FI90410C - Optisesti aktiivinen reagenssi ja menetelmä enantiomeeristen primaaristen ja sekundaaristen amiinien määrittämiseksi HPLC:llä - Google Patents

Description

9041 0

Optisesti aktiivinen reagenssi ja menetelmå enantiomeeristen primaaristen ja sekundaaristen amiinien maårittåmiseksi HPLC:llå TSmå keksinto koskee parannettua enantiomeerien erottamista ja ilmaisua kiraalisen reagenssin ja suurpainenestekromato-grafian (HPLC) avulla. Tarkemmin sanottuna se koskee optisesti aktiivista fluorenyylikloroformaattia, joka rouodostaa kvantitatiivisella tavalla stabiileja diastereomeerisia kar-bamaatteja primaaristen ja sekundaaristen amiinien kanssa. Tåma tuote voidaan ilmaista fluorimetrisesti tai absorptio-metrisesti HPLC-pylvaassa erottamisen jalkeen.

Optisesti aktiivisten aminopitoisten aineiden erottaminen on tarkeaS biologisessa tutkimuksessa seka farmaseuttisessa ke-miassa. Nama aineet ovat yleisia farmaseuttisissa aineissa, ja monet niista ovat enantiomeereja, jotka ovat raseemisina seoksina. Useissa tapauksissa naiden enantiomeerien biologisen aktiivisuuden syyna pidetaan jonkin tietyn optisesti ak-tiivisen antipodin konformaatiota. Nain olien enantiomeerien tunnistaminen tai erottaminen on hyvin tarkeaa.

Kvantitatiiviseen tarkoitukseen on sopivaa kayttaå kromato-grafisia menetelmia, koska ne tarjoavat monia etuja, kuten pienen nSytekoon, yksinkertaisen esikasittelyn ja suuren il-maisuherkkyyden.

SiitS léihtien kun optisesti aktiivisia isomeereja ensimmai-sen kerran erotettiin kromatografisesti paperikromatografi-atekniikalla vuonna 1951, on hyvin monia tallaisia menetelmia esitelty, ja niitS on myos askettain selostettu kirjal-lisuudessa (Souter, R. W. "Chromatographic Separation of Stereoisomers"; CRC Press, Boca Raton, 1985; ja Jacques, J.; Collet, A.; Wilen, S.H. "Enantiomers, Racemates and Resolutions"; John Wiley & Sons; New York, 1981).

2 90410

Enantiomeerien erotuksessa tarvitaan kiraalisen aineen kayt-toa. Kromatografisten erotusmenetelmien kehityksessa on ol-lut kaksi pSasuuntausta: 1. Enantiomeerien suora erotus pylvaissa joko kiraalisella stationaarisella faasilla (CSP) tai kiraalikomponentilla liikkuvassa faasissa.

2. Muodostuneiden diastereomeerien epåsuora erotus sen jal-keen kun ne on muunnettu johdannaisikseen kiraalisella rea-genssilla.

Enantiomeerien nestekromatografinen suora erotus kiraalisilla stationaarisilla faaseilla on saanut paljon huomiota osakseen, ja talla hetkella on saatavissa muutamia kaupalli-sia kiraalisia pylvåitå. Yritykset ovat kohdistuneet sellai-sen kiraalisen stationaarisen faasin aikaansaamiseen, jolla pystyttåisiin erottamaan niin monta erityyppista kiraalista ainetta kuin mahdollista. Silti on vain hyvin harvoja amii-neja ja aminohappoja, joita on suoraan erotettu minkåan tyyppisella kiraalisella pylvaallS ilman edeltavaa johdan-naiseksi muuntamista.

Tamegai et al. J. Liq. Chromatography, 1979, 2, 1229 ovat selostaneet menetelmiS, jotka perustuvat enantiomeerien epa-suoraan erotukseen muuntamalla ne kiraalisen reagenssin kanssa johdannaiseksi muodostamaan diastereomeereja, jotka erotetaan tavallisilla pylvailla. Furukava et al. Chem. Pharm. Bull. 1975, 23, 1623 erottivat ensimmaisina enantio-meerisia aminohappoja kayttaen helposti saatavaa (+)-10-kam-ferisulfonyylikloridia kiraalisena reagenssina. Karbonyyli-tåhde muutettiin sitten toisessa vaiheessa p-nitrobentsyyli-esteriksi, jolloin saatiin UV-ilmaisulle herkkiS johdannai-sia.

Yleisimmat kiraalisen reagenssit toiminnallisen amiinin se-lektiiviseen muuntamiseen johdannaiseksi perustuvat isotio- 3 90410 syanaattiin, jolla saadaan UV-herkkiå tioureajohdannaisia primaaristen ja sekundaaristen amiinien kanssa. Reaktio suo-ritetaan heikosti happamissa oloissa noin 20 minuutin ajan huoneenlSmmosså ilman sivutuotteiden muodostumista.

Parhain tåmantyyppinen reagenssi on 2,3,4,6-tetra-o-asetyy- li-p-d-gluko-pyranosyyliisotiosyanaatti (GITC), jota kayte-taån seka aminohapoilla ettå amiineille. Useimpien proteii-niaminohappojen saadut tioureajohdannaiset on erotettu ta-vallisella kåånteisfaasipylvaållM kahden tunnin sisålia. Saatu erottuminen johtuu ensi sijassa sokeritahteen lipofii-lisesta luonteesta yhdesså rakenteen jaykkyyden kanssa. Aminopitoisille yhdisteille tarkoitetut fluoresenssiset ki-raaliset muunnosreagenssit ovat harvinaisia, ja vain rea-gensseja, jotka perustuvat kiraalisiin tioleihin yhdistet-tyihin o-ftaalialdehydeihin (OPA), on selostettu, JP 60 38,652 (85 38,652). Erilaisia kiraalitioliyhdisteitå, joita on kaytetty, ovat N-asetyyli-L-kysteiini, BOC-L-kysteiini, kaikkien nåiden johtaessa diastereomeerisiin isoindoleihin primaaristen aminoryhmien kanssa. Reaktio on selektiivinen ja taydellinen minuutin sisalla huoneenlammossa suoraan pus-kuroidussa vesiseoksessa ilman rasemisaatiota. Muodostuneet diastereomeerit eivat kuitenkaan ole stabiileja.

Seuraavassa on lueteltu eraita olennaisia ja toivottavia ominaisuuksia, joita tHllaisella reagenssilla tulisi olla.

* sen tulee olla optisesti puhdas * sen tulee sisåltåå kromoforin tai fluoroforin * reaktio-olojen tulisi olla heikkoja, muussa tapauksessa kasvaa vaara mahdollisesta rasemisaatiosta * syntyvien diastereomeerien tulisi olla stabiileja * syntyvien diastereomeerien tulisi erottua tavallisilla HPLC-pylvailla * menetelmaå tulisi voida kåyttåå preparatiivisessa mitta-kaavassa * menetelman tulisi soveltua automatisoitavaksi.

4 90410

Koskaan aikaisemmin ei kuitenkaan ole kuvattu tai ehdotettu kiraalista reagenssia, joka yhdistyisi menetelmåan, jolla voidaan tehokkaasti muuntaa johdannaisiksi, ilmaista ja erottaa primaarisia ja sekundaarisia aminoryhmia sisSltSvien yhdisteiden raseemisia seoksia.

Taman keksinnon tarkoituksena on aikaansaada kiraalinen rea-genssi ja menetelmå primaarisia ja sekundaarisia aminoryhmia sisåltåvien yhdisteiden epasuoraa erotusta vårten tavalli-silla kSSnteisfaasi-HPLC-pylvailia. Reagenssilla tulisi saa-da fluoresoivia johdannaisia, jotka ovat stabiileja ja il-maistavissa fluorometrisesti tai absorptiometrisesti sen jalkeen kun ne on erotettu nestekromatografisesti. Stabiili johdannainen helpottaa kvantitointia ja automatisointia. Li-saksi reaktion tulisi tapahtua nopeasti lievissa oloissa ve-sifaasissa ja ilman rasemisaatiota.

Tama on aikaansaatu muuntamalla sanottujen yhdisteiden toi-minnallinen aminoryhma johdannaisekseen lisaamallS optisesti aktiivista reagenssia, jonka kaava on

R O

I M

H *CH - 0 - C -X

jossa X on halogeeni, atsidiryhma tai sukkinimidyyliryhma, ja jossa R on metyyliryhma tai trifluorimetyyliryhma, dia-stereomeeristen karbamaattien muodostamiseksi, jotka maari-tetaån sinanså tunnetuilla menetelmilla, esim. fluorimetri-sesti tai absorptiometrisesti, sen jalkeen kun ne on erotettu nestekromatografisesti.

Reagenssi suorittaa: 1. Optisen puhtauden maarityksen erotetuissa amiineissa ja aminohapoissa.

ll 5 90410 2. Biologisen systeemin enantiomeeristen aminopitoisten yh-disteiden eri maHrien maarityksen.

3. Aminopitoisten raseemisten seosten preparatiivisen ero-tuksen.

Oheisissa piirustuksissa:

Kuva 1 esittaa reagenssia ja reaktiokaavaa.

Kuvan 2 kayrSt esittåvåt reaktionopeuksia ja saantoja muo-dostettaessa erilaisten aminohappojen fluoresoivia diaste-reomeerisia karbamaatteja,

Kuvan 3 kayrSt esittSvåt reaktion saantoja pH:n funktiona asparagiinihapolle ja glutamiinihapolle,

Kuva 4 on kromatogrammi, joka esittaa 17 aminohapon erotusta fluoresenssimerkattuina diastereomeerisina karbamatteina kaMnteisfaasinestekromatografisesti suoritettuna,

Kuva 5 on kromatogrammi, joka esittaa raseemisen metoprolo-lin erotusta,

Kuva 6 on kromatogrammi, joka esittaa kaupallisesti saatavan "optisesti puhtaan” L-glutamiinin muuntamista johdannaiseksi ja erotusta.

Keksinto perustuu kloroformaattien nopeaan reaktioon erilaisten amiinien kanssa stabiilien karbamaattien muodostami-seksi Schotten-Baumann-oloissa. Reaktio suoritetaan yhtena vaiheena muutamassa sekunnissa huoneenlåmmossa. Tietyllå pH-alueella reaktio on selektiivinen funktionaalisiin amino-ryhmiin nahden, ja ainoa muodostunut sivutuote on vastaava alkoholi. Reagenssiylimaara on helppo kasitellS, ja siten valtytaan hairioilta seuraavassa erotusvaiheessa.

6 90410 9—fluorenyy 1 imetyy 1 ikloroforxnaattireagenss i (FMOC) on fluo-resoiva herate-emissioaallonpituuksilla 270/315 mm. Muodostu-neet tuotteet ilmalstaan siten selektiivisesti talla aallon-pituusyhdistelmalla. Tama ominaisuus yhdessa selektiivisen reaktion kanssa johtaa siihen, etta hyvin moniaineisia seok-sia, esim. kehonnesteita, voidaan kåsitella ilman minkSan-laista puhdistusta tai esikasittelymenettelyå.

Keksinnossa on tarkoitus syntetisoida optisesti aktiivinen reagenssi, jota voidaan kayttaå samalla tavalla kuin akiraa-lista FMOC-reagenssia sen monine etuineen siten diastereo-meerien muodostamiseksi raseemisten aminopitoisten yhdistei-den kanssa. Diastereomeerit tulisi voida erottaa tavallisel-la erotussysteemilla, tyypillisesti kaanteisfaasi-HPLC:llå, yleisimmalla ja tehokkaimmalla LC-erotussysteemilla hiven-maåraanalyysia ja preparatiivista erotusta vårten. Reagens-sin tekeminen optisesti aktiiviseksi ei tietystikaan takaa erotettavien diastereomeerien saamista. Asymmetrisen hiilia-tomin tuominen on tehtava sellaiseen asemaan, etta reagens-sin ominaisuudet sailyvåt.

Keksinnon tarkoitus oli aikaansaada kiraalisuus FMOC-rea-genssille tuomalla asymmetrinen hiiliatomi 9-fluorenyyli-1-asemaan. TamHntyyppista yhdistetta ei kirjallisuudessa ole aikaisemmin kuvattu. Tama asema on strateginen, koska se on lShella sekS muodostettua toiminnallista amidia ettS fluo-reeniosuutta edustavaa jaykkaa syklistM jårjestelya. On ko-rostettava, etta nama eivat vielakaSn ole mitaMn yleisia saantojS kiraalisten reagenssien suunnittelemiseksi, joita voidaan soveltaa diastereomeerien onnistuneeseen erotukseen. Sen vuoksi tulosta ei voida ennustaa. Nain olien optinen erotus perustuu yha yrityksen ja erehdyksen menettelyyn. Yllattaen kuitenkin 9-fluorenyyli-l-etyylikloroformaattirea-genssi (FLEC) aikaansaa diastereomeereja useimpien amiinien kanssa, jotka ovat erotettavissa kaanteisfaasi-LC-pylvåillS. Lisåksi (+)-1-(9-fluorenyyli)etyylikloroformaatilla saatiin

II

7 90410 harvinaisten D-aminohappojen diastereomeereja, jotka erot-tuivat ennen L-pååmuotoa ideaalisesti harvinaisissa mååri-tyksissa. Uuden reagenssin ominaisuudet pysyivåt muuttumat-tomina akiraaliseen FMOC-reagenssiin verrattuna. Nain olien on kuvattu uusi reagenssi, joka on hyvin kåytannollinen ja kåyttokelpoinen optisesti aktiivisten aminopitoisten yhdis-teiden maårittåmiseksi moniaineisista seoksista seka amii-nien preparatiivista erottamista vårten.

FLEC:n reaktio aminohappojen kanssa kulkee kuvassa 1 esite-tylla tavalla. Reagenssi reagoi myos veden kanssa muodostaen vastaavan alkoholin hydrolyysituotteena.

f+1-1-(9-fluorenvvli)etvvlikloroformaatin (FLEC) svnteesi 1-^9-fluorenvvli)etanolin svnteesi; Liuokseen, jossa oli 8,3 g fluoreenia 100 mlrssa kuivaa eetteria lisattiin 31 ml BuLi:a (1,6 M heksaanissa). Seosta refluksoitiin 30 minuutin ajan ja sitten jaahdytettiin jSHhauteessa. Saatuun seokseen lisattiin liuos, jossa oli 2,8 ml asetaldehydia 40 ml:ssa kuivaa eetteria, 15 minuutin kuluessa ja refluksoitiin sitten 1 h. Lisåttiin vetta (100 ml) ja eetterikerros kerattiin erotussuppiloon, kuivattiin (MgS04) ja haihdutettiin. Tuote puhdistettiin edelleen flash-kromatografisesti ja uudelleen-kiteytettiin ligroiinista (k.p. 80-ll0°C), jolloin saatiin valkoisia neulasia, s.p. 101-103°C; massaspektri M+m/e 210,15, 1H NMR(CDC13), 0,87(d, 3H) , 1,70 (S, IH), 4,09 (d, IH), 4,35-4,65 (m, IH), 7,15-7,85 (m, 8H).

1-f9-fluorenvvli^etanolin optinen erotus: Liuokseen, jossa oli 4,0 g 1-(9-fluorenyyli)etanolia 25 ml:ssa vedetdnta py-ridiinia, lisattiin ekvimolaarinen måara (-)-kamfaanihappo-kloridia (4,12 g), ja seosta sekoitettiin huoneen låmmossa 3 h. Liuos kaadettiin jååveteen ja uutettiin C^C^illa. CH2Cl2-kerros pestiin laimealla suolahapolla, kuivattiin (MgS04) ja haihdutettiin kuivaksi. Raakaesteri liuotettiin 8 90410 200 ml:aan MeOH ja jåahdytettiin -15°C:seen. Saostuneet kiteet (fraktio A) kiteytettiin kahdesti samasta liuottimesta, jolloin saatiin 1,0 g vahemman liukoista diastereomeerista esteria puhtaassa muodossa (s.p. 159-160°C), (rasemalåmp.

152°C). Diastereomeeriesterin optinen puhtaus tarkistettiin kiraalisella stationaarisella faasilla ((-)-dinitrobentso-yylifenyyliglysiini kytkettyna aminopropyylipiidioksidiin, Pirklen faasi), ja se oli 99%.

Esterin hvdrolvvsi: Optisesti puhtaan diastereomeeriesterin (1,0 g) liuokseen 50 ml:ssa kuivaa eetteriå lisattiin 0,8 g LiAlH4. Seosta sekoitettiin huoneenlammossS 1 h, jolloin lo-puksi saatiin alkoholi, s.p. 91-93° (haj.).

(+ 1-1-(9-fluorenvvli)etvvlikloroformaatti: 0°C:seen jaahdy-tettyyn fosgeenin (0,8, 8,1 mmol) liuokseen 15 ml:ssa kuivaa tolueenia lisattiin tiputtamalla liuos, jossa oli optisesti puhdasta alkoholia (0,44 g, 2,1 mmol) ja trietyyliamiinia (0,30 ml, 2,1 mmol) 20 ml:ssa kuivaa tolueenia. Kun lisays oli suoritettu, sekoitusta jatkettiin 2 h 0°C:ssa. Trietyy-liamiinihydrokloridi poistettiin sitten suodattamalla ja suodos konsentroitiin alipaineessa, jolloin saatiin oljy.

[a]25 = +67,9° (CH2C12, C=l) [a]25 = +70,5° (CH2C12, C=l) 1H NMR (CDCI3): 0,76 (d, 3H), 4,30 (d, IH), 5,47-5,75 (m, IH), 7,18-7,85 (m, 8H).

Anal. laskett. C16H1302C1:Ile: C, 70,46; H, 4,80; Cl, 13,00

Saatu: C, 70,64; H, 4,80; Cl, 13,13 9 90410

Koeolot

Liuottimet ja reagenssit: asetonitriili, tetrahydrofuraani ja asetoni ostettiin Rathburnilta (Walkerburn, U.K.)· Amino-happostandardit ja FMOC-Cl-reagenssi saatiin Sigmalta (St. Louis, MO, USA). Eluointipuskuri tehtiin etikkahaposta kak-soistislattuun veteen (3 mL/L) titrattuna sopivaan pH:hon natriumhydroksidilla. FLEC-Cl-reagenssi liuotettiin asetonitriili : asetoniin (1:3) ja sen konsentraatio oli 15 mmol/L. Reaktiopuskuri tehtiin boorihaposta (1M) ja sen pH saadet-tiin natriumhydroksidilla.

Muuntaminen iohdannaisiksi: Nayte (0,4 mL) ja puskuri (0,1 mL, pH) sekoitetaan 3 ml:n reaktiopullossa. LisatSSn reagenssi (0,5 mL) ja annetaan reagoida. 1 minuutin jålkeen pullo taytetaan låhes tayteen pentaanilla, ja reaktioseos uutetaan ylimaåråisen reagenssin poistamiseksi. Uutto tois-tetaan kahdesti, minkH jålkeen vesifaasi on valmis ruisku-tettavaksi.

Reaktionopeus; Aminohappojen reaktionopeus FLEC-Cl-reagens-sin kanssa on esitetty kuvassa 2, ja se maSritettiin muunta-malla aminohappoja (yksi kerrallaan) johdannaisikseen taval-lisella tavalla reagenssin kanssa pH 8,03:ssa (nayte + pus-kuri). Tietyn aikavålin jalkeen reaktio pysSytettiin etikka-happoa lisMamSlia, ja ylimaSrainen FLEC-Cl-reagenssi pois-tettiin pentaaniuutoilla. Reagoimatta jaanyt mMarS maSritet-tiin muuntamalla ennen pylvasta johdannaisiksi o-ftaalialde-hydi/merkaptoetanolilla, mita seurasi nestekromatografia. Tuloksia verrattiin liuokseen, joka oli kasitelty samalla tavalla mutta ilman FLEC-Cl-reagenssia (alkuperainen maarå aminohappoa), mista voitiin laskea muutos FLEC-johdannaisek-si. Kukin mittauspiste on kahden mittauksen keskiarvo.

Kuvassa 3 on esitetty pH:n vaikutus asparagiinihapon ja glu-tamiinihapon reaktionopeuksiin samalla tavalla mitattuna 10 90 41 0 kuin edellå 1 minuutin reaktioajalia. Mittaukset suoritet-tiin pH-arvoilla 8,01, 8,46, 9,01, 9,47 ja 10,23. pH mitat-tiin reaktioliuoksesta puskurilisSyksen jalkeen.

FLEC-Cl:n ja FMOC-Cl:n reaktiiviset reaktionopeudet valii-nin, glutamiinihapon, proliinin ja lysiinin kanssa mååritet-tiin vertailemalla saantoa, joka saatiin kun standardiami.no-happoliuos muunnettiin johdannaisiksi kullakin reagenssilla, tuloksiin, jotka saatiin kun kaytettiin sekoitettua FLEC/ FMOC-reagenssia. Johdannaiset erotettiin kromatografisesti ja huippupinta-aloja verrattiin keskenaan.

Kuvassa 4 on esitetty 17 aminohapon erotus fluoresenssimer-kattuina diastereomeerisia karbamaatteina kaånteisfaasines-tekromatografisesti suoritettuna.

Koeolot olivat: FLEC-Cl-reagenssi liuotettuna asetonitriili/asetoniin (1/4, 15 mM). Reaktiopuskuri on boraattipuskuri, 1M, pH 6,5.

Sekoitetaan 0,4 ml nåytetta ja 0,1 ml boraattipuskuria. Ta-han liuokseen lisataan 0,5 ml reagenssia. 1 minuutin reak-tioajan kuluttua seos uutetaan 3 kertaa pentaanilla. Pentaa-niuutteet poistetaan ja vesifaasi on valmis ruiskutettavak-si. Kun johdannaisiksi muunnetaan suhteellisen hydrofobisia amiineja, joissa ei ole hapanta ryhmaa, uuttovaihe jatetaan pois ja ylimaarainen reagenssi poistetaan reaktiolla hydro-fiilisen amiinin, tyypillisesti hydroksiproliinin tai hyd-ratsiinin, kanssa.

II

11 9041 0

Taulukko I

Eluointiaste: Aika (min) %AcN %THF %puskuri 0 8 17 75 8 8 17 75 22 O 30 70 70 0 50 50

Erotusolot (aminohapot): pylvås: 150 x 4,6 mm pakattu Spherisol oktyyli-materiaalil-la, d=3 /im.

Eluointipuskuri: etikkahappo 3 promillea, pH 4,35. Virtausnopeus: 0,3 ml/min.

Seuraavassa taulukossa II on esitetty k'-arvot ja erotusker-toimet, α-arvot eraille aminopitoisille farmaseuttisille ai-neille.

Taulukko II

Amiini k'l k'2 a metoprololi 6,8 7,5 1,1 (1) tokainidi 9,4 10 1,06 (2) norefedriini 5,03 5,28 1,05 (3)

Pylvas: 250 x 4,6 mm, pakattu Spherisorb· oktyyli-materiaa-lilla, d=5 μπι.

Virtausnopeus: 1,2 ml/min.

Eluointiolot: (1) 60% asetonitriilia, 40% vetta (2) 50% asetonitriilia, 50% vetta (3) 55% THF (tetrahydrofuraania), 45% vetta

Kuvassa 5 on esitetty metoprololin, kardioselektiivisen β-ad-renoseptoriantagonistin (Ø-salpaajan) raseemisen liuoksen, joka on muunnettu johdannaiseksi raseemisella FLEC-Cl-rea-genssilla, erotus.

„ 9041 0

Pylvås: 4,6 x 250 mm, pakattu 5 μν\ oktyylimateriaalilla (Spherisorb).

Eluentti: 60% asetonitriiliS, 40% vettM.

Kuvassa 6 on esitetty kaupallisesti saatavan Moptisesti puh-taan" L-glutamiinin xnuuntaminen johdannaisekseen ja erotus aminohappostandardin optisen puhtauden, reagenssin optisen puhtauden ja johdannaiseksi muuntamisen rasemisaation yhdis-tetyn vaikutuksen maarittamiseksi. L-glutamiini (lmmol/1) muunnettu FLEC-Cl:llå. D-glutamiinihuippu on suuruudeltaan 0,6 proroillea L-glutamiinista, maaritettyna pienen maarån D-glutamiinia (2 μπιοΐ/ΐ) standardilisayksella.

Seuraavassa taulukossa III on esitetty k' ja erotuskertoi-met, α-arvot, tavallisille peptidiaminohapoille, jotka on erotettu kaSnteisfaasipylvaalla.

li 13 9041 0

Taulukko III

aminohappo k^ k'2 α

asparagiini 1,34 1,46 1,09 I

glutamiini 1,29 1,46 1,13 seriini 2,01 2,09 1,04 aspartaattihappo 2,37 2,54 1,07 treoniini 2,94 3,31 1,13 glutaamihappo 3,26 3,69 1,13 arginiini 3,54 4,03 1,14 alaniini 5,63 6,20 1,10 proliini 5,51 5,51 1,00 --

tyrosiini 3,29 3,91 1,19 II

metioniini 3,57 4,29 1,20 fenyylialaniini 4,83 6,09 1,26 valiini 5,00 5,91 1,18 isoleusiini 8,17 9,69 1,19 leusiini 8,46 10,20 1,21 - histidiini 3,37 4,77 1,42 m ornitiini 5,37 6,69 1,25 lysiini 7,23 8,37 1,16 -

Eluenttikoostumus I 35% THF, 65% etikkahappopuskuria (3%, pH 4,35) II 40% THF, 60% III 45% THF, 55%

Pylvas: 4,6 x 250 mm, pakattu 5 /xm oktyylimateriaalilla (Spherisorb).

Kuten edella on esitetty, ylimaarainen reagenssi voidaan poistaa eri menetelmilla. Eras menetelma, jota suositelta-vasti kaytetaan amiineja erotettaessa, on antaa reagenssi-ylimaåran reagoida amiinin kanssa tuotteen saamiseksi, joka ei hMiritse måaritettavien yhdisteiden erotuksen aikana.

14 9041 0

Seka amiinin etta johdannaisen tulisi olla vesiliukoinen. Esimerkkeja tallaisista amiineista ovat hydroksiproliini ja hydratsiini.

Toinen menetelma, jota suositeltavasti kaytetaSn erotettaes-sa aituninohappoja tai aminosokereita, jotka muodostavat hyd-rofiilisia aminojohdannaisia, on uuttaa reagenssiylimaara pienipolaarisella liuottimella, esim. pentaanilla tai hek-saanilla.

Tåman keksinnon mukaista reagenssia voidaan kåyttaa myos aminopitoisten raseemisten seosten preparatiiviseen erotta-miseen. Johdannaisten HPLC:11M erottamisen jSlkeen saadaan aminopitoiset yhdisteet talteen tavanomaisilla menetelmilia, kuten happo- tai emashydrolyysilla tai hydrogenolyysilla.

Seuraavassa taulukossa IV verrataan nykyisia ennen pylvasta kaytettaviS, johdannaiseksi muuntavia aineita ja FLEC-Cl:aa, ja siita nahdaan FLEC-reagenssin ylivoimaisuus.

Taulukko IV

PITC Dansyl FLEC GITC OPA Dabsyl

Primaariset ja sekundaa- riset aminoyhdisteet kylia kylla ei kylla automatisoitu kyllM ei kylla ei stabiilit johdannaiset kylla ei ei ei MDQ 100-200 1-10 100-200 100-200 femto- piko- femto- femto- moolia moolia moolia moolia suuria hairioita ei ei ei

Vaikka 1-(9-fluorenyyli)etyylikloroformaatti onkin ainao esimerkinomaisesti kuvattu reagenssi, on olemassa useita rail „ 90410 kenteellisia analogeja, joita voidaan yhta hyvin kåyttaå. Vaatimuksen 1 yleisen kaavan R:nå oleva metyyli voitaisiin korvata trifluorimetyylillå. Kloorin sijasta X voisi olla bromi, atsidiryhma tai sukkinimidyyliryhma, joita on testat-tu FMOC-reagenssien yhteydessa ja havaittu hyviksi poistu-viksi ryhmiksi.

Claims (10)

1. Menetelmå yhdisteiden, joissa on toiminnallinen amino-ryhmå, erottamiseksi ja mSårittMmiseksi vesipitoisista ja vedettdmista naytteistS, tunnettu siita, etta nSyttee-seen, joka sisSltMS yhdisteita, joissa on primaSrinen ja/tai sekundaarinen aminoryhma, lisataån kaavan R 0 *' " H CH - 0 - C -X Q20 mukaista optisesti aktiivista reagenssia, jolloin X on halogeeni, atsidiryhma tai sukkinimidyyliryhma, ja R on metyyliryhma tai trifluorimetyyliryhmS, yhdisteiden toi-minnallisen aminoryhmSn muuntaroiseksi johdannaisekseen ja diastereomeeristen karbamaattijohdannaisten muodostami-seksi, jotka sitten erotetaan ja maaritetaan HPLCilia.

1. 90410

2. Sått enligt patentkravet 1, kånnetecknat dårav, att R år en metylgrupp.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siita, etta R on metyyliryhma.

3. Sått enligt patentkravet 1 eller 2, kånnetecknat dårav, att X år klor.

3. Patenttivaatimuksien 1 tai 2 mukainen menetelmå, tunnettu siita, ettå X on kloori.

4. Sått enligt patentkravet 1 eller 2, kånnetecknat dårav, att overskottsreagens reageras med en amin som ger en produkt vilken ej interfererar under separation och beståmning av derivaten.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmå, tunnettu siita, etta ylimaarMisen reagenssin annetaan rea-goida amiinin kanssa siten etta saadaan tuote, joka ei hairitse johdannaisten erotuksen ja maarityksen aikana.

5. Sått enligt patentkravet 1, kånnetecknat dårav, att dverskottsreagens bortextraheras med ett lågpolårt los-ningsmedel, t.ex. pentan eller hexan, då hydrofila amino-derivat bildas, t.ex. aminosocker och aminosyror.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siita, etta ylimaarainen reagenssi uutetaan pois polaari-suudeltaan alhaisella liuottimella, esim. pentaanilla tai heksaanilla, silloin kun muodostetaan hydrofiilisia aminojohdannaisia, esim. aminosokereita ja aminohappoja. II 90410

6. Sått enligt patentkravet 1, kånnetecknat dårav, att foreningarna innehållande en aminofunktion återvinnes efter separation och beståmning.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmS, tunnettu siita, etta yhdisteet, joissa on toiminnallinen aminoryh-ma, otetaan talteen erotuksen ja måårityksen jaikeen.

7. Optiskt aktiv forening med formeln ti i« 90410 R O ★ 1 M H CH - O - C -X vari X Mr halogen, en azldgrupp eller en succinimidyl-grupp och vari R Mr en metylgrupp eller en trifluormetyl-grupp.

7. Kaavan R O I H H *CH - 0 - C -X 0¾) mukainen yhdiste, jossa X on halogeeni, atsidiryhma tai sukkinimidyyliryhma ja jossa R on metyyliryhma tai tri-fluorimetyyliryhmå·

8. Forening enligt patentkravet 7, kannetecknat dMrav, att X Mr klor.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen yhdiste, tunnettu siita, ettå X on kloori.

9. Forening enligt patentkravet 7 eller 8, kannetecknat dMrav, att R Mr metylgrupp.

9. Patenttivaatimuksien 7 tai 8 mukainen yhdiste, tunnettu siita, etta R on metyyliryhma.

10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen yhdiste, tunnettu siita, etta se on (+)-1-(9-fluorenyyli)etyyliklorofor-maatti. 1. satt for resolvering och bestamning av foreningar med en aminofunktion i vattenhaltiga och icke-vattenhaltiga prover, kannetecknat darav, att till ett prov innehål-lande foreningar med en primar och/eller en sekundar aminogrupp sattes ett optiskt aktivt reagens med den alimanna formeln is 90 41 0 R O I N H *CH - O - C -X 020 vari X år halogen, en azidgrupp eller en succinimidyl-grupp och vari R år en metylgrupp eller trifluormetyl-grupp for derivatisering av fdreningarnas aminofunktioner och bildning av diastereomera karbamatderivat vilka dårefter separeras och detekteras medelst HPLC.

10. Forening enligt patentkravet 7 vilken utgores av (+)- 1-(9—fluorenyl)etylkloroformat.