CN111721873A - 一种基于反相hplc分离二氢杨梅素和其(2s,3s)手性异构体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于反相HPLC分离二氢杨梅素和其(2S,3S)手性异构体的方法，包括如下参数：色谱柱：C18柱；流动相A相：由甲醇‑四氢呋喃‑水按体积比8:2:90混合而成，并添加终浓度为200μg/mL的4‑氟‑DL‑苯丙氨酸，临用现配；流动相B相：由甲醇‑四氢呋喃‑水按体积比35:5:60混合而成，并添加终浓度为200μg/mL的4‑氟‑DL‑苯丙氨酸，临用现配；洗脱方式：梯度洗脱；流动相流速：0.9mL/min；柱温：30℃。本发明只需要常规的C18反相硅胶柱即可有效分离二氢杨梅素和其(2S,3S)手性异构体，无需手性色谱柱，成本低。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种基于反相HPLC分离二氢杨梅素和其(2S,3S)手性异构体的方法。
背景技术
二氢杨梅素(Dihydromyricetin，DMY)是一种二氢黄酮醇类化合物，存在于多种天然植物中，具有多种生物活性。二氢杨梅素含有两个手性中心，植物来源以(2R,3R)-DMY为主，但在高温、重结晶或存在金属离子等时，天然的(2R,3R)-DMY容易发生消旋化，形成(2R,3R)-DMY和(2S,3S)-DMY的混合物。(2R,3R)-DMY和(2S,3S)-DMY化学结构式如下。
由于(2R,3R)-DMY的生物活性显著优异于(2S,3S)-DMY，为了提高(2R,3R)-DMY的质量标准研究，控制(2R,3R)-DMY产品中(2S,3S)-DMY的含量，有必要建立一种分离(2R,3R)-DMY和(2S,3S)-DMY的方法。
阮丽君等提供了一种HPLC测定二氢杨梅素手性异构体含量的方法，但是，该方法采用了EnantioPakAD手性柱才将二者分离(HPLC测定二氢杨梅素手性异构体含量方法学研究，今日药学2019年12月第29卷第12期)。因为EnantioPakAD手性柱较为昂贵，且使用寿命短，所以阮丽君等提供的方法显然成本高。
手性流动相色谱法是一种采用添加了手性试剂的流动相进行手性异构体(对映体)分离的色谱技术。该方法使用普通填料的色谱柱即可实现手性异构体(对映体)的分离，成本低。
目前未见手性流动相色谱法成功用于(2R,3R)-DMY和(2S,3S)-DMY的报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中存在的缺陷和不足，提供一种基于反相HPLC分离二氢杨梅素和其(2S,3S)手性异构体的方法。
实现上述目的的技术方案如下：
一种基于反相HPLC分离二氢杨梅素和其(2S,3S)手性异构体的方法，包括如下HPLC色谱参数：
色谱柱：C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；
流动相A相：由甲醇-四氢呋喃-水按体积比8:2:90混合而成，并添加终浓度为200μg/mL的4-氟-DL-苯丙氨酸，临用现配；
流动相B相：由甲醇-四氢呋喃-水按体积比35:5:60混合而成，并添加终浓度为200μg/mL的4-氟-DL-苯丙氨酸，临用现配；
洗脱方式：梯度洗脱；
洗脱程序：0→10min，0％B→45％B；10→20min，45％B；20→25min，45％B→0％B；25→30min，0％B；
流动相流速：0.9mL/min；
柱温：30℃。
根据上述的基于反相HPLC分离二氢杨梅素和其(2S,3S)手性异构体的方法，色谱柱优选DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm，5μm)。
根据上述反相HPLC分离二氢杨梅素和其(2S,3S)手性异构体的方法，检测波长为290nm。
根据上述反相HPLC分离二氢杨梅素和其(2S,3S)手性异构体的方法，进样量为10μL。
根据上述反相HPLC分离二氢杨梅素和其(2S,3S)手性异构体的方法，分析时间为30min。
有益效果：
本发明提供了一种基于反相HPLC分离二氢杨梅素和其(2S,3S)手性异构体的方法，(2R,3R)-DMY和(2S,3S)-DMY在该HPLC色谱条件下能有效分离。本发明提供的方法只需要常规的C18反相硅胶柱，无需手性色谱柱，成本低。
附图说明
图1为流动相添加4-氟-DL-苯丙氨酸的色谱图，其中：A为(2R,3R)-DMY单标溶液的色谱图，B为(2S,3S)-DMY单标溶液的色谱图，C为(2R,3R)-DMY和(2S,3S)-DMY混标溶液的色谱图，可见混标溶液中的两个色谱峰的出峰时间分别与单标溶液中(2R,3R)-DMY、(2S,3S)-DMY的出峰时间一致，混标溶液中(2R,3R)-DMY、(2S,3S)-DMY实现基线分离。
图2为流动相不添加4-氟-DL-苯丙氨酸的色谱图，其中：A为(2R,3R)-DMY单标溶液的色谱图，B为(2S,3S)-DMY单标溶液的色谱图，二者出峰时间相同。
具体实施方式
一、试验仪器和试剂
LC-20AT型高效液相色谱仪(日本岛津)，配有紫外检测器及LCSolution工作站。
电子分析天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司。
(2R,3R)-DMY、(2S,3S)-DMY对照品的纯度不低于98％。
4-氟-DL-苯丙氨酸购自麦克林试剂，纯度不低于98％。
流动相使用的水为超纯水，有机溶剂为色谱纯试剂。
色谱柱为DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm，5μm)，购自迪马科技。
二、试验方法和结果
1、溶液配制
(2R,3R)-DMY单标溶液的配制：精密称取(2R,3R)-DMY标准品2mg，置于20mL容量瓶中，甲醇溶解定容，备用。
(2S,3S)-DMY单标溶液的配制：精密称取(2S,3S)-DMY标准品2mg，置于20mL容量瓶中，甲醇溶解定容，备用。
(2R,3R)-DMY和(2S,3S)-DMY混标溶液的配制：分别精密称取(2R,3R)-DMY、(2S,3S)-DMY标准品10mg，置于10mL容量瓶中，甲醇溶解定容，备用。
2、色谱条件
色谱柱：DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm，5μm)；
流动相A相：由甲醇-四氢呋喃-水按体积比8:2:90混合而成，并添加终浓度为200μg/mL的4-氟-DL-苯丙氨酸，临用现配；
流动相B相：由甲醇-四氢呋喃-水按体积比35:5:60混合而成，并添加终浓度为200μg/mL的4-氟-DL-苯丙氨酸，临用现配；
洗脱方式：梯度洗脱；
洗脱程序：0→10min，0％B→45％B；10→20min，45％B；20→25min，45％B→0％B；25→30min，0％B；
流动相流速：0.9mL/min；
柱温：30℃；
检测波长：290nm；
进样量：10μL；
分析时间：30min。
3、进样分析
分别精密量取10μL(2R,3R)-DMY单标溶液、(2S,3S)-DMY单标溶液、(2R,3R)-DMY和(2S,3S)-DMY混标溶液注入液相色谱仪，采集色谱图。
色谱图如图1所示，其中A为(2R,3R)-DMY单标溶液的色谱图，B为(2S,3S)-DMY单标溶液的色谱图，C为(2R,3R)-DMY和(2S,3S)-DMY混标溶液的色谱图，可见混标溶液中的两个色谱峰的出峰时间分别与单标溶液中(2R,3R)-DMY、(2S,3S)-DMY的出峰时间一致，混标溶液中(2R,3R)-DMY、(2S,3S)-DMY实现基线分离，分离效果优异。
同时，设置对比试验，对比试验与上述试验的唯一区别在于流动相A相和B相中均不添加4-氟-DL-苯丙氨酸，色谱图如图2所示，其中A为(2R,3R)-DMY单标溶液的色谱图，B为(2S,3S)-DMY单标溶液的色谱图，二者出峰时间相同。由于(2R,3R)-DMY和(2S,3S)-DMY出峰时间相同，为了避免共洗脱产生的过载对色谱柱的损伤，没有进样混标溶液。但是，通过单标溶液中(2R,3R)-DMY、(2S,3S)-DMY的保留时间，已经可以确信二者在该色谱条件下无法分离。
Claims (5)
1.一种基于反相HPLC分离二氢杨梅素和其(2S,3S)手性异构体的方法，其特征在于，包括如下HPLC色谱参数：
色谱柱：C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；
流动相A相：由甲醇-四氢呋喃-水按体积比8:2:90混合而成，并添加终浓度为200μg/mL的4-氟-DL-苯丙氨酸，临用现配；
流动相B相：由甲醇-四氢呋喃-水按体积比35:5:60混合而成，并添加终浓度为200μg/mL的4-氟-DL-苯丙氨酸，临用现配；
洗脱方式：梯度洗脱；
洗脱程序：0→10min，0％B→45％B；10→20min，45％B；20→25min，45％B→0％B；25→30min，0％B；
流动相流速：0.9mL/min；
柱温：30℃。
2.根据权利要求1所述的基于反相HPLC分离二氢杨梅素和其(2S,3S)手性异构体的方法，其特征在于：色谱柱优选Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)。
3.根据权利要求1所述的基于反相HPLC分离二氢杨梅素和其(2S,3S)手性异构体的方法，其特征在于：检测波长为290nm。
4.根据权利要求1所述的基于反相HPLC分离二氢杨梅素和其(2S,3S)手性异构体的方法，其特征在于：进样量为10μL。
5.根据权利要求1所述的基于反相HPLC分离二氢杨梅素和其(2S,3S)手性异构体的方法，其特征在于：分析时间为30min。
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