SU732278A1 - Способ модификации полисахаридов - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к химии .природных соединений, точнее к способам получени  носителей (сорбентов дл  иммобилизации, а также дл  хроматографическсй очистки белков, в особенности ферментов. Известен способ модификации амин целлюлозы серюуглеродом и изобутилхлорфермиатом , позвол ющий получить сорбенты дл  ковалентного св зывани  ферментов 1. Полученный сорбент может взаимодействовать с водой, в частности с атмосферной влажностью, что отрицательно вли ет на его устойчивость. Использование его как сорбента дл  св зывани  ферментов возможно тольк в водных растворах, так как фермент не только не раствор ютс  в органических растворител х; но и инактиви руютс  ими.Поэтому сорбент в процес се его применени  взаимодействует не To.jibKO с ферментом, но и с раст ворителем - водой. Наиболее близким к предлагаемому  вл етс  способ модификации целлюло зы путем ее обработки гексаметилендиизоцйанатом с целью получени  производного цел.люлозы, содержаиего .свободные изоцианатные группы, пригодного дл  использовани  в качестве сорбента иммунобелков 2. Однако применение таких соединений дл  иммобилизации белков (в том числе ферментов) осложнено тем, что из-за реагировани  изоцианатов со всеми реакционноспособными группами белков легко происходит потер  каталитической активности ферментов, вследствие модификации активного центра или других участков, а также тем, что значительное количество содержащихс  изоцианатных групп тер етс  в побочной реакции гидролиза, поэтому сорбционна  емкость носителей небольша . Цель изобретени  - разработка способа получени , модифицированных полисахаридов, пригодных .дл  иммобилизации и хроматографической очистки белков, в том числе ферментов , облгщающих химической стабильностью , повышенной сорбционной емкостью , и тем самым расширение арсенала носителей (сорбентов) . Указанна  цель достигаетс  тем, что модификаци  полисахаридов осуществл етс  их обработкой диизоцианатами с последующей дополнительной обработкой бифункциональными или

Монофункциональными соединени ми в стехиометрическсйч избытке.

В качестве бифункциональных сое- динений используют алифатические диамины и дикарбоновые кислоты С«- С а в качестве монофункциональных соединений используют алифатические ,

спирты Cj- CQ,

В качестве нерастворимого полисахарида прнмен)т целлюлозу, агароау , декст ран, хитин, крахмал и их производные в виде порошков или гранул. Реакци  с диизоцианатом проводитс  в безводных органических растворител х , не содержащих подвижных атомов водорода,, например, в д и океане , ацетон е,хл о ро(|юрме и др. Реакцию катализируют третичные основани  и кислоты, наиболее подход щим  вл етс  триэтиламин. Предпочтительны умеренные температуры - 20-50 С,

Промежуточное производное после-удалени  непрореагировавшего диизоцианата промыванием органическим растворителем,Подвергают взаимодействию с бифункциональньлм или монофункциональным соединением, содержащим подвижные атокжа водорода, структура которого: выбираетс  в зависимости от назначени  носител . Реакци  проводитс  в присутствии органического растворител  и катализатора, как указано дл  первой стадии, или без растворител , примен   избыток реагента.

В зависимости от длины алифатической цепочки Я получают носители с различной отдаленностью функциональных групп (-NHj, -СООН и др.) от полисахаридной матрицы.

Пример 1. Получение носител , содержащего аминогруппы. К суспензии 3,0 г порошковой ц.еллюлозы в 30 мл безводного диоксана прибавл ют 1 мл 2,4-толуолдиизоцианата, 5 капель триэтиламина и смесь медленно перемешивают б .4 при температуре 40-5О С. Затем целлюлозу отфильтровывают, промывают на фильтре 5-6 порци ми диоксана по 20 мл. Полученное промежуточное производное по данным элементарного анализа содержит 4,7%N. В ИКспектре имеетс  полоса поглощени  при 2270 , соответствующа  свободным изоцианатным группам. Производное суспендируют в растворе 0,2 г гексаметилендиамина в 30 мл диоксана , содержащего 5 капель триэтиламина . Смесь нагревают 4, ч при 6080 с , после чего носитель отфильтровывают , промывают несколькими порци ми диоксана,смеси диоксан-вода 1:1 и водой. По данным элементарного анализа продукт содержит 6,5% N. Концентрацию вводимых аминогрупп можно варьировать путем изменени  исходного соотношени  полисахариддиизоцианат , а также изменением интенсивности условий реакции. Полученный носитель, содержащий

аминогруппы, активируют известным глутаральдегидным методом и исполь ,зуют дл  иммобилизации ферментов.

Результаты определени  активности нгданобилизованных препаратов приведены в таблице. Дл  сравнени  там же приведены данные, полученные при иммобилизации тех же ферментов йа широк он спал ьзуемс носителе макропористом аминосилохроме С-80 проведенной в аналогичных услови х и с теь же исходным соотношением фермент:носитель.

По примеру 1 242 6220 6,1

Аминосилохром С-80 152 2270 1,4

П р и м е р 2, Получение носител , содержащего карбоксильные группы. Носитель получают как в примере 1,

только вместо раствора гексаметилендиамина примен ют раствор 2,0 г

себациновой кислоты в 30 мл диокса- . на. По данным элементарного анализа продукт содержит 4,5% N. Дл  иммобилизации ферментов синтезированный

носитель активируют водорастворимым карбодиимидом известным методом., Получены иммобилизованные препараты с активностью глюкозооксидазы 1120 Е/г, аспергил{1опепсина - 6,2 Е/г.

Пример 3. Получение носителей , содержащих гидрофобные радикалы . Получение носител  ведут как в примере 1, только вместо раствора гексаметилендиамина используют октиловый спирт. После аналогичной обработки получают носитель, содержа1ЧИЙ октиловый остаток, присоединенный к фенильному кольцу через амидную св зь (по данным элементарного анализа продукт содержит

4,0% N). Функциональные свойства носител  обусловлены гидрофобным взаимодействием с молекулами белков . При адсорбционной иммобилизации глюкозооксидазы на этом носитепе получен препарат с активностью 80 Е/г, в то врем  как при применении исходной немодифицированной целлюлозы активность равна нулю. Аналогичным образом модифицирована сефароза CL-4B, только в этом

случае водна  суспензи  носител  переводитс  в органический растворитель и обратно в водную среду промыванием смес ми дноксан-вода с постепенно увеличивающейс  (обратно-уменьшающейс ) концентрацией

Claims (3)

1. Формула изобретения

   1. Способ модификации полисахаридов обработкой диизоцианатами, от-

   ЗОдичающийся тем, что, с целью получения сорбентов, обладающих химической стабильностью и высокой сорбционной емкостью, для иммобилизации или хроматографической 35 очистки белков, проводят дополнительную обработку полученного продукта ’ бифункциональными или Монофункциональными соединениями в стехиометрическом избытке.

   40
2. 2. Способ по п,1, отличающий с я тем,что в качестве бифункциональных соединений используют алифатические диамины и дикарбоновые КИСЛОТЫ С₂- Сд.
3. 3. Способ по n.J, отличаю45 щ и й с я тем, что в качестве монофункциональных соединений используют алифатические спирты Cg- Cg.