CN113655131B - 一种Fmoc-Ile-OH的有关物质检测方法 - Google Patents

一种Fmoc-Ile-OH的有关物质检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113655131B
CN113655131B CN202110439206.4A CN202110439206A CN113655131B CN 113655131 B CN113655131 B CN 113655131B CN 202110439206 A CN202110439206 A CN 202110439206A CN 113655131 B CN113655131 B CN 113655131B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fmoc
ile
mobile phase
detecting
related substances
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110439206.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113655131A (zh
Inventor
朱莉
徐红岩
闫峰
徐金勇
吴福全
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Binhai Gl Polypeptide Co ltd
Jill Peptide Biopharmaceutical Dalian Co ltd
Original Assignee
Binhai Gl Polypeptide Co ltd
Jill Peptide Biopharmaceutical Dalian Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Binhai Gl Polypeptide Co ltd, Jill Peptide Biopharmaceutical Dalian Co ltd filed Critical Binhai Gl Polypeptide Co ltd
Priority to CN202110439206.4A priority Critical patent/CN113655131B/zh
Publication of CN113655131A publication Critical patent/CN113655131A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113655131B publication Critical patent/CN113655131B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明涉及一种Fmoc‑Ile‑OH的有关物质检测方法，其特征在于参数条件如下：采用高效液相色谱法进行检测，检测波长为210～280nm，所用流动相A为水，流动相B为乙腈，均填加0.05～0.15%TFA的离子对溶液；梯度变化中流动相A的体积含量为52~5~52%，流动相B的体积含量为48~95~48%。本发明方法可以较好的检测Fmoc‑Ile‑OH的有关物质，检测速度较快，结果准确，方法步骤简单，便于操作。

Description

一种Fmoc-Ile-OH的有关物质检测方法
技术领域
本发明涉及多肽领域，具体涉及一种Fmoc-Ile-OH的有关物质检测方法。
背景技术
Fmoc-Ile-OH，又名Fmoc-L-异亮氨酸或N-芴甲氧羰基-L-异亮氨酸，其结构如下所示：
Fmoc-Ile-OH是合成多肽的重要原料，其原料药对杂质鉴定限是小于0.1％，质控限度＜0.15％，控制有关物质限度单杂0.1％的，大大减少药企的工艺研究和质量研究的时间以及成本，所以Fmoc-Ile-OH的有关物质研究和控制对原料药和制剂的质量研究都有重要意义。
L-异亮氨酸(L-Isoleucine)是人体必须的八种氨基酸之一，同时又是支链氨基酸的一种，因其特殊的结构和功能而占有特别重要的地位，是二十多种药用氨基酸中最为昂贵的一种，以用量计占第二位，以金额计占第一位，主要用于配制各种复合氨基酸制剂，除营养型氨基酸输液外，特别应用于高支链氨基酸输液(如3H输液等)及口服液(如肝安干糖浆等)。L-异亮氨酸具有促进体内蛋白质、酶和肽类激素合成等功能，在肌肉蛋白代谢中尤为重要，主要用于治疗神经障碍、食欲减退和贫血等，有增强机体免疫力的功能，是氨基酸输液、氨基酸口服剂不可缺少的组分，对治疗肝昏迷、肾脏病、肌肉萎缩等症有显著疗效。此外，L-异亮氨酸被广泛运用于食品工业、化妆品、光化学和电化学等领域。
异亮氨酸(Ile)具有两个手性中心，存在4种立体异构体：(2S,3S)L-异亮氨酸(L-Ile)、(2R,3R)D-异亮氨酸(D-Ile)、(2S,3R)L-别异亮氨酸(L-allo-Ile)和(2R,3S)D-别异亮氨酸(D-allo-Ile)。亮氨酸与异亮氨酸是结构差异很小的同分异构体氨基酸，结构上亮氨酸与异亮氨酸的碳主链相同，前者的γ位有个甲基，后者β位有个甲基。因此Fmoc-Ile-OH的有关物质之一Fmoc-Leu-OH分离难度尤其大。4种立体异构体的结构式如下所示：
公开号为CN104345114A的中国专利公开了一种反相分离衍生化亮氨酸和异亮氨酸的方法，虽然样品能够分离，但Fmoc-Leu-OH与Fmoc-Ile-OH出峰时间均在40分钟左右，色谱分析时间长，且分离度小于1.5。因此，目前亟需一种检测时间较短，对相关物质分离度较好的Fmoc-Ile-OH的有关物质检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种操作快捷、对相关物质分离度好的Fmoc-Ile-OH的有关物质检测方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种Fmoc-Ile-OH的有关物质检测方法，其特征在于参数条件如下：
采用高效液相色谱法进行检测，检测波长为210～280nm，所用流动相A为水，流动相B为乙腈，均添加0.05～0.15％TFA的离子对溶液；梯度变化中流动相A的体积含量为52～5～52％，流动相B的体积含量为48～95～48％。
优选的，所述有关物质检测方法中色谱柱可以选自C4色谱柱。
优选的，所述有关物质检测方法中柱温为25～40℃，流动相流速优选为0.5～1.2ml/min。
优选的，所述有关物质检测方法中柱温为40℃，流动相流速为0.8ml/min。
优选的，所述有关物质检测方法中直接采用流动相溶解样品，进样浓度为0.25～0.75mg/ml。
优选的，所述有关物质检测方法具体是将含有Fmoc-β-Ala-OH，Fmoc-β-Ala-Ile-OH，Fmoc-Ile-Ile-OH和Fmoc-Leu-OH与Fmoc-Ile-OH的混合溶液进样，以及将上述五种物质的对照品分别进样定位，最后采用面积归一化法计算Fmoc-Ile-OH的纯度。
优选的，所述有关物质检测方法中流动相中TFA的离子对溶液浓度为0.1％(体积比)。
优选的，有关物质检测方法中洗脱梯度变化如表1所示：
表1
时间min 流动相A％ 流动相B％
0 52 48
20 52 48
25 5 95
29 5 95
30 52 48
35 52 48
本发明中化合物的中文命名与结构式有冲突的，以结构式为准；结构式有明显错误的除外。
本发明提供的Fmoc-Ile-OH的有关物质检测方法成功分离了Fmoc-Ile-OH的4个有关物质，Fmoc-Leu-OH与Fmoc-Ile-OH出峰时间23min和24min，分离度远远大于1.5，即使最难分离的Fmoc-Leu-OH与Fmoc-Ile-OH分离度也能达到1.64。本发明方法可以较好的检测Fmoc-Ile-OH的有关物质，检测速度较快，结果准确，方法步骤简单，便于操作。
说明书附图
图1是本发明实施例1提供的Fmoc-Ile-OH及其4个有关物质的高效液相色谱分离图；
图2是本发明对照例1提供的Fmoc-Ile-OH及其4个有关物质的高效液相色谱分离图；
图3是本发明对照例2提供的Fmoc-Ile-OH及其4个有关物质的高效液相色谱分离图。
具体实施方式
以下结合实例说明本发明，但不限制本发明。在本领域内，技术人员对本发明所做的简单替换或改进均属于本发明所保护的技术方案内。
高效液相色谱仪：：赛默飞U3000，四元泵，自动进样器，UV检测器，Chromeleon 7工作站，电子天平BT25S型(赛多利斯，十万分之一)，C18柱，4.6mm×250mm，5μm；C12柱，4.6mm×250mm，5μm；C4柱，4.6mm×250mm，5μm。Fmoc-Ile-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-Leu-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-Leu-OH(吉尔生化)，Fmoc-Ile-Ile-OH(吉尔生化)，乙腈(色谱纯，国药)，三乙胺(AR，国药)，KH2PO4(AR，国药)，三氟乙酸(AR，国药)，重蒸馏水(自制)。
本申请中涉及的杂质结构如表2所示：
表2
实施例1
(1)将蒸馏水和0.1％TFA的离子对溶液按一定比例配置流动相A；
(2)将乙腈和0.1％TFA的离子对溶液按一定比例配置流动相B；
(3)注入待测溶液，以流动相A和流动相B对色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱的柱温为40℃，进样浓度控制在0.5mg/ml，流动相流速为0.8ml/min,所述梯度洗脱时紫外线检测器的检测波长为220nm。
(4)记录色谱图，并采用面积归一化法计算Fmoc-Ile-OH的纯度。
色谱条件采用
色谱柱：C4柱，4.6mm×250mm，5μm；
流速：0.8ml/min
检测波长：220nm
柱温：40℃
进样量：10μl
流动相A:100％H2O+0.1％TFA流动相B:100％ACN+0.1％TFA
洗脱条件如下：
注入Fmoc-Ile-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-Ile-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-Ile-Ile-OH(吉尔生化)，Fmoc-Leu-OH(吉尔生化)的混合溶液，以及分别单独进样，从图1看，5个峰成功分离，分离度分别为11.39、17.79、1.64和5.31，均符合符合分离度不低于1.5的标准，其中最难分离的Fmoc-Leu-OH与Fmoc-Ile-OH分离度也能达到1.64。
本方法能够很好的分离Fmoc-Leu-OH的4个有关物质，从而有效的控制Fmoc-Ile-OH的纯度。
对比例1
(1)将适量三乙胺溶于蒸馏水，再加适量的磷酸调pH得到2～2.5的流动相A为80mmTEAP；
(2)色谱乙腈为流动相B；
(3)注入待测溶液，以流动相A和流动相B对色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱的柱温为40℃，进样浓度控制在0.5mg/ml，流动相流速为0.8ml/min,所述梯度洗脱时紫外线检测器的检测波长为220nm。
(4)记录色谱图，并采用面积归一化法计算Fmoc-Ile-OH的纯度。
色谱条件采用
色谱柱：C18柱，4.6mm×250mm，5μm；
流速：0.7ml/min
检测波长：220nm
柱温：40℃
进样量：10μl
流动相A:80M TEAP流动相B:ACN
洗脱条件如下：
时间min 流动相A％ 流动相B％
0 45 45
20 45 45
25 10 90
29 10 90
30 52 48
35 52 48
注入Fmoc-Leu-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-Leu-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-Leu-Leu-OH(吉尔生化)，Fmoc-Ile-OH(吉尔生化)的混合溶液，以及分别单独进样，从图2看，有5个峰，分离度分别10.50,33.84,0.8和6.58，其中Fmoc-Leu-OH与Fmoc-Ile-OH分离度只有0.8，不符合分离度不低于1.5的标准。
对比例2
(1)将定量KH2PO4溶于蒸馏水按一定比例配置流动相A；
(2)色谱乙腈为流动相B；
(3)注入待测溶液，以流动相A和流动相B对色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱的柱温为40℃，进样浓度控制在0.5mg/ml，流动相流速为0.8ml/min,所述梯度洗脱时紫外线检测器的检测波长为220nm。
(4)记录色谱图，并采用面积归一化法计算Fmoc-Ile-OH的纯度。
色谱条件采用
色谱柱：C12柱，4.6mm×250mm，5μm；
流速：1.0ml/min
检测波长：220nm
柱温：35℃
进样量：10μl
流动相A:100％H2O+0.1％H3PO4流动相B:ACN
洗脱条件如下：
注入Fmoc-Ile-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-Ile-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-Ile-Ile-OH(吉尔生化)，Fmoc-Leu-OH(吉尔生化)的混合溶液，以及分别单独进样，从图3看，有5个峰，但其中Fmoc-Leu-OH与Fmoc-Ile-OH分离度比较小，未能完全分开。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种Fmoc-Ile-OH的有关物质检测方法，其特征在于参数条件如下：
采用高效液相色谱法进行检测，检测波长为210～280nm，所用流动相A为水，流动相B为乙腈，均添加0.05～0.15％TFA的离子对溶液；梯度变化中流动相A的体积含量为52～5～52％，流动相B的体积含量为48～95～48％，所述有关物质检测方法中色谱柱选自C4色谱柱，所述有关物质检测方法具体是将含有Fmoc-β-Ala-OH，Fmoc-β-Ala-Ile-OH，Fmoc-Ile-Ile-OH和Fmoc-Leu-OH与Fmoc-Ile-OH的混合溶液进样，以及将上述五种物质的对照品分别进样定位，最后采用面积归一化法计算Fmoc-Ile-OH的纯度；有关物质检测方法中洗脱梯度变化为：
时间min 流动相A％ 流动相B％ 0 52 48 20 52 48 25 5 95 29 5 95 30 52 48 35 52 48
。
2.如权利要求1所述的Fmoc-Ile-OH的有关物质检测方法，其特征在于，所述有关物质检测方法中柱温为25～40℃，流动相流速为0.5～1.2ml/min。
3.如权利要求1所述的Fmoc-Ile-OH的有关物质检测方法，其特征在于，所述有关物质检测方法中柱温为40℃，流动相流速为0.8ml/min。
4.如权利要求1所述的Fmoc-Ile-OH的有关物质检测方法，其特征在于，所述有关物质检测方法中直接采用流动相溶解样品，进样浓度为0.25～0.75mg/ml。
5.如权利要求1所述的Fmoc-Ile-OH的有关物质检测方法，其特征在于，所述有关物质检测方法中流动相中TFA的离子对溶液浓度为0.1％。
CN202110439206.4A 2021-04-23 2021-04-23 一种Fmoc-Ile-OH的有关物质检测方法 Active CN113655131B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110439206.4A CN113655131B (zh) 2021-04-23 2021-04-23 一种Fmoc-Ile-OH的有关物质检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110439206.4A CN113655131B (zh) 2021-04-23 2021-04-23 一种Fmoc-Ile-OH的有关物质检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113655131A CN113655131A (zh) 2021-11-16
CN113655131B true CN113655131B (zh) 2023-09-29

Family

ID=78476872

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110439206.4A Active CN113655131B (zh) 2021-04-23 2021-04-23 一种Fmoc-Ile-OH的有关物质检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113655131B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1987006929A1 (en) * 1986-05-16 1987-11-19 Eka Nobel Ab An optically active reagent and a method for the determination of enantiomeric amine compounds
CN104345114A (zh) * 2013-07-30 2015-02-11 希施生物科技（上海）有限公司 一种反相分离衍生化亮氨酸和异亮氨酸的方法
CN109115899A (zh) * 2018-06-19 2019-01-01 南京肽业生物科技有限公司 一种Fmoc氨基酸的分析方法
CN109470799A (zh) * 2018-12-29 2019-03-15 成都市科隆化学品有限公司 Fmoc-Arg(Pbf)-OH的纯度及杂质定位检测方法
CN111505160A (zh) * 2020-05-11 2020-08-07 成都市科隆化学品有限公司 一种Fmoc-保护氨基酸纯度及相关物质分析方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1987006929A1 (en) * 1986-05-16 1987-11-19 Eka Nobel Ab An optically active reagent and a method for the determination of enantiomeric amine compounds
CN104345114A (zh) * 2013-07-30 2015-02-11 希施生物科技（上海）有限公司 一种反相分离衍生化亮氨酸和异亮氨酸的方法
CN109115899A (zh) * 2018-06-19 2019-01-01 南京肽业生物科技有限公司 一种Fmoc氨基酸的分析方法
CN109470799A (zh) * 2018-12-29 2019-03-15 成都市科隆化学品有限公司 Fmoc-Arg(Pbf)-OH的纯度及杂质定位检测方法
CN111505160A (zh) * 2020-05-11 2020-08-07 成都市科隆化学品有限公司 一种Fmoc-保护氨基酸纯度及相关物质分析方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HPLC在N-Fmoc-Cys(Trt)合成工艺中的定性、定量分析;冯冬 等;《生命科学仪器》;20090228;第8卷;42-45 *
J. L＇opez-Cervantes 等.Analysis of free amino acids in fermented shrimp waste by high-performance liquid chromatography.《Journal of Chromatography A》.2006,第1105卷 *
Liquid-Chromatography Quantitative Analysis of 20 Amino Acids after Derivatization with FMOC-Cl and Its Application to Different Origin Radix isatidis;Wei Zhou 等;《Journal of the Chinese Chemical Society》;20110415;第58卷;509-515 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113655131A (zh) 2021-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Van Wandelen et al. Using quaternary high-performance liquid chromatography eluent systems for separating 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate-derivatized amino acid mixtures
Kroef et al. Production scale purification of biosynthetic human insulin by reversed-phase high-performance liquid chromatography
Hancock et al. Use of mixed-mode, high-performance liquid chromatography for the separation of peptide and protein mixtures
Hancock et al. High-pressure liquid chromatography of peptides and proteins XI. The use of cationic reagents for the analysis of peptides by high-pressure liquid chromatography
LeMaster et al. Preparative-scale isolation of isotopically labeled amino acids
Carsten A Procedure for the Ion Exchange Chromatography of the Amino Acids of Urine1
Hearn et al. High-pressured liquid chromatography of amino acids, peptides and proteins: V. Separation of thyroidal iodo-amino acids by hydrophilic ion-paired reversed-phase high-performance liquid chromatography
Boyes et al. Modern trends and best practices in mobile-phase selection in reversed-phase chromatography
JPS63503352A (ja) タンパク質の精製
CN112782311A (zh) 一种富马酸丙酚替诺福韦中l-丙氨酸异丙酯的hplc测定方法
CN111505151A (zh) 高效液相色谱法测定l-缬氨酸原料中其他氨基酸的方法
CN113655131B (zh) 一种Fmoc-Ile-OH的有关物质检测方法
KEHL et al. High-performance liquid chromatography of proteins as applied to fibrinogen chains
Buck et al. A validated HPLC assay for salmon calcitonin analysis. Comparison of HPLC biological assay
Jeon et al. Direct enantiomer separation of thyroxine in pharmaceuticals using crown ether type chiral stationary phase
CN113214160B (zh) 一种无氨氮排放高效纯化组氨酸原料药的方法
Chernobrovkin et al. Determination of amino acid enantiomers in pharmaceuticals by reversed-phase high-performance liquid chromatography
Jiskra et al. Use of capillary electrophoresis and high-performance liquid chromatography for monitoring of glycosylation of the peptides dalargin and desmopressin
CN111007184A (zh) 一种4-甲基哌嗪-1-甲酰氯盐酸盐含量的检测方法
Begum et al. Purification of peptides using surrogate stationary phases on reversed-phase columns
JPWO2020004583A1 (ja) ポリペプチドの分離方法、ポリペプチドの製造方法及びポリペプチドの精製装置
Brent R et al. A method for quantitative amino acid analysis using precolumn o-phthalaldehyde derivatization and high performance liquid chromatography
CN116482282A (zh) 一种乙酰基四肽-3中对映异构体的分离分析方法及其应用
CN113092648A (zh) 一种氨基酸的分离提纯方法
CN115656391B (zh) 一种特立帕肽含有的杂质的检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant