DK174265B1 - Optisk aktivt 9-fluorenylalkylhalogenformiatreagens og fremgangsmåde til bestemmelse af eanatiomere aminforbindelser - Google Patents

Description

i DK 174265 B1

Den foreliggende opfindelse angår en forbedring vedrørende adskillelse og påvisning af enantiomerer ved hjalp af et chiralt reagens og højtydende vaskekromatografi (HPLC). Mere specielt angår den et optisk aktivt 9-fluorenylalkylhalogenformiat, der danner 6 stabile diastereomere carbamater med primåre og sekundåre aminer på kvantitativ måde. Dette produkt kan påvises ved fluori-metri eller ved absorptiometri efter adskillelse på HPLC-søj-le.

Adskillelsen af optisk aktive aminoholdige stoffer er af stor betydning for biologisk forskning og farmaceutisk kemi. Disse stoffer er almindelige i farmaceutiske produkter, og mange af dem er enantiomerer, der forekommer som racemiske blandinger.

I mange tilfælde tilskrives den biologiske aktivitet af disse jg enantiomerer konformationen af en speciel optisk aktiv antipode. Det er derfor meget vigtigt at kunne skelne mellem og opspalte de enantiomere.

Til kvantitative formål anvendes kromatografiske metoder, fordi de frembyder mange fordele, såsom lille prøvestørrelse, 20 simpel forbehandling og høj påvisningsfølsomhed.

Siden den første kromatografiske adskillelse af optisk aktive isomerer i 1951 ved papirkromatografiteknik er der blevet indført et stort antal sådanne metoder, og de er for nylig blevet 25 omtalt i bøger (R.W. Souter, "Chromatographic Separation of Stereoisomers", CRC Press, Boca Raton, 1985 og J. Jacques, A. Collet, S.H. Wilen, "Enantiomers, Racemates and Resolutions", John Wiley & Sons, New York, 1981).

30 Opspaltningen af enantiomerer kraver indgriben af et chiralt middel. Kromatografiske opspaltningsmetoder er blevet udviklet i to hovedretningers 1. Direkte opspaltning af enantiomerer i søjler med enten en chiral stationær fase {CSP) eller en chiral komponent i 35 den mobile fase.

2. Indirekte opspaltning af dannede diastereomerer efter de-rivatisering med et chiralt reagens.

2 DK 174265 B1

Den vaskekromatografiske direkte adskillelse af enantiomerer på chirale stationære faser har fået en hel del opmærksomhed, og i dag findes der nogle industrielt tilgængelige chirale søjler. Bestræbelserne har været fokuseret på at gøre en chi-5 ral stationær fase i stand til at adskille så mange forskellige typer chirale stoffer som muligt. Der er stadig meget få aminer og aminosyrer, som er blevet direkte opspaltet på chirale søjler af nogen type uden forudgående derivatisering.

Tamegai m.fl., J. Liq. Chromatography, 1979, 2, 1229 har givet en oversigt over fremgangsmåder baseret på indirekte opspaltning af enantiomere ved derivatisering med et chiralt reagens til dannelse af diastereomerer, som opspaltes på sædvanlige søjler. Furukawa m.fl., Chem. Pharm. Bull. 1975, 23, 1623 var de første, der adskilte enantiomere aminosyrer under anvendel-1 δ se af let tilgængeligt (+)-10-camphorsulfonylchlorid som chiralt reagens. Carbonyl resten blev så omdannet i et andet trin til p-nitrobenzylesteren, hvilket resulterede i derivater, der er følsomme for UV-påvisning.

20

De mest almindelige chirale reagenser til selektiv derivatisering af aminfunktionen er de, der er baseret på isothiocyanat, som giver UV-følsomme thiourinstofderivater med primære eller sekundære aminer. Reaktionen udføres under svagt basiske betingelser i ca. 20 minutter ved stuetemperatur uden dannelse 25 af biprodukter.

Det mest vellykkede reagens af denne art er 2,3,4,6-tetra-o-acetyl-p-d-gluco-pyranosylisothiocyanat (GITC) anvendt til både aminosyrer og aminer. Oe fremkomne thiourinstofderivater 30 af de fleste proteinaminosyrer blev opspaltet på en sædvanlig omvendt fasesøjle i løbet af 2 timer. Den opnåede opspaltning skyldes fortrinsvis den lipofile karakter af sukkerresten i kombination med konformationsstivhed.

35 Fluorescerende chirale derivatiseringsreagenser til aminohol-dige forbindelser er sjældne, og kun reagenser baseret på o-phthalaldehyd kombineret med chirale thioler (OPA) har været nævnt, JP 60 38.652 (85 38.652). De forskellige chirale thiol- 3 DK 174265 B1 forbindelser, der har været anvendt, er N-acetyl-L-cystein og BOC-L-cystein, og disse giver diastereomere isoindoler med primåre am inogrupper. Reaktionen er selektiv og afsluttes i løbet af 1 minut ved stuetemperatur direkte i en pufret S vandblanding uden racemisering. De dannede diastereomerer er imidlertid ikke stabile.

Nogle væsentlige og ønskelige betingelser, som et sådant reagens skal opfylde er følgende.

10 * Det skal v*re optisk rent * Det skal indeholde en chromopho'r eller fluorophor * Reaktionsbetingelserne skal være milde, idet risikoen for potentiel racemisering ellers vil forøges.

* Reagenset skal reagere med primære og sekundære aminogrup- 15 per.

* De fremkomne diastereomerer skal være stabile.

* De fremkomne diastereomerer skal adskilles på sædvanlige HPLC-søjler.

* Fremgangsmåden skal være anvendelig i præparativ skala.

20 * Fremgangsmåden skal kunne automatiseres.

Der er imidlertid ingen steder blevet beskrevet eller foreslået et chiralt reagens kombineret med en fremgangsmåde, der effektivt der ivatiserer, påviser og adskiller racemiske blandin-25 ger af forbindelser indeholdende primær og sekundær amino.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe et chiralt reagens og en fremgangsmåde til indirekte opspaltning af primære og sekundære aminholdige forbindelser på sæd-30 vanlige omvendt fase-HPLC-søjler. Reagenset skal give fluorescerende derivater, som er stabile og påviselige ved fluorime-tri eller absorptiometri efter adskillelse ved væskekromatografi. Et stabilt derivat letter kvantificering og automatisering. Endvidere skal reaktionen ske hurtigt under milde betin-35 gelser i vandig fase og uden racemisering.

Dette er blevet opnået ved derivatisering af aminfunktionen af disse forbindelser ved tilsætning af et optisk aktivt reagens med formlen 4 DK 174265 B1

ft O

I J

h cm- o- c - x I

0¾ 5 hvor X er halogen, en azidgruppe eller en succinimidylgrup-pe, og hvor R er en alkylgruppe eller en trif1uormethylgruppe, til dannelse af diastereomere carbamater, son bestemmes på i og for sig kendte måder, f.eks. fluorimetri eller absorptiome-tri efter adskillelse ved væskekromatografi.

10

Reagenset udfører: 1. Bestemmelse af optisk renhed i opspaltede aminer og aminosyrer.

15 2. Bestemmelse af forskellige mængder af enantiomere amino-holdige forbindelser i biologiske systemer.

3. Præparativ opspaltning af aminoholdige racemiske blandinger.

20

Opfindelsen er nærmere anskueliggjort på tegningen, hvor fig. 1 viser et reagens og reaktionsskema, fig. 2 er en kurve, der viser reaktionshastigheder og udbytter 25 til dannelse af fluorescerende diastereomere carbamater af forskellige aminosyrer, fig. 3 er en kurve, der viser reaktionsudbytter, som funktion af pH-værdien for asparaginsyre og glutaminsyre, 30 fig. 4 er et kromatogram, der viser opspaltningen af 17 aminosyrer som fluorescerende mærkede diastereomere carbamater udført med omvendt fasevæskekromatografi, fig. 5 er et kromatogram, der viser opspaltningen af raeemisk 35 „ , , metoprolol, fig. $ er et kromatogram, der viser derivatisering og opspaltning af industrielt tilgængelig "optisk rent" L-gluta-min.

i 5 DK 174265 B1

Opfindelsen er baseret på den hurtige reaktion af chlorformia-ter med forskellige aminer til dannelse af stabile carbamater under Shcotten-Baumann-betingelser. Reaktionen udføres i et trin i løbet af sekunder ved stuetemperatur. Inden for et vist 5 pH-interval er reaktionen selektiv til aminofunktioner, og det eneste dannede biprodukt er den tilsvarende alkohol. Reagensoverskuddet er let at håndtere, og derved udelukkes indgreb i det følgende adskillelsestrin.

9-fluorenylmethylchlorformiatreagenset (FMOC) er fluorescerende med stimuleringsemissionsbølgelængder 270/315 mm. De dannede produkter påvises derfor selektivt ved denne bølgelængde-koabination. Denne egenskab sammen med den selektive reaktion fører til, at meget komplekse blandinger, f.eks. legemsvasker kan håndteres uden nogen oprensning eller forbehandlingsprocedure.

Med opfindelsen er der syntetiseret optisk aktive reagenser, der kan anvendes på samme nåde som det achirale FMOC-reagens med dets mange fordele til dannelse af diastereomerer med race- 20 rniske aminoholdige forbindelser. De diastereomere kan opspaltes på et sædvanligt adskillelsessystem typisk omvendt fase-HPLC, som er det mest almindelige og effektive LC-adskil-lelsessystem til sporanalyse og præparativ adskillelse. At gøre reagenset optisk aktivt er sandelig ikke en garanti for at 25 opnå opspaltelige diastereomerer. Indføringen af et asymmetrisk carbonatom må ske i en sådan stilling, at reagensegenskaberne bevares.

Opfindelsen var at skabe chiralitet af FMOC-reagenset ved at 30 indføre et asymmetrisk carbonatom i 9-fluorenyl-l-sti11 ingen.

Denne type forbindelse er ikke før blevet beskrevet i litteraturen. Denne stilling er strategisk, fordi den er tæt ved den dannede amidfunktion og ved det. stive cykliske arrangement, som repræsenterer fluorenmolekyldelen. Det skal påpeges, at 35 disse stadig ikke er almene regler til udformning af chirale reagenser, der egner sig til vellykket opspaltning af diastereomerer. Det er derfor ikke muligt at forudsige noget. Optisk opspaltning er således baseret på at prøve sig frem ved for- 6 DK 174265 B1 søg. Overraskende giver 9-f1uoreny1-1-ethyl formi at reagenset (FLEC) imidlertid diastereomerer med de fleste aminer, som kan opspaltes på omvendt fase LC-søjler. Endvidere gav (+)-1-(9-f1uoreny1)-ethylch1 orform iatet diastereomerer af de sjældne D-S aminosyrer, som blev fraskilt før hoved L-formen, ideelt er sjældne bestemmelser. Egenskaberne af det nye reagens blev opretholdt sammenlignet med achiralt FMOC-reagens. Sammenfattende beskrives et nyt reagens, som er meget praktisk og nyttigt til bestemmelse af optisk aktive aminoholdige forbin-10 delser i komplekse blandinger og til præparativ opspaltning af aminer.

Reaktionen af FLEC med aminosyrer forløber som vist på fig. 1.

Reagenset reagerer også med vand til dannelse af den tilsva- jg rende alkohol som et hydrolyseprodukt.

Syntese af (+1-1-(9-f1uorenvl)ethvlchlorformiat (FLEC)

Syntese af 1-(8-f1uorenvl1 ethanol s Til en opløsning af 3,8 g fluoren i 100 ml tør ether blev sat 31 ml BuLi (1,6 M i he-20 xan). Blandingen blev opvarmet under tilbagesvaling i 30 minutter og derefter afkølet i et isbad. Til den fremkomne blanding blev i løbet af 15 minutter sat en opløsning af 2,8 ml acetaldehyd i 40 ml tør ether, og derefter blev der tilbage-svalet i 1 time. 100 al vand blev tilsat, og etherlaget blev 25 opsamlet i en skilletragt, tørret (MgS04) og inddampet. Produktet blev yderligere renset ved lynkromatografi og oakrys-talliseret af ligroin (kogepunkt 80-110°C) til dannelse af hvide nåle, smp. 101-103*C, massespektrum M+m/e 210,15, ^HMR (C0C13) , 0,87 (d, 3H) , 1,70 (S, IH), 4,09 (d,lH), 4,35-4,65 30 (m, IH), 7,15-7,85 (m, 8H).

Optisk spaltning af 1-(9-fluorenvllethanol; Til en opløsning af 4,0 g l-(9-fluorenyl) ethano 1 i 25 ml vandfri pyridin blev sat en ækvimolær mængde (-)-camphansyrechlorid (4,12 g), og blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 3 timer. Opløsningen blev hældt i isvand og ekstraheret med CH2C12· CH2Cl2”la-get blev vasket med fortyndet saltsyre, tørret (MgSOj) og inddampet til tørhed. Oen rå ester blev opløst i 200 ml MeOH og 7 DK 174265 B1 afkølet til -15eC. Aflejrede krystaller (fraktion A) blev krysta 11 i seret to gange af samme opløsningsmiddel og gav 1,0 g af den mindre opløselige diastereomere ester i ren form (smp. 159-160eC), (racematsmp. 152*C). Den optiske renhed af den 5 diastereomere ester blev kontrolleret på en chiral stationer fase ((-)-dinitrobenzoylphenylglycin koblet med aminopropylsi-1iciumdioxid, Pirkle's fase), og den var 99%.

Hydrolyse af esteren; Til en opløsning af den optisk rene 10 diastereomere ester (1,0 g) i 50 ml tør ether blev der sat 0,8 g LiAlH4. Blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 1 time og gav alkoholen efter oparbejdning, smp. 91-93*C under dekomponer ing .

( +1-1-(9-fluorenvi lethvlchlorformiat-. Til en opløsning af 15 phosgen (0,8, 8,1 mmol) i 15 ml tør toluen afkølet til 0*C blev dråbevis sat en opløsning af optisk ren alkohol (0,44 g, 2,1 mmol) og triethylamin (0,30 ml, 2,1 mmol) i 20 ml tørt toluen. Efter endt tilsætning blev omrøringen fortsat i 2 timer ved 0eC, og triethylaminhydrochloridet blev så fjernet ved 20 filtrering, og filtratet blev koncentreret ved reduceret tryk til dannelse af en olie.

[o]25 = +67,9* (CH2C12, C*l) [a]25 * +70,5* (CH2C12, C*l) S78 25

Ih NMR (CDC13) : 0,76 (d, 3H), 4,30 (d, IH)*, 5,47-5,75 (m, IH), 7,18-7,75 («, 8H)

Analyse beregnet for Ci6Hi302c1; c* 70,46; H, 4,80; Cl, 13,00 3Q Fundet; C, 70,64; H, 4,80; Cl, 13,13

Forsøgsbetingelser

Opløsningsmidler og reagenser: ·Acetonitri1, tetrahydrofuran og acetone blev købt fra Rathburn (Walkerburn, U.K.). Amino-35 syrestandarderne og FM0C-C1-reagenset blev fremskaffet fra Sigma (St. Louis, HO, USA). El ut ionsstødpuden blev fremstillet af eddikesyre i dobbeltdesti lieret vand (3 ml per liter) titreret til den ønskede pH-vatrdi med natriumhydroxid. FLEC-C1- 8 DK 174265 B1 reagenset blev opløst i acetonitri 1:acetone (1:3) og havde en koncentration på 15 mmol/l. Reaktionsstødpuden blev fremstillet af borsyre (1M), og pH-værdien blev indstillet med natriumhydroxid .

5

Derivatisering; Prøve (0,4 ml) og stødpude (0,1 ml) blandes i en 3 ml reaktionsflaske. Reagenset (0,5 ml) tilsættes og får lov at reagere. Efter 1 minut er flasken næsten fyldt med pen-tan, og reaktionsblandingen ekstraheres for at fjerne overskud jg af reagens. Ekstraktionen gentages to gange, og derefter er den vandige fase parat til injektion.

Reaktionshastighed: Hastigheden af reaktionen af aminosyrerne med PLEC-Cl-reagenset er vist på fig. 2 og blev bestemt ved derivatisering af aminosyrerne (en af gangen) på sædvanlig må-15 de med reagenset ved pH 8,03 (prøve plus stødpude). Efter en vis tid blev reaktionen standset ved tilsætning af eddikesyre, og overskuddet af FLEC-C1-reagenset blev fjernet ved pentan-ekstraktioner. Den mængde, som forblev ureageret, blev bestemt ved præsøjlederivatisering med o-phtalaldehyd/mercaptoethanol 20 efterfulgt af væskekromatografi, Resultaterne blev sammenlignet med en opløsning behandlet på samme måde, men uden FLEC-Cl-reagenset (oprindelig mængde aminosyre), hvoraf omdannelsen til FLEC-deri vat kunne beregnes. Hvert punkt er et gennemsnit af to målinger.

25

Virkningen af pH-værdi på reaktionshastighederne af asparagin-syre og glutaminsyre er vist på fig. 3 og blev udført på samme måde som beskrevet ovenfor med en reaktionstid på 1 minut. Målinger blev foretaget ved pH 8,01, 8,46, 9,01, 9,47 og 10,23.

30 pH-værdien blev målt i reaktionsopløsningen efter tilsætning af stødpuden.

De reaktive reaktionshastigheder af FLEC-C1- og FM0C-Cl-rea-genserne med valin, glutaminsyre, prolin og lysin blev bestemt 3g ved sammenligning af udbyttet, der blev opnået, når en standard aminosyreopløsning blev derivati seret med hver af reagenserne, med resultaterne, når der blev anvendt et blandet FLEC/FM0C-reagens. Derivaterne blev adskilt ved kromatografi og topområderne sammenlignet.

9 DK 174265 B1 På fig· 4 er vist opspaltningen af 17 aminosyrer, som fluorescerende mærkede diastereomere carbamater udført ved omvendt fasevæskekromatografi.

Forsøgsbetingelserne var: 5 FLEC-Cl-reagenset opløses i acetonitri 1/acetone (1/4) is mmol. Reaktionsstødpuden er en boratstødpude, 1M, pH 6,5.

0,4 ml prøve og 0,1 ml boratstødpude blandes. Til denne opløs-10 ning sattes 0,5 ml af reagenset. Efter 1 minuts reaktionstid ekstraheres blandingen 3 gange med pentan. Pentanekstrakterne kasseres, og den vandige fase er parat til injektion. Når der derivatiseres forholdsvis hydrofobe aminer, der ikke har en syregruppe, udelades ekstraktionstrinnet, og overskud af reals gens fjernes ved reaktion med en hydrofil amin, typisk hydro-xyprolin eller hydrazin.

Tabel I

Gradienteluering: Tid (min) %AcN %THF ^Stødpude 20 0 6 17 75 8 8 17 75 22 0 30 70 70 0 50 50 25 Adskillelsesbetingelser (aminosyrer): Søjle: 150 x 4,6 mm pakket med SpherisorboctylmateriaTe, d=3pm. Elutionsstødpude: eddikesyre 3 promille, pH 4,35.

Strømningshastighed: 0,3 ml/min.

jq I tabel II anføres k’-værdierne og opspaltningsfaktorerne og α-værdierne for nogle aminoholdige farmaceutika.

35 DK 174265 B1 10

Tabel II

Amin k'l k'2 a

Metoprolol 6,8 7,5 1,1 (1) 5 Tokainid 9,4 10 1,06 (2)

Norephedrin 5,03 5,28 1,05 (3) Søjle: 250 x 4,6 mm pakket med Spherisorb® octylmateriale, d=5pm. Strømningshastighed 1,2 ml per minut.

10

El ueringsbetingelser: (1) 60% ace.tonitril, 40% vand {2) 50% acetonitril, 50% vand {3) 55% THF (tetrahydrofuran), 45% vand På fig. 5 er vist opspaltningen af en racemisk opløsning af metoprolol, en kardi osel ekt i v ø-adrenoceptorantagonist (0-blokker), derivatiseret med et racemisk FLEC-C1-reagens. Søjle: 4,6 x 250 mm pakket med 5 pm octyl materiale (Spherisorb): Eluent: 60% acetonitril, 40% vand.

20 På fig. 6 er vist derivatiseringen og opspaltningen af industrielt tilgangelig "optisk rent" l-glutamin for at bestemme den kombinerede virkning af optisk renhed af aminosyrestandar-den, den optiske renhed af reagenset og racemiseringen af derivatet. L-glutamin (1 mmol/1) derivati seret med FLEC-C1. 0-25 glutamintoppen andrager 0,6 promille af L-glutaminet bestemt ved standard tilsætning af en ringe mængde D-glutamin (2 μηοΙ/1).

1 tabel III nedenfor er anført k' og opspaltningsfaktorerne 3q α-værdierne for de almindelige aminosyrer adskilt på omvendt fasesøjle.

35 11 DK 174265 B1

Tabel III

Aminosyre k’χ k'2 a

Asparagin 1,34 1,46 1,09 I

® Qlutamin 1,29 1,46 1,13

Serin 2,01 2,09 1,04

Asparaginsyre 2,37 2,54 1,07

Threonin 2,94 3,31 1,13

Glutaminsyre 3,26 3,69 1,13 10 Arginin 3,54 4,03 1,14

Alanin 5,63 ' 6,20 1,10

Prolin 5,51 5,51 1,00 -

Tyrosin 3,29 3,91 1,19 II

Methionin 3,57 4,29 1,20 15 Phenylalanin 4,83 6,09 1,26

Valin 5,00 5,91 1*18

Isoleucin 8,17 9,69 1,19

Leucin 8,46 10,20 1,21 .........

Histidin 3,37 4,77 1,42 III

20 om i thin 5,37 6,69 1,25

Lysin 7,23 8,37 1,16 - E1 uentsammensatn ing: 25 1 35% THF, 65% eddikesyrestødpude (3%, pH 4,35) II 40% THF, 60% - ·» - III 45% THF, 55% - " - Søjle: 4,6 x 250 mm pakket med 5 μπ» octylmateriale {Spheri- sorb).

30

Som vist ovenfor kan overskud af reagens fjernes ved forskellige metoder. En metode, der fortrinsvis anvendes, når der adskilles aminer, er at bringe overskud af reagens til at reagere med en amin, der giver et produkt, som ikke under adskil-35 leisen generer forbindelserne, der skal bestemmes. Både aminen og derivatet skal vmre vandopløselige. Eksempler på sådanne aminer er hydroxyprolin og hydrazin.

12 DK 174265 B1

En anden metode, der fortrinsvis anvendes, når der adskilles aminosyrer eller aminosukkerarter, der danner hydrofile amino-derivater, er at ekstrahere overskud af reagens med et opløsningsmiddel af lav polaritet, f.eks. pentan eller hexan.

5

Reagenset ifølge opfindelsen er også anvendeligt til præparativ opspaltning af aminoholdige racemiske blandinger. Efter adskillelse af derivaterne ved HPLC genvindes de aminoholdige forbindelser ved sædvanlige metoder, såsom sur eller basisk jø hydrolyse eller ved hydrogenolyse.

I tabel IV nedenfor er foretaget en sammenligning af kendte præsøjlederivatiseringsmidler og FLEC-C1, som illustrerer overlegenheden af FLEC-reagenset.

Is Tabel IV

PITC Oansyl FLEC 6ITC OPA Dabsvl

Primære og sekundære 20 aminoforbindelser Ja Ja Nej Ja

Automatiseret Ja Nej Ja Nej

Stabile derivater Ja Nej Nej Nej 25 MOQ 100-200 1-10 100-200 100-200 femtomol picomol femtomol femtomol

Større interferencer Nej Nej Nej 20 Selvom l-(9-fluorenylJethylchlorformiat er det eneste reagens, der er beskrevet i eksemplerne, er der en række strukturelle -analoge, der lige så godt kan anvendes. Methyl som R i den almene formel i krav 1 kunne erstattes med trifluormethyl eller en højere alkylgruppe. I stedet for chlor kunne X være brom, 35 en azidgruppe eller en succinimidylgruppe, der er blevet afprøvet til FMOC-reagenset og har vist sig at være gode bortgående grupper.

Claims (8)

1. Fremgangsmåde til enantiomerisk opspaltning, bestemmelse og eventuel genvinding af optisk aktive forbindelser, der har en aminofunktion i vandige og ikke-vandige prøver, 5 kendetegnet ved, at et optisk aktivt reagens med formlen: R o mJcm -o-c-x hvor X er halogen, en azidgruppe eller en succinimidylgruppe, og hvor R er en alkylgruppe eller en trifluormethylgruppe, sættes til prøven indeholdende de optisk aktive forbindelser for at derivatisere aminofunktionen af forbindelserne og danne diastereomere carbamat-10 derivater, som så adskilles, bestemmes og om ønsket genvindes.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at R er en methylgruppe.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at X er chlorid.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at overskud af reagens bringes til at reagere med en amin, der giver et produkt, som ikke generer under adskillelsen og 15 bestemmelsen af derivaterne.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at overskud af reagens ekstra-heres med et opløsningsmiddel med lav polaritet, f.eks. pentan eller hexan, når der dannes hydrofile aminoderivater, f.eks. aminosukkerarter og aminosyrer.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at forbindelserne, der har en 20 aminfunktion, genvindes efter adskillelse og bestemmelse. DK 174265 B1 7. 9-fluorenylalkylhalogenformiatforbindelser med formlen R o .1 !l M CH-O-C-X 0¾ hvor X er halogen, en azidgruppe eller en succinimidylgruppe, og hvor R er en alkylgruppe eller en trifluormethylgruppe.

8. Forbindelse ifølge krav 7, kendetegnet ved, at X er chlor.

9. Forbindelse ifølge krav 7 eller 8, kendetegnet ved, at R er en methylgruppe.