JPS63501507A - 光学活性試薬および対掌体アミン化合物の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 光学活性試薬および対掌体アミン化合物の測定法発明の背景 本発明はキラル試薬および高速液体り・ロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）による対 掌体の分離と検出の改良に関する。さらに詳しくは、本発明は第一級および第二 級アミンと反応して安定なジアステレオマーカルバミン酸塩を定量的に形成する 光学活性クロロギ酸フルオレニルに関する。この生成物はＨＰＬＣカラムで分離 後、螢光分析または吸光光度法により検出できる。

光学活性アミノ含有物質の分離は生物学研究および薬化学において著しく重要で ある。これらの物質は薬剤においては通例のもので、その多くはラセミ混合物と して存在する対掌体である。多くの場合、これら対掌体の生物学的活性は一つの 特定の光学活性対掌体の立体配座に帰せられる。それ故対掌体を識別または分割 することが非常に重要である。

クロマトグラフィー法は少量の試料、簡単な前処理、検出の高感度のような多く の利点を与えるから、定量目的に使用される。

ベーパークロマトグラフィーによる１９５１年の光学活性異性体の最初のクロマ トグラフィー分離以来、多数のこのような方法が導入されており、最近水に総括 されている（Ｒ，Ｗ、サラター著“立体異性体のクロマトグラフィー分離”　； ＣＲＣブレス、バコ　レートン。

１９８５年およびＪ、ジャクス、；Ａ、コレット、；Ｓ。

Ｈ，ワイレン共著“対掌体、ラセミ化合物、および分割”　；ジョーン・ワイリ ー・アンドサンズ；ニューヨーク；　１９１１１１年）。

対常体の分割はキラル試薬の介在を必要とする。クロマトグラフィー分割法は二 つの主方向に発達してきた。

ｌ、　キラル固定相（Ｃ８Ｐ”）または移動相中のキラル成分によるカラムでの 対掌体の直接分割。

２、キラル試薬で誘導体形成後生成ジアステレオマーの間接分割。

キラル固定相での対掌体の液体クロマトグラフィーによる直接分離は多くの注目 を集めており、現在幾つかの商業上利用できるキラルカラムがある。できるだけ 多くの異なる型のキラル物質を分離できるキラル固定相をつくるのに努力が向け られている。それでもなお、事前に誘導体形成なしにどの型のキラルヵラムでも 直接分割されたアミンおよびアミノ酸はごく少ない。

タメガイ等（」ルｉｇ、ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　１　１９７９年・　２ 巻、１２２９頁）はキラル試薬で誘導体形成し、通常のカラムで分割されるジア ステレオマーを形成することによる対掌体の間接分割に基づく方法を総括してい る。

フルカワ等（ＣｈｅＩｌ、Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌｌ、１９７５年、２３巻、１６２ ３頁）はキラル試薬として容易に入手できる塩化（＋）−１０−ショウノウスル ホニルを使う対掌体アミノ酸の分離を最初に行った。ついでカルボニル残基を第 ２工程でｐ−ニトロベンジルエステルに変換すると紫外線検出に敏感な誘導体を 生成した。

選択的アミン官能基誘導体形成に最も普通のキラル試薬は、第一級および第二級 アミンと反応して紫外線に敏感なチオ尿素誘導体を与えるイソチオシアネートに 基づくものである。反応は弱塩基性条件で約２０分室温で、副生物の生成なしに 行われる。

この種の最も成功した試薬は、アミノ酸およびアミンの両者に使われた２、３． ４．６−テトラ−０−アセチルーｐ−ｄ−グルコピラノシルイソチオシアネート （ＧＩＴＣ）である。大部分の蛋白質アミノ酸から生成するチオ尿素誘導体は、 通常の逆相カラムで２時間以内に分割された。得られた分割は、立体配座的剛性 と関連した糖残基の親油性によるものと考えるべきであろう。

アミノ含有化合物に対する螢光キラル誘導体形成試薬は稀であり、キラルチオー ルと組合したＯ−フタルアルデヒド（０ＰＡ）に基づく試薬のみが報告されてい る。

（日本特許６０−３８．６５２（８５−３８，６５２）。使われた各種のキラル チオール化合物はＮ−アセチル−Ｌ−システィン、ＢＯＣ−Ｌ−システィンで、 これらすべては第一級アミノ基と反応してジアステレオマーイソインドールを形 成する。反応は選択的で、ラセミ化することなく緩衝水性混合液中直接室温で１ 分以内に完結する。

しかし、生成ジアステレオマーは安定ではない。

このような試薬がもつべき幾つかの必須で望ましい条件は次の通りである。

＊試薬は光学的に純粋でなければならない。

＊試薬は発色団または発螢光団を含んでいなければならない。

＊反応条件は温和であるべきで、さもないと潜在的ラセミ化の危険が増す。

＊試薬は第一級および第二級アミノ基と反応すべきである。

本生成ジアステレオマーは安定でなければならない。

本生成ジアステレオマーは通常のＨＰＬＣカラム上で分離される必要がある。

本方法は分取規模で応用できる必要がある。

本方法は自動化できる必要がある。

しかし、第一および第二アミノ含有化合物のラセミ混合物を効果的に誘導体に変 え、検出し、分離する方法と組合わされたキラル試薬がこれまでに開示または示 唆されたことはない。

発明の要約 本発明の目的は、通常の逆相ＨＰＬＣカラムで第一級および第二級アミノ含有化 合物を間接分割するためのキラル試薬と方法を提供するにある。当該試薬は、安 定で液体クロマトグラフィーにより分離後螢光分析または吸光光度法で検出でき る螢光誘導体を与えるべきである。安定な誘導体は定量化と自動化を容易にする 。

さらに、反応は温和な条件下、水相中でラセミ化なく迅速に起るべきである。

次の一般式 （式中、Ｘはハロゲン、アジド基、またはスクシンイミジル基で、Ｒはアルキル 基またはトリフルオロメチル基である）を有する光学活性試薬を添加することに より当該化合物のアミノ官能基を誘導体に変え、ジアステレオマーカルバミン酸 塩を形成することにより、上記を達成でき、上記カルバミン酸塩は液体クロマト 発明の説明 グラフィーによる分離後、既知の方法たとえば螢光分析または吸光光度法により 測定される。

本試薬は次のことを実行する： １、分割したアミンおよびアミノ酸の光学純度の測定。

２、生物系中に種々の量で含まれる対掌体アミノ含有化合物の測定。

３、アミノ含有ラセミ混合物の分取的分割。

図の説明 第１図は試薬および反応式を示す。

第２図は種々のアミノ酸の螢光ジアステレオマーカルバミン酸塩を形成する反応 速度と収率を示すグラフである。

第３図はアスパラギン酸とグルタミン酸について反応収率対ｐｉを示すグラフで ある。

第４図は逆相液体クロマトグラフィーで行った螢光標識したジアステレオマーカ ルバミン酸塩としての１７種のアミノ酸の分割を示すクロマトグラムである。

第５図はラセミメトプロロールの分割を示すクロマｍ６図は市販の“光学的に純 粋な゛Ｌ−グルタミン誘導体形成と分割を示すクロマトグラムである。

を維持するような位置で実施する必要がある。

本発明は、ショツテン−バウマン条件下でクロロギ酸塩と種々のアミンとが迅速 に反応し、安定なカルバミン酸塩を形成することに基づくものである。反応は１ 工程で室温で数秒以内に遂行される。あるｐｎ範囲では、反応はアミノ官能基に 対し選択的で、唯一の生成副生物は相当するアルコールである。過剰の試薬は容 易に処理されるので次の分離工程での妨害をはふける。

クロロギ酸９−フルオレニルメチル試薬（ＦＭＯＣ）　ハ、励起発光波長２７０ ／３１５ｒｖを有する螢光体である。したがって生成物はこの波長の組合せで選 択的に検出される。この性質を選択的反応と組合せるとごく複雑な混合物たとえ ば体液（ｂｏｄｙ　Ｎｕｌｄｓ）を浄化または″前処理操作なしに取扱えるよう になる。

本発明の目的は、ラセミアミノ含有化合物と反応してジアステレオマーを形成す るように、多くの利点をもってアキラルＦＭＯＣ試薬と同一方法で使用できる光 学活性試薬を合成することである。該ジアステレオマーは、通常の分離系、典型 的には、痕跡分析および分取分離用の最も普通な有効なＬＣ分離系である逆相１ １ＰＬｃで分割可能であるべきである。試薬を光学活性にすることは、分割可能 なジアステレオマーを得ることの保証とはならない。不斉炭素原子の導入は、試 薬の性質本発明は９−フルオレニル−１−位置に不斉炭素原子を導入することに より、ＰＭＯＣ試薬のキラリティーをつくり出すことであった。この型の化合物 は従来文献に記載されていない。この位置は生成アミド官能基およびフルオレン 部分を表わす剛性の環状配置に近いが、重要である。これらはジアステレオマー の成功的分割を受け易いキラル試薬を設計する一般規則ではないことを指摘して おく必要がある。したがって、予言を行うことは不可能なので、光学分割はなお 試行錯誤的実験に基づいている。しかし、驚くことに、クロロギ酸９−フルオレ ニル−１−エチル試薬（ＦＬＥＣ）は多くのアミンと反応して逆相ＬＣカラムで 分割可能なジアステレオマーを生成する。さらにクロロギ酸（＋）　−１−（９ −フルオレニル）エチルは、主として存在するし一形の前に分離される希に存在 するＤ−アミノ酸のジアステレオマーを与え、理想的に微量定量である。

新試薬の性質はアキラルＰＭＯＣ試薬に匹敵して維持された。最後に複雑な混合 物中の光学活性アミノ含有化合物の測定およびアミンの分取分割に著しく実際的 で有用な新規試薬を記載する。

ＦＬＥＣとアミノ酸との反応は第１図に示したように進む。この試薬はまた水と 反応し、加水分解生成物として相当するアルコールを生成する。

クロロギ酸（＋）　−１−、（９−フルオレニル）エチレル（ＦＬＥＣ）の合成 １−（９−フルオレニル）エタノールの合成：乾燥エーテル１００ｍ１中のフル オレン８．３ｇの溶液に、ＢｕＬｌ　（ヘキサン中１．６Ｍ）　３１ｍ１を添加 した。混合物を３０゛分環流し、ついで水浴で冷した。生成混合物に、乾燥エー テル４０ｍ１中のアセトアルデヒド”２　、８　ｍｌの溶液を１５分で加え、１ 時間環流した。水１００　ｍｌを加え、ニーチル層を分液濾斗で集め、乾燥（Ｍ ｇＳ０４）し、蒸発させた。生成物をフラッシュクロマトグラフィでさらに精製 し、リグロイン（沸点８０〜１１０℃）で再結晶し、白色針状晶を得た。融点１ ０１〜１０３℃。質量スぺ■ クトルＭ　ｉ／ｅ２１０．１５　ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩｌａ）　。

０．８７　（二重線、　３　Ｈ）　、　１．７０（−重線、ＬＭ）。

４．０９　（二重線、Ｉ　Ｈ）　、　４．３５〜４．６５　（多重線、ＩＨ）。

７．１５〜７．８５　（多重線、８Ｈ）。

■−（９−フルオレニル）エタノールの光学分割無水ピリジン２５ｍ１中の１− （９−フルオレニル）エタノール４６０ｇの溶液に、（−）−カンファン酸塩化 物の等モル量４．１２ｇを添加し、混合物を室温で３時間かきまぜた。溶液を氷 水にあけ、ＣＨ２０ｇ２で抽出した。ＣＨＣＬ）２層を希塩酸で洗い乾燥（Ｍｇ Ｓ０４）し、蒸発乾固した。粗エステルをメタノール（Ｈｅ’１ｌ）２００　ｍ ｌに溶し、−１５℃に冷した。析出結晶（画分Ａ）を同一溶媒から２回結晶化し 、溶解性の小さいジアステレオマーエステル１．０ｇを純粋形で得た（融点１５ ９〜１６０℃）、（ラセミ化合物の融点１５２℃）。このジアステレオマーエス テルの光学純度はキラル固定相［アミノプロピルシリカに結合した（−）−ジニ トロベンゾイルフェニルグリシン、バークル相コで検査し、９９％であった。

上記エステルの加水分解 乾燥エーテル５０ｍ１中の光学的に純粋なジアステレオマーエステル１．０ｇの 溶液に、Ｌ　ｉＡ　４７　Ｈ４，０−８ｇを加えた。混合物を室温で１時間かき まぜ、後処理後アルコールを得た。融点９１〜９３℃分解）。

クロロギ酸（＋）−１−（９−フルオレニル）エチル０℃に冷した乾燥トルエン １５ｍ１中のホスゲン（０，８ｇ、８．１　ＩＩｌｍｏｉ）　）の溶液に、乾燥 トルエン２０ｍ１中の光学的に純粋なアルコール（０，４４ｇ、２．１　ｍｍｏ Ω）とトリエチルアミン（０，３０ｍ１．２．１　ｍｍｏΩ）の溶液を滴下した 。添加完了後、０℃で２時間攪拌を続け、次いでトリエチルアミン塩酸塩を濾過 で除き、濾液を減圧で濃縮し、油を得た。

［α］　−＋６７．９”　（ＣＨ（ｌ　Ｃ−１）２２゜ ［α］　２５−＋７０．５°　（ＣＨＣｆ　Ｃ−１）２２゜ ’ＨＮＭＲＣＣＤＣＲｓ　）：０．７１１ｉ（二重線、３Ｈ）、４．３０　（二 重線、Ｉ　Ｈ）　、５．４７〜５．７５　（多重線、ＩＨ）７．１８〜７．７５ 　（多重線、８Ｈ）分析　ＣｔａＨｔａｏ　２　Ｃｉ）として計算値：　Ｃ，７ ０，４６゜Ｈ，４，８０７ＣＬ２　Ｓ　１３．００実測値：　Ｃ，７０，６４： 　Ｈ，４，８０；　ＣＬ７　、１３．３実験条件 溶剤と試薬ニ アセトニトリル、テトラヒドロフランおよびアセトンはラスバーン（ウォーカー バーン、英）から購入した。アミノ酸標準およびＰＭＯＣ−ＣＮ試薬はシグマ（ セント・ルイス、ミズーリ州、米）から得た。溶出緩衝液は２倍量の蒸溜水に溶 かした酢酸からつくり（３ｍｌ／ｇ）、水酸化ナトリウムで適当なｐＨに滴定し た。

ＦＬＥＣ−Ｃｉ）試薬はアセトニトリル：アセトン（１：３）に溶かし、１５ｍ 　ｍｏｎ　／Ｒの濃度であった。反応緩衝液はホウ酸（ＩＭ）から作り、ｐＨを 水酸化ナトリウムで調節した。

誘導体形成： 試料（０，４ｍｌと緩衝液（０，１ｍｌ、、ｐＨ）を３　ｍｌの反応ガラスびん で混合する。試薬（０，５ｍ１）を加え、反応させる。１分後ガラス瓶をペンタ ンでほとんど充たし、反応混合物を抽出し過剰の試薬を除く。抽出を２回くり返 すと、水相は注入にすぐ使える。

反応速度ニ アミノ酸とＰＬＥＣ−ＣｆＩ試薬との反応速度を第２図に示し、これはｐＨ８， ０３（試料プラス緩衝液）で試薬により常法でアミノ酸の誘導体形成（一度に一 つ）により測定した。ある時間間隔後、酢酸を添加して反応を止めペンタン抽出 によりＦＬＥＣ−Ｃ！ｌ試薬の過剰を除いた。

未反応で残った量は、０−フタルアルデヒド／メルカプトエタノールでカラム前 誘導体形成、ついで液体クロマトグラフィーにより測定した。結果を、同一方法 だがＦＬＥＣ−Ｃ１ｌ試薬なしに（アミノ酸の最初の量）処理した溶液と比較し 、それからＰＬＥＣ−誘導体への転化率が計算された。各点は２回の測定の平均 である。

アスパラギン酸およびグルタミン酸の反応速度に対するＰＨの影響を第３図に示 し、１分の反応時間で上記と同一方法で実施した。ｐ）Ｉ　８．０１．８．４Ｂ 、　９．０１．９．４７および１０．２３で測定した。Ｉ）Ｈは緩衝液添加後の 反応溶液で測定した。

ＰＬＥＣ−ＣＮ　オよびＰＭＯＣ−ＩＪＩ試薬とバリン、グルタミン酸、プロリ ン、リジンとの相対反応速度は、標準アミノ酸溶液を試薬の各々で誘導体に変え たとき得られた収率と、混合ＦＬＥＣ／　ＦＭＯＣ試薬を使ったときの結果とを 比較することによ、り決定した。誘導体をクロマトグラフィーで分離し、ピーク 面積を比較した。

第４図に、逆相液体クロマトグラフィーで行なった螢光標識ジアステレオマーカ ルバミン酸塩としての１７種のアミン酸の分割を示す。

実験条件： ＦＬＥＣ−ＣＤ試薬をアセトニトリル／アセトン（１／４）、１５ｍ　Ｍに溶か す。反応緩衝液はホウ酸塩緩衝液、ＬＭ。

ｐｌ！　６．５である。

試料０．４ｍｌとホウ酸塩緩衝液０　、１　ｍｌを混合する。この溶液に試薬０ ．５ｍｌを加える。１分の反応時間後、混合物をペンタンで３回抽出する。ペン タン抽出物を捨て、水相は注入にすぐ使える。酸基をもたない比較的疎水性アミ ンの誘導体形成のときは、抽出工程をはふき、親水性アミン、典型的にはヒドロ キシプロリンまたはヒドラジンとの反応により過剰の試薬を除去する。

第　１　表 分離条件（アミノ酸）： カラム：スフェリソルブオクチル剤（ｄ−３μｍ）を充てんした　１５０　Ｘ　 ４．８■。溶出緩衝液：酢酸３プロミル（ｐｒｏｍｌｌｌｅ）、ｐＨ４，３５゜ 流速：　０．３ｍｌ／分。

下記第２表に、幾つかのアミノ含有薬剤のに′−値、分割係数α値を示す。

第　２　表 カラム：スフエリソルブ■オクチル材（ｄ−５μｍ）を充填した２５０Ｘ４．６ 　ＩＩｍ、流速：４．２　ｍｌ／ｌ溶分条件：（１）アセトニトリル６０％、水 ４０％（２）アセトニトリル５０％、水５０％（３）テトラヒドロフラン５５％ 、水４５％第５図に、ラセミＦＬＥＣ−Ｃρ試薬で誘導体形成したメトプロロー ル、心臓選択的β−アドレナリン受容体遮断薬（β遮断薬）のラセミ溶液の分割 を示す。

カラム＝　５μｍのオクチル材（スフェリソルブ）を充填した４、６Ｘ　２５０ ＋ｎｍ、溶離剤ニアセトニトリル６０％、水４０％。

アミノ酸標準の光学純度、試薬の光学純度、および誘導体形成のラセミ化の複合 効果を決定するために、市販の「光学的に純粋な」Ｌ−グルタミンの誘導体形成 と分割を第６図に示す。ＰＬＥＣ−Ｃ４）で誘導体形成したし一グルタミン（ｌ ａｍｏｉ！　／Ｄ　）。少量のＤ−グルタミン（２μ＠ｏｌ）／Ｎ）の標準添加 により測定し、Ｄ−グルタミンピークはＬ−グルタミンの０．６ブロミルにあた る。

下記第３表に、逆相カラムで分離したふつうのペプチドアミノ酸のに′および分 割係数α値を示す。

第　３　表 溶離剤組成： Ｊ　Ｔ）ＩＦ３５％、酢酸６５％緩衝液（３％、ｐＨ４，３５）。

ｎ　ＴＨＦ４０％、酢酸６０％緩衝液（〃）。

１１１ＴＨＰ４５％、酢酸５５％緩衝液（３％、ｐＨ４，３５）カラム：　５μ ｍオクチル材（スフエリソルブ）を充てんした４、６Ｘ　２５０＋＋ｓ。

上記のように、過剰の試薬を種々の方法により除去できる。アミンの分離のとき 使うのが好ましい１方法は、測定しようとする化合物と分離中緩衝しない生成物 を生じるアミンと過剰の試薬とを反応させることである。アミンおよび誘導体は 水溶性であるべきである。

このようなアミンの例はヒドロキシプロリンおよびヒドラジンである。

親水性アミノ誘導体を形成するアミノ酸またはアミノ糖を分離するとき使うのが 好ましい別の方法は、低極性の溶剤、たとえばペンタンまたはへキサンで過剰の 試薬を抽出することである。

本発明による試薬はアミノ含有ラセミ混合物の分取分割にも応用できる。ＨＰＬ Ｃにより誘導体を分離後、常法たとえば酸または塩基性加水分解または水素化分 解によりアミノ含有化合物を再生する。

下記第４表に、現在のカラム前誘導体形成剤とＰＬＥＣ−Ｃｇの比較をし、ＰＬ ＥＣ−Ｃ試薬の優れていることを例示する。

第４表 クロロギ酸１−（９−フルオレニル）エチルが例として記載した唯一の試薬であ るが、同様に使用できる多数の構造類似体がある。請求の範囲第１項の一般式の Ｒとしてのメチルをトリフルオロメチルまたは一層高級のアルキル基で置き代え ることができた。塩素Ｘの代りに、ＦＭＯＣ−試薬で試験し、良好な脱離基であ ることがわかった臭素、アジド基、またはスクシンイミジル基を用いることも可 能であった。

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Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．次の一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘはハロゲン、アジド基、またはスクシンイミジル基で、Ｒはアルキル 基またはトリフルオロメチル基である）を有する光学活性試薬を、アミノ官能基 をもつ化合物を含む試料に、当該化合物のアミノ官能基を誘導体に変え、ジアス テレオマーカルバミン酸塩誘導体を形成するように添加し、ついで当該誘導体を 分離し測定することを特徴とする、水性または非水性試料中のアミノ官能基をも つ化合物の分割および測定法。
2. ２．Ｒがメチル基であることを特徴とする請求の範囲第１項の方法。
3. ３．Ｘが塩素である請求の範囲第１項または第２項の方法
4. ４．誘導体の分離および測定中妨害しない生成物を生じるアミンと過剰の試薬と を反応させることを特徴とする請求の範囲第１項の方法。
5. ５．たとえぱアミノ糖またはアミノ酸のように親水性アミノ誘導体が形成される 場合、過剰の試薬を低極性の溶剤、たとえはペンタンまたはヘキサンで抽出し除 くことを特徴とする請求の範囲第１項の方法。
6. ６．分離および測定後、アミノ官能基をもつ化合物を再生することを特徴とする 請求の範囲第１項の方法。
7. ７．次の一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘはハロゲン、アジド基、またはスクシンイミジル基で、Ｒはアルキル 基またはトリフルオロメチル基である）を有する化合物。
8. ８．Ｘが塩素であることを特徴とする請求の範囲第７項の化合物。
9. ９．Ｒがメチル基であることを特徴とする請求の範囲第７項または第８項の化合 物。