JPS63232846A

JPS63232846A - 新規な固定相担体

Info

Publication number: JPS63232846A
Application number: JP62064119A
Authority: JP
Inventors: Haruo Ogura; 小倉　治夫; Kazuisa Takeda; 収功武田; Kazuo Iwaki; 岩木　和夫; Sadahiro Yoshida; 吉田　定弘; Noriyuki Futamura; 二村　典行; Toshio Kinoshita; 俊夫木下
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1987-03-20
Filing date: 1987-03-20
Publication date: 1988-09-28

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、クロマトグラフィー固定相用の活性な担体物
質、あるいは酵素固定化用又は分析用担体物質に関する
。特に、本発明は光学異性体のりロマトグラフィー分離
のための光学活性な固定相担体の調製に有用であり、ま
たアフィニティークロマトグラフィーの固定相担体の調
製に有用であり、さらに酵素の固定化用に有用である新
規な活性担体物質に関する。

（従来の技術及び発明が解決しようとする問題点）クロ
マトグラフィーにおいて望まれることは、熟練を必要と
せずに容易に、その最適な分離条件が決定できることで
ある。一般に、クロマトグラフィーは、移動相、固定相
及び分離される試料の３者の最適な組み合わせを勘案す
ることにより、その最適の分離条件を決定する。従来、
最適な分離条件の決定は、主として、用いた移動相の種
類、組成、等２例えば溶媒の組成、水素イオン濃度、塩
濃度、等を検討、調整することにより行うのが普通であ
る。これまで、簡便で且つ緩和な条件下に、クロマトグ
ラフィー用固定相（特に光学異性体のクロマトグラフィ
ー分離用の固定相やアフィニティークロマトグラフィー
用の固定相）の物質を調製できるクロマトグラフィー固
定相用の担体物質は、未だ開発されていない。

（問題点を渭決するための手段）本発明者らは、水系溶媒中でも簡便に且つ緩和な条件（
例えば室温にて攪拌）でクロマトグラフィー固定相用の
担体を調製するのに使用でき、なおかつ、多目的（光学
分割のためのクロマトグラフィー及びアフィニティーク
ロマトグラフィー等）にも使用可能な固定相担体物質を
開発することを目的として鋭意研究を進めた。その結果
、本発明者は、Ｎ、Ｎ’−ジスクシンイミジル・カーボ
ネー１〜（以下、ｒＤｓｃＪと略記する：　「テトラヘ
ドロン・レター」麺、　４５６９−４５７２頁、（１９
８３）参照〕、あるいはＮ、Ｎ’−ジスクシンイミジル
・オキザレート〔以下、ｒＤＳＯＪと略記する；　「テ
トラヘドロン・レター晟、　４４５１−４４５４頁、（
１９８３）参照〕を、アミノ基を含有するクロマトグラ
フィー用固定相担体物質として知られるアミノ基含有の
固定相担体物質に反応させることにより、本発明の目的
に適する担体物質が得られることを知見した。

従って、第１の本発明の要旨とするところは、アミノ基
を含有するクロマトグラフィー用固定相担体物質にＮ、
Ｎ’−ジスクシンイミジル・カーボネート又はＮ、Ｎ’
−ジスクシンイミジル・オキザレートを反応させること
により得られて１次式〔式中、ｎは１又は２の整数である〕で示される基を含
有する物質から成ることを特徴とする、クロマトグラフ
ィー固定相用の活性担体物質にある。

また、第２の本発明の要旨とするところは、アミノ基を
含有する担体物質にＮ、Ｎ’−ジスクシンイミジル・カ
ーボネート又はＮ、Ｎ’−ジスクシンイミジル・オキザ
レートを反応させることにより得られて１次式〔式中、ｎは１又は２の整数である〕で示される基を含
有する物質から成ることを特徴とする、酵素固定化用又
は分析用の活性担体物質にある。

本発明で用いられるＤＳＣは下記の式（１）で示され且
つＤＳＯは下記の式（Ｉｆ）で示される化合物であり、
これら化合物が素材のアミノ基含有担体物質のアミノ基
と反応すると、次の反応式（イ）又は（ロ）に従って、
下記の式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）で示される基を含有す
る担体物質を生成する。

（ｍ）従って、上記の反応で得られた本発明の担体物質は、上
記の式（ＩＩＩ）又は式（ＩＶ）で示される基、すなわ
ち次の一般式〔ｎ＝１又は２〕で示される基を含有することになる。

この式（Ｖ）で示される基が本発明の担体物質の活性の
一環を受は持つことになる。

本発明の担体物質を製造するのに原料に用いるアミノ基
を含有する固定担体としては、アミノプロピルシリカゲ
ル、例えば商品名Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　５−Ｎ）ｌ、　
（西独Ｎａｇｅ１社製）として知られるアミノプロピル
基を含有するクロマトグラフィー用シリカゲルがあり、
また前記アミノプロピルシリカゲルをペンタエチレンヘ
キサミンなどのアルキルアミン類と結合させてアミン側
鎖を伸長させたアミノアルキル基を結合したシリカゲル
、なども使用できる。

本発明による活性担体物質は、ＤＳＣ又はＤＳＯをアセ
トニトリル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどの有
機溶媒に溶解した溶液を、原料としての上記のアミノ基
を含有する固定相担体物質と混合し、その混合物を室温
下に攪拌することにより（バッチ法）、製造できる。あ
るいは、上記アミノ基を含有する固定相担体物質をカラ
ムに充填したものにＤＳＣのアセトニトリル溶液、ある
いはＤＳＯのテトラヒドロフランまたはジオキサン溶液
を室温下に送液することにより（カラム法）、製造でき
る。この際、原料として用いたアミノ基含有の固定相担
体物質がアミノプロピル基を含むシリカゲルである場合
には、前記のアミノプロピル基は次式（ｎ＝１又は２）の基に転化される。

本発明に係る活性担体物質に含有される式（Ｖ）の基は
、これに次の一般式％式％（）〔式中、Ｒは光学活性アミンからアミノ基１個を除いた
ことに相当するアミン残基、あるいは蛋白質分子からア
ミノ基１個を除いたことに相当する蛋白質分子の残基で
ある〕で示される光学活性アミン、あるいは蛋白質、例
えば酵素を作用させると、速やかに反応して次式％式％（）〔Ｒは上記の意味をもち、ｎ　＝　１又は２である〕で
示される非対称の尿素誘導体又はオキザミレート誘導体
型の基になり、このような式（■）の基を含有する担体
物質は、ｄドアミノ酸の如き光学異性体の混合物のクロ
マトグラフィー的光学分離に、またアフィニティークロ
マトグラフィーの固定相担体として効率良く働くことが
見出された。

特に、本発明の活性担体物質と光学活性なアミン類との
反応により生成し′た上記の式（■）で示される非対称
型の尿素誘導体型又はオキザミレート誘導体型の基を含
有する担体物質は、ＨＰＬＣによる光学異性体の分離に
有効であり、更に１本発明の活性担体物質と酵素蛋白質
との反応により生成した上記の式（■）で示される非対
称型の尿素誘導体型又はオキザミレート誘導体型の基を
含有する担体物質は、特に固定化酵素として有用である
ことを見出した。

上記の光学活性アミンとしては１例えば（Ｒ）−（リー
１−フェニルエチルアミン、　（Ｓ）−（−）−１−フ
ェニルエチルアミン、（Ｒ）−（＋）−１−（１−ナフ
チル）エチルアミン、（Ｓ）−（−）−（１−ナフチル
）エチルアミンなどが用いられる。

また、蛋白質としては、例えば、グルコース、オキシダ
ーゼ、ウリカーゼ（尿酸酸化酵素）、等の酵素が用いら
れる。

なお、上記の式（■）で示される非対称な尿素又はオキ
ザミレート誘導体型の基を含有する担体物質は、先づＤ
ＳＣ又はＤＳＯを一般式（ＶＩ）で示される光学活性ア
ミン又は蛋白質と次の反応式：（１）’（ＤＳＣ）　　
　　　　　　　　（ＩＩ）　（１）ＳＯ）〔但しｎ＝１
又は２、Ｒは前記の意味をもつ〕に従って反応させ、得
られた式（■）の化合物又は物質を、次に前記のアミノ
基を含有する担体物質（本発明による活性担体物質の製
造原料として用いられたもの）に反応させることによっ
ても調製できる。

（発明の効果）本発明に係る活性担体物質は、これを用いると種々のク
ロマトグラフィー固定相用の担体及び固定化酵素を簡便
かつ安価に調製することが可能となる。

さらに、従来、光学異性体のクロマトグラフィー分離に
用いられるキラルな固定相担体物質には、はとんどの場
合、順相系の移動相が用いられているが、本発明の活性
担体物質と光学活性アミンとの反応で調製されたキラル
な担体物質を固定相として用いると、水系の移動相の使
用が可能となる。

尖１但上ＤＳＣの０．５％（ｗ／ｖ）を含むアセトニトリル溶液
の５０ｍＡに商品名Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　５−Ｎｌ２（
Ｎａｇｅ１社′ｌＡ＞のアミノプロピル・シリカゲルを
少斌づつ加え（全Ｍ５ｇ）、−晩室温にて攪拌し、ニン
ヒドリン反応が陰性となった後、このように処理された
シリカゲルを活性カルバメート体（本発明の活性担体物
質）として濾取する。この活性カルバメート体ゲル（５
，５ｇ）をアセトニトリル（２００ｏ＋ｊｌ）で充分洗
浄し、乾燥した。こうして、活性な担体物質を得た。

６％　　　　　　　４，００　　　　　　　４．９ｇＨ
％　　　　　　　　１．０７　　　　　　　１．１５Ｎ
％　　　　　　　　１，４２　　　　　　　１．５０豊
Ａ目」Ｙ（イ）キラル固定相の調製実施例１で！Ｉ１ｍした活性カルバメート型の基を含有
する活性担体物質の２．５ｇを、１−（１−ナフチル）
エチルアミンの０．５％を含むアセトニトリル溶液５０
＋＋＋Ｑに加えて一晩攪拌後、このように処理したシリ
カゲルを濾過する。得られたシリカゲルをアセトニトリ
ル、　１０．１％リン酸水溶液、水、及びアセトニトリ
ルの順で充分に洗浄し、乾燥する。このゲルをＨＰＬＣ
用のカラム（６，ＯＸ　１００ｍｏ＋）にスラリー充填
し、キラル固定相とした。

豆亙分近ｌ６％　　　　　　１１．６０Ｈ％　　　　　　　１．２４Ｈ％　　　　　　１゜９１（ロ）アミノ酸の誘導体化と分離次の第１表に示したアミノ酸のｄＱ体の０．５ｍｇ／ｍ
Ｑを含む０．ＩＮ　ｌＩＣ４溶液２０μＱニ０．３Ｍホ
ウ酸緩衝液（ｐＨ９，５）　３０μＱ及び５＋ｍＭ　Ｎ
−（Ｎ’−ｐ−ブロモフェニルカルバモイルスクシンイ
ミデートのアセトニトリル溶液５０μＱを加え、５分間
反応させた。この反応液５μＱを上記のように調製した
ＨＰＬＣカラムに直接注入した。

このＨＰＬＣ操作では、ポンプＬＣ−３Ａ　（島津製作
所）、検出器ＥＲＣ−８７．１０紫外部モニター（エル
マ）を用い、移動相は０．１％リン酸水溶液／メタノー
ル、検出波長は２５０ｎｍとし、カラムは室温で操作し
た。

アミノ酸の分離の結果を次表に示す。

」Ｌ」−ｊＬＰｒｏ拳　　　　　　　　３５　　　　　　　　　　　
２３．２５　　２２．０６　　１．０５　　０．７４Ｔ
ｙｒ　　　　　　５０　　　　　　１５．５４　１６．
３８　１，０５　０．７８Ｐｈｅ　　　　　　６０　　
　　　　　９．７４　１０．１８　１．０５　０．５４
Ｔｒｐ　　　　　　６０　　　　　　１０．２０　１０
，８９　１．０？　　０．８４Ｃｙｓ　　　　　　７０
　　　　　　１４．１１　１５．４０　１．０９　１．
２８ｔｏ＝１．３分間に’＝保持値６２分離係数Ｒ，＝分離度以下、ｋ′、α、Ｒ，の意味は上記と同様である。

尖五叢主ＤＳＯ（２５０＋ａｇ）をアセトニトリル５０ｍＲに懸
濁した懸濁液にＮｕｃｌｅｏｓｉｌ、　５−ＮＨ，（Ｎ
ａｇｅ１社製）を少量づつ加え（総ｎ５ｇ）、−晩室温
にて攪拌しニンヒドリン反応が陰性となった後、このよ
うに処理したシリカゲルを活性カルバメート体として濾
取する。この活性カルバメート体ゲル（５，３ｇ）をア
セトニトリル（２００ｍ１２）で充分洗浄し、乾燥して
活性担体物質を得た。

０％　　　　　４．９０Ｈ％　　　　　１．１８Ｎ％　　　　　１．５３見互叢又（イ）キラル固定相の調製実施例２でＷＲ製した活性担体物質の２．５ｇを０．５
％の１−（１−ナフチル）エチルアミンのアセトニトリ
ル溶液５０ｍ１２に加えて、−晩攪拌後、濾過する。こ
のように処理したシリカゲルをアセトニトリル、０．１
１リン酸、水、及びアセトニトリルの順で充分に洗浄し
、乾燥する。このゲルをＨＰＬＣカラム（６，。

ｘ　１００＋ｗｍ）にスラリー充填しキラル固定相とし
た。

天皇分近ｉ０％　　　　　　１１．５３Ｈ％　　　　　　　１．２３Ｎ％　　　　　　　１．９８（ロ）アミノ酸の誘導体化と分離次の第２表に示したアミノ酸のｄｆｉ体の０　、５ｍｇ
／＋ｍｎを含む０．１Ｎ　ＨＣ（ｉ溶液２０　／Ａ　Ｑ
　＆ＣＯ，３Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９，５）　３０μＱ
及び５ｍＭ　Ｎ−（Ｎ’−ｐ−ブロモフェニルカルバモ
イルスクシンイミデートのアクリルニトリル溶液５０μ
党を加え、５分間反応させた。この反応液５μ党を上記
のように調製したＨＰＬＣカラムに直接注入した。

（ｔｌＰＬｃ条件〕ポンプＬＣ−３Ａ　（島津製作所）、検出器ＥＲＣ−８
７１０紫外部モニター紫外用モニターい、移動相は０．
１％リン酸水溶液／メタノール、検出波長は２５０ｒｖ
とし。

カラムは室温で操作した。

アミノ酸の分離の結果を次表に示す。

第２表Ｈｉｓ　　　３５　３．２２３．５２１．０６０．４２
Ａｌａ　　　３５　６．９４７．２９１．０５０．６７
Ｌｅｕ　　　５０　６．８９７．６０１．１０１．７０
ｔ、＝１．３分間ヌ１目１止（イ）アミノプロピルシリカゲルをスラリー充填しｔニ
ー　カラム（６，Ｑ　Ｘ　Ｌｏｏｍｍ）　ニ０．５％　
（７）ＤＳＣ（７）　７　セトニトリル溶液を、流速０
．５ｗｘ（１／分で３時間送液した後。

アセトニトリルで充分洗浄し、クロマトグラフィー固定
相として活性担体物質の充填カラムを得た。

次に０１．５％の１−（ｌ−ナフチル）エチルアミンの
アセトニトリル溶液を上記のカラムに３時間送液した。

その後、アセトニトリルで充分洗浄し、ＩＩ　Ｐ　Ｌ　
Ｃ用のキラル固定担体の充填カラムを得た。

及亙分近貞０％　　　　　　６．２０Ｈ％　　　　　　１．０８Ｎ％　　　　　　１．１８（ロ）アミノ酸の誘導体化と分離次表に示したアミノ酸のｄＱ体の０．５ｍｇ／ＩＩΩを
含む０．１Ｎ　ＨＣｕ溶液４０μａ４：０．３Ｍホウ酸
緩衝液（ｐＨ９，５）６０μｇ及び５ｍＭのスクシンイ
ミジル・ｐ−ブロモフェニルカルバメートのアクリルニ
トリル溶液１００μＱを加え、５分間反応させた。この
反応液５μｇを上記のように調製したＩＩＰＬＣカラム
に直接注入した。

［ＨＰＬＣ条件］ポンプＬＣ−３Ａ　（島津製作所）、検出器ＥＲＣ−８
７１０紫外部モニター紫外用モニターい、移動相は、０
．１５Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５／アセトニトリル＝　３
０７７０とした。検出波長は２５０ｎ■とし、カラムは
、室温で操作した。

各アミノ酸類の分離の結果を次表に示す。

第３表Ｔｙｒ　　　５０　　５．７０　＆、２３１．０９０．
６０Ｐｈａ　　　６０　　４．８０６．２３１．０６０
．３４Ｔｒｐ　　　６０　　４，８２５．２５１．０９
０．４６ｔ、＝１．３分間」１工（イ）ヌクレオシル（Ｎｕｃｌａｏｓｉｌ）、５ＮＨ，
をスラリー充填したカラム（６，ＯＸ　１００−■）に
０．５％のＤＳＣのアセトニトリル溶液を流速０．５ｒ
ａΩ／分で３時間送液した後、アセトニトリルで充分洗
浄する。

次に０．５％のペンタエチレンへキサミンのアセトニト
リル溶液を流速０　、５１１１／分で３時間送液した後
。

アセトニトリルで充分洗浄した。さらに０．５％（Ｓ）
＝（−）−スクシンイミド１−（１−ナフチル）エチル
カルバメートのアセトニトリル溶液を流速０　、５ｍｍ
／分で５時間送液し再びアセトニトリルで充分洗浄し、
）ＩＰＬＣ用のキラル固定相担体充填カラムを得た。

元亙分灰ｌ０％　　　　　　１２．４５Ｈ％　　　　　　１．８ＯＮ％　　　　　　３．５２（ロ）アミノ酸の誘導体化と分離次表に示したアミノ酸のラセミ体の０．５ａ＋ｇ／ｍ（
ｌを含む０．ＩＮ　ＨＣＱ溶液４０１１ニ０．３Ｍホウ
酸緩衝液（ｐｔ１９．５）　６０μａ及び５ｍＭのスク
シンイミジル・Ｐ−ブロモフェニルカルバメートのアセ
トニトリル溶液１００μｎを加え５分間反応させた。こ
の反応液５μΩを上記の調製したＨＰＬＣカラムに直接
注入した。

［）ＩＰＬＣ条件〕ポンプＬＣ−３Ａ　（島津製作所）、検出器ＥＲＣ−８
７１０紫外部モニター紫外用モニターい、移動相は、　
０．１５に酢酸ナトリウムＰＨ５／アセトニトリル＝　
３０／７Ｇ、検出波長は２５０ｎ鵬とし、カラムは、室
温で操作した。

下表に各アミノ酸（Ｎ−（ｐ−ブロモフェニルカルバミ
ル）誘導体として〕の分離の結果を示す。

Ｔｈｒ　　　　５．８１　　６，２４　　１．０７　　
　！、１１Ｔｙｒ　　　　１２．４９　　１４．４３　
　１．１６　　２．３０１１ａ　　　　４，５３　　５
，１０　　１，１３　　１．４４Ｖａｌ　　　　６．６
６　　７．３３　　１．１０　　１．４９Ｎｅｔ　　　
　６．７６　　７．３４　　１．０８　　　Ｌ３９Ｐｈ
ｅ　　　　８．１４　　９．４０　　１．１５　　２．
５１Ｔｒｐ　　　　１３．７８　　１５．９６　　１．
１６　　２．３８Ｌｙｓ１３．３６　　１４．７２　　
１．１Ｇ　　　１．６４Ｃｙｓ　　　　１８．２８　　
２１．５８　　１．１８　　２．８０ｔｏ＝１．８分間災産■旦　固定化酵素の調製実施例１で調製した活性カルバメート体型の担体物質１
ｇを、グルコースオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社製、Ｔｙ
ｐｅｘ）　５０Ｂ含有のリン酸バッファ　−（５０ｍＭ
。

ｐＨ７，５）中に加え、室温で２時間ゆるやかに攪拌し
て１反応させる。濾取後、上記バッファー及びＩＭ　Ｎ
ａＣ１水溶液各１００ｍｊｌを用いて洗浄する。

得られたゲルのうち約１／４ｍを試験管にとり、グルコ
ースの各種濃度溶液（０，２Ｍリン酸バッファｐＨ４，
８）　３ｍｊｌを加え、３７℃で２００分間反応せた後
、上清２ｍｊｌを別の試験管にとる。これに５０μｇ過
酸化水素酸化酵素（ＰＯＤ）及び１０μｇ発色剤（４−
アミノアンチピリン＋フェノール）を含むリン酸バッフ
ァー（ｐＨ７，０）　２ｍｊｌを加え、発色させる。発
色後、比色計による吸収を測定してグルコース意を調べ
た。その結果を次表に示す。

第５表この結果、グルコースの量に応じて発色の程度が変化す
ることより、グルコースオキシダーゼがその活性を保っ
たまま、シリカゲルに固定化されたことがわかる。

災胤孤旦実施例１で調製した活性カルバメート体型の基を含有す
るシリカゲルよりなる固定用担体物質の１ｇを、ウリカ
ーゼ（Ｓｉｇｍａ社製、尿酸酸化酵素、Ｔｙｐｅｌｌ）
を５０ｍｇ含むリン酸バッファー中に加え、固定化酵素
を前実施例と同様にして得る。

尿酸の各種濃度液を基質溶液として用いて実施例５と同
様に操作して測定する。

第６表この結果、ウリカーゼがその酵素活性を保ったまま、シ
リカゲルに固定化され得たことが明らかとなった。

Claims

【特許請求の範囲】１、アミノ基を含有するクロマトグラフィー用固定相担
体物質にＮ，Ｎ′−ジスクシンイミジル・カーボネート
又はＮ，Ｎ′−ジスクシンイミジル・オキザレートを反
応させることにより得られて、次式▲数式、化学式、表
等があります▼（Ｖ）〔式中、ｎは１又は２の整数である〕で示される基を含
有する物質から成ることを特徴とする、クロマトグラフ
ィー固定相用の活性担体物質。２、アミノ基を含有する担体物質にＮ，Ｎ′−ジスクシ
ンイミジル・カーボネート又はＮ，Ｎ′−ジスクシンイ
ミジル・オキザレートを反応させることにより得られて
、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ）〔式中、ｎは１又は２の整数である〕で示される基を含
有する物質から成ることを特徴とする、酵素固定化用又
は分析用の活性担体物質。３、アミノ基を含有する担体物質としては、アミノプロ
ピル基を含有するシリカゲル、又はアミノプロピル基を
含有するシリカゲルにアルキルアミンを結合させて得ら
れたアミノアルキル基を結合したシリカゲル、あるいは
その他の公知であるアミノ基含有のクロマトグラフィー
用固定相担体物質が用いられた特許請求の範囲第１項又
は第２項記載の物質。