FR2623193A1 - Anticorps immobilises, fixes par liaison covalente a un polymere-matrice, et leur procede de preparation - Google Patents

Abstract

L'invention concerne des anticorps immobilisés, fixés par liaison covalente à un polymère-matrice au moyen de leur région glucidique modifiée, caractérisés en ce que la fixation de l'anticorps est effectuée par la condensation entre au moins un groupe aldéhyde de la région glucidique oxydée et au moins une fonction époxy d'un polymère-matrice MP portant des groupes époxy réactifs, au moyen d'un réactif bifonctionnel BR qui porte, dans l'une des positions terminales d'une unité d'écartement à trois maillons au moins, un groupement amino susceptible de condensation avec le groupe aldéhyde et, dans l'autre position terminale, un groupe qui réagit de façon covalente avec la fonction époxy.

Description

L'invention concerne la formation régiospecifique de conjugues d'anticorps

contenant des oligosaccharides, au moyen d'une modification par oxydation de la région glucidique des anticorps, La fixation de substances biologiquement actives sur des supports fait partie des procédés standard dans.la recherche et la technique de la biochimie. A cet égard, différentes méthodes ont été développees - en fonction de la nature chimique des substances a fixer et de l'objectif de la fixation - (cf. par exemple K. Buchholz, "Characterization of Immobilized Biocatalysts", Dechema

Monographs, volume 84, n' 1724-1731, Verlag Chemie 1979).

Dès le début, des polysaccharides tels que la cellulose, l'amidon, le dextrane, qui sont ordinairement modifiés chimiquement en vue de leur activation, ont pris une grande importance pratique comme matières de support. De nombreuses méthodes de modification ont été proposées, et notamment l'activation d'amidon par oxydation avec un periodate [cf. L. Goldsjein, M. Pecht, S. Blumberg, D. Atlas, Y. Levin, Biochemistry (1979) 2322] avec formation de groupes formyle par ouverture du noyau d'hémiacétal. La copulation au moyen des parties glucidiques de membranes cellulaires a été obtenue par oxydation avec un

periodate, par exemple dans le cas de globules rouges.

Les groupes aldéhyde réactifs ainsi formes copulent avec les groupements amine de chaînes latérales de protéines Of. C.I. Sanderson, D.V. Wilson, Immunochemistry, 1971 (8) 1633. L'oxydation d'anticorps par un periodate a été également utilisée pour la conjugaison d'anticorps avec des marqueurs d'enzymes (cf. A.G. Gaivoronskaya et al., Chem. Abstr. S5, 130 787j). De façon analogue, il est proposé, dans le brevet EP-A 0 175 617, des conjugués qui sont formés à partir d'anticorps et de substances thérapetitiquement actives et qui sont dirigés contre un antigene-cible. Le brevet US-A 4 671 958 comprend un procédé pour la fixation par liaison covalente de groupes "linker" en des points spécifiques de molécules d'anticorps qui peuvent être utilisées contre des antigenes-cibles quelconques. Le brevet EP-A 0 088 695 décrit plusieurs méthodes pour la fixation par liaison covalente de partenaires de conjugués solubles et insolubles, tels que substances chimiques, supports, etc., sur des anticorps. Les conjugués formes sont interessants pour des procédés de séparation et de purification par affinité, ainsi que pour des applications diagnostiques et thérapeutiques. La fixation peut notamment s'effectuer sur la partie glucidique des anticorps. Par exemple, pour des immunotests, l'IgM monoclonale est oxydée avec une galactose-oxydase et une

catalase, puis est condensée avec la phénylhydrazine-

glycyi-glycyl-arginyl-7-amino-4-methyl-coumarine [cf.

aussi J.D. Rodwell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2632-36 (1986) /Immunology]. M.M. Chua et ses collaborateurs [Biochem. Biophys. Acta, BQ (3) 291 (1984)] sont également parvenus & la fixation d'immunoglobuline sur des membranes liposomiales par

oxydation douce (avec un periodate ou une galactose-

oxydase) de groupes glucidiques dans le fragment constant de la chaîne lourde de l'immunoglobuline, pour l'obtention de fonctions aldéhyde qui peuvent alors réagir avec des groupes hydrazide qui sont fixés à la surface de la membrane des liposomes. Il a également été proposé, par D.J. O'Shannessy et ses cc-iaborateurs, la conjugaison spécifique d'anticorps, tant polyclonaux que monoclonaux, au moyen de leurs régions glucidiques, des groupes aldéhyde pouvant tout d'abord être formés par oxydation douce, puis transformés, par des dérivés hydraziniques de la biotine, des colorants fluorescents appropriés ou des enzymes, en conjugués stables d'anticorps - qui ont conservé la pleine.activite immunologique. On mentionnera aussi la possibilité de fixation sur des supports solides modifiés par l'hydrazine. Comme support pour la chromatographie

d'immuno-affinité, on utilise par exemple l'agarose-

hvdrazide d'acide adipique (disponible dans le commerce) [cf. J. Appl. Biochem. 7, 347-355 (1985)]. Par ailleurs, O'Shannessy et W.L. Hoffmann utilisent la condensation, catalysee par un acide faible, de grouve$ aldéhyde formes

par oxydation, sur les chaines atérales oligo-

saccharidiques de glycoproteines, avec un agarose fonctionnalisé par l'hydrazine qui a ete orépare par réaction d'agarose du commerce, contenant des groupes ester activés, avec l'hydrate d'hydrazine [cf. Biological

Chemistry Hoppe-Seyler, vol. 368 (7) 767, 768 (r987)].

L'utilisation d'anticorps et d'antigènes fixées à un polymère pour la mise en évidence de la presence de substances spécifiques est devenue l'outil d'analyse biochimique à emplois multiples (cf. Encyclopedia of Polymer Science and Technology, vol. 2, J. Wiley 1985, pp. 55-59). On citera en particulier leur utilisation pour la mise en évidence d'hormones spéciales, de constituants du sang, de types de cellules normaux et anormaux, d'agents pathogènes et jusqu'aux molécules qui

sont des indications de la présence de tumeurs malignes.

En outre, les anticorps monoclonaux trouvent aussi des applications en thérapeutique. C'est ainsi par exemple qu'il existe un espoir de fixer des agents ayant une action létale, par exemple des substances actives ou

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des radio-isotopes, sur des anticorps spécifiques du cancer, avec l'objectif que ce complexe sélectionne sa cellule-cible et s'y fixe pour la détruire finalement

sans porter atteinte durablement à l'environnement.

Lorsqu'on manipule des anticorps, il faut partir du fait que ceux-ci présentent une stabilité limitée, aussi bien à l'égard du pH qu'à l'égard de la force ionique du milieu qui les environne. Il va également de soi qu'une modification chimique d'anticorps dans le but de leur fixation par liaison covalente, par exemple sur des matieres de support, n'est pas sans poser des problèmes, car il ne faut pas porter atteinte au moins à leur capacité de fixation à l'égard de l'antigène. Non sans raison, l'attention est attirée sur le fait que les methodes classiques d'immobilisation d'anticorps sur des

supports solides au moyen de cyanure de brome, de 1,1-

carbonyldiimidazole, d'oxydation par un periodate, ainsi qu'au moyen de la chimie des époxydes, conduisent potentiellement à la liaison sur des groupes à activité nucléophile, comme par exemple des groupements amine, thio ou hydroxy, à proximité du site de fixation sur l'antigene et, en conséquence, peuvent porter atteinte à la capacité de fixation [cf. K. Tim, Biological Chemistry, Hoppe-Seyler, vol. 386 <(7) 785 (1987)]. Dans la littérature, l'accent est mis à juste titre sur le fait que la composition du.support polymère détermine ses

caractéristiques et son adéquation comme support (K.

Buchholz Ed. dans Characterization of Immobilized Biocatalysts, op. cit. p. 64>. Il existe, à la suite des propositions faites dans la littérature, un choix extrêmement abondant de matières de support en puissance qui peuvent être faites aussi bien de matières essentiellement inorganiques que de substances naturelles

modifiées ou de polymères organiques synthétiques.

D'apres Yim <op. cit.), la fixation des anticorps est effectuée par liaison covalente au moyen de

thiosemicarbazine sur du gel de silice.

Eu égard au rôle que les anticorps fixés à un support Jouent déjà en biochimie et en médecine, il existait le besoin de systèmes porteurs optimisés a base de supports polymères, l'activité des anticorps fixés au support devant d'une part être aussi peu altérée que possible et le système porteur devant d'autre part être optimise en ce qui concerne sa stabilité, son spectre d'applications

et son efficacité.

Il a été découvert que les exigences de la technique étaient satisfaites dans une mesure particulière par l'immobilisation selon l'invention sur des supports polymères spécifiques. L'invention concerne des anticorps

immobilises, fixes par liaison covalente a un polymere-

matrice au moyen de leur région glucidique modifiée, la fixation de l'anticorps étant effectuee par la condensation entre au moins un groupe aldéhyde de la région glucidique oxydée et au moins une fonction époxy d'un polymere-matrice (MP) portant des groupes epoxy réactifs, au moyen d'un réactif bifonctionnel (BR) qui porte, dans l'une des positions terminales d'une unité d'écartement à trois maillons au moins, un groupe amino susceptible de condensation avec le groupe aldéhyde et, dans l'autre position terminale, un groupe qui réagit de

façon covalente avec la fonction époxy.

En ce qui concerne le polymère-matrice (NP), il s'agit en particulier d'un copolymère réticulé d'acrylamide ou de méthacrylamide et d'acrylate ou de méthacrylate de glycidyle, qui est formé de préférence de particules en forme de perles. De tels polymères-matrices sont décrits dans les brevets DE-C 27 22 751 ou US-A 4 713 et US-A 4 511 694. Les perles ont en règle générale un diamètre de 5 à 1000 gm, en particulier de 30 à 1000 ym et elles présentent une cavité intérieure (perles creuses) . Comme valeur indicative pour la teneur du polymère-matrice MP en groupes glycidyle qui peuvent être mis en réaction, on donnera une valeur de 0,8 à 2,5 jmol par mg de matière de support sèche. On trouvera, dans le tableau suivant, d'autres données caractéristiques concernant un polymère-matrice disponible dans le commerce (EUPERGIT C de Rbhm GmbH) qui est representatif des polymères-matrices MP du type en question. Donnees caracteristiques Valeur - Grosseur de grains moyenne 140 - 180 gm Diametre des pores 40 nm - Limite d'exclusion = N.L 2.10' daltons Surface utile de fixation 180 m2/g (à sec) - Absorption d'eau 2,3 ml/g (à sec) - Densité = d420 1,20 - Masse volumique apparente 0,34 g/ml Capacité de fixation (dans les conditions ordinaires): Albumine humaine 48 mg/g (humide) IgG humaine 34 mg/g (humide) - Gonflement en présence d'eau 1: 1,4 1 mi (à sec) donne 1,4 ml (à l'état humide) - Solubilité (dans l'eau, dans des solutions tampons et dans des solvants organiques): insoluble - Stabilité à la compression 300 bars Sous le microscope électronique, on distingue la structure macroporeuse des perles avec des canaux et des cavités qui ont un diamètre d 0,1 à 2,5 pm (1000 à 25 000 A) , ce qui fait que des molécules'd'enzyme ou de substrat ayant une grosseur de 10 à 100 A peuvent atteindre tout

l'intérieur de la matrice macroporeuse.

Modification spécifique au site apportée aux anticorps Conviennent en principe, dans le cadre de la présente invention, tous les anticorps qui, comme on le sait, présentent une teneur en groupes glucidiques et qui sont accessibles à la modification chimique et à la fixation subséquente. Comme valeur indicative, on peut partir d'une teneur d'environ 3% de fraction giucidique dans le cas des anticorps. Les anticorps monoclonaux se situent au centre de l'intérêt. Les procédés pour la préparation d'anticorps monoclonaux sont suffisamment connus (cf. Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3ème éd., vol. 2, J. Wiley (1983), pp. 637 à 643; D. Baron, U. Hartlaub, Humane Nolekulare Antikbrper, Gustav Fischer

Verlag, Stuttgart, New York 1987).

A cet égard, on peut procéder en particulier de la manière suivante. Les lymphocytes ou anticorps monoclonaux, purifiés par exemple par des procédés de purification positive tels que la chromatographie d'affinité ou-par des procédés de purification négative (élimination de l'excès d'autres cellules) tels par exemple que le panning, la lyse du complément et la formation de rosettes E, sont de préféerence dialysés avant l'oxydation, par exemple avec un tampon compatible

approprié, dans la gamme de pH aux alentours de 5,5.

L'oxydation de la partie glucidique' pour l'obtention de groupes formyle peut être effectuee de façon connue en soi, chimiquement par oxydation au periodate ou - avec une moindre préférence - enzymatiquement au moyen des enzymes galactose-oxydase et catalase. En opérant avec un pH relativement bas, de préférence dans la gamme aux alentours de 5,5, on réduit ou on élimine le risque de la réticulation interne des anticorps. Une méthode d'oxydation préférée est l'oxydation avec du periodate de sodium, de préférence O,1 molaire dans une solution tampon inerte appropriée, opportunément dans la gamme de pH 5,5, par exemple dans un tampon d'acétate O,1 K. De préférence, la réaction est menée & une température relativement basse, par exemple de O & 5'C, et dans l'obscurité. L'oxydation, qui peut être ordinairement achevée en une période de l'ordre d'une heure, est arrêtée, par exemple par addition de petites quantités d'éthylèneglycol. Après quoi, les anticorps sont traités, opportunément par chromatographie de filtration sur gel en colonne (cf. Ullmann's Encyklopâdie der techn. Chemie, 4ème éd., vol. 5, Verlag Chemie, p. 167; Gel-filtration, Theory and Practice, Pharmacia Fine Chemicals 1979, Deutsche Pharmacia GmbH, Freiburg 1979). Convient par exemple.& cet effet un gel de dextrane <par exemple le produit SEPHADEX G 25 de Pharmacia), de préférence

équilibre avec une solution tampon dans la gamme de pH 5.

La concentration des anticorps peut être effectuée par surconcentration, par exemple par ultracentrifugation. La production des anticorps se situe ordinairement à plus de %. Copulation des anticorps modifiés spécifiquement au site avec des supports polymères Les anticorps oxydés et purifiés obtenus sont mis en incubation, dans un milieu légèrement acide approprié, par exemple dans un tampon d'acétate et dans la gamme de pH aux alentours de 5,5, dans des concentrations comprises entre 60 et 200 pg, avec le support polymere modifie, substitué par hydrazide (HY-MP) ' dans des quantités de 100 mg, pendant une certaine periode de temps, par exemple de 16 4 h, à une température abaissee, par exemple à 4'C. La part d'anticorps immobilisés est déterminée suivant la méthode de Bradford [cf. Analyt. Biochem. 72, 248 (1976)] à partir de la différence entre la teneur initiale en anticorps et la teneur restante. Les anticorps fixés au moyen de dérivés d'hydrazine ont - en comparaison des anticorps fixés sur le support polymère non modifié P - une capacité améliorée de fixation des antigènes, qui s'approche de la valeur théorique maximale- de 2 mol d'antigène par mol d'anticorps, en particulier lorsqu'une charge

relativement faible en anticorps est présente.

Modification des polymères-matrices MP Le polymère-matrice (NF) formé de (meth)acrylamide et de (méth)acrylate de glycidyle, se composant de

préférence de particules en forme de perles <voir ci-

dessus), spécialement le produit EUPERGIT CE de Rbhm GmbH, Darmstadt, est traité, opportunément dans une solution tampon appropriée dans la gamme alcaline, par exemple dans un tampon de phosphate et à un pH de 8,8, pendant une certaine période de temps, par exemple de 16 3 h à la température ambiante, par le réactif bifonctionnel (BR), de préférence un bis-hydrazide d'un acide dicarboxylique aliphatique, en particulier le dihydrazide d'acide adipique. De préférence, on utilise le réactif bifonctionnel (BR) dans des proportions de 0,1 à O1 pol de BR par gramme de support polvmere MP, spéciaiezant d'EUPERGIT CE <poids à sec), en particulier de i Mmol de BR par g de poids-à sec. Opportunement, on lave le polymère-matrice modifié HY-/P avec un tampon standard de phosphate (PBS). Il peut être équilibré de preférence avec un tampon (par exemple un tampon d'acétate 0,1 M) à un pH de 5,5 et être stocké à basse

température, par exemple à 4'C.

Le réactif bifonctionnel (BER) Conformément à la définition, le réactif bifonctionnel BR se compose d'une unité d'écartement à trois maillons au moins, avec un groupe amino marquant l'une des positions terminales, susceptible de condensation avec le groupe aldéhyde, et, dans l'autre position terminale, un groupe qui réagit de façon

covalente avec la fonction époxy du polymère-matrice HP.

De préférence, le réactif bifonctionnel (BR) peut être représenté par la formule

H2N - (X)- - A - Q

A étant mis pour un élément d'écartement, de préférence un radical alkyle ou cycloalkyle comportant au moins 3 et jusqu'à 12 maillons, de préférence des unités -CH2-, l'un

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ou plusieurs des maillons pouvant être éventuellement remplacé par un atome d'oxygène, et n étant mis pour O ou

H H H H

f,! i 1, X pour un radical -C-N-, -C-N-, -N-C-N-, -N-C-N-, et Q

0 H S H O S

ayant la même signification que -X-NH2 ou pouvant être mis pour -NH2. De façon particulièrement préférée, le reactif bifonctionnel BR représente le bis-hydrazide d'un acide dicarboxylique (A = (CH3-; X = -C-N-; O H Q = -C-N-NHm). Le dihydrazide d'acide adipique est tout ' O H particulièrement préféré. Dans le cas o BR est mis pour une alkylènediamine (n = O, A = <(CHm)3-6, Q = NHm), la double liaison de la base de Schiff formée lors de la condensation est avantageusement réduite, par exemple

avec du borohydrure de sodium.

Dtermination de l'immunocapadité des anticorps fixes selon l'invention La capacité de fixation des anticorps immobilisés selon l'invention est déterminée par mesure des antigènes, en particulier d'enzymes comme par exemple l'anticarboxypeptidase (CPA), qui se fixent sur les anticorps. A cet effet par exemple, de la CPA en quantités égales dans le PBS est introduite dans des

tubes a essais qui contiennent chacun 100 mg du polymère-

matrice modifié HY-MP, mais avec des charges différentes d'anticorps monoclonaux immobilisés. La proportion de CPA fixee aux anticorps du polymère-matrice est déterminée de la manière suivante: ca) par détermination de la différence des teneurs respectives en protéines, au moyen du test de BRADFORD et de l'activité enzymatique, présentes dans la solution de départ et finalement dans la solution résiduelle, 3) par détermination de l'activité enzymatique de l'enzyme immobilisée sur les perles de support de H.Y-NP, par exemple au moyen de la méthode à la Ninhydrine dans le cas de la CPA. La part d'enzyme fixée sur le support a été éluée après incubation avec un tampon de carbonate de sodium de pH 10, 5. Apres égalisation du pH, l'activité de

l'enzyme éluée, par exemple de la CPA, est déterminée.

La détermination par le moyen de l'activité enzymatique est pratiquée dans tous les cas o. sont présents des anticorps qui ne nuisent pas à l'activité enzymatique. Il se révèle que les anticorps modifies par oxydation qui sont fixés aux perles de support de HY-MP conservent leur pleine activité immunologique pour la

fixation de l'enzyme, par exemple la CPA.

Le rapport molaire d'anticorps monoclonaux a la CPA a

varié dans les limites de 2:1 à 1:1.

Comme on l'a déjà indique, l'enseignement de l'invention s'étend à des conjugués spécifiques d'anticorps contenant des oligosaccharides dans le sens général. On mentionnera en particulier des anticorps monoclonaux qui sont dirigés par exemple contre des

antigènes du genre suivant.

Classe d'antigènes Antigène Bactériens Anatoxine tétanique H. influenza type b polysaccharide Toxine diphtérique Chlamydia trachomatis N. leprae Lipopolysaccharide/endotoxine Pneumocoques LPS de P. aeruginosa Exotoxine de P. aeruginosa Streptocoques groupe A glucide Viraux Nucléoprotéine de virusde l'influenza X31 Virus de la rougeole HSV glycoprotéine D Virus de la rougeole, nucléocapside Virus de la cytomégalie Virus A de la grippe épidémique Antigène de virus de la rubéole

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Classe d'antigènes Antigene Viraux HTLV I Zona HBsAg Auto-immunes ADN à double brin Cellules des îlots de Langerhans (diabète sucré) Xyasthénie grave, anti-idiotypes Récepteur de thyréotropine Facteur rhumatismal Récepteur d'acétyicholine Thyroïde Sperme Tumeurs Cancer du sein Cancer de la prostate Cancer du poumon Cancer de l'estomac mélanome GD2 (mélanome humain) Gliome Cancer du rectum Leucémie Cancer du col Tissus/sang Rhésus D Antigène du groupe sanguin A

HLA-A, B, C, DR

Filaments intermédiaires Autres Nalaria Antigène de Forssman Erythrocytes de mouton Nitrophénol Dinitrophénol Trinitrophénol Keyhole limpet hemocyanin (KLH) Facteur rhumatismal Insuline

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La fixation selon l'invention offre toute une série d'avantages par rapport à l'état de la technique, en particulier en cas d'utilisation d'hydrazides d'acides dicarboxyliques et notamment d'hydrazide d'acide adipique. Si l'on conduit par exemple la condensation à un pH aux alentours de 5,5, on évite une condensation des groupements amino des anticorps avec leurs propres

fonctions aldéhydes.

La fixation chimique au moyen de l'hydrazide est stable et inerte de façon désirable. Une fixation non spécifique des anticorps est réduite au minimum. Un

blocage après la fixation des anticorps est superflu.

Les exemples qui suivent serviront à expliquer l'invention. Exemmle 1 Copulation des anticorps monoclonaux contenant des

groupements aldéhyde avec le polymere-matrice modifié HY-

KP servant de support.

Des anticorps monoclonaux modifiés et oxydés de l'exemple 2 sont mis en incubation, dans des concentrations qui varient entre 60 et 200 Mg, dans 1 ml de tampon d'acétate à un pH de 5,5, avec 400 pl du polymère-matrice modifié MP de l'exemple 3 (100 mg), pendant 16 h à 4'C. La proportion d'anticorps immobilisés est déterminee par la méthode de BRADFORD, à partir de la différence entre la quantité initiale et la quantité

restante d'anticorps.

En comparaison de conjugués fixés directement par la fonction oxiranne, les anticorps fixés selon l'invention ont une capacité plus élevée de fixation des antigènes (par exemple à l'égard de la CFA). Cette capacité atteint la valeur théorique maximale de deux antigènes par mol d'anticorps, en particulier lorsque de faibles charges

d'anticorps sont utilisées (cf. tableau 2).

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Tableau 2

Fixation des anticorps monoclonaux oxydés purifies sur le polymère-

matrice HY/MP.

Anti- Corps actif Anticorps fixé Antigène CPA Rapport molaire

corps utilisé par par g de par g de antigène/anti-

g de support support NP support MP corps P sec (mg) sec (mg) (mg) (mol/mol)

CPA 1 0,7 0,7 0,32 2,0

CPA 6 0,5 0,5 0,30 2,5

CPA 6 17,5 7,5 4,5 2,5

CPA 7 1,0 0,7 0,34 2,1

CPA 8 0,8 0,8 0,32 1,65

CPA 8 25,0 13,0 4,40 2,5

CPA 2 3,5 1,0 0,36 1,5

CPA 3 2,2 1,0 0,40 1,7

CPA 5 3,0 2,0 0,40 1,0

Exemmp_ 2 Préparation des anticorps anti-CPA monoclonaux contenant des groupes aldéhyde Une série d'anticorps anti-CPA monoclonaux, purifiés par chromatographie d'affinité, ont été dialysés avant l'oxydation par periodate en présente,de tampon d'acétate 0,1 M & un pH de 5,5. Chaque anticorps monoclonal a été traité par du periodate de sodium 0,1 M en solution dans un tampon d'acétate O,1 M de pH 5,5 (10 ml). A cette faible valeur du pH, la réticulation interne des molécules d'anticorps est supprimée. La réaction a

été conduite pendant 1 h à O'C dans l'obscurité.

On arrête l'effet d'oxydation par addition de 3 gouttes d'éthylèneglycol, avant de charger une colonne de Sephadex G 25 , pré-équilibrée avec un tampon d'acétate O, 1 M de pH 5. Les anticorps oxydés sont concentrés dans une cellule d'ultrafiltration Amicon de 10 ml équipée d'une membrane PM 50 et la teneur en protéines est déterminée par la méthode de BRADFORD. La production des

anticorps dâpamsse ordinairement 90%.

Exempla 3 Modification du polymère-matrice MP 2 g du copolymère méthacrylamide/méthacrylate de glycidyle réticulé (EUPERGIT C, produit de Rbhm GmbH, Darmstadt) sont traités par du dihydrazide d'acide adipique 0,1 M du commerce dans 20 ml d'un tampon de phosphate 0,2 M de pH 8,8, pendant 16 h & la température ambiante: Le support polymère modifié est lave abondamment au PBS, équilibré avec un tampon d'acétate

0,1 M de pH 5,5 et conservé à 4'C.

Claims (10)

REVENDICATIONS

1.- Anticorps immobilisés, fixés par liaison covalente à un polymèrematrice au moyen de leur région glucidique modifiée, caractérisés en ce que la fixation de l'anticorps est effectuée par la condensation entre au moins un groupe aldéhyde de la région glucidique oxydée et au moins une fonction époxy d'un polymère-matrice <OP) portant des groupes époxy, au moyen d'un réactif bifonctionnel (BR) qui porte, dans l'une des positions terminales d'une unité d'écartement à trois maillons au moins, un groupement amine susceptible de condensation avec le groupe aldéhyde et, dans l'autre position terminale, un groupe qui réagit de façon covalente avec

la fonction époxy.

2.- Procédé de préparation des anticorps immobilisés selon la revendication 1, caractérisé en ce que les groupes aldéhyde sont formés par oxydation par un

periodate des groupes hémiacétal de la région glucidique.

3.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'oxydation par un periodate est effectuée à un pH dans la gamme de 5 à 5,5, de préférence dans un tampon

inerte approprié.

4.- Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce qu'on traite par de l'éthylèneglycol

pour mettre fin & l'oxydation.

5.- Procédé de préparation des anticorps immobilisés selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise

un réactif bifonctionnel BR de formule.

H2N - (X) - A - Q

A étant mis pour un élément d'écartement (spacer) comportant au moins 3 maillons, n étant mis pour 0 ou 1, X pour un radical -C-N-, -C-N-, -N-C-N, -N-C-N-, et Q Il..... u a * " 1

0 H S H H 0 H H S H

ayant la méme signification que -X-NHz ou étant mis pour -NH2.

6.- Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on utilise, comme réactif bifonctionnel BR, un 10. composé de formule

H 0 0 H

HN- N C C - N- H

dans laquelle n' est un nombre de 3 a 6, de préférence de

3 ou 4.

7.- Procédé de préparation des anticorps immobilises selon la revendication 1, caractérise en ce qu'on utilise, comme polymère-matrice portant des groupes époxy >P, un copolymère composé essentiellement d'acrylamide ou

de méthacrylamide et de (méth)acrylate de glycidyle.

8.- Procédé de préparation des anticorps immobilisés selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit de réaction d'un réactif bifonctionnel BR selon la revendication 5 avec le polymère- matrice selon la

revendication 7 est préparé à un pH de 8,8 à 9.

9.- Procédé de préparation des anticorps immobilisés selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit de réaction d'un réactif bifonctionnel BR avec le polymère-matrice MP est condensé avec le groupe aldéhyde

de la région glucidique oxydée de l'anticorps.

10.- Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la réaction est conduite dans la gamme de pH de 5

& 5,5.