附树脂处理后的ZDT-I酶解物的SephadexG-25凝胶过滤层析结果；
图4为本发明实施例1中Sephadex G-25凝胶过滤层析所得的组分的DPPH自由基清除活性；
图5为本发明实施例1中凝胶层析组分GD-Ⅱ的反相高效液相色潜(RP-HPLC)分离纯化结果；
图6为本发明实施例1中降血脂寡肽的纯度分析；
图7为本发明实施例1中降血脂寡肽的质谱图；
图8为本发明实施例1中降血脂寡肽对人肝癌细胞系hepG2的增殖作用的影响；
图9为本发明实施例1中降血脂寡肽对人肝癌细胞系hepG2内脂肪堆积的影响；
图10为本发明实施例1中降血脂寡肽对人肝癌细胞系hepG2内甘油三酯(TG)含量的影响；
图11为本发明实施例1中降血脂寡肽对人肝癌细胞系hepG2内总胆固醇(TC)含量的影响。
具体实施方式
下面，结合具体实施例对本发明一实施方式的一种麒麟菜降血脂四肽及其应用作进一步说明。
实施例1：
一种麒麟菜降血脂四肽，其氨基酸序列为Phe-Tyr-Lys-Ala(FYKA)，ESI-MS测定分子量为527.50Da，具有较好的降脂活性。该麒麟菜降血脂寡肽Phe-Tyr-Lys-Ala(FYKA)麒麟菜四肽Phe-Tyr-Lys-Ala(FYKA)可以显著降低由油酸诱导的肝细胞的脂肪堆积量，显著降低肝细胞内甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)水平，表明Phe-Tyr-Lys-Ala(FYKA)具有较好的降脂活性。因此，Phe-Tyr-Lys-Ala(FYKA)具有良好的降血脂活性，可用于降血脂相关的药品、保健产品，以及特殊医用食品的开发。
一种麒麟菜降血脂四肽的制备方法，包括麒麟菜藻蛋白的制备、麒麟菜藻蛋白的酶解、麒麟菜抗氧化寡肽的制备，其中麒麟菜藻蛋白的制备步骤提取溶剂为浓度为0.3％(W/V)CaCl2溶液，CaCl2溶液含有CaCl2重量2.8％的乳酸依沙吖啶和15.8％的硝酸钾。上述提取溶剂中合适浓度的钙离子使得细胞能够比较容易的吸收和释放物质，即细胞通透性变大，细胞壁变薄，有利于蛋白流出，有助于超声波法破壁处理蓝藻细胞，同时在蛋白质分子结构中，钙离子影响其电荷分布与分子构象，导致蛋白质分子充分与钙离子结合，在这些改变的作用下，蛋白质分子的吸附行为得到提高，乳化液的稳定性也有明显提升，藻蛋白在钙溶液的条件下保持稳定状态。超声有效作用区域为一环形，在提取罐的周壁存在形成超声空白区的隐患，CaCl2溶液中乳酸依沙吖啶和硝酸钾的存在能够通过范德华力吸附在细胞壁表面，进而破坏细胞壁的多糖类物质，产生细小的裂孔，促进麒麟菜藻细胞快速吸水，撑破细胞壁，即使在超声空白区也能使藻细胞内的蛋白类物质溶出，不影响超声波提取麒麟菜藻蛋白的效率，同时能够大大减少超声波提取的时间，节约能耗。此外能够促进溶出的藻蛋白分子中氢键与水结合速度，在藻蛋白表面迅速形成水化膜，避免蛋白质在超声波的影响下变性，提高藻蛋白在提取溶剂中的稳定性，最终提高麒麟菜藻蛋白的得率。
上述麒麟菜降血脂四肽的制备方法的具体步骤为：
1)麒麟菜藻蛋白的制备：取麒麟菜粉末，按照料液比1g:100mL加入去离子水浸泡12h后，在室温下下用频率53kHz超声提取45min，提取液离心，取上清液加入硫酸铵至饱和度达到10％的，充分搅拌25min，在7000r/min的条件下冷冻离心15min，收集蛋白沉淀ZD10，上清液继续加入硫酸铵使之饱和度达到60％，充分搅拌25min，在7000r/min的条件下冷冻离心15min，收集蛋白沉淀ZD60，蛋白沉淀ZD10和ZD60透析、冻干，即为麒麟菜藻蛋白；
2)麒麟菜藻蛋白的酶解：取麒麟菜藻蛋白ZD10和ZD60，按料液比1g:10mL加入蒸馏水各配置5份溶液，按照表1调不同溶液的温度和pH后，按照酶用量1.0％分别向蛋白溶液中加入胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，碱性蛋白酶，中性蛋白酶和胰蛋白酶，对麒麟菜藻蛋白ZD10和ZD60酶解4h，酶解液于95℃水浴中加热灭酶15min，在10,000r/min的条件下离心10min，收集上清液，测定不同溶液的DPPH自由基清除活性(如图1所示，其中*表示P<0.05)，麒麟菜藻蛋白ZD60的木瓜蛋白的DPPH自由基清除活性最高，所以麒麟菜藻蛋白的酶解选用木瓜蛋白酶；
表1五种蛋白酶的酶活力及最适温度和pH
| 项目 | 最适温度/℃ | 最适pH | 酶活力/(u/g) |
| 胃蛋白酶 | 37 | 2.1 | 300000 |
| 木瓜蛋白酶 | 55 | 7.0 | 500000 |
| 碱性蛋白酶 | 50 | 8.0 | 160000 |
| 中性蛋白酶 | 40 | 7.0 | 50000 |
| 胰蛋白酶 | 50 | 8.0 | 200000 |
3)麒麟菜降血脂寡肽的制备：将麒麟菜藻蛋白ZD60酶解液经截留分子量为1kDa和3kDa超滤膜进行分级，得ZDT-I(MW<1kDa)、ZDT-II(1kDa<MW<3kDa)和ZDT-III(＞3kDa)三个组分，测定其DPPH自由基清除活性(如图2所示，其中*表示P<0.05)，超滤组分ZDT-I自由基清除活性最强，将ZDT-I组分配成100mg/mL溶液，按照体积比1mL：10mL加入到装有D101大孔吸附树脂柱中，先用2～3柱体积洗脱，然后用2～3柱体积95乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部分，冻干，经凝胶柱层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，得到麒麟菜降血脂肽，利用氨基酸序列分析仪和质谱测定其结构，具体过程为：
①凝胶柱层析：将上述大孔吸附树脂处理后的ZDT-I酶解物溶于双蒸水配成浓度为50mg/mL的溶液，于4℃、12000r/min的条件下离心20min，上清液按照体积比1mL:20～25mL加入到葡聚糖凝胶Sephadex G-25层析柱中，用超纯水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分(GD-I，GD-II，GD-III，GD-IV)(如图3)，测定其DPPH自由基清除活性(如图4所示，其中*表示P<0.05)，GD-Ⅱ显示出最强的自由基清除活性；
②RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物GD-Ⅱ用双蒸水配成40～50μg/mL的溶液，利用RP-HPLC(进样量20μL；色谱柱Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)进行纯化，根据降血脂活性制备降血脂寡肽(如图5)，降血脂寡肽经RP-HPLC检测为单一峰(如图6)，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Phe-Tyr-Lys-Ala(FYKA)，ESI-MS测定分子量为527.50Da(如图7)。
以油酸诱导的人肝癌细胞系HepG2的脂质堆积模型来评价麒麟菜降血脂寡肽Phe-Tyr-Lys-Ala(FYKA)对油酸诱导的HepG2的脂质堆积的影响，结果如下：在浓度为100μmol/l的条件下，Phe-Tyr-Lys-Ala(FYKA)对人肝癌细胞系HepG2的细胞存活率无显著影响(如图8)，且可以降低由油酸诱导的肝细胞的脂肪堆积量(如图9所示，其中###P<0.001vs Control组；**P<0.01vs模型组)，显著降低肝内的甘油三脂(TG)(如图10所示，其中###P<0.001vsControl组；***P<0.001，*P<0.05vs模型组)和胆固醇含量(如图11所示，其中###P<0.001vsControl组；***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05vs模型组)，表明Phe-Tyr-Lys-Ala(FYKA)具有较好的降脂活性。
一种麒麟菜降血脂四肽在制备降血脂药品、保健产品以及食品添加剂中的应用。
实施例2：
一种麒麟菜降血脂四肽，其氨基酸序列为Phe-Tyr-Lys-Ala(FYKA)，ESI-MS测定分子量为527.50Da，具有较好的降脂活性。
一种麒麟菜降血脂四肽的制备方法，包括麒麟菜藻蛋白的制备、麒麟菜藻蛋白的酶解、麒麟菜抗氧化寡肽的制备，其中麒麟菜藻蛋白的制备步骤提取溶剂为浓度为0.1％(W/V)CaCl2溶液，CaCl2溶液含有CaCl2重量2.5％的乳酸依沙吖啶和15.0％的硝酸钾。
上述麒麟菜降血脂四肽的制备方法的具体步骤为：
1)麒麟菜藻蛋白的制备：取麒麟菜粉末，按照料液比1g:100mL加入提取溶剂浸泡8h后，在室温下用频率50kHz超声提取30min，提取液离心，取上清液加入硫酸铵至饱和度达到10％的，充分搅拌20min后冷冻离心，取上清液继续加入硫酸铵使之饱和度达到60％，充分搅拌20min后冷冻离心，沉淀透析、冻干，即为麒麟菜藻蛋白。
2)麒麟菜藻蛋白的酶解：取上述麒麟菜藻蛋白，按料液比1g:10mL加入蒸馏水，调节pH值至6.5，加入麒麟菜藻蛋白重量0.5％木瓜蛋白酶，在50℃下酶解4h，灭酶，冷却至室温后离心，收集上清液，即麒麟菜藻蛋白酶解液；
3)麒麟菜抗氧化寡肽的制备：将麒麟菜藻蛋白酶解液超滤，收集截留分子量小于1kDa组分，然后按照体积比1mL:5mL加入到装有大孔吸附树脂柱中，洗脱，收集乙醇洗脱部分，冻干，纯化，得到麒麟菜降血脂四肽。
其中，纯化包括凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，具体步骤为：
凝胶柱层析：将所述冻干酶解物溶于双蒸水配成浓度为50mg/mL的溶液，于4℃、10,000r/min的条件下离心10min，上清液按照体积比1mL:10mL加入到葡聚糖凝胶SephadexG-25层析柱中，用超纯水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，降血脂活性最强组分为凝胶层析酶解物；
反相高效液相色谱纯化：将所述凝胶层析酶解物用双蒸水配成20μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化，进样为15μL，流动相为35％乙腈，洗脱速度为1.0mL/min，紫外检测波长为215nm，根据各组分降血脂活性筛选获得降血脂六肽。
实施例3：
一种麒麟菜降血脂四肽，其氨基酸序列为Phe-Tyr-Lys-Ala(FYKA)，ESI-MS测定分子量为527.50Da，具有较好的降脂活性。
一种麒麟菜降血脂四肽的制备方法，包括麒麟菜藻蛋白的制备、麒麟菜藻蛋白的酶解、麒麟菜抗氧化寡肽的制备，其中麒麟菜藻蛋白的制备步骤提取溶剂为浓度为0.5％(W/V)CaCl2溶液，CaCl2溶液含有CaCl2重量3.0％的乳酸依沙吖啶和16.0％的硝酸钾。
上述麒麟菜降血脂四肽的制备方法的具体步骤为：
1)麒麟菜藻蛋白的制备：取麒麟菜粉末，按照料液比1g:100mL加入提取溶剂浸泡12h后，在室温下用频率60kHz超声提取60min，提取液离心，取上清液加入硫酸铵至饱和度达到10％的，充分搅拌25min后冷冻离心，取上清液继续加入硫酸铵使之饱和度达到60％，充分搅拌25min后冷冻离心，沉淀透析、冻干，即为麒麟菜藻蛋白。
2)麒麟菜藻蛋白的酶解：取上述麒麟菜藻蛋白，按料液比1g:15mL加入蒸馏水，调节pH值至7.5，加入麒麟菜藻蛋白重量1.5％木瓜蛋白酶，在60℃下酶解6h，灭酶，冷却至室温后离心，收集上清液，即麒麟菜藻蛋白酶解液；
3)麒麟菜抗氧化寡肽的制备：将麒麟菜藻蛋白酶解液超滤，收集截留分子量小于1kDa组分，然后按照体积比1mL:8mL加入到装有大孔吸附树脂柱中，洗脱，收集乙醇洗脱部分，冻干，纯化，得到麒麟菜降血脂四肽。
其中，纯化包括凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，具体步骤为：
凝胶柱层析：将所述冻干酶解物溶于双蒸水配成浓度为70mg/mL的溶液，于4℃、12,000r/min的条件下离心15min，上清液按照体积比1mL:15mL加入到葡聚糖凝胶SephadexG-25层析柱中，用超纯水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，降血脂活性最强组分为凝胶层析酶解物；
反相高效液相色谱纯化：将所述凝胶层析酶解物用双蒸水配成30μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化，进样为20μL，流动相为35％乙腈，洗脱速度为1.5mL/min，紫外检测波长为215nm，根据各组分降血脂活性筛选获得降血脂六肽。
对比例1：
一种麒麟菜降血脂四肽的制备方法，包括麒麟菜藻蛋白的制备、麒麟菜藻蛋白的酶解、麒麟菜抗氧化寡肽的制备，其中麒麟菜藻蛋白的制备步骤提取溶剂为浓度为0.5％(W/V)CaCl2溶液。其余和实施例1一致。
对比例2：
一种麒麟菜降血脂四肽的制备方法，包括麒麟菜藻蛋白的制备、麒麟菜藻蛋白的酶解、麒麟菜抗氧化寡肽的制备，其中麒麟菜藻蛋白的制备步骤提取溶剂为蒸馏水。其余和实施例1一致。
对比例3：
一种麒麟菜降血脂四肽的制备方法，包括麒麟菜藻蛋白的制备、麒麟菜藻蛋白的酶解、麒麟菜抗氧化寡肽的制备，其中麒麟菜藻蛋白的制备步骤提取溶剂为浓度为0.3％(W/V)CaCl2溶液，CaCl2溶液含有CaCl2重量2.8％的乳酸依沙吖啶。
对比例4：
一种麒麟菜降血脂四肽的制备方法，包括麒麟菜藻蛋白的制备、麒麟菜藻蛋白的酶解、麒麟菜抗氧化寡肽的制备，其中麒麟菜藻蛋白的制备步骤提取溶剂为浓度为0.3％(W/V)CaCl2溶液，CaCl2溶液含有CaCl2重量15.8％的硝酸钾。
测定实施例1、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4制备麒麟菜降血脂四肽的过程中的麒麟菜藻蛋白含量：
采用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量是一种染料结合法，考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，在488nm处有最大光吸收；当它与蛋白质结合后变为蓝色，结合物的最大光吸收在595nm处。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右达到平衡，反应迅速；结合物在室温下1h内保持稳定，在5-20min，颜色的稳定性最好；试剂配制与操作简便快捷，干扰物质少，反应非常灵敏，可测定微克级蛋白质含量。
蛋白质标准曲线制作：准确称100mg取牛血清白蛋白置于100ml容量瓶中，定容后充分混匀，为蛋白质标准溶液；分别吸取2、4、6、8、10ml蛋白质标准溶液至100ml容量瓶中，定容并混匀，得到浓度分别为20、40、60、80、100μg/ml的牛血清蛋白质溶液；取6支具塞试管分别作为1-6号，1号中加入1ml蒸馏水作为空白对照，2-6号中分别加入浓度为20、40、60、80、100μg/ml的牛血清蛋白溶液1ml，每支试管中再分别加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混匀，放置2min后测定各管溶液在595nm下的光吸收值。
样品中蛋白质含量的测定：吸取适当浓度样品液1ml于带刻度试管，加入5ml考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混匀后放置2min，测其在595nm处光密度值；通过标准曲线方程计算样品液中蛋白质含量。
实施例1、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4藻蛋白的得率分别为：2.89％、2.61％、2.33％、2.59％、2.62％，实施例1的酶解效果好于对比例1、对比例2、对比例3和对比例4，这说明CaCl2溶液中乳酸依沙吖啶和硝酸钾的存在能够提高麒麟菜藻蛋白的得率。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种麒麟菜降血脂四肽及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 麒麟菜(Eucheuma muricatum)
<400> 1
Phe Tyr Lys Ala
1
Claims (9)
1.一种麒麟菜降血脂四肽，其特征在于：所述降血脂寡肽的氨基酸序列为Phe-Tyr-Lys-Ala(FYKA)。
2.根据权利要求1所述的一种麒麟菜降血脂四肽，其特征在于：所述降血脂四肽的ESI-MS测定分子量为527.50Da。
3.根据权利要求1或2所述的一种麒麟菜降血脂四肽，其特征在于：所述降血脂四肽具有较好的降脂活性。
4.权利要求1-3任一项所述的一种麒麟菜降血脂四肽的制备方法，包括麒麟菜藻蛋白的制备、麒麟菜藻蛋白的酶解、麒麟菜抗氧化寡肽的制备，其特征在于：所述麒麟菜藻蛋白的制备步骤提取溶剂为浓度为0.1-0.5％(W/V)CaCl2溶液，所述CaCl2溶液含有CaCl2重量2.5-3.0％的乳酸依沙吖啶和15.0-16.0％的硝酸钾。
5.根据权利要求4所述的一种麒麟菜降血脂四肽的制备方法，其特征在于：所述麒麟菜藻蛋白的制备步骤为：取麒麟菜粉末，按照料液比1g:100mL加入提取溶剂浸泡8～12h后，在室温下用频率50～60kHz超声提取30～60min，提取液离心，取上清液加入硫酸铵至饱和度达到10％的，充分搅拌20～25min后冷冻离心，取上清液继续加入硫酸铵使之饱和度达到60％，充分搅拌20～25min后冷冻离心，沉淀透析、冻干，即为麒麟菜藻蛋白。
6.根据权利要求4所述的一种麒麟菜降血脂四肽的制备方法，其特征在于：所述麒麟菜藻蛋白的酶解步骤为：取所述麒麟菜藻蛋白，按料液比1g:10～15mL加入蒸馏水，调节pH值至6.5～7.5，加入麒麟菜藻蛋白重量0.5～1.5％木瓜蛋白酶，在50～60℃下酶解4～6h，灭酶，冷却至室温后离心，收集上清液，即麒麟菜藻蛋白酶解液。
7.根据权利要求4所述的一种麒麟菜降血脂四肽的制备方法，其特征在于：所述麒麟菜抗氧化寡肽的制备步骤为：将麒麟菜藻蛋白酶解液超滤，收集截留分子量小于1kDa组分，配成80～100mg/mL溶液，然后按照体积比1mL:10～15mL加入到装有大孔吸附树脂柱中，洗脱，收集乙醇洗脱部分，冻干，纯化，得到麒麟菜降血脂四肽。
8.根据权利要求7所述的一种麒麟菜降血脂四肽的制备方法，其特征在于：所述纯化包括凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，具体步骤为：
凝胶柱层析：将所述冻干酶解物溶于双蒸水配成浓度为50～70mg/mL的溶液，离心，上清液按照体积比1mL:10～15mL加入到葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析柱中，用超纯水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，降血脂活性最强组分为凝胶层析酶解物；
反相高效液相色谱纯化：将所述凝胶层析酶解物用双蒸水配成20～30μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化，进样为15～20μL，流动相为35％乙腈，洗脱速度为1.0～1.5mL/min，紫外检测波长为215nm，根据各组分降血脂活性筛选获得降血脂六肽。
9.权利要求1-8任一项所述的一种麒麟菜降血脂四肽在制备降血脂药品、保健产品以及食品添加剂中的应用。
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| CN104774243A (zh) * | 2015-04-09 | 2015-07-15 | 张海涛 | 一种麒麟菜多肽提取物及其制备方法和应用 |
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| 郭自安 等: "异枝麒麟菜酶法降解工艺的优化研究", 《水产科学》 * |
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