CN116482282A - 一种乙酰基四肽-3中对映异构体的分离分析方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙酰基四肽‑3中对映异构体的分离分析方法及其应用。本发明采用高效液相色谱法进行分离分析，其中，选用亲水性十八烷基硅烷键合硅胶柱，使用浓度为体积百分比0.05～0.15％的有机酸溶液以0.2～1.0mL/min的流速进行洗脱，能有效对乙酰基四肽‑3及其对映异构体进行了分离分析，分离度达到1.5及以上。本发明避免使用有机试剂，环保及对人体毒害小；且本发明避免配置特殊仪器，操作简便，成本低。
Description
技术领域
本发明属于制备和检测分析领域，特别涉及一种乙酰基四肽-3中对映异构体的分离分析方法及其应用。
背景技术
由于氨基酸多为手性分子(甘氨酸除外)，在多肽合成的过程中不可避免的存在对映异构体杂质的产生，或由氨基酸原料引入，这可能导致其生物活性的改变。因此，应对多肽合成中的对映异构体杂质进行控制。
对于氨基酸、较短的多肽的对映异构体杂质检测，以及化学药物的对映异构体杂质检测，通常采用正相手性色谱柱法、柱前或柱后衍生法、流动相手性添加剂法。正相手性色谱柱法通常具有耗时较长、灵敏度低、操作复杂、毒性较大、需要配置专用仪器的缺点。柱前或柱后衍生法对实验操作和试剂的要求比较高，还有衍生产物不单一的问题。流动相手性添加剂法分离效果不稳定，色谱柱寿命短，且灵敏度很低。如果有反相色谱法可以分离某些化妆品多肽的对映异构体杂质，也会用到甲醇、乙腈等有机试剂，有一定的毒性。
乙酰基四肽-3是一种含有4个氨基酸的化妆品多肽，氨基酸序列为Ac-Lys-Gly-His-Lys-NH2，CAS号为827306-88-7，具有促进毛发生长的作用。
现有技术尚无乙酰基四肽-3中对映异构体的分离分析方法。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种乙酰基四肽-3中对映异构体的分离分析方法。
本发明的另一目的在于提供上述乙酰基四肽-3中对映异构体的分离分析方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种乙酰基四肽-3中对映异构体的分离分析方法，包括如下步骤：采用高效液相色谱法进行分离分析，色谱条件包括如下参数：
色谱柱：亲水性十八烷基硅烷键合硅胶柱；
流动相：浓度为体积百分比0.05～0.15％的有机酸溶液。
所述的亲水性十八烷基硅烷键合硅胶柱优选为Ultimate ALK C18色谱柱。
所述的有机酸优选为甲酸、乙酸和磷酸中的一种以上。
所述的有机酸溶液的浓度优选为体积百分比0.1％。
所述的色谱条件中的洗脱为等度洗脱。
所述的等度洗脱的时间为10min以上；优选为20min。
所述的洗脱的流速为0.2～1.0mL/min；更优选为0.5～1.0mL/min。
所述的色谱条件还包括如下条件：检测波长200～220nm；柱温20～30℃。
所述的检测波长优选为210nm。
所述的柱温优选为25℃。
所述的色谱条件还包括：进样量为5μL。
上述乙酰基四肽-3中对映异构体的分离分析方法在分离和/或分析乙酰基四肽-3样品中的乙酰基四肽-3对映异构体中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明首次对乙酰基四肽-3及其对映异构体进行了分离分析，分离度达到1.5及以上；
2.本发明避免使用有机试剂，环保及对人体毒害小；
3.本发明避免配置特殊仪器，操作简便，成本低。
附图说明
图1是实施例1的乙酰基四肽-3的液相色谱图。
图2是实施例1的乙酰基四肽-3对映异构体的液相色谱图。
图3是实施例1的混标验证溶液的液相色谱图。
图4是对比例1的乙酰基四肽-3的液相色谱图。
图5是对比例1的乙酰基四肽-3对映异构体的液相色谱图。
图6是对比例1的混合溶液的液相色谱图。
图7是对比例2的乙酰基四肽-3的液相色谱图。
图8是对比例2的乙酰基四肽-3对映异构体的液相色谱图。
图9是对比例2的乙酰基四肽-3与乙酰基四肽-3对映异构体叠加对比的液相色谱图。
图10是对比例3的乙酰基四肽-3的液相色谱图。
图11是对比例3的乙酰基四肽-3对映异构体的液相色谱图。
图12是对比例3的混合样品的液相色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1.仪器与试剂：岛津LC-2010CHT高效液相色谱仪；甲酸(Sigma-Aldrich)。
样品：乙酰基四肽-3样品(合肥国肽生物科技有限公司)、乙酰基四肽-3对映异构体(合肥国肽生物科技有限公司)。
2.实验方法：
2.1样品的制备：取乙酰基四肽-3样品适量，置于20mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，制成约1mg/mL的乙酰基四肽-3样品溶液。取乙酰基四肽-3对映异构体适量，置于20mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，制成约1mg/mL的乙酰基四肽-3对映异构体溶液。取乙酰基四肽-3样品溶液与乙酰基四肽-3对映异构体溶液各1mL，等体积混合均匀后作为混标验证溶液，备用。各样品进样前均经0.22μm滤膜过滤。
2.2色谱条件：采用岛津LC-2010CHT高效液相色谱仪，色谱柱为Ultimate ALK C185μm 4.6×250mm；流动相为浓度为0.1％(v/v)的甲酸水溶液；流速为0.5mL/min；检测波长为210nm；柱温为25℃；进样量为5μL；等度洗脱20min。
3.实验结果：
乙酰基四肽-3样品色谱图的积分结果如表1所示，图谱见图1。
表1乙酰基四肽-3样品积分结果表
乙酰基四肽-3对映异构体色谱图的积分结果如表2所示，图谱见图2。
表2乙酰基四肽-3对映异构体积分结果表
混标验证溶液的的色谱图积分结果如表3所示，图谱见图3。
表3
从以上结果可以看出：乙酰基四肽-3的保留时间在7.843min(如图1所示)；乙酰基四肽-3对映异构体保留时间在9.626min(如图2所示)；混标验证溶液的图谱中，两者混合后达到基线分离，分离度为3.509，分离效果非常好(如图3所示)。
对比例1
1.仪器与试剂：岛津LC-2010CHT高效液相色谱仪，控制软件为变色龙7网络版色谱工作站；磷酸二氢钾、1-戊烷磺酸钠、磷酸、乙腈。
样品：乙酰基四肽-3样品(合肥国肽生物科技有限公司)、乙酰基四肽-3(合肥国肽生物科技有限公司)。
2.实验方法：
2.1样品的制备：取乙酰基四肽-3样品适量，置于20mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，制成约1mg/mL的乙酰基四肽-3样品溶液。取乙酰基四肽-3对映异构体适量，置于20mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，制成约1mg/mL的乙酰基四肽-3对映异构体溶液。取乙酰基四肽-3样品溶液与乙酰基四肽-3对映异构体溶液各1mL，等体积混合均匀后作为混合样品溶液，备用。各样品进样前均经0.22μm滤膜过滤。
2.2色谱条件：采用岛津LC-2010CHT高效液相色谱仪，色谱柱为XAqua C18 5μm4.6×250mm反相色谱柱。流动相A为25mmol/L的磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调pH至2.6)，其中含有5mmol/L的1-戊烷磺酸钠；流动相B为0.1％(v/v)磷酸水溶液-乙腈(体积比20:80)。流动相A的制备方法如下：称取1-戊烷磺酸钠1.74g，磷酸二氢钾6.80g，加入去离子水定容至2L，完全溶解后，用磷酸调节pH至2.60，过滤、超声即得。流动相B的制备方法如下：量取500mL去离子水，加入0.5mL磷酸，混匀、过滤，取滤液400mL，加入1600mL乙腈，混匀，待用。流速为1.0mL/min；检测波长为210nm，柱温为35℃，进样量为5μL。洗脱梯度如下：
表4
| 时间 | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 100 | 0 |
| 8 | 95 | 5 |
| 15 | 80 | 20 |
| 30 | 0 | 100 |
| 40 | 100 | 0 |
| 50 | 100 | 0 |
3.实验结果：
如图4所示，乙酰基四肽-3样品的保留时间为15.990min；如图5所示，乙酰基四肽-3对映异构体的保留时间为16.143min；如图6所示，混合样品溶液分离效果不佳。
对比例2对比不同类型色谱柱
1.仪器与试剂：Agilent 1260高效液相色谱仪，控制软件为变色龙7网络版色谱工作站；磷酸、乙腈。
样品：乙酰基四肽-3样品(合肥国肽生物科技有限公司)、乙酰基四肽-3对映异构体(合肥国肽生物科技有限公司)。
2.实验方法：
2.1样品的制备：取乙酰基四肽-3样品适量，置于20mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，制成约1mg/mL的乙酰基四肽-3样品溶液。取乙酰基四肽-3对映异构体适量，置于20mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，制成约1mg/mL的乙酰基四肽-3对映异构体溶液。各样品进样前均经0.22μm滤膜过滤。
2.2色谱条件：采用Agilent 1260高效液相色谱仪，色谱柱为Ultimate XB-C18 5μm 4.6×250mm反相色谱柱。流动相A为0.1％(v/v)磷酸水溶液：乙腈＝96：4(v/v)混合得到；流动相B为0.1％(v/v)磷酸水溶液：乙腈＝20:80(v/v)混合得到。流速为1.0mL/min；检测波长为210nm，柱温为30℃，进样量为5μL。洗脱梯度如下：
表5
| 时间 | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 15 | 85 | 15 |
| 31 | 0 | 100 |
| 35 | 0 | 100 |
| 35.1 | 100 | 0 |
| 50 | 100 | 0 |
3.实验结果：
如图7所示，乙酰基四肽-3样品的保留时间为15.938min；如图8所示，乙酰基四肽-3对映异构体的保留时间为16.115min；图7和图8进行叠加对比如图9所示，分离效果不佳。
对比例3对比不同的亲水性色谱柱
1.仪器与试剂：Waters ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色谱仪，控制软件为Empower3色谱工作站；甲酸、乙腈。
样品：乙酰基四肽-3样品(合肥国肽生物科技有限公司)、乙酰基四肽-3对映异构体(合肥国肽生物科技有限公司)。
2.实验方法：
2.1样品的制备：取乙酰基四肽-3样品适量，置于20mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，制成约1mg/mL的乙酰基四肽-3样品溶液。取乙酰基四肽-3对映异构体适量，置于20mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，制成约1mg/mL的乙酰基四肽-3对映异构体溶液。取乙酰基四肽-3样品溶液与乙酰基四肽-3对映异构体溶液各1mL，等体积混合均匀后作为混合样品溶液，备用。各样品进样前均经0.22μm滤膜过滤。
2.2色谱条件：采用Waters ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色谱仪，色谱柱为Thermo Accucore aQ C18 1.7μm 2.1×100mm反相色谱柱。流动相A为0.1％(v/v)甲酸水溶液；流动相B为纯乙腈。流速为0.2mL/min；检测波长为210nm，柱温为30℃，进样量为0.1μL。洗脱梯度如下：
表6
| 时间 | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 100 | 0 |
| 15 | 60 | 40 |
| 20 | 100 | 0 |
| 25 | 100 | 0 |
3.实验结果：
乙酰基四肽-3样品和乙酰基四肽-3对映异构体的保留都很弱，其中乙酰基四肽-3样品的保留时间为0.414min，如图10所示。乙酰基四肽-3对映异构体的保留时间为0.412min，如图11所示。混合样品溶液的保留时间为0.412min，无法分离乙酰基四肽-3及其对映异构体，如图12所示。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种乙酰基四肽-3中对映异构体的分离分析方法，其特征在于包括如下步骤：采用高效液相色谱法进行分离分析，色谱条件包括如下参数：
色谱柱：亲水性十八烷基硅烷键合硅胶柱；
流动相：浓度为体积百分比0.05～0.15％的有机酸溶液。
2.根据权利要求1所述的乙酰基四肽-3中对映异构体的分离分析方法，其特征在于：
所述的亲水性十八烷基硅烷键合硅胶柱为Ultimate ALK C18色谱柱；
所述的有机酸为甲酸、乙酸和磷酸中的一种以上。
3.根据权利要求1所述的乙酰基四肽-3中对映异构体的分离分析方法，其特征在于：
所述的有机酸溶液的浓度为体积百分比0.1％。
4.根据权利要求1所述的乙酰基四肽-3中对映异构体的分离分析方法，其特征在于：
所述的色谱条件中的洗脱为等度洗脱。
5.根据权利要求4所述的乙酰基四肽-3中对映异构体的分离分析方法，其特征在于：
所述的洗脱的流速为0.2～1.0mL/min；
所述的等度洗脱的时间为10min以上。
6.根据权利要求5所述的乙酰基四肽-3中对映异构体的分离分析方法，其特征在于：
所述的洗脱的流速为0.5～1.0mL/min；
所述的等度洗脱的时间为20min。
7.根据权利要求1所述的乙酰基四肽-3中对映异构体的分离分析方法，其特征在于：
所述的色谱条件还包括如下条件：检测波长200～220nm；柱温20～30℃。
8.根据权利要求7所述的乙酰基四肽-3中对映异构体的分离分析方法，其特征在于：
所述的检测波长为210nm；
所述的柱温为25℃。
9.权利要求1～8任一项所述的乙酰基四肽-3中对映异构体的分离分析方法在分离和/或分析乙酰基四肽-3样品中的乙酰基四肽-3对映异构体中的应用。
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