FI90410B - Optisesti aktiivinen reagenssi ja menetelmä enantiomeeristen primaaristen ja sekundaaristen amiinien määrittämiseksi HPLC:llä - Google Patents

Description

9041 0

Optisesti aktiivinen reagenssi ja menetelmä enantiomeeristen primaaristen ja sekundaaristen amiinien määrittämiseksi HPLC:llä Tämä keksintö koskee parannettua enantiomeerien erottamista ja ilmaisua kiraalisen reagenssin ja suurpainenestekromato-grafian (HPLC) avulla. Tarkemmin sanottuna se koskee optisesti aktiivista fluorenyylikloroformaattia, joka muodostaa kvantitatiivisella tavalla stabiileja diastereomeerisia kar-bamaatteja primaaristen ja sekundaaristen amiinien kanssa. Tämä tuote voidaan ilmaista fluorimetrisesti tai absorptio-metrisesti HPLC-pylväässä erottamisen jälkeen.

Optisesti aktiivisten aminopitoisten aineiden erottaminen on tärkeää biologisessa tutkimuksessa sekä farmaseuttisessa kemiassa. Nämä aineet ovat yleisiä farmaseuttisissa aineissa, ja monet niistä ovat enantiomeereja, jotka ovat raseemisina seoksina. Useissa tapauksissa näiden enantiomeerien biologisen aktiivisuuden syynä pidetään jonkin tietyn optisesti aktiivisen antipodin konformaatiota. Näin ollen enantiomeerien tunnistaminen tai erottaminen on hyvin tärkeää.

Kvantitatiiviseen tarkoitukseen on sopivaa käyttää kromatografisia menetelmiä, koska ne tarjoavat monia etuja, kuten pienen näytekoon, yksinkertaisen esikäsittelyn ja suuren il-maisuherkkyyden.

Siitä lähtien kun optisesti aktiivisia isomeerejä ensimmäisen kerran erotettiin kromatografisesti paperikromatografi-atekniikalla vuonna 1951, on hyvin monia tällaisia menetelmiä esitelty, ja niitä on myös äskettäin selostettu kirjallisuudessa (Souter, R. W. "Chromatographic Separation of Stereoisomers"; CRC Press, Boca Raton, 1985; ja Jacques, J.; Collet, A.; Wilen, S.H. "Enantiomers, Racemates and Resolutions"; John Wiley & Sons; New York, 1981).

2 90410

Enantiomeerien erotuksessa tarvitaan kiraalisen aineen käyttöä. Kromatografisten erotusmenetelmien kehityksessä on ollut kaksi pääsuuntausta: 1. Enantiomeerien suora erotus pylväissä joko kiraalisella stationaarisella faasilla (CSP) tai kiraalikomponentilla liikkuvassa faasissa.

2. Muodostuneiden diastereomeerien epäsuora erotus sen jälkeen kun ne on muunnettu johdannaisikseen kiraalisella rea-genssilla.

Enantiomeerien nestekromatografinen suora erotus kiraalisillä stationaarisilla faaseilla on saanut paljon huomiota osakseen, ja tällä hetkellä on saatavissa muutamia kaupallisia kiraalisia pylväitä. Yritykset ovat kohdistuneet sellaisen kiraalisen stationaarisen faasin aikaansaamiseen, jolla pystyttäisiin erottamaan niin monta erityyppistä kiraalista ainetta kuin mahdollista. Silti on vain hyvin harvoja amiineja ja aminohappoja, joita on suoraan erotettu minkään tyyppisellä kiraalisella pylväällä ilman edeltävää johdannaiseksi muuntamista.

Tamegai et ai. J. Liq. Chromatography, 1979, 2, 1229 ovat selostaneet menetelmiä, jotka perustuvat enantiomeerien epäsuoraan erotukseen muuntamalla ne kiraalisen reagenssin kanssa johdannaiseksi muodostamaan diastereomeereja, jotka erotetaan tavallisilla pylväillä. Furukava et ai. Chem. Pharm. Bull. 1975, 23, 1623 erottivat ensimmäisinä enantio-meerisia aminohappoja käyttäen helposti saatavaa (+)-10-kam-ferisulfonyylikloridia kiraalisena reagenssina. Karbonyyli-tähde muutettiin sitten toisessa vaiheessa p-nitrobentsyyli-esteriksi, jolloin saatiin UV-ilmaisulle herkkiä johdannaisia.

Yleisimmät kiraalisen reagenssit toiminnallisen amiinin selektiiviseen muuntamiseen johdannaiseksi perustuvat isotio- 3 90410 syanaattiin, jolla saadaan UV-herkkiä tioureajohdannaisia primaaristen ja sekundaaristen amiinien kanssa. Reaktio suoritetaan heikosti happamissa oloissa noin 20 minuutin ajan huoneenlämmössä ilman sivutuotteiden muodostumista.

Parhain tämäntyyppinen reagenssi on 2,3,4,6-tetra-o-asetyy- li-p-d-gluko-pyranosyyliisotiosyanaatti (GITC), jota käytetään sekä aminohapoilla että amiineille. Useimpien proteii-niaminohappojen saadut tioureajohdannaiset on erotettu tavallisella käänteisfaasipylväällä kahden tunnin sisällä. Saatu erottuminen johtuu ensi sijassa sokeritähteen lipofii-lisesta luonteesta yhdessä rakenteen jäykkyyden kanssa. Aminopitoisille yhdisteille tarkoitetut fluoresenssiset ki-raaliset muunnosreagenssit ovat harvinaisia, ja vain rea-gensseja, jotka perustuvat kiraalisiin tioleihin yhdistettyihin o-ftaalialdehydeihin (OPA), on selostettu, JP 60 38,652 (85 38,652). Erilaisia kiraalitioliyhdisteitä, joita on käytetty, ovat N-asetyyli-L-kysteiini, BOC-L-kysteiini, kaikkien näiden johtaessa diastereomeerisiin isoindoleihin primaaristen aminoryhmien kanssa. Reaktio on selektiivinen ja täydellinen minuutin sisällä huoneenlämmössä suoraan puskuroidussa vesiseoksessa ilman rasemisaatiota. Muodostuneet diastereomeerit eivät kuitenkaan ole stabiileja.

Seuraavassa on lueteltu eräitä olennaisia ja toivottavia ominaisuuksia, joita tällaisella reagenssilla tulisi olla.

* sen tulee olla optisesti puhdas * sen tulee sisältää kromoforin tai fluoroforin * reaktio-olojen tulisi olla heikkoja, muussa tapauksessa kasvaa vaara mahdollisesta rasemisaatiosta * syntyvien diastereomeerien tulisi olla stabiileja * syntyvien diastereomeerien tulisi erottua tavallisilla HPLC-pylväillä * menetelmää tulisi voida käyttää preparatiivisessa mittakaavassa * menetelmän tulisi soveltua automatisoitavaksi.

4 90410

Koskaan aikaisemmin ei kuitenkaan ole kuvattu tai ehdotettu kiraalista reagenssia, joka yhdistyisi menetelmään, jolla voidaan tehokkaasti muuntaa johdannaisiksi, ilmaista ja erottaa primaarisia ja sekundaarisia aminoryhmiä sisältävien yhdisteiden raseemisia seoksia.

Tämän keksinnön tarkoituksena on aikaansaada kiraalinen rea-genssi ja menetelmä primaarisia ja sekundaarisia aminoryhmiä sisältävien yhdisteiden epäsuoraa erotusta varten tavallisilla käänteisfaasi-HPLC-pylväillä. Reagenssilla tulisi saada fluoresoivia johdannaisia, jotka ovat stabiileja ja ilmaistavissa fluorometrisesti tai absorptiometrisesti sen jälkeen kun ne on erotettu nestekromatografisesti. Stabiili johdannainen helpottaa kvantitointia ja automatisointia. Lisäksi reaktion tulisi tapahtua nopeasti lievissä oloissa ve-sifaasissa ja ilman rasemisaatiota.

Tämä on aikaansaatu muuntamalla sanottujen yhdisteiden toiminnallinen aminoryhmä johdannaisekseen lisäämällä optisesti aktiivista reagenssia, jonka kaava on

R O

I M

H *CH - O - C -X

jossa X on halogeeni, atsidiryhmä tai sukkinimidyyliryhmä, ja jossa R on metyyliryhmä tai trifluorimetyyliryhmä, dia-stereomeeristen karbamaattien muodostamiseksi, jotka määritetään sinänsä tunnetuilla menetelmillä, esim. fluorimetri-sesti tai absorptiometrisesti, sen jälkeen kun ne on erotettu nestekromatografisesti.

Reagenssi suorittaa: 1. Optisen puhtauden määrityksen erotetuissa amiineissa ja aminohapoissa.

Il 5 90410 2. Biologisen systeemin enantiomeeristen aminopitoisten yhdisteiden eri määrien määrityksen.

3. Aminopitoisten raseemisten seosten preparatiivisen erotuksen .

Oheisissa piirustuksissa:

Kuva 1 esittää reagenssia ja reaktiokaavaa.

Kuvan 2 käyrät esittävät reaktionopeuksia ja saantoja muodostettaessa erilaisten aminohappojen fluoresoivia diaste-reomeerisia karbamaatteja,

Kuvan 3 käyrät esittävät reaktion saantoja pH:n funktiona asparagiinihapolle ja glutamiinihapolle,

Kuva 4 on kromatogrammi, joka esittää 17 aminohapon erotusta fluoresenssimerkattuina diastereomeerisina karbamatteina käänteisfaasinestekromatografisesti suoritettuna,

Kuva 5 on kromatogrammi, joka esittää raseemisen metoprolo-lin erotusta,

Kuva 6 on kromatogrammi, joka esittää kaupallisesti saatavan "optisesti puhtaan" L-glutamiinin muuntamista johdannaiseksi ja erotusta.

Keksintö perustuu kloroformaattien nopeaan reaktioon erilaisten amiinien kanssa stabiilien karbamaattien muodostamiseksi Schotten-Baumann-oloissa. Reaktio suoritetaan yhtenä vaiheena muutamassa sekunnissa huoneenlämmössä. Tietyllä pH-alueella reaktio on selektiivinen funktionaalisiin amino-ryhmiin nähden, ja ainoa muodostunut sivutuote on vastaava alkoholi. Reagenssiylimäärä on helppo käsitellä, ja siten vältytään häiriöiltä seuraavassa erotusvaiheessa.

6 90410 9—fluorenyy 1 imetyy 1 ikloroforxnaattireagenss i (FMOC) on fluoresoiva heräte-emissioaallonpituuksilla 270/315 mm. Muodostuneet tuotteet ilmaistaan siten selektiivisesti tällä aallon-pituusyhdistelmällä. Tämä ominaisuus yhdessä selektiivisen reaktion kanssa johtaa siihen, että hyvin moniaineisia seoksia, esim. kehonnesteitä, voidaan käsitellä ilman minkäänlaista puhdistusta tai esikäsittelymenettelyä.

Keksinnössä on tarkoitus syntetisoida optisesti aktiivinen reagenssi, jota voidaan käyttää samalla tavalla kuin akiraa-lista FMOC-reagenssia sen monine etuineen siten diastereo-meerien muodostamiseksi raseemisten aminopitoisten yhdisteiden kanssa. Diastereomeerit tulisi voida erottaa tavallisella erotussysteemillä, tyypillisesti käänteisfaasi-HPLC:llä, yleisimmällä ja tehokkaimmalla LC-erotussysteemillä hiven-määräanalyysia ja preparatiivista erotusta varten. Reagens-sin tekeminen optisesti aktiiviseksi ei tietystikään takaa erotettavien diastereomeerien saamista. Asymmetrisen hiiliatomin tuominen on tehtävä sellaiseen asemaan, että reagens-sin ominaisuudet säilyvät.

Keksinnön tarkoitus oli aikaansaada kiraalisuus FMOC-rea-genssille tuomalla asymmetrinen hiiliatomi 9-fluorenyyli-1-asemaan. Tämäntyyppistä yhdistettä ei kirjallisuudessa ole aikaisemmin kuvattu. Tämä asema on strateginen, koska se on lähellä sekä muodostettua toiminnallista amidia että fluo-reeniosuutta edustavaa jäykkää syklistä järjestelyä. On korostettava, että nämä eivät vieläkään ole mitään yleisiä sääntöjä kiraalisten reagenssien suunnittelemiseksi, joita voidaan soveltaa diastereomeerien onnistuneeseen erotukseen. Sen vuoksi tulosta ei voida ennustaa. Näin ollen optinen erotus perustuu yhä yrityksen ja erehdyksen menettelyyn. Yllättäen kuitenkin 9-fluorenyyli-l-etyylikloroformaattirea-genssi (FLEC) aikaansaa diastereomeereja useimpien amiinien kanssa, jotka ovat erotettavissa käänteisfaasi-LC-pylväillä. Lisäksi (+)-1-(9-fluorenyyli)etyylikloroformaatilla saatiin

II

7 90410 harvinaisten D-aminohappojen diastereomeereja, jotka erottuivat ennen L-päämuotoa ideaalisesti harvinaisissa määrityksissä. Uuden reagenssin ominaisuudet pysyivat muuttumattomina akiraaliseen FMOC-reagenssiin verrattuna. Näin ollen on kuvattu uusi reagenssi, joka on hyvin käytännöllinen ja käyttökelpoinen optisesti aktiivisten aminopitoisten yhdisteiden määrittämiseksi moniaineisista seoksista sekä amiinien preparatiivista erottamista varten.

FLEC:n reaktio aminohappojen kanssa kulkee kuvassa 1 esitetyllä tavalla. Reagenssi reagoi myös veden kanssa muodostaen vastaavan alkoholin hydrolyysituotteena.

f+1-1-f9-fluorenvvli)etvvlikloroformaatin (FLEC) synteesi 1-f9-fluorenvvli)etanolin synteesi; Liuokseen, jossa oli 8,3 g fluoreenia 100 mlrssa kuivaa eetteriä lisättiin 31 ml BuLi:a (1,6 M heksaanissa). Seosta refluksoitiin 30 minuutin ajan ja sitten jäähdytettiin jäähauteessa. Saatuun seokseen lisättiin liuos, jossa oli 2,8 ml asetaldehydiä 40 ml:ssa kuivaa eetteriä, 15 minuutin kuluessa ja refluksoitiin sitten 1 h. Lisättiin vettä (100 ml) ja eetterikerros kerättiin erotussuppiloon, kuivattiin (MgS04) ja haihdutettiin. Tuote puhdistettiin edelleen flash-kromatografisesti ja uudelleen-kiteytettiin ligroiinista (k.p. 80-ll0°C), jolloin saatiin valkoisia neulasia, s.p. 101-103°C; massaspektri M+m/e 210,15, 1H NMR(CDC13), 0,87(d, 3H) , 1,70 (S, 1H), 4,09 (d, 1H) , 4,35-4,65 (m, 1H), 7,15-7,85 (m, 8H) .

1-f9-fluorenvvli^etanolin optinen erotus: Liuokseen, jossa oli 4,0 g 1-(9-fluorenyyli)etanolia 25 ml:ssa vedetöntä py-ridiiniä, lisättiin ekvimolaarinen määrä (-)-kamfaanihappo-kloridia (4,12 g), ja seosta sekoitettiin huoneen lämmössä 3 h. Liuos kaadettiin jääveteen ja uutettiin CH2Cl2:lla. CH2Cl2-kerros pestiin laimealla suolahapolla, kuivattiin (MgS04) ja haihdutettiin kuivaksi. Raakaesteri liuotettiin 8 90410 200 ml:aan MeOH ja jäähdytettiin -15°C:seen. Saostuneet kiteet (fraktio A) kiteytettiin kahdesti samasta liuottimesta, jolloin saatiin 1,0 g vähemmän liukoista diastereomeerista esteriä puhtaassa muodossa (s.p. 159-160°C), (rasemalämp.

152°C). Diastereomeeriesterin optinen puhtaus tarkistettiin kiraalisella stationaarisella faasilla ((-)-dinitrobentso-yylifenyyliglysiini kytkettynä aminopropyylipiidioksidiin, Pirklen faasi), ja se oli 99%.

Esterin hvdrolvvsi: Optisesti puhtaan diastereomeeriesterin (1,0 g) liuokseen 50 ml:ssa kuivaa eetteriä lisättiin 0,8 g LiAlH4. Seosta sekoitettiin huoneenlämmössä 1 h, jolloin lopuksi saatiin alkoholi, s.p. 91-93° (haj.).

(+ 1-1-(9-fluorenvvli)etvvlikloroformaatti: 0°C:seen jäähdytettyyn fosgeenin (0,8, 8,1 mmol) liuokseen 15 ml:ssa kuivaa tolueenia lisättiin tiputtamalla liuos, jossa oli optisesti puhdasta alkoholia (0,44 g, 2,1 mmol) ja trietyyliamiinia (0,30 ml, 2,1 mmol) 20 ml:ssa kuivaa tolueenia. Kun lisäys oli suoritettu, sekoitusta jatkettiin 2 h 0°C:ssa. Trietyy-liamiinihydrokloridi poistettiin sitten suodattamalla ja suodos konsentroitiin alipaineessa, jolloin saatiin öljy.

[a]25 = +67,9° (CH2C12, C=l) [a]25 = +70,5° (CH2C12, C=l) 1H NMR (CDCI3): 0,76 (d, 3H), 4,30 (d, 1H), 5,47-5,75 (m, 1H), 7,18-7,85 (m, 8H).

Anal, laskett. C16H1302C1:lie: C, 70,46; H, 4,80; Cl, 13,00

Saatu: C, 70,64; H, 4,80; Cl, 13,13 9 90410

Koeolot

Liuottimet ja reagenssit: asetonitriili, tetrahydrofuraani ja asetoni ostettiin Rathburnilta (Walkerburn, U.K.)· Amino-happostandardit ja FMOC-Cl-reagenssi saatiin Sigmalta (St. Louis, MO, USA). Eluointipuskuri tehtiin etikkahaposta kak-soistislattuun veteen (3 mL/L) titrattuna sopivaan pH:hon natriumhydroksidilla. FLEC-Cl-reagenssi liuotettiin asetonitriili : asetoniin (1:3) ja sen konsentraatio oli 15 mmol/L. Reaktiopuskuri tehtiin boorihaposta (IM) ja sen pH säädettiin natriumhydroksidilla.

Muuntaminen johdannaisiksi: Näyte (0,4 mL) ja puskuri (0,1 mL, pH) sekoitetaan 3 ml:n reaktiopullossa. Lisätään rea-genssi (0,5 mL) ja annetaan reagoida. 1 minuutin jälkeen pullo täytetään lähes täyteen pentaanilla, ja reaktioseos uutetaan ylimääräisen reagenssin poistamiseksi. Uutto toistetaan kahdesti, minkä jälkeen vesifaasi on valmis ruiskutettavaksi.

Reaktionopeus; Aminohappojen reaktionopeus FLEC-Cl-reagens-sin kanssa on esitetty kuvassa 2, ja se määritettiin muuntamalla aminohappoja (yksi kerrallaan) johdannaisikseen tavallisella tavalla reagenssin kanssa pH 8,03:ssa (näyte + puskuri) . Tietyn aikavälin jälkeen reaktio pysäytettiin etikka-happoa lisäämällä, ja ylimääräinen FLEC-Cl-reagenssi poistettiin pentaaniuutoilla. Reagoimatta jäänyt määrä määritettiin muuntamalla ennen pylvästä johdannaisiksi o-ftaalialde-hydi/merkaptoetanolilla, mitä seurasi nestekromatografia. Tuloksia verrattiin liuokseen, joka oli käsitelty samalla tavalla mutta ilman FLEC-Cl-reagenssia (alkuperäinen määrä aminohappoa), mistä voitiin laskea muutos FLEC-johdannaiseksi. Kukin mittauspiste on kahden mittauksen keskiarvo.

Kuvassa 3 on esitetty pH:n vaikutus asparagiinihapon ja glu-tamiinihapon reaktionopeuksiin samalla tavalla mitattuna 10 90 41 0 kuin edellä 1 minuutin reaktioajalla. Mittaukset suoritettiin pH-arvoilla 8,01, 8,46, 9,01, 9,47 ja 10,23. pH mitattiin reaktioliuoksesta puskurilisäyksen jälkeen.

FLEC-Cl:n ja FMOC-Cl:n reaktiiviset reaktionopeudet valii-nin, glutamiinihapon, proliinin ja lysiinin kanssa määritettiin vertailemalla saantoa, joka saatiin kun standardiamino-happoliuos muunnettiin johdannaisiksi kullakin reagenssilla, tuloksiin, jotka saatiin kun käytettiin sekoitettua FLEC/ FMOC-reagenssia. Johdannaiset erotettiin kromatografisesti ja huippupinta-aloja verrattiin keskenään.

Kuvassa 4 on esitetty 17 aminohapon erotus fluoresenssimer-kattuina diastereomeerisia karbamaatteina käänteisfaasines-tekromatografisesti suoritettuna.

Koeolot olivat: FLEC-Cl-reagenssi liuotettuna asetonitriili/asetoniin (1/4, 15 mM). Reaktiopuskuri on boraattipuskuri, IM, pH 6,5.

Sekoitetaan 0,4 ml näytettä ja 0,1 ml boraattipuskuria. Tähän liuokseen lisätään 0,5 ml reagenssia. 1 minuutin reak-tioajan kuluttua seos uutetaan 3 kertaa pentaanilla. Pentaa-niuutteet poistetaan ja vesifaasi on valmis ruiskutettavaksi. Kun johdannaisiksi muunnetaan suhteellisen hydrofobisia amiineja, joissa ei ole hapanta ryhmää, uuttovaihe jätetään pois ja ylimääräinen reagenssi poistetaan reaktiolla hydro-fiilisen amiinin, tyypillisesti hydroksiproliinin tai hyd-ratsiinin, kanssa.

Il il 9041 0

Taulukko I

Eluointiaste: Aika (min) %AcN %THF %puskuri 0 8 17 75 8 8 17 75 22 O 30 70 70 0 50 50

Erotusolot (aminohapot): pylväs: 150 x 4,6 mm pakattu Spherisol oktyyli-materiaalil-la, d=3 /im.

Eluointipuskuri: etikkahappo 3 promillea, pH 4,35. Virtausnopeus: 0,3 ml/min.

Seuraavassa taulukossa II on esitetty k7-arvot ja erotusker-toimet, α-arvot eräille aminopitoisille farmaseuttisille aineille.

Taulukko II

Amiini k'l k'2 a metoprololi 6,8 7,5 1,1 (1) tokainidi 9,4 10 1,06 (2) norefedriini 5,03 5,28 1,05 (3)

Pylväs: 250 x 4,6 mm, pakattu Spherisorb· oktyyli-materiaa-lilla, d=5 μπι.

Virtausnopeus: 1,2 ml/min.

Eluointiolot: (1) 60% asetonitriiliä, 40% vettä (2) 50% asetonitriiliä, 50% vettä (3) 55% THF (tetrahydrofuraania), 45% vettä

Kuvassa 5 on esitetty metoprololin, kardioselektiivisen β-ad-renoseptoriantagonistin (0-salpaajän) raseemisen liuoksen, joka on muunnettu johdannaiseksi raseemisella FLEC-Cl-rea-genssilla, erotus.

„ 9041 0

Pylväs: 4,6 x 250 mm, pakattu 5 μν\ oktyylimateriaalilla (Spherisorb).

Eluentti: 60% asetonitriiliä, 40% vettä.

Kuvassa 6 on esitetty kaupallisesti saatavan “optisesti puhtaan" L-glutamiinin muuntaminen johdannaisekseen ja erotus aminohappostandardin optisen puhtauden, reagenssin optisen puhtauden ja johdannaiseksi muuntamisen rasemisaation yhdistetyn vaikutuksen määrittämiseksi. L-glutamiini (lmmol/1) muunnettu FLEC-Cl:llä. D-glutamiinihuippu on suuruudeltaan 0,6 promillea L-glutamiinista, määritettynä pienen määrän D-glutamiinia (2 ^mol/l) standardilisäyksellä.

Seuraavassa taulukossa III on esitetty k' ja erotuskertoi-met, α-arvot, tavallisille peptidiaminohapoille, jotka on erotettu käänteisfaasipylväällä.

li 13 9041 0

Taulukko III

aminohappo k^ k'2 a

asparagiini 1,34 1,46 1,09 I

glutamiini 1,29 1,46 1,13 seriini 2,01 2,09 1,04 aspartaattihappo 2,37 2,54 1,07 treoniini 2,94 3,31 1,13 glutaamihappo 3,26 3,69 1,13 arginiini 3,54 4,03 1,14 alaniini 5,63 6,20 1,10 proliini 5,51 5,51 1,00 --

tyrosiini 3,29 3,91 1,19 II

metioniini 3,57 4,29 1,20 fenyylialaniini 4,83 6,09 1,26 väliini 5,00 5,91 1,18 isoleusiini 8,17 9,69 1,19 leusiini 8,46 10,20 1,21 - histidiini 3,37 4,77 1,42 m ornitiini 5,37 6,69 1,25 lysiini 7,23 8,37 1,16 -

Eluenttikoostumus I 35% THF, 65% etikkahappopuskuria (3%, pH 4,35) II 40% THF, 60% III 45% THF, 55%

Pylväs: 4,6 x 250 mm, pakattu 5 μτα oktyylimateriaalilla (Spherisorb).

Kuten edellä on esitetty, ylimääräinen reagenssi voidaan poistaa eri menetelmillä. Eräs menetelmä, jota suositelta-vasti käytetään amiineja erotettaessa, on antaa reagenssi-ylimäärän reagoida amiinin kanssa tuotteen saamiseksi, joka ei häiritse määritettävien yhdisteiden erotuksen aikana.

i4 9041 0

Sekä amiinin että johdannaisen tulisi olla vesiliukoinen. Esimerkkejä tällaisista amiineista ovat hydroksiproliini ja hydratsiini.

Toinen menetelmä, jota suositeltavasti käytetään erotettaessa amminohappoja tai aminosokereita, jotka muodostavat hyd-rofiilisia aminojohdannaisia, on uuttaa reagenssiylimäärä pienipolaarisella liuottimena, esim. pentaanilla tai hek-saanilla.

Tämän keksinnön mukaista reagenssia voidaan käyttää myös aminopitoisten raseemisten seosten preparatiiviseen erottamiseen. Johdannaisten HPLC:llä erottamisen jälkeen saadaan aminopitoiset yhdisteet talteen tavanomaisilla menetelmillä, kuten happo- tai emäshydrolyysilla tai hydrogenolyysilla.

Seuraavassa taulukossa IV verrataan nykyisiä ennen pylvästä käytettäviä, johdannaiseksi muuntavia aineita ja FLEC-Cl:ää, ja siitä nähdään FLEC-reagenssin ylivoimaisuus.

Taulukko IV

PITC Dansyl FLEC GITC OPA Dabsyl

Primaariset ja sekundaariset aminoyhdisteet kyllä kyllä ei kyllä automatisoitu kyllä ei kyllä ei stabiilit johdannaiset kyllä ei ei ei MDQ 100-200 1-10 100-200 100-200 femto- piko- femto- femto- moolia moolia moolia moolia suuria häiriöitä ei ei ei

Vaikka 1-(9-fluorenyyli)etyylikloroformaatti onkin ainao esimerkinomaisesti kuvattu reagenssi, on olemassa useita rail „ 90410 kenteellisia analogeja, joita voidaan yhtä hyvin käyttää. Vaatimuksen 1 yleisen kaavan R:nä oleva metyyli voitaisiin korvata trifluorimetyylillä. Kloorin sijasta X voisi olla bromi, atsidiryhmä tai sukkinimidyyliryhmä, joita on testattu FMOC-reagenssien yhteydessä ja havaittu hyviksi poistuviksi ryhmiksi.

Claims (10)

1. Menetelmä yhdisteiden, joissa on toiminnallinen amino-ryhmä, erottamiseksi ja määrittämiseksi vesipitoisista ja vedettömistä näytteistä, tunnettu siitä, että näytteeseen, joka sisältää yhdisteitä, joissa on primäärinen ja/tai sekundäärinen aminoryhmä, lisätään kaavan R 0 *' " H CH - 0 - C -X OÖO mukaista optisesti aktiivista reagenssia, jolloin X on halogeeni, atsidiryhmä tai sukkinimidyyliryhmä, ja R on metyyliryhmä tai trifluorimetyyliryhmä, yhdisteiden toiminnallisen aminoryhmän muuntamiseksi johdannaisekseen ja diastereomeeristen karbamaattijohdannaisten muodostamiseksi, jotka sitten erotetaan ja määritetään HPLCillä.

1. 90410

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R on metyyliryhmä.

3. Patenttivaatimuksien 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että X on kloori.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ylimääräisen reagenssin annetaan reagoida amiinin kanssa siten että saadaan tuote, joka ei häiritse johdannaisten erotuksen ja määrityksen aikana.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ylimääräinen reagenssi uutetaan pois polaarisuudeltaan alhaisella liuottimena, esim. pentaanilla tai heksaanilla, silloin kun muodostetaan hydrofiilisia aminojohdannaisia, esim. aminosokereita ja aminohappoja. Il 90410

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdisteet, joissa on toiminnallinen aminoryh-mä, otetaan talteen erotuksen ja määrityksen jälkeen.

7. Kaavan R O I H H *CH - O - C -X QÖD mukainen yhdiste, jossa X on halogeeni, atsidiryhmä tai sukkinimidyyliryhmä ja jossa R on metyyliryhmä tai tri-fluorimetyyliryhmä.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että X on kloori.

9. Patenttivaatimuksien 7 tai 8 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että R on metyyliryhmä.

10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että se on (+)-1-(9-fluorenyyli)etyyliklorofor-maatti.